JP2003503039A - 弱毒化したワクチンの操作のための方法および組成物 - Google Patents

弱毒化したワクチンの操作のための方法および組成物

Info

Publication number
JP2003503039A
JP2003503039A JP2001505941A JP2001505941A JP2003503039A JP 2003503039 A JP2003503039 A JP 2003503039A JP 2001505941 A JP2001505941 A JP 2001505941A JP 2001505941 A JP2001505941 A JP 2001505941A JP 2003503039 A JP2003503039 A JP 2003503039A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
virus
nucleic acid
viruses
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2001505941A
Other languages
English (en)
Inventor
ジュハ パノネン，
ラッセル ホワード，
ウィレム ピー． シー． ステマー，
ステファン デルカーデイル，
ドリス アプト，
Original Assignee
マキシジェン， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/344,655 external-priority patent/US6121736A/en
Application filed by マキシジェン， インコーポレイテッド filed Critical マキシジェン， インコーポレイテッド
Publication of JP2003503039A publication Critical patent/JP2003503039A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A61K39/255—Marek's disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A61K39/265—Infectious rhinotracheitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
    • C12N2710/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/12011—Astroviridae
    • C12N2770/12034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32411—Hepatovirus, i.e. hepatitis A virus
    • C12N2770/32434—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、弱毒化されたワクチン、および弱毒化されたワクチンを得る方法を提供する。本発明のワクチンは、組換えウイルス、細菌、寄生生物、およびワクチンとしての有効性を失うことなく増加した毒弱化を示すように進化された他の生物を含む。本発明の方法は、組換え核酸のライブラリー（例えば、ゲノム全体または部分的なゲノム、あるいは特定の核酸）の作製（このライブラリーは、ワクチンウイルスまたは他の生物に導入される）、次いで、弱毒化されるこれらのウイルスまたは生物をスクリーニングする工程および／または選択を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （政府後援の研究に関する陳述） 適用されず （関連出願の相互参照） 適用されず （発明の背景） （発明の分野） 本発明はワクチン開発分野に関する。従来の弱毒化ワクチンに比較して改良さ
れた弱毒化ワクチンを得る方法が提供される。
【０００２】 （背景） エドワード・ジェンナーは１７９６年、人に牛痘ウイルスを接種すると、牛痘
と同じ系統で極めて恐ろしい天然痘に対する防御が起こることを証明した。ジェ
ンナーの発見に続いて、１８７９−１８８１年にルイ・パスツールがヒナドリの
コレラ、炭疽菌、及び狂犬病の弱毒化ワクチンを開発した。これらの初期の発見
以来、弱毒化ワクチンは種々の感染性疾患及びその他の疾患に対する医学的兵器
庫に多大の貢献をしてきた。
【０００３】 弱毒化ワクチンは、疾患をおこすために必要な幾つかの特性を失った、本来は
病原性である生物体である。細菌もウイルスも弱毒化ワクチンとして適切に使用
できる。弱毒化ウイルスワクチンには例えばワクシニアウイルス及びその他の弱
毒化ポックスウイルス ベクター類がある。そのようなポックスウイルス弱毒化
ワクチンの一つであるＮＹＶＡＣワクチンは、ワクシニアのコペンハーゲン株を
、毒性、組織向性及び宿主域に関係する１８遺伝子のリーディングフレームの完
全な欠失によって弱毒化するという方法で得られた（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、Ｖ
ｉｏｌｏｇｙ １８８巻：２１７−３２ページ（１９９２））。高度に弱毒化さ
れ、それにもかかわらず元のコペンハーゲン株の免疫ポテンシャルを有する生成
した上記ベクターが、ヒトワクチンベクターとして臨床試験に用いられる（Ｌａ
ｎａｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ６４巻：１６６６−７１ページ（１９
９６）；Ｌｉｍｂａｃｈ及びＰａｏｌｅｔｔｉ、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｉｎｆｅ
ｃｔ．１１６巻２４１−５６ページ（１９９６）；Ｐａｏｌｅｔｔｉら、Ｄｅｖ
．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ． ８４巻１５９−６３ページ（１９９５））。その他
のポックスウイルスベクター、ＡＬＶＡＣベクター、はカナリーポックスから誘
導される高度に弱毒化された株であり、カナリアのための獣医学的ワクチンとし
て特許を得ている。それはヒトを含む数種の哺乳動物種において安全かつ有効な
ベクターである。ＴＲＯＶＡＣベクターは高度に弱毒化されたファウルポックス
ワクチン株をベースにしており、生後１日のヒナドリをファウルポックス病に対
して免疫するために用いられる。ＴＲＯＶＡＣは、ヒナドリをニワトリインフル
エンザウイルス及びニューカッスル病ウイルスに対してワクチン接種するための
ベクターとしても用いられる（Ｐａｏｌｅｔｔｉら、同上）。その他の弱毒化ウ
イルスワクチンとしては、ポリオ、麻疹、ムンプス（流行性耳下腺炎）、風疹、
黄熱及び水痘等に対して有効なものがある。ワクチンとして有用な弱毒化細菌の
例には、例えば、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ
）、サルモネラ及び大腸菌等がある。
【０００４】 弱毒化ウイルス及び細菌は種々の方法によって、例えばＵＶ照射（Ｈｒｉｓｔ
ｏｖ及びＫａｒａｄｊｏｖ、Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｎａｕｋｉ、１３巻：８ページ（
１９７５））、ホルマリンまたはエタノール処理による化学的弱毒化（Ｚｕｓｃ
ｈｅｋら、Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ，１３９巻：２３６ページ（
１９６１）；Ｈａｒａｌａｎｂｉｅｖ、Ａｃｔａ．Ｖｅｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｈｕｎｇ．２６巻：２１５ページ（１９７６））、及びインビトロまたはインビ
ボにおけるストレス条件下の接種等によって産生される。ストレス下のインビト
ロ接種の例は、天然痘ワクチンとして特許を得た最初の弱毒化ウイルスの開発で
あり、これはワクシニアのオリジナル リスター株（Ｌｉｓｔｅｒ ｓｔｒａｉ
ｎ）（ＬＯ）を初代ウサギ腎細胞において３０℃で３６接種を行い、その後さら
に６接種を行うことによって得られた。その後の選択によりＬＣ１６ｍ０が温度
感受性及び培地−痘疹形成ウイルスとして得られた。ＬＣ１６ｍ８はＬＣ１６ｍ
０から天然痘形成性改変体としてクローン化された（例えばＳｕｇｉｍｏｔｏ、
Ｖａｃｃｉｎｅ １２巻、６７５−６８１ページ（１９９４）；Ｍｏｒｉｔａら
、Ｖａｃｃｉｎｅ ５巻６５−７０ページ（１９８７））。インビトロで連続接
種によってワクチンを開発したもう一つの例は、ワクシニアウイルスをトリ胚線
維芽細胞を５７０より多く接種させて、宿主制限的で、ヒト及びその他の哺乳動
物細胞では複製できない改変化ワクシニアウイルス（ＭＶＡ）を生成することで
ある。ＭＶＡは一般的天然痘ワクチン株とは異なり、正常であり、免疫抑制され
た動物では無毒性であり、副作用を生じない。ＭＶＡは少なくとも３０，０００
ｂｐのＤＮＡを欠失し、少なくとも２つの宿主域遺伝子が欠損している。
【０００５】 弱毒化ワクチンの開発のもう一つのアプローチは、毒性を与えることが知られ
ている遺伝子の特異的欠失である。例えばワクシニアウイルスの場合、下記の遺
伝子が欠失し、ウイルス表現型を変えている：ＴＫ、増殖因子、ヘマグルチニン
、１３．８ｋｂ分泌タンパク質、リボヌクレオチド還元酵素、エンベロープタン
パク質、ステロイド脱水素酵素、補体コントロールタンパク質、宿主域遺伝子（
Ｍｏｓｓ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔｒａｎｄ．８２巻：５５−６３ページ（１９
９４）；Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、Ｊ．Ｇｅｎ，Ｖｉｒｏｌ．７９巻、１１５９−
１１６７ページ（１９９８）；Ｃａｒｒｏｌｌ及びＭｏｓｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
２３８巻：１９８−２１１ページ（１９９７））。上述のＮＹＶＡＣベクター
の開発の例は、全ゲノムが配列決定され、関連遺伝子を正確に欠失したという点
で注目される。このためこれは、正確な変化が知られ、野生型からの隔たりが理
解された弱毒化ワクチンの構築物の例である。弱毒化株の遺伝変化のこのような
正確な描写は、より大きい細菌ゲノムよりも、ウイルスを用いた方が技術的に取
り組みやすいことは明らかである。同様に、必須の糖タンパク質（ｇＨ遺伝子）
が欠失したＨＳＶは、正常細胞において単一ラウンドの複製を受け得るが、この
感染から誘導されるウイルス粒子は非感染性である。それらはＤＩＳＣウイルス
（不能感染性単一サイクル）と呼ばれ、ｇＨ配列が欠失しているＨＳＶ−２の場
合に、生殖器ＨＳＶ−２感染のモルモットモデルにおいて感染に対し、及び原発
性疾患及び再発性疾患に対し防御することが証明された（Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌら
、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １７５巻：１６−２５ページ（１９９７））。
【０００６】 ウイルスゲノムへの特異的遺伝子の挿入は、弱毒化ワクチンを開発する別の方
法を提供する。例えばリンホカイン遺伝子をワクシニアのゲノムに挿入すると、
免疫性に影響を与えずに毒性を減らした。マウスまたはヒトＩＬ−２またはイン
ターフェロンγをワクシニアのゲノムに挿入すると、病原性は遥かにより低く、
免疫性は変化していないウイルスが得られる（Ｍｏｓｓ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓ
ｔａｎｄ．８２巻：５５−６３ページ（１９９４））。同様なアプローチは、ワ
クシニアウイルスのＬＯ株のＢ５Ｒ遺伝子をＬＣ１６ｍ８感染ＲＫ１３細胞に挿
入し、ＬＯＴＣウイルス株を誘導体化（ＬＯＴＣ−１〜５）することを含む。Ｂ
５Ｒ遺伝子はプラーク及び痘疹のサイズ及び宿主域に関係しており、ｐｓ／ｈｒ
遺伝子に相当する（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ、Ｖａｃｃｉｎｅ １２巻：６７５−６７
８ページ（１９９４））。
【０００７】 上記のいくつかの例では、既に弱毒化されたウイルスで明確な遺伝子変化が行
わているが、他の例、特に細菌性ワクチンの例では、弱毒化を授与する遺伝子損
傷の知識はほとんどまたは全くない。弱毒化の過程では、点変異、ＤＮＡ欠失及
び再配列を含む種々のタイプの遺伝子変化が発生することが推定される。これら
の弱毒化法はそれ自体では、弱毒化表現型を与える遺伝子変化の正確な性質を描
写しない。変異は、特徴づけられた化学的メカニズムを介して化学的またはＵＶ
照射で誘発されるとはいえ、現在の技術によっては変異の位置をコントロールす
ることはできない。変化させるゲノム部位の数もコントロールされずまたは特徴
づけられない。例えば変異誘発物質の濃度と表現型の変化程度との間に用量反応
関係があるとはいえ、弱毒化プロセスにおいて機能が破壊される遺伝子が１０な
のか、１００なのかは不明である。したがってこれらの変異誘発法はどの遺伝子
または抑制要素を改変するかをコントロールしない。細菌またはウイルスの全ゲ
ノムの配列決定が行われていない場合（最近まで、実際的または技術的実施の可
能性はない）、そのゲノムの変異／欠失／再配列の位置は不明である。したがっ
て弱毒化表現型は１つの毒性遺伝子及び毒性には無関係の多数のその他の遺伝子
における変化を反映するか、または１０の毒性遺伝子並びに毒性とは無関係の多
数のその他の遺伝子の変化を反映する可能性がある。このような場合、弱毒化遺
伝子型間の差の程度は遺伝的には非常に異なるが、表現型にはほとんど差が出な
いかもしれない。
【０００８】 現在の弱毒化法に関係するその他の問題としては、例えばワクチン接種を受け
た人において弱毒化生物が野生型表現型に復帰し、そのため重症疾患及び死を含
む病的状態が発生すること等がある。感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）のワク
チン株は、インビボでより毒性の強い株に復帰しやすい弱毒化ワクチンの一例で
ある（Ｈｐｋｉｎｓ及びＹｏｄｅｒ、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ． ３０巻：２２１−
３ページ（１９８６））。関連する問題は、弱毒化ワクチンを開発、製造及び配
布する数年または数十年の過程における上記弱毒化ワクチン生物の遺伝子変化の
安定性をモニターすることができないということである。何が変化したかを知ら
なければ、遺伝子型が流動的であるかどうか、上記生物が野生型表現型近くに復
帰しつつあるかどうかを確認することは不可能である。ワクチン製造者は標準プ
ロトコルによって弱毒化生物の表現型をモニターし、上記生物が標準的条件のも
とでは安定にみえることを確かめるが、このような方法は不正確であり、弱毒化
生物と野生型表現型とを分ける変異の数が減少していって、非常に少数の追加的
遺伝子型復帰が野生型表現型を与えるという場合にその数まで減ってしまうかど
うかを理解することはできない。弱毒化ワクチンを開発するためにこれまで使用
された方法のさらなる問題は、配列の喪失または変化による遺伝子変化による免
疫原性（これはワクチンを接種される人において所望免疫反応を引き出すために
重要である）の喪失である。
【０００９】 別の問題として、弱毒化ワクチンまたはワクチンベクターにおける複製能力の
保留が安全性の懸念を高める；特に、実質的に弱毒化したウイルスまたは細菌で
さえも病気を起こす免疫無防備状態のヒトまたは動物においてはなおさらである
。他方、複製能力の保留は、広いベースで長続きする免疫を刺激するためには有
益であり得る。このジレンマを解決する一つのアプローチは、ウイルスの疾病誘
発能力は排除するが、免疫能力は複製無能力（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｃ
ｏｍｐｅｔｅｎｔ）ウイルスまたは不活性化ウイルスに比較して効果的に高めら
れるようにそのウイルスに１ラウンドだけの複製を受けさせるように操作するこ
とである。一例は、不可欠なｇＨ遺伝子が欠失しているＨＳＶ−１またはＨＳＶ
−２ウイルスで例示されるような、ＤＩＳＣウイルスワクチン法である。生きて
いる弱毒化水痘ウイルスワクチンによる免疫によって誘発される潜伏帯状ヘルペ
スウイルスの再活性化は、弱毒化ワクチンの使用の別の欠点であるＧａｒｎｅｔ
ｔ及びＧｒｅｎｆｅｌｌ、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．１０８巻：５１
３−５２８ページ（１９９２））。
【００１０】 弱毒化ワクチンと関連する潜在的問題は重要であるとはいえ、上記弱毒化ワク
チンは、その他のワクチンがまだ使用できない感染症に対して有望であることを
示した。例えば国際的ＡＩＤＳワクチン イニシアチブレポートは、弱いＨＩＶ
株に感染した若干の人々は１２年以上も健康であったと報告している。弱めたＨ
ＩＶ菌株を保持する少なくとも一名は、その他のＨＩＶ菌株の複数回の被曝を防
ぐことに成功した。この研究結果は、幾つかの霊長類研究によって裏づけられて
いる。よって、ＡＩＤＳワクチンが非常に必要ならば、弱毒化ワクチンが現在非
常に注目される。しかしサルに感染させたＨＩＶ類似体ＳＩＶの弱毒化バージョ
ンを用いた最近の研究は、若干のサルが弱毒化ワクチンからＡＩＤＳにかかった
かもしれないことを見いだした。そこで、改良弱毒化ワクチンの必要性及びその
ようなワクチンを開発する方法の必要性が生まれる。本発明はこれらの及びその
他の必要性を満たすものである。
【００１１】 （発明の要旨） 本発明は弱毒化ワクチンを得る方法を提供する。上記ワクチンは治療的及び予
防的目的のために有用であり、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原性因子に対して
有効である。いくつかの実施形態では、この方法はウイルスまたは細胞の完全ま
たは部分的ゲノムライブラリーを含む一つ以上の核酸セグメントの第一セットを
、一つ以上の核酸セグメントの少なくとも一つの第二セットで組換えることを含
む。生成した組換え核酸フラグメントのライブラリーのメンバーを含むウイルス
類または細胞をその後スクリーニングして、宿主生物体中に存在する生理的条件
のもとで弱毒化されるものを確認する。例えば上記ウイルスまたは細胞類は、そ
れらが上記ウイルスまたは細胞の天然に存在する単離体よりも宿主生物体中でよ
り増殖しにくくおよび／または疾患をおこしにくいという点で「弱毒化」され得
る。
【００１２】 好ましい実施形態において、弱毒化ウイルスまたは細胞をスクリーニングして
、病原性因子に対して免疫反応を誘発することができ、弱毒化ウイルスまたは細
胞によってもあらわされる免疫原性決定基をあらわすものを確認する。免疫反応
を誘発し得る弱毒化ウイルスまたは細胞はその病原性因子に対する弱毒化ワクチ
ンとして有用である。
【００１３】 いくつかの実施形態において、これらの方法は、反復的組換え及びスクリーニ
ング／選択を実施することを含む。これは第一ラウンドの組換え及びスクリーニ
ング／選択で得られた弱毒化細胞またはウイルスからのポリヌクレオチドを、一
種類以上の核酸の別のセットで組換え、組換え核酸のもう一つのライブラリーを
形成することを含む。組換え核酸フラグメントの上記もう一つのライブラリーの
或るメンバーを含むウイルスまたは細胞類をスクリーニングし、宿主生物体中に
存在する生理的条件のもとでさらに弱毒化したウイルスまたは細胞を識別する。
上記組換え及び選択／スクリーニングを、生成した弱毒化ウイルスまたは細胞が
複製能力を失うかまたは宿主生物体中に存在する生理的条件のもとで病気をおこ
す能力を失うまで繰り返し得る。
【００１４】 これらのセットのうちの少なくとも一つのセットの核酸セグメントは、いくつ
かの実施形態において、非病原性ウイルス株または細胞株から得られる。このよ
うな場合、その他の核酸セグメントセットの少なくとも一つのセットは上記非病
原性株と同じ種であるかまたは異なる種である病原性因子から誘導されるのが一
般的である。一つ以上のセットの核酸セグメントは上記セグメントが由来する細
胞またはウイルスの完全なまたは実質的に完全なゲノムライブラリーを含むこと
ができ、または上記細胞またはウイルスの部分的ゲノムライブラリーであっても
よい。上記核酸セグメントは、病原性因子上に表される免疫原ポリペプチドの全
部または一部をコードするもの、またはワクチンによって誘起される免疫反応に
所望の影響を与える免疫調節分子または治療的タンパク質等のポリペプチドをコ
ードするものも含むことができる。
【００１５】 本発明の好ましい実施形態において、弱毒化ウイルスまたは細胞は戻し交配を
受け、不必要な変異を除去する。本発明による戻し交配は、組換え核酸のさらな
るライブラリーを形成するように、弱毒化ウイルスまたは細胞からの核酸を野生
型の、または天然に発生するウイルス株または細胞株からの核酸ライブラリーで
組換えることを含む。組換え核酸の上記もう一つのライブラリーのメンバーを含
むウイルスまたは細胞をその後スクリーニングし、接種された宿主生物体に存在
する生理的条件のもとで弱毒化されたままに留まる、戻し交配されたウイルスま
たは細胞を識別する。野生型株からの核酸ライブラリーはいくつかの実施形態で
は上記天然発生株の部分的または完全ゲノムライブラリーである。戻し交配した
弱毒化ウイルスまたは細胞をスクリーニングして、病原性因子に対して免疫反応
を誘発することができ、弱毒化ウイルスまたは細胞によってもあらわされる免疫
原性決定基をあらわすものを確認することもできる。戻し交配は所望ならば一回
以上繰り返すことができる。
【００１６】 上記方法は弱毒化ウイルスまたは細胞をスクリーニングして、弱毒化ウイルス
または細胞の産生のために用いられる、複製を許容する条件のもとでは増殖する
が、接種された宿主生物体内では顕著には増殖しないものを確認することも含む
ことができる。産生のために用いられる複製可能の条件は、例えば温度、ｐＨ、
糖含有量、易感染性免疫系、補体または補体成分の欠如、及び血清タンパク質の
在不在において、宿主内の生理的条件とは異なることができる。
【００１７】 いくつかの実施形態において、弱毒化ワクチンの産生に用いられる複製可能条
件は、弱毒化ウイルスまたは細胞のゲノムに挿入された非天然発生性終止コドン
における翻訳の終止を抑制し得るサプレッサーｔＲＮＡ分子の存在である。組換
えを受ける核酸セグメントは、ウイルスまたは細胞の複製または病原性に関係す
るポリペプチドの全てまたは部分をコードする一つ以上のポリヌクレオチドを含
む。上記ポリペプチド−コーディング ポリヌクレオチド類は或るウイルスまた
は細胞の完全または部分的ゲノムライブラリー内に含まれ得る。上記ポリペプチ
ドのコーディング配列内に点在する一つ以上の終止コドンを有するオリゴヌクレ
オチドの集団もこの組換えに含まれる。上記オリゴヌクレオチドはポリペプチド
−コーディング ポリヌクレオチドによる組換えを受けて組換え核酸のライブラ
リーを形成する。上記核酸では複製ポリペプチドのコーディング配列内に少なく
とも一つの非天然発生性終止コドンが点在する。弱毒化ウイルスまたは細胞は、
組換え核酸フラグメントのライブラリーを、非天然発生性終止コドンにおける翻
訳終止を抑制するサプレッサーｔＲＮＡ分子と接触させ、サプレッサーｔＲＮＡ
分子の存在下では増殖するがサプレッサーｔＲＮＡ分子が存在しないと増殖しな
い子孫ウイルスまたは細胞を集めることによって得られる。
【００１８】 本発明は、核酸フラグメントのライブラリーを複数の細胞に導入し、それによ
って上記フラグメントの少なくとも一つが上記細胞のゲノムまたはエピソームの
セグメントによって組換えられ、改変細胞を産生するというやり方で弱毒化ワク
チンを得る方法も提供する。改変細胞をスクリーニングし、宿主生物体に見いだ
される生理的条件のもとで増殖する能力を失う方向に変化した条件つき欠陥細胞
を確認する。条件付き欠陥細胞は、それはそれでスクリーニングされ、弱毒化ワ
クチン産生のために用いられる複製可能条件下では複製する能力を維持する改変
された細胞を確認する。複製が許容される条件下では複製するが宿主哺乳動物で
は複製しない条件つき欠陥細胞が弱毒化ワクチン生物として適切に使用できる。
【００１９】 その他の実施形態において、本発明はキメラ弱毒化ワクチンの製法も提供する
。これらの方法は概ねウイルスまたは細胞からの一つ以上の核酸セグメントの第
一のセットを一つ以上の核酸セグメントの少なくとも一つの第二セットで組換え
ることを含む。一般に、上記第二セットの核酸セグメントは、上記核酸セグメン
トを含むウイルスまたは細胞に、ワクチン接種（予防接種）のために望ましい特
性を与える。組換えＤＮＡフラグメントのライブラリーがこうして形成される。
その後、組換えＤＮＡフラグメントのライブラリーのメンバーを含むウイルスま
たは細胞をスクリーニングして、上記ウイルスまたは細胞を接種した宿主生物体
に存在する生理的条件のもとで弱毒化されているウイルスまたは細胞を確認する
ことによって、弱毒化ウイルスまたは細胞を確認する。上記弱毒化ウイルスまた
は細胞をその後スクリーニングし、ワクチン接種のために望ましい特性が改良さ
れているものを確認する。上記スクリーニングはいかなる順序で行ってもよい。
【００２０】 幾つかの実施形態において、核酸セグメントのセットの少なくとも一つはウイ
ルスまたは細胞の部分的または実質的に完全なゲノムライブラリーである。例え
ば一つのセットは病原性ウイルスまたは細胞からのものであり、他のセットはウ
イルスまたは細胞の非病原性単離体からのものである。これらの病原性及び非病
原性単離体は同じ種でも異なる種でもよい。
【００２１】 いくつかの実施形態において、組換えは、第二セットの核酸セグメントを複数
の非病原性細胞に導入することによって行われる。核酸セグメントの第二セット
の少なくとも一つのメンバーは非病原性細胞のゲノムまたはエピソーム内のセグ
メントによる組換えを受け、改変細胞を生成する。上記改変細胞をその後スクリ
ーニングし、非病原性で、ワクチン接種のために望ましい特性が改良された弱毒
化キメラ細胞を確認する。
【００２２】 いくつかの実施形態において、キメラワクチンを得る方法は、反復する組換え
及びスクリーニングを含む。例えば、弱毒化キメラ細胞またはウイルスからの核
酸を別のセットの核酸セグメントで組換えて、別の組換え核酸ライブラリーを形
成する。弱毒化の、またはワクチン接種のために望ましい特性のさらなる改良を
示す弱毒化キメラウイルスまたは細胞を確認するためには、上記別の組換えＤＮ
Ａフラグメントライブラリーのメンバーを含むウイルスまたは細胞をスクリーニ
ングし、改良された弱毒化または所望特性を示すものを確認する。組換え及びス
クリーニングは、弱毒化キメラウイルスまたは細胞の病原性喪失またはワクチン
接種のために望ましい特性の改良が所望レベルに到達するまで、所望通り一回以
上繰り返される。
【００２３】 本発明は、本明細書に記載された方法を用いて産生される弱毒化及びキメラウ
イルス及び細胞も提供する。ワクチン組成物及び本発明のワクチン組成物を使用
してワクチン接種する方法も提供される。
【００２４】 （詳細な説明） （定義） 「病原性因子」とは宿主細胞に感染しうる生物またはウイルスを指す。病原性
因子は一般的には感染した細胞または生物に疾患またはその他の不都合な効果を
誘発し得る。病原性因子には例えばウイルス、細菌、真菌、寄生虫等がある。用
語「ウイルス」は完全ウイルス粒子だけでなく、一つ以上のウイルスポリペプチ
ドを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）も含める。
【００２５】 用語「弱毒化」は、ウイルスまたは細胞に関して使用する場合、上記ウイルス
または細胞が生物に感染した際にその増殖能力および／または疾患またはその他
の不都合な効果を誘発する能力の一部または全てを失っていることを意味する。
例えば「弱毒化」ウイルスまたは細胞は、上記弱毒化ウイルスまたは細胞の野生
型またはその他の病原性変異体が複製し得る生体内において、全く複製し得ない
かまたは１または数ラウンドの複製に限られる。或いは、または追加的に、「弱
毒化」ウイルスまたは細胞はウイルスまたは細胞の病原性に関係する一遺伝子ま
たは複数遺伝子に一つ以上の変異を有するかも知れない。
【００２６】 「宿主生物体」とは、本発明の弱毒化及びキメラワクチンのワクチン接種の標
的である動物を言う。このような宿主生物体は免疫原の接種に反応する免疫系を
有する。適切な宿主生物体には例えばヒト、家畜、鳥、及び治療的または予防的
目的でワクチン接種することが望まれるその他の動物がある。
【００２７】 本明細書において使用される用語「ワクチン」とは、宿主生物体に接種した際
、病原性因子に対する完全または部分的免疫を誘起し得るか、または病原性因子
に関連した疾患の効果を軽減することができる免疫原をいう。ワクチンはまた、
病原性物質と関連した疾患以外の免疫系障害（例えば、自己免疫状態）を緩和す
るためにも有用である。
【００２８】 用語「スクリーニング」とは概して、弱毒化のような最適特性を有するワクチ
ンを同定するプロセスをいう。選択は、弱毒化ワクチンの同定および物理的分離
が同時に達せられる形態のスクリーニングである。例えば、選択マーカーの発現
（それはある遺伝的環境において、他の細胞が死ぬ間、細胞に生き残るマーカー
を発現させる（またはこの逆））を選択法として使用することができる。スクリ
ーニングマーカーには、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよび
グリーン蛍光タンパク質、または発現すると容易に検出される他の遺伝子産物を
発現する遺伝子類がある。選択マーカーには例えば、薬剤および毒素耐性遺伝子
が包含される。一次免疫反応のインビトロ研究には制限があることから、インビ
ボ研究が特に有用なスクリーニング法である。これらの研究において、推定のワ
クチンを試験動物に導入し、その後防御免疫反応を分析するか、または誘起され
た免疫反応の質または強度を例えば免疫動物に由来するリンパ系細胞を用いて調
べることによって免疫反応を研究する。自然の進化過程において自然淘汰が起こ
り得るし、実際起きるが、本発明の方法において選択は人為的に行われる。
【００２９】 ここに用いる「外因性ＤＮＡセグメント」、「異種配列」または「異種核酸」
は、特定の宿主細胞にとって外来供給源に由来するもの、または同じ供給源の場
合、そのもとの形態から変化しているものである。従って宿主細胞における異種
遺伝子には、上記特定の宿主細胞に対しては内因性であるが改変されたものが含
まれる。本明細書において記載される適用における異種配列の改変は、代表的に
はＤＮＡシャッフリングの使用中に起こる。従って、この用語は細胞にとって外
来もしくは異種であるＤＮＡセグメント、または細胞に対して同種であるが、宿
主細胞核酸内の、本来上記エレメントが見いだされない位置にあるＤＮＡセグメ
ントをいう。外因性ＤＮＡセグメント類は発現されると外因性ポリペプチドを与
える。
【００３０】 用語「遺伝子」は、広義で用いられて、生物学的機能と関連するＤＮＡの任意
のセグメントをいう。例えば、遺伝子はコード配列および／またはそれらの発現
のために必要な調節配列を含む。遺伝子はまた、例えば他のタンパク質の認識配
列を形成する発現されないＤＮＡセグメントも含む。遺伝子は、関心とする供給
源からクローン化するか、または公知のもしくは推定の配列情報から合成するこ
とを含む、種々の供給源から得ることができ、そして所望のパラメーターを有す
るように設計された配列も含むことができる。
【００３１】 用語「単離された（る）」とは、核酸またはタンパク質に適用される場合、上
記核酸またはタンパク質が、その天然の状態において付随する他の細胞成分を実
質的に含まないことを意味する。それは乾燥状態でも水溶液でもよいが、均質状
態であるのが好ましい。純度および均質性は代表的には、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学的方法を用いて
決められる。試料中に存在する主要な種であるタンパク質が実質的に精製される
。より詳細に述べれば、単離された遺伝子を、その遺伝子に側面に接する（flan
k)、関心とする遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレ
ームから分離する。用語「精製された（る）」は、核酸またはタンパク質が電気
泳動ゲル上で実質的に一つのバンドを与えることを意味する。特に、より詳細に
述べれば上記核酸またはタンパク質が少なくとも約５０％、より好ましくは少な
くとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９９％純粋であることを意味する
。
【００３２】 用語「天然に存在する」とは、天然に見いだされる対象物を、ヒトが人工的に
生産するものと区別して述べるために用いられる。例えば、天然における供給源
から単離され得、そして研究室で人によって意図的に改変されていない生物体、
または生物体中（ウイルス、細菌、原生動物、昆虫、植物または哺乳動物組織）
に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列が、天然に発生するもの
である。
【００３３】 用語「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌク
レオチドまたはリボヌクレオチドおよびこれらのポリマー類をいう。特に制限さ
れない限り、この用語は標準核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌク
レオチド類と同様にして代謝される、公知の天然ヌクレオチド類似体を含む核酸
を包含する。特に記載のない限り、ある特定の核酸配列は、暗示的に保存的に改
変されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明
示的に指示された配列も含む。詳細には、縮重コドン置換は、一つ以上の選択さ
れた（または全ての）コドンの第三の位置が混合塩基および／またはデオキシイ
ノシン残基で置換されている配列を作製することによって実現することができる
（Batzerら（１９９１））Nucleic Acid Res.１９巻：５０８１ページ；Otsuka
ら（１９８５）J.Biol.Chem.２６０巻：２６０５−２６０８ページ；Cassolら（
１９９２）；Rossoliniら（１９９４）Mol.Cell.Probes ８巻：９１−９８ペー
ジ）。用語「核酸」は、遺伝子、遺伝子によってコードされる、ｃＤＮＡ、およ
びｍＲＮＡと交換可能に用いられる。
【００３４】 「遺伝子に由来する核酸」とは、その核酸の合成のために、その遺伝子または
そのサブ配列が最終的にテンプレートとして役立っているという核酸をいう。従
って、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写さ
れたＲＮＡ、上記ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、上記増幅されたＤＮＡから転
写されたＲＮＡなどは全て上記遺伝子に由来し、このように由来する産物の検出
は、サンプル中の元々の（オリジナル）遺伝子および／または遺伝子転写物の存
在および／または量の指標である。
【００３５】 核酸は、別の核酸配列と機能的関係に配置されているとき「作動可能に連結す
る」。例えばプロモーターまたはエンハンサーは、もしもそれがコード配列の転
写を高めるならば、そのコード配列に作動可能に連結されている。「作動可能に
連結される」とは、結合するＤＮＡ配列が、代表的には連続しており、そして２
つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合には、連続かつインフレー
ムであることを意味する。しかしエンハンサーが概してプロモーターから数キロ
ベース離れる場合に機能し、そしてイントロン配列の長さが可変であり得ること
から、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは機能的に結合され得るが、連続
していなくてもよい。
【００３６】 二つの分子（例えば、リガンドおよびリセプター）の間の特異的結合親和性と
は、分子の混合物中においてある分子が別の分子に優先的に結合することを意味
する。結合親和性が約１×１０4Ｍ-1〜約１×１０6Ｍ-1またはそれを超える場合
、これら分子の結合は特異的と考えることができる。
【００３７】 用語「組換え」は、細胞またはウイルスに関して用いる場合は、上記細胞また
はそのウイルスに感染したある細胞が異種核酸を複製し、または異種核酸によっ
てコードされるペプチドまたはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞お
よびウイルス類はその細胞またはウイルスの天然型（非組換え）には見出されな
い遺伝子を含み得る。組換え細胞およびウイルスはまた、その細胞またはウイル
スの天然型に見出される遺伝子であって、その遺伝子は人工的手段によって改変
されかつその細胞に再導入された、遺伝子も含み得る。上記用語はまた、細胞か
ら核酸を取り出すことなく改変された、上記細胞にとって内因性である核酸を含
む細胞類およびウイルス類も含む；このような改変としは、遺伝子の置換、部位
特異的変異および関連技術によって行われるものが挙げられる。
【００３８】 「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」は、そのような配列と適
合する宿主において構造遺伝子を発現させ得る核酸エレメントを含む、組換え技
術的、または合成的に作製された核酸構成物である。発現カセットは、少なくと
もプロモーターを含み、必要に応じて転写終止シグナルを含む。代表的には、組
換え発現カセットには転写される核酸（例えば所望のポリペプチドをコードする
核酸）およびプロモーターが含まれる。発現させるために必要なまたは役立つあ
らなる因子もまた、本明細書に記載のように使用され得る。例えば発現カセット
はまた、発現されるタンパク質の宿主細胞からの分泌を指向するシグナル配列を
コードするヌクレオチド配列も含むことができる。転写終止シグナル、エンハン
サー、および遺伝子発現に影響する他の核酸配列もまた、発現カセットに含むこ
とができる。
【００３９】 用語「同一の」またはパーセント「同一性」は、二つ以上の核酸またはポリペ
プチド配列の範囲で、最大対応について比較および整列させたときに、下記の配
列比較アルゴリズムの一つを用い、または目視検査によって測定して、同一であ
る二つ以上の配列またはサブ配列、または同一であるアミノ酸残基またはヌクレ
オチドの特定のパーセントを有する二つ以上の配列またはサブ配列についていう
。
【００４０】 用語「実質的に同一」は、二つの核酸またはポリペプチドの文脈において、最
大対応を得るように比較、整列させた際に、下記の配列比較アルゴリズムの一つ
を用い、または目視検査によって測定して、最低６０パーセント、好ましくは８
０％、最も好ましくは９０−９５％ヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有
する二つ以上の配列またはサブ配列についていう。少なくとも約５０残基長さの
領域、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたって実質的に同一で
あるのが好ましく、配列が少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一であ
るのが最も好ましい。最も好ましい実施形態においては、配列はコード領域の全
長にわたって実質的に同一である。
【００４１】 配列の比較のためには、代表的には、一つの配列を標準配列として、それと試
験配列とを比較する。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験配列および標準
配列はコンピューターに入力され、必要ならばサブ配列対応物が指定され、そし
て配列アルゴリズムプログラムパラメータが示される。次いで、配列比較アルゴ
リズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、試験配列のパーセント
配列同一性を標準配列に対して計算する。
【００４２】 比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔ
ｅｒｍａｎの局部的相同性アルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２巻：
４８２ページ（１９８１））によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈの相
同性アラインメントアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３ペー
ジ（１９７０））によって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎの類似性検索法（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５巻：２４４４（１９８８
））によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Ｗｉｓｃｏ
ｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，のＧＡＰ、
ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍ
ｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、
ＷＩ）によって、または目視検査によって（概ねＡｕｓｕｂｅｌら、下記参照）
行うことができる。 パーセント配列同一性および配列類似性の測定のために適したアルゴリズムの
一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムである。これはＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３−４１０ページ（１９９０）に記載されている。
ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅ
ｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ
：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から一般に手に入る。こ
のアルゴリズムは、データベースの配列の同じ長さのワードと整列させたときに
、あるポジティブ値の域スコアＴにマッチするかまたはそれを満足させる、クエ
リ配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）中の長さＷの短いワードを同定するこ
とによって、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは
近隣ワードスコア閾値と言われる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、同上）。これらの最初
の近隣ワードヒットは、検索を開始してそれらを含むより長いＨＳＰを見いだす
ためのシードとして機能する。ワードヒットはその後、累積的アラインメントス
コアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に広がる。累積的スコアは、ヌク
レオチド配列の場合、パラメータＭ（対合する残基の一対のためのリウォードス
コア（ｒｅｗａｒｄ ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のた
めのペナルティー スコア；常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列の場合
、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向のワードヒ
ットの延長が停止するのは次の場合である：上記累積アラインメントスコアがそ
の最大実現値から量Ｘだけ離れた場合；一つ以上のマイナススコアの残基アライ
ンメントのために、累積スコアがゼロまたはそれ以下になったとき；またはどち
らかの配列の終端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、お
よびＸはアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム
（ヌクレオチド配列の場合）は既定値として、ワード長さ（Ｗ）１１、期待値（
Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。
アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは既定値として、ワード長さ（Ｗ
）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリックス
を用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９巻：１０９１５を参照）。 パーセント配列同一性の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類
似性の統計学的分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９
３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０巻：５８７３−
５７８７ページ）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の一つの
尺度は最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。それは２つのヌクレオチドまたはアミノ
酸配列間の対合が偶然起きる確率の指標である。例えば、標準核酸に対する比較
における試験核酸の最小和確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満
、最も好ましくは約０．００１未満である場合、その核酸は標準配列に類似して
いると考える。 ２つの核酸配列が実質上同一であることを示すその他の指標は、それら２つの
分子がストリンジェント条件下でハイブリダイズすることである。語句「〜に特
異的にハイブリダイズする」は、分子がストリンジェント条件下で特定のヌクレ
オチド配列だけに結合、二重鎖形成またはハイブリダイズする（上記配列が複雑
な混合物（例えば全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合）ことをいう。
「実質的に結合する」は、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的ハイブリダイ
ゼーションを指し、標的ポリヌクレオチドを所望通り検出するためにハイブリダ
イゼーション培地のストリンジェンシーを減らすことによって適応させ得るわず
かのミスマッチを含む。
【００４３】 サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイゼー
ション実験の範囲で「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」および「
ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性で、異なる環
境パラメーターのもとでは種々異なる。より長い配列はより高温で特異的にハイ
ブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの大規模な指針は、Ｔｉｊｓｓ
ｅｎ（１９９３）のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ「核酸プ
ローブとのハイブリダイゼーションＩ部、２章“ハイブリダイゼーション原理の
概論および核酸プローブアッセイの戦略」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋに見いだされる。概して高ストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗
浄条件は決められたイオン強度およびｐＨで、特異的配列の融点（Ｔm）より約
５℃低く選択される。一般に「ストリンジェント条件」のもとではプローブはそ
の標的サブ配列にはハイブリダイズするがその他の配列にはハイブリダイズしな
い。
【００４４】 Ｔmは標的配列の５０パーセントが完全に対合するプローブにハイブリダイズ
する温度（決められたイオン強度およびｐＨにおいて）である。非常にストリン
ジェントな条件は特定プローブのＴmに等しいように選択される。サザンおよび
ノーザンブロットにおけるフィルター上に１００より多い相補的残基を有する相
補的核酸のためのストリンジェントハイブリダイゼーションの例は、ヘパリン１
ｍｇを含む５０％ホルムアミド、４０℃で、ハイブリダイゼーションが一晩行わ
れる。高度にストリンジェントな洗浄条件の一例は０．１５Ｍ ＮａＣｌ、７２
℃、約１５分である。ストリンジェント洗浄条件の一例は０．２ｘ ＳＳＣ洗浄
、６５℃、１５分である（ＳＳＣ緩衝液の説明はＳａｍｂｒｏｏｋ（下記）参照
）。しばしば、高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を行
ってバックグラウンドプローブシグナルが除去される。例えば１００ヌクレオチ
ドより大きい二重鎖のための中程度ストリンジェンシー洗浄の一例は１ｘＳＳＣ
、４５℃、１５分である。例えば１００ヌクレオチドより大きい二重鎖のための
低ストリンジェンシー洗浄の一例は、４−６×ＳＳＣ、４０℃、１５分である。
短いプローブ（例えば約１０−５０ヌクレオチド等）では、ストリンジェント条
件はｐＨ７．０ないし８．３で一般的に約１．０Ｍ未満のＮａイオン、典型的に
は約０．０１ないし１．０ＭのＮａイオン濃度（またはその他の塩類）の塩濃度
が関係し、温度は一般的には最低約３０℃である。ストリンジェント条件はホル
ムアミドのような不安定化剤の添加によっても実現できる。概して、特定のハイ
ブリダイゼーションアッセイにおける無関係プローブで認められるものの２倍（
またはそれ以上）のシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検
出を示唆する。ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズしない核酸でも
なお、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、実質的に同
一である。これは例えば、遺伝暗号によって複製が許容される最大コドン縮重を
用いて核酸のコピーが作られる場合に起きる。
【００４５】 ２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのその他の指標
は、第一の核酸によってコードされるポリペプチドが、第二の核酸によってコー
ドされるポリペプチドと免疫学的に交差反応し、または特異的に結合することで
ある。こうして、例えば２つのペプチドにおいて保存的置換だけが異なる場合に
は、一般的に一つのポリペプチドは第二のポリペプチドに実質的に同一である。
【００４６】 用語「抗体に特異的に（または選択的に）結合する」または「〜との特異的（
選択的）免疫反応」とは、タンパク質またはペプチドに関する場合には、タンパ
ク質類またはその他の生物学的物質類の異種集団の存在下で上記タンパク質の存
在を決定することができる結合反応をいう。従って、指示されたイムノアッセイ
条件下で、特異的抗体類は特定のタンパク質に結合し、サンプル中に存在するそ
の他のタンパク質に多量には結合しない。そのような条件下での抗体への特異的
結合は、特定のタンパク質に関するその特異性について選択される抗体を必要と
し得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドのいずれかによってコードされるア
ミノ酸配列を有するタンパク質に対して生成した抗体を選択し、そのタンパク質
とは特異的に免疫反応するが、多型性改変体を除く他のタンパク質とは免疫反応
しない抗体を得ることができる。種々のイムノアッセイフォーマットを用いて特
定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、
固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、ウェスタンブロット、または免疫組織化学は、
あるタンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために日
常的に用いられている。特異的免疫反応性を決定するために用いることができる
イムノアッセイフォーマットの説明には、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８
８）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、
ＣＯＬＤ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ「ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ」）、を参照されたい。一般的には特
異的または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの最低２倍、
より代表的にはバックグラウンドの１０〜１００倍を超える。
【００４７】 特定のポリヌクレオチド配列の「保存的に改変された変異」とは、同一のまた
は実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド類をいい、または
上記ポリヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合は、実質的に同一の配
列をいう。遺伝暗号の縮重のために、多数の機能的に同一の核酸がある所与のポ
リペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、Ａ
ＧＡ、およびＡＧＧ全てがアミノ酸アルギニンをコードする。このため、アルギ
ニンがコドンによって特定されるあらゆる位置において、そのコドンは上記のコ
ードされたポリペプチドを変化させずに、対応する上記コドンのいずれかに変る
ことができる。このような核酸改変は、「保存的に改変された改変」の一種であ
る「サイレント改変」である。ポリペプチドをコードする本明細書に記載のあら
ゆるポリヌクレオチド配列は、別に記載された場合を除き、考えられるあらゆる
サイレント改変を説明する。当業者は、核酸中の各コドン（ＡＵＧを除く、これ
は通常、メチオニンのための唯一のコドンである）は改変され、標準的な方法に
よって機能的同一分子を与え得ることを理解する。よって、ポリヌクレオチドを
コードする核酸の各「サイレント改変」は各記載される配列に必然的に含まれる
。
【００４８】 さらに、当業者は、コードされた配列における単一アミノ酸または低パーセン
トのアミノ酸（代表的には５％未満、より代表的には１％未満）を変化させ、付
加または決失させる個々の置換、欠失または付加は、「保存的に改変された改変
」であり、この場合これらの変化の結果、あるアミノ酸が化学的に類似のアミノ
酸によって置換されることも理解する。機能的に類似のアミノ酸をもたらす保存
的置換テーブルは当業者には公知である。例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４
）、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ
を参照されたい。さらに、あるコードされた配列の、単一アミノ酸または低パー
セントのアミノ酸の変化、付加、または決失をもたらす個々の置換、決失または
付加も「保存的に改変された改変」である。
【００４９】 「サブ配列」とは、それぞれ核酸またはアミノ酸のより長い配列（例えばポリ
ペプチド）の一部を含む、核酸またはアミノ酸の配列をいう。
【００５０】 （好ましい実施形態の説明） 本発明は弱毒化ワクチン開発の新しいアプローチを提供する。このアプローチ
は特にＤＮＡシャッフリング等の方法を用いる進化をベースにしたものであり、
弱毒化ワクチンの開発には最適である。ＤＮＡシャッフリングは反復組換えおよ
び変異のプロセスであり、関連ＤＮＡ配列のランダム断片化およびそれに続く無
プライマーＰＣＲによる上記フラグメント類の再アセンブリによって行われる。
天然の進化のように、この方法はＤＮＡ配列の欠失、挿入、反転および点変異を
利用して組換え配列の大プールを形成し、そこから、改良された機能探索に基づ
くスクリーニングまたは選択によって、特定の目的に最適のものが同定される。
さらなる改良が所望される場合、最適化された核酸に対して新たなラウンドのシ
ャッフリングおよび選択を行う。ＤＮＡシャッフリングは、同種ＤＮＡ配列の大
規模ライブラリーを作成するための最も効率的な公知の方法であり、特に弱毒化
ワクチンの開発に関して言えば、ＤＮＡシャッフリングはウイルス、細菌および
他の病原体等の生物全体にも適用できる。
【００５１】 このような組換え／スクリーニング法を使用して弱毒化ワクチンを作製するこ
とは、従来使用してきた方法にまさる顕著な利点を提供する。一般に、病原性を
減らし得、一方、細胞または培地の製造において、ワクチンウイルスの複製も他
の生物の複製も妨げず、ワクチン生物が宿主細胞において防御免疫応答を誘導す
る能力も妨げない特定の変異については、ほとんど情報が利用可能ではない。本
発明の方法は、弱毒化、または複製および病原性を調節するメカニズムに関する
これまでの仮説に基づく証拠を全て排除することによって、この障害を克服する
。本発明の組換えおよびスクリーニング／選択法は簡単に実施することができ、
所望特性を有する弱毒化ワクチンを得ることができる。
【００５２】 その上、誘発を含む方法等、従来の方法で得られる弱毒化ワクチンは、概して
毒性に関係する遺伝子およびその他の遺伝子両方に、多くの広範囲のタイプの変
異を有する。例えば、弱毒化ワクチンの開発のために化学的または紫外線照射に
よる変異誘発を利用した場合、病原性遺伝子における変異を得るために、病原性
に関係しない遺伝子のどのくらい多くが変異をおこすかについての情報が提供さ
れない。これは細菌性ワクチンの場合特にそうである。弱毒化ワクチンの効果は
、ワクチンを接種された宿主において免疫原を保持した特定の抗原類の存在に依
存するから、できるだけ多くの野生型アミノ酸配列を保持することが望ましい。
従って、これらの抗原をコードする遺伝子に、これまで使用した弱毒化法で変異
を導入すると、上記ワクチンの免疫原性が低下し得る。
【００５３】 この問題は、弱毒化をおこすための、一般にはたった一つのまたは数箇所の変
異を有する弱毒化ワクチンを提供する本発明によって回避される。ここで好まし
い実施形態において、本発明を用いて得られる組換えワクチンは分子戻し交配（
ｂａｃｋｃｒｏｓｓｉｎｇ）にかけられる。これにより、弱毒化を与えることが
できる変異遺伝子（単数または複数）を親ゲノムまたは野生型ゲノムに戻すこと
ができ、これによって、所望の進化した弱毒化表現型に重要なこのような少ない
変異は保持され、弱毒化とは関係のない変異の少なくとも若干が排除される。こ
のように、戻し交配を用いて防御免疫反応の誘発にとって重要な野生型微生物か
らの配列を保持し、一方ワクチン微生物の弱毒化表現型に責任のある変異遺伝子
を保持することもできる。戻し交配を用いて所望表現型に重要である変異を確認
することもできる。
【００５４】 現在の弱毒化法と関連するその他の問題も本発明の方法及び弱毒化ワクチンに
よって回避される。例えば、本発明の方法は、以前利用可能な方法を使用して調
製される弱毒化ワクチンでよく起きる、ワクチン接種受容者における弱毒化微生
物からの野生型の疾患誘起性表現型への逆転を著しく軽減しまたは排除し得る。
その上、本発明の方法を用いて得られる弱毒化ワクチンは、よく特徴づけられた
変異を有し得るので、そのワクチンの開発、製造及び配布の過程での弱毒化ワク
チン生物における遺伝的変化の安定性を多年または数十年にわたってモニターし
得る。このため、本発明は、以前に利用可能な弱毒化ワクチンと関連する潜在的
問題を誘発せずに、病原性因子に対する免疫応答を誘発する改善された能力を有
する弱毒化ワクチンを入手し得る手段を提供する。
【００５５】 （Ｉ．弱毒化ワクチン進化への一般的アプローチ） 本発明の弱毒化ワクチンは先ず最初に組換え核酸のライブラリーを作製するこ
とによって作製される。上記ライブラリーは、核酸の二つ以上の改変形態を組換
えて、組換え核酸ライブラリーを作製することによって作製される。上記ライブ
ラリーをその後スクリーニングして潜在的ワクチンウイルスまたはその他の生物
の弱毒化を生じる変異を含む組換え核酸を同定する。例えば、組換え核酸は、通
常は病原性である生物を非病原性にする一つ以上の変異を含み得る。重要なのは
、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物またはその他の病原体の完全または部分的ゲ
ノムが断片化され、本発明の組換え及びスクリーニング法を受け得ることである
。単独の遺伝子またはその他の核酸フラグメントも、それだけで、またはウイル
スまたは生物の完全または部分ゲノムと組み合わせてのいずれかで、この組換え
及びスクリーニング法を受け得る。病原性を調節する重要な遺伝子が公知である
場合には、単独の病原体遺伝子の組換え及び選択は有用である。例えば、天然宿
主細胞への結合をおこすタンパク質が公知である場合には単一遺伝子シャッフリ
ングが有用である。全ゲノムシャッフリングは、例えばそのゲノムが比較的小さ
く、弱毒化を起こす重要な配列がほとんど知られていない場合に特に有用である
。
【００５６】 スクリーニングまたは選択のための組換え核酸ライブラリーを作製し得る多数
の種々のフォーマットが利用可能である。幾つかの実施形態において、本発明の
方法は、組換え（「シャッフリング」または「配列組換え」）及びスクリーニン
グまたは選択を行い、個々の遺伝子、全プラスミドまたはウイルス、多重遺伝子
クラスター、または全ゲノムさえもを「進化」させることを伴う（ステマー（Ｓ
ｔｅｍｍｅｒ）（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３巻、５４９−
５５３ページ；ＰＣＴ ＵＳ９８／００８５２；１９８８年７月１５日に提出さ
れた米国特許出願第０９／１１６，１８８号）。組換え及びスクリーニング／選
択の反復サイクルが行われ、関心とする核酸をさらに進化させ得る。このような
技術は、ポリペプチド工学のための従来の方法において要求される膨大な分析及
び計算を必要としない。シャッフリングは、伝統的な対合組換え事象（例えば、
性複製において起こるような）に比較して、最小数の選択サイクルで多数の変異
の組換えを可能にする。このように、本明細書に記載の配列組換え技術は、いか
なる変異の間にも、または全ての変異間にも組換えを提供し、それによって変異
の種々の組み合わせが、所望結果に影響し得る仕方を探索する非常に速い方法を
提供するという点で、特別な有益性を提供する。しかし、いくつかの場合、配列
組換えには必要ないが、この技術を改良する機会を提供する構造および／または
機能的情報が利用可能である。
【００５７】 配列組換えは以下により詳細に説明するように、多くの異なるフォーマットで
、及びフォーマットの変更によって実現し得る。これらのフォーマットは幾つか
の共通の原理を共有する。互いに対していくらかの配列同一性は有するが、変異
の存在は異なる核酸分子群が組換えの基質として代表的に用いられる。いかなる
与えられたサイクルにおいても、組換えはインビボまたはインビトロで、細胞内
または細胞外で起こり得る。さらに、組換えにより生ずる多様性は、組換えの基
質または生成物のいずれかにその他の変異誘発法（例えば、誤りがちな（ｅｒｒ
ｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲまたはカセット変異誘発）を適用することによって、
あらゆるサイクルで増強され得る。いくつかの場合、新しいまたは改良された性
質または特性が、一回のインビボまたはインビトロ組換えサイクル後に達成され
得る。それは、その配列の異なる改変形態を用いる場合（或る生物体の異なる個
体または株からのホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｓ）のような）または同じ生物体か
らの関連配列を用いる場合（対立変異のような）等である。しかし、組換え及び
選択／スクリーニングの連続サイクルを必要とする反復性配列組換えはさらなる
改善を生じ得る。
【００５８】 ＤＮＡシャッフリング法は少なくとも四種類の異なるアプローチの一つ以上を
含み、さもなくば病原性であるワクチン候補物質の弱毒化を改善し得、かつワク
チンのために関心とするその他の特性（例えば免疫原性の増加）を改善する。第
一に、ＤＮＡシャッフリングは単独遺伝子で行い得る。第二に、数種類の高度に
相同性である遺伝子が、公知の相同遺伝子との配列比較によって同定され得る。
これらの遺伝子は合成され、ホモログファミリーとしてシャッフリングされ、所
望活性を有する組換え体を選択し得る。この“ファミリーシャッフリング”法は
図１に図式的に示される。シャッフルされた遺伝子は適切な宿主細胞に導入され
得る。これらには大腸菌、酵母、植物、真菌、動物細胞等が含まれ、所望特性を
有するものは、本明細書に記載の方法によって同定され得る。第三に、全ゲノム
シャッフリングを行い、病原性に関係する遺伝子をシャッフリングし（その他の
ゲノム核酸と共に）、生物体の病原性を軽減または排除する変異病原性遺伝子を
入手し得る。全ゲノムシャッフリングアプローチでは、どの遺伝子がシャッフル
されているかを同定することすら必要ない。その代わり、例えば細菌細胞または
ウイルスゲノム類を合わせ、シャッフリングし、本明細書中に記載のいずれかの
アッセイで測定されるように、それ自体、またはポリペプチドをコードすること
によって高められた免疫応答誘発能を有する組換え核酸を得る。第四に、ポリペ
プチド−コード化遺伝子は、いかなる天然に発生する遺伝子にも存在しない変異
多様性に近づくように改質されたコドンであり得る。
【００５９】 配列組換え（ＤＮＡシャッフリング、進化、または分子育種と呼ばれることも
ある）の典型的フォーマット及び例は本発明者及び共同研究者によって、以下の
同時係属出願、１９９４年２月１７日に提出された米国特許出願番号第０８／１
９８，４３１号；１９９５年２月１７日提出の出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０
２１２６号；１９９５年４月１８日提出の出願番号第０８／４２５，６８４号；
１９９５年１０月３０日提出の出願番号第０８／５３７，８７４号；１９９５年
１１月３０日提出の出願番号第０８／５６４，９５５号；１９９６年３月２５日
提出の出願番号第０８／６２１，８５９号；１９９６年３月２５日提出の出願番
号第０８／６２１，４３０号；１９９６年４月１８日提出の出願番号第ＰＣＴ／
ＵＳ９６／０５４８０号；１９９６年５月２０日提出の出願番号第０８／６５０
，４００号；１９９６年７月３日提出の出願番号第０８／６７５，５０２号；１
９９６年９月２７日提出の出願番号第０８／７２１，８２４号；１９９７年９月
２６日提出の出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１７３００号；及び１９９７年１２
月１７日提出の出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９７／２４２３９号に記載されている。
ステマー、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０巻：１５１０ページ（１９９５）；ステマー
ら、Ｇｅｎｅ １６４巻：４９−５３ページ（１９９５）；ステマー、Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３巻：５４９−５５３ページ（１９９５）；ステマー
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１巻：１０７４７−１０
７５１ページ（１９９４）；ステマー、Ｎａｔｕｒｅ ３７０巻：３８９−３９
１ページ（１９９４）；クラメリ（Ｃｒａｍｅｒｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ ２（１）：１−３（１９９６）；クラメリら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４巻：３１５−３１９ページ（１９９６）も参照さ
れたい。これらの参考文献の各々は全ての目的のために参考としてその全体が本
明細書に援用される。
【００６０】 組換えポリヌクレオチド類のライブラリーを得るため、および／またはシャッ
フリングのための基質として使用する核酸における多様性を得るためのその他の
方法には、例えば相同組換え（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０５２２３；公開番号ＷＯ９
８／４２７２７）；オリゴヌクレオチド指向性変異誘発（概説として、スミス、
Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９巻：４２３−４６２ページ（１９８５）；ボ
ツテイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ）及びショートゥル（Ｓｈｏｒｔｌｅ）、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２９９巻：１１９３−１２０１ページ（１９８５）；カーター（Ｃａｒ
ｔｅｒ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７巻：１−７ページ（１９８６）；クンケ
ル（Ｋｕｎｋｅｌ）、“オリゴヌクレオチド指向性変異誘発の効率”、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ ａｃｉｄｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、エクスタイン
（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）及びリリー（Ｌｉｌｌｙ）編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅ
ｒｌａｇ、ベルリン（１９８７））が含まれる。これらの方法のなかには、オリ
ゴヌクレオチド指向性変異誘発（ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）及びスミス、Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０巻：６４８７−６５００ページ（１９８２）、Ｍｅ
ｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００巻：４６８−５００ページ（１９８３
）、及びＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４巻：３２９−３５０ペー
ジ（１９８７））、ホスホチオエート改変ＤＮＡ変異誘発（テイラー（Ｔａｙｌ
ｏｒ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３巻：８７４９−８７６４（１９
８５）；テイラーら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３巻：８７６５−８７
８７ページ（１９８５）；ナカメイ（Ｎａｋａｍａｙｅ）及びエクスタイン（Ｅ
ｃｋｓｔｅｉｎ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４巻：９６７９−９６９
８ページ（１９８６）；セイヤーズ（Ｓａｙｅｒｓ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１６巻：７９１−８０２ページ（１９８８）；セイヤーズら、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６巻：８０３−８１４ページ（１９８８））、ウラ
シル含有テンプレートを使用する変異誘発（クンケル、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２巻：４８８−４９２ページ（１９８５）及びク
ンケルら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４巻：３６７−３８２ペ
ージ）；ギャップド二重鎖ＤＮＡ（ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ）を用
いる変異誘発（クレイマー（Ｋｌａｍｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１２巻：９４４１−９４５６ページ（１９８４）；クレイマー及びフリッツ（
Ｆｒｉｔｚ）、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４巻：３５０−３６
７ページ（１９８７）；クレイマーら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６巻
、７２０７ページ、（１９８８）；及びフリッツら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１６巻：６９８７−６９９９ページ（１９８８））が含まれる。さらなる
適切な方法には、ポイントミスマッチ修復（クレイマーら、Ｃｅｌｌ ３８巻：
８７９−８８７ページ（１９８４））、修復欠失宿主株を使用する変異誘発（カ
ーターら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３巻：４４３１−４４４３ページ
（１９８５）；カーター、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４巻：３
８２−４０３ページ（１９８７））、欠失変異誘発（Ｅｇｈｔｅｄａｚａｄｅｈ
及びヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４巻：
５１１５ページ（１９８６））、制限選択および制限精製（ウェールズ（Ｗｅｌ
ｌｓＩら、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ３１７：４１５−
４２３（１９８６））、全遺伝子合成による変異誘発（ナンビエル（Ｎａｍｂｉ
ａｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３巻：１２９９−１３０１ページ（１９８４）
；サカマー（Ｓａｋａｍａｒ）及びコラナ（Ｋｈｏｒａｎａ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１４巻：６３６１−６３７２ページ（１９８８）；ウェルズ（
Ｗｅｌｌｓ）ら、Ｇｅｎｅ ３４巻：３１５−３２３ページ（１９８５）；及び
グルンドシュトレム（Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１３巻：３３０５−３３１６ページ（１９８５））が含まれる。変異誘発用
キットは市販されている（例えば、バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、アマルシ
ャム インターナショナル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）
、アングリア バイオテクノロジー（Ａｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ））。
【００６１】 組換え法は、一般的に互いに対する実質的配列同一性（すなわち少なくとも約
３０％、５０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性）を示すが或る位置
では互いに異なる、少なくとも２つの核酸基質で出発する。その差は、任意のタ
イプの変異であり得る（例えば、置換、挿入及び欠失）。しばしば、異なるセグ
メントは、約５〜２０の位置において互いに異なる。組換えによって出発材料に
比較して増加した多様性を得るためには、上記出発材料は少なくとも２つのヌク
レオチド位置において互いに異なっていなければならない。すなわち、もし２つ
の基質しかないとするならば、少なくとも２つの互いに異なる位置がなければな
らない。もしも３つの基質があるならば、例えば、一つの基質は第二の基質と１
つの位置が異なり得、そして第二の基質は第三の基質と別の１つの位置が異なり
得る。出発ＤＮＡセグメントはまた、互いの天然改変体（例えば対立変異体また
は種変異体）であり得る。上記セグメントはまた、いくらかの程度の構造的関連
性及び通常には機能的関連性を示す非対立遺伝子の由来であり得る（例えば（例
えば、ヒト・パピローマウイルスＬ１及びＬ２コーディング遺伝子ファミリーの
ような）スーパーファミリー内の異なる遺伝子）。出発ＤＮＡセグメントはまた
、誘起された互いの改変体であり得る。例えば、或るＤＮＡセグメントを他のＤ
ＮＡセグメントの誤りがちなＰＣＲ複製によって生成し得、その核酸を化学物質
またはその他の変異原物質で、または変異誘発カセットの置換によって処理し得
る。誘発された変異体はまた、変異原性株のセグメントにおいて一つ（または両
方）を増殖させることによって、またはその細胞において誤りがちな修復系を誘
発することによっても調製され得る。これらの状況では、厳密に言うと、第二の
ＤＮＡセグメントは単一セグメントでなく、関連セグメントの大きいファミリー
である。出発材料を形成する異なるセグメントは、しばしば、同じ長さまたは実
質的に同じ長さである。しかし、この場合にはそうである必要はない；例えば、
一つのセグメントが、別のセグメントのサブ配列であり得る。上記セグメントは
、ベクターのような、より大きい分子の一部として存在し得るか、または単離さ
れた形態であり得る。
【００６２】 出発ＤＮＡセグメントは、本明細書に提供される配列組換えフォーマットのい
ずれかによって組換えられ、組換えＤＮＡセグメントの多様なライブラリーを形
成する。このようなライブラリーのサイズは、１０未満から１０5、１０9、１０ 12 またはそれ以上のメンバーより多くを有するものまでに広く変動し得る。幾つ
かの実施形態では、出発セグメント及び生成した組換えライブラリーは、全長コ
ード化配列及び発現に必要な任意の必須の調節配列（例えばプロモーター及びポ
リアデニル化配列）を含む。その他の実施形態において、ライブラリー中の組換
えＤＮＡセグメントが一般的ベクターに挿入され、発現に必要な配列を提供し、
その後スクリーニング／選択を行う。
【００６３】 核酸配列における変異の組換えのためのさらなる技術は、「再集合（ｒｅａｓ
ｓｅｍｂｌｙ）ＰＣＲ」を利用する。この方法を用いて、別々に進化した多数の
セグメントを遺伝子のような全長核酸テンプレートに集合させ得る。この技術は
、有益な変異体のプールの存在がこれまでの研究から公知であるか、または当業
者に公知の任意の変異誘発技術（例えばＰＣＲ変異誘発、カセット変異誘発、ド
ープド（ｄｏｐｅｄ）オリゴ変異誘発、化学的変異誘発、またはミューテーター
株におけるインビボでの ＤＮＡテンプレート増殖）によって、作り出され得た
変異体をスクリーニングすることによって同定された場合に行われる。関心とす
る核酸配列のセグメントを規定する境界は、好ましくは、遺伝子間領域、イント
ロン、または関心とする変異がありそうもない遺伝子領域にある。好ましくは、
関心とする核酸配列のセグメントのＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプラ
イマー（ｏｌｉｇｏｓ）が、上記オリゴヌクレオチドの配列が２つのセグメント
の連結部にオーバーラップするように合成される。そのオーバーラップ領域は代
表的に約１０〜１００ヌクレオチドの長さである。セグメントの各々はこのよう
なプライマーのセットで増幅される。次いで、ＰＣＲ生成物は、本明細書中で考
察されたようなアセンブリープロトコルに従って「再集合」し、ランダムに断片
化された遺伝子を組み立てる。つまり、アセンブリープロトコルにおいて、まず
最初にＰＣＲ生成物を例えばゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィー
によってプライマーから精製する。精製した生成物を一緒に混合し、ポリメラー
ゼ及びデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ’ｓ）及び適切な緩衝塩の存在
下、付加的プライマーは使用せずに（「セルフ−プライミング」）、約１〜１０
サイクルの変性、再アニーリング、及び伸長を受けさせる。遺伝子に隣接するプ
ライマーを用いるその後のＰＣＲを行い、完全に再集合されかつシャッフルされ
た遺伝子の収量を高める。
【００６４】 さらなる実施形態において、関心とする核酸配列のセグメントの増幅のための
ＰＣＲプライマーを用いて関心とする遺伝子に下記のように変化を導入する。核
酸配列における関心とする部位の変異は、スクリーニングまたは選択、上記核酸
配列のホモログの配列決定等によって同定される。その後、関心とする部位の野
生型または変異体情報をコードするオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーが合成
される。次いで、これらのプライマーがＰＣＲ変異誘発において用いられ、指定
の位置に野生型及び変異体情報の変更をコードする全長遺伝子のライブラリーを
生成する。この技術は、関心とする変異体の遺伝子の配列決定及び変異原性オリ
ゴヌクレオチドの合成に対してスクリーニングまたは選択プロセスが高価、煩雑
または非実用的である場合に代表的に有益である。
【００６５】 本発明の好ましい実施形態において、ＤＮＡシャッフリングが組換え核酸のラ
イブラリーを得るために使用され得る。ＤＮＡシャッフリングは、病原性が仲介
されるメカニズムが詳細に理解されていない場合でも、病原体の弱毒化を起こし
得る。特性の獲得または特性の改良のための候補基質の例には、遺伝的典型的タ
イプの予防接種に用いられる細菌性、ウイルス性及び非ウイルス性ベクター、並
びに免疫応答の特定の局面の仲介に関係する核酸（例えば、抗原をコードする核
酸）が含まれる。これらの方法は、出発基質の少なくとも２つの改変形態を伴う
。候補成分の改変形態は実質的な配列類似性または二次構造類似性を有し得るが
、それらはまた、少なくとも２つの位置で異なるべきである。形態間の初期の多
様性は天然の変化の結果であり得る。例えば異なる改変形態（ホモログ）は、生
物の異なる個体または株から得られる（地理学的改変体を含む；「ファミリーシ
ャッフリング」（図１）と呼ばれる）か、または同じ生物からの関連配列を構成
する（例えば対立変異）。或いは、初期多様性が誘発され得る。例えば、第二の
改変形態は、第一の改変形態の誤りがちな転写によって（例えば、誤りがちなＰ
ＣＲまたは校正活性（ｐｒｏｏｆ−ｒｅａｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の欠如
したポリメラーゼの使用によって（リアオ（Ｌｉａｏ）（１９９０）Ｇｅｎｅ
８８巻：１０７−１１１ページを参照されたい））、またはミューテーター株に
おける第一の形態の複製によって生成され得る。
【００６６】 （１．弱毒化ウイルスワクチン） いくつかの実施形態において、本発明は、弱毒化ウイルスワクチン及び上記弱
毒化ウイルスワクチンを得るための方法を提供する。本発明の方法を使用するこ
とによって、天然には発生しない、またはそうでなければかなりの頻度で起こる
ことは期待されない遺伝子型及び表現型を有する新規の改変体ウイルスを作製し
得る。この方法の好ましい局面は、「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる反復性
ヌクレオチド配列組換えを用いる；これにより、そうでなければ同じ年月のうち
に自然の進化によって生成する表現型よりも、より広範囲の新規表現型またはよ
り極端な表現型について選択的に育種され得る広範に多様なウイルス表現型のコ
レクションを速やかに生成し得る。この方法は典型的には（１）複数のウイルス
ゲノムのシャッフリング、及び（２）生成したシャッフルされたウイルスゲノム
を選択して所望表現型（例えば弱毒化）を有する複数のシャッフルされたウイル
スゲノムを単離または富化する、及び必要に応じて、（３）所望表現型をウイル
スに伝える複数のシャッフルドウイルスゲノムで工程（１）及び工程（２）を、
十分最適化された所望表現型（１または複数）を与える１つ以上の改変体ウイル
スゲノムが得られるまで繰り返す。この一般的様式において、この方法はウイル
スゲノムの「強制進化」を容易にし、これまで自然の選択及び進化が起きなかっ
た弱毒化ウイルスをコードするようにする。図２は、ウイルスゲノムシャッフリ
ング及び所望表現型の選択のための基礎的方法のブロック図を示す；反復するか
しないかは、一般に、所望表現型（１または複数）の十分な最適化を与える１つ
以上のウイルスゲノムが得られるまでの各サイクルで選択される。
【００６７】 代表的には、同じ分類学的分類の複数のウイルスゲノムが、本発明の方法によ
ってシャッフリングされ、そして選択される。この方法の一般的使用は、ウイル
スの臨床的分離物または実験室株の変異改変体をシャッフルして、新規の所望表
現型（例えば弱毒化）を有する臨床的分離物または実験室株の改変体を得ること
であると考えられる。しかし、この方法は、複数のウイルス株（またはクレード
）と共に、または複数の関連ウイルス（例えばレンチウイルス、ヘルペスウイル
ス、アデノウイルス等）と共にでも使用され得、いくつかの例では組換え誘発性
部分（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ ｐｏｒｔｉｏｎ）（天然の、または遺伝
子工学によって生成された）を有する非関連ウイルスまたはその部分と共に使用
され得る。この方法は、異種ウイルス配列をウイルスゲノムにシャッフル（ｓｈ
ａｆｆｌｅ）するために使用され得る（例えば第一のウイルスの遺伝子を第二の
ウイルスのゲノムに組み込み、進化させて、所望表現型を第二ウイルスの進化し
たゲノムに与える）。さらに、この方法は、異種核酸（例えば自然には発生しな
い変異体ウイルス遺伝子）を進化させ、ウイルスゲノム、および／または特定の
宿主細胞または発現系（例えば、発現カセットまたは発現レプリコン）における
その表現型の発現（例えば免疫原性）を最適化するために使用され得る。図１は
、種々の変異または明確に識別されるゲノム部分を有するウイルスゲノムのファ
ミリー（科）のコレクションの組換えシャッフリングの図式的説明を示す；明確
に区別されるゲノムセグメント（例えば、異なるウイルス単離物のゲノムから得
られるもの）は蔭をつけたボックスで示される。
【００６８】 ＲＮＡウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンが利用可能であることは有用である
が、弱毒化ウイルスワクチンの改良株の開発には必要ない。感染性ｃＤＮＡクロ
ーンは、例えばブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス（ミューレンバーグ（Ｍｅｕｌ
ｅｎｂｅｒｇ）ら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）４４０巻
：１９９−２０６ページ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ヤナギ（Ｙａｎａｇｉ）ら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６巻：２２９１
−５ページ）、ダニ媒介脳炎ウイルス（グリツァン（Ｇｒｉｔｓｕｎ）ら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９８）７６巻：１０９−２０ページ；マンド
ル（Ｍａｎｄｌｅ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７８巻：１０４
９−５７ページ）、プラム ポックス ポティウイルス（ｐｌｕｍ ｐｏｘ ｐ
ｏｔｙｖｉｒｕｓ）（グオ（Ｇｕｏ）ら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．（１９９８）５
７巻：１８３−９５ページ）、ＲＳウイルス（ジン（Ｊｉｎ）ら、Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ（１９９８）２５１巻：２０６−１４ページ）、パラミクソウイルス（ヒー
（Ｈｅ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９８）２５０巻：３０−４０ページ）、ウ
シウイルス性下痢ウイルス（ゾンク（Ｚｈｏｎｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９
９８）７２巻：９３６５−９ページ）、ネコカリチウイルス（ソスノヴツェフ（
Ｓｏｓｎｏｖｔｓｅｖ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２巻：３０５１−
９ページ）、伝染性ファルビキウス病ウイルス（ヤオ（Ｙａｏ）ら、Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．（１９９８）７２巻：２６４７−５４ページ）、デングウイルス２型（グ
ァラノ（Ｇｕａｌａｎｏ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７９巻：
４３７−４６ページ）、ブタコレラウイルス（ミッテルホルツァー（Ｍｉｔｔｅ
ｌｈｏｌｚｅｒ）ら、Ｖｉｒｕｓ．Ｒｅｓ．（１９９７）５１巻：１２５−３７
ページ）、コクサッキーウイルスＢ３（リー（Ｌｅｅ）ら、Ｖｉｒｕｓ．Ｒｅｓ
．（１９９７）５０巻：２２５−３５ページ）、ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）及
びバナジー（Ｂａｎｅｒｊｅｅ）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１巻：４２
７２−７ページ）、ウマ動脈炎ウイルス（ヴァン ディンテン（ｖａｎ Ｄｉｔ
ｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）９４
巻：９９１−６ページ）、黄熱病ウイルス（ガラー（Ｇａｌｌｅｒ）ら、Ｂｒａ
ｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．（１９９７）３０巻：１５７−６８ページ
）、ヒト アストロウイルス セロタイプ１（ｈｕｍａｎ ａｓｔｒｏｖｉｒｕ
ｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ１）（ガイゲンミュラー（Ｇｅｉｇｅｎｍｕｌｌｅｒ）ら
、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１巻：１７１３−７ページ）から確立された
。これらのウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンが確立されたという事実は、同じ
アプローチを用いて、同じ科（ファミリー）に属するその他のウイルス及びそれ
らのシャッフルされた改変体の感染性ｃＤＮＡクローンを作製し得ることを示唆
する。そのため、これらの、及び関連するウイルスのファミリーシャッフリング
は弱毒化ワクチン株の開発のためのすぐれた出発点を提供する。 本発明の方法は、多くの異なるウイルスの弱毒化バージョンの生成に利用可能
である。特に興味深いウイルスの例には、非制限的に、ロタウイルス、パルボウ
イルスＢ１９、単純ヘルペスウイルス１及び−２、ＣＭＶ、ＲＳＶ、水痘−帯状
疱疹ウイルス、インフルエンザウイルス、ＨＰＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、Ａ、Ｂ、Ｃ
、Ｄ及びＥ型肝炎ウイルスが含まれる。ピコルナウイルス科のウイルス類も特に
興味深い。それらは下記の属を含む：普通かぜの約５０％の症例をひきおこし、
そのため医学的利用にとって関心があるライノウイルス；ポリオウイルスおよび
コクサッキーウイルスを含むエンテロウイルス；エコウイルス類、及びＡ型肝炎
ウイルスのようなヒトエンテロウイルス類；及び手足口病ウイルスであるアプト
ウイルス類、これは特に獣医学的利用に興味がある（標的抗原としてはＶＰ１、
ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４及びＶＰＧが挙げられる）。カルチウイルス科（これは
流行性胃腸炎の重要な原因物質であるノーウォーク群ウイルスを含む）も、弱毒
化ワクチンとして使用するために特に興味深い。弱毒化ワクチンを作るために本
発明の方法が有用であるその他のウイルス類には、例えばウシウイルス性下痢ウ
イルス、マレク病（Ｍａｒｅｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス（ＭＤＶ）、ウ
シヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）、感染性気管支炎ウイルス、伝染性ファ
ルビキウス病ウイルス（ＩＢＤＶ）、ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス、イヌジ
ステンパーウイルス（ＣＤＶ）がある。 弱毒化ワクチンとしての使用に関心がもたれるのは、トガウイルス科（これに
は下記の属が含まれる：医学的及び獣医学的使用に関心がもたれ、例えばセニリ
スウイルスロスリヴァーウイルス、及びイースタン＆ウェスターン ウマウイル
スを含むアルファウイルス類）並びにレオウイルス科（風疹ウイルスを含む）で
ある。フラビウイルス科のウイルス類もまた、本発明の方法を用いる弱毒化ワク
チンの開発のために特に関心がもたれている。例としては：デング、黄熱病、日
本脳炎、セントルイス脳炎及びダニ媒介脳炎ウイルスがある。Ｃ型肝炎ウイルス
はまた、本発明の方法を用いて弱毒化した場合に医学的使用に特に関心がもたれ
る。
【００６９】 関心とする弱毒化ウイルスワクチンにはコロナウイルス科のものが含まれる。
これは医学的及び獣医学的の両方の適用に使用を見出す。獣医学適用について有
用であるコロナウイルスには、非制限的に、伝染性気管支炎ウイルス（家禽）、
ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）、ブタ赤血球凝集脳脊髄炎ウイルス（ブタ）
、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）及びイヌ
コロナウイルス（イヌ）が含まれる。医学的使用では、特に興味深いコロナウイ
ルス科のメンバーには例えばヒト呼吸コロナウイルスが含まれる。これは普通か
ぜの約４０％の症例をひきおこす（例えばウィンザーら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｈｉｎｏ
ｌ．１２巻１７−２０ぺーじ（１９９８）を参照されたい）。コロナウイルスは
非−Ａ、Ｂ、またはＣ型肝炎も引き起こすらしい。標的抗原には例えばＥ１（Ｍ
またはマトリックスタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ２（Ｓまたはスパイクタンパ
ク質とも呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥまたはヘマグルチネルテローズ糖タンパクとも
呼ばれる（全てのコロナウイルスに存在するものではない））、及びＮ−ヌクレ
オカプシドがある。
【００７０】 ラブドウイルス科は、本発明の方法により弱毒化した際、ワクチンとして有用
なウイルスのもう一つの科である。この科のなかの特に有用な属には、例えばベ
シリオウイルス（ｖｅｓｉｌｉｏｖｉｒｕｓ）、リッサウイルス（狂犬病；医学
及び獣医学の両方の適用に使用される）。この科のウイルスの標的抗原には、例
えばＧタンパク質及びＮタンパク質が含まれる。フィロウイルス科のウイルス類
も興味深い。これにはマールブルグ及びエボラウイルスのような出血熱ウイルス
が含まれる。
【００７１】 パラミクソウイルス科のウイルスも、本発明の方法により弱毒化した際、医学
及び獣医学両方に用いられるワクチンを提供する。興味深い属の例は、例えば、
パラミクソウイルス（医学及び獣医学両方に使用）、ムンプスウイルス、ニュー
カッスル病ウイルス（ニワトリの重要な病原体）、麻疹ウイルス（医学及び獣医
学に利用）、はしか、イヌジステンバー、肺炎ウイルス、及びＲＳウイルスであ
る。オルトミクソウイルス科のウイルスも、本方法により弱毒化した際には医学
的使用において関心がもたれる。これらには例えばインフルエンザウイルスがあ
る。
【００７２】 下記の属を含むブンガウイルス科も興味深い：ブンガウイルス（カリホルニア
脳炎ウイルス、ＬＡクロスウイルス等）、フレボウイルス（リフトバレー（Ｒｉ
ｆｔ Ｖａｌｌｅｙ）熱ウイルス等）、ハンタウイルス（Ｐｕｕｍａｌａは出血
熱ウイルスである）、ナイロウイルス（ナイロビヒツジ病をおこす、したがって
獣医学的適用に使用できるワクチンである）。多くの確定されていないブンガウ
イルスが公知であり、本発明の方法を用いて弱毒化した際にはこれらもまたワク
チンとして有用である。
【００７３】 ＬＣＭ及びラッサ熱ウイルスを含むアレナウイルス科のウイルスも弱毒化ワク
チンとして使用することに関心が向けられている。レオウイルス科も、弱毒化さ
れると、興味深いワクチンを提供する。特に興味深い属には、例えばレオウイル
ス（可能なヒトの病原体である）、ロタウイルス（子供に急性胃腸炎をおこす）
、オルビウイルス（医学及び獣医学両方に使用される。コロラドダニ熱、レボン
ボ（ヒト）、ウマ脳症、及びブルータング（青い舌）等をおこす）がある。
【００７４】 レトロウイルス科には、既存の治療法には頑固に抵抗する重要な疾患を起こす
多くのウイルス性病原体がある。これらのウイルスから誘導される弱毒化ワクチ
ンは獣医学と医学の両方に使用される。レトロウイルス科の亜科には、例えばオ
ンコリウイルス亜科レトロウイルス（例えばネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩ及
びＨＴＬＶＩＩ）、レンチウイルス亜科トロウイルス（例えばＨＩＶ、ネコ免疫
不全ウイルス、ウマ感染症及び貧血ウイルス）及びスプナウイルス亜科レトロウ
イルス科がある。
【００７５】 パポバウイルス科の弱毒化ウイルスもワクチンとしての使用に関心がもたれる
。この科は次の亜科を含む：ポリオーマウイルス（ＢＫＵ及びＪＣＵウイルス類
を含む）、パピローマウイルス（ガンまたは乳頭腫の悪性進行に関係する多くの
ウイルス型を含む）、アデノウイルス（ＡＤ７、ＡＲＤ．、ＯＢ．を含め、医学
的使用に有用である；あるアデノウイルスは呼吸器疾患を起こし、あるアデノウ
イルス（例えば２７５）は腸炎を起こし得る）。
【００７６】 パルボウイルス科の弱毒化ウイルス類は特に獣医学に使用される。例えばネコ
パルボウイルス（ネコ腸炎を起こす）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパル
ボウイルスおよびブタパルボウイルスの弱毒化ウイルスワクチンを本発明の方法
を用いて得ることができる。
【００７７】 ヘルペスウイルス科のウイルス類も本発明の弱毒化法を受け、弱毒化ワクチン
を提供することができる。特に興味深いヘルペスウイルス亜科には、アルファヘ
ルペスウイルス科サブファミリー（単純ヘルペスウイルス属（例：ＨＳＶＩ、Ｈ
ＳＶＩＩ、そのどちらも医学的使用に適する）；水痘ウイルス（医学および獣医
学両方の使用に有用）、及び偽性狂犬病（水痘・帯状疱疹））、ベータヘルペス
ウイルス科（サイトメガロウイルス（例えばＨＣＭＶ）及びムロメガロウイルス
属を含む）及びガンマヘルペスウイルス科サブファミリー（リンフォクリプトウ
イルス属、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、及びラジノウイルス等）がある。
【００７８】 ポックスウイルス科も弱毒化ワクチンの開発のために特に興味深い。ポックス
ウイルス科にはコルドポックスウイルス科サブファミリー（本発明の方法を用い
て弱毒化した場合、医学及び獣医学両方の適用に使用できるウイルスを含む；属
には痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）、ワクシニア（ｃｏｗｐｏｘ）、パラポックスウ
イルス（獣医学）、アウイポックスウイルス（獣医学）、カプリポックスウイル
ス、レポリポックスウイルス及びスイポックスウイルスがある）及びエンテモポ
ックスウイルス科サブファミリーがある。
【００７９】 関心とする別のウイルス科はヘパドナウイルス科である。これには例えばＢ型
肝炎ウイルスが含まれる。弱毒化ワクチンの開発のために関心のある未分類のウ
イルス類には例えば肝炎デルタウイルスがある。関心とするウイルス類のリスト
は表１に示される。
【００８０】
【表１】 （２．弱毒化の細菌ワクチン、真菌ワクチン及び寄生虫ワクチン） 本発明は細菌、真菌及びその他の寄生虫などの病原体に対する弱毒化ワクチン
も提供する。これらの弱毒化ワクチンを得るための方法がまた、提供される。本
発明の方法は、天然には存在しないかまたはかなりの頻度では発生することが期
待されない、遺伝子型及び表現型を有する新規の変異体細菌または変異体寄生虫
を生成できる手段を提供する。本発明の好ましい面は「配列シャッフリング」ま
たは「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる反復ヌクレオチド配列組換えを用いる
；これは、広く多様な細菌または寄生虫の表現型のコレクションを速やかに生成
することができ、同じ長さの期間に自然の進化によって生じるよりも、広範囲の
新規の表現型またはより極端な表現型を得るために、この表現型を選択的に増殖
し得る。
【００８１】 上記のウイルスワクチンの場合と同様に、本発明の好ましい方法は、（１）全
または一部の細菌ゲノムまたは寄生虫ゲノムの複数の配列シャッフリングをする
工程、（２）生成したシャッフリングされた細菌ゲノムまたは寄生虫ゲノムを選
択して、所望の表現型（例えば弱毒化）を有する生物体を生成する複数のシャッ
フリングされたゲノムを分離または富化する工程を含む。好ましい実施形態にお
いて、上記方法は（３）十分に最適化された所望の表現型を与える１種類以上の
変異体ゲノムが得られるまで、所望の表現型を与える複数のシャッフリングされ
たゲノムに対して、工程（１）及び工程（２）を繰り返す工程を含む。この一般
的な様式で、上記方法により、細菌またはその他の病原体のゲノムは、これまで
自然淘汰及び進化では出現しなかった弱毒化生物体をコードするように「強制進
化」が促進される。反復数は一般的に、所望の表現型に関して十分な最適化を与
える一つ以上のゲノムが得られるまで、各サイクルを選択する。
【００８２】 典型的には複数の同じ分類学的クラスの細菌、寄生虫またはその他のゲノムが
本発明の方法によってシャッフリング及び選択される。この方法の一般的利用は
、或る生物体の臨床的分離物または実験室系統の変異改変体をシャッフリングし
て、新規の所望の表現型（例えば弱毒化）を有する上記臨床的分離物または実験
室系統の改変体を得ることである。しかし、上記方法は、複数の種の病原生物体
（またはクレイド）で、または複数の関連生物体（例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｃｃａ
ｅ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ））でも使用でき
、或る場合には、組換え誘発（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）部分（天然また
は遺伝子工学によって生成されたかのいずれか）を有する非関連性病原体または
それらの部分でも使用できる。この方法を用いて異種配列を或る病原体ゲノムに
シャッフルすることができる（例えば第一の病原体生物体の遺伝子を第二の生物
体のゲノムに組み込み、進化させ、所望の表現型（免疫原性等）を上記第二の生
物体の進化したゲノムに与えるようにする。）さらに、この方法を用いて、異種
核酸（例えば天然に存在しない変異体遺伝子）を進化させ、細菌ゲノムまたは寄
生虫ゲノムに存在する際、および／または特定の宿主細胞または発現系（例えば
発現カセットまたは発現レプリコン）に存在する際の、その表現型発現（例えば
、免疫原性）を最適化する。
【００８３】 幾つかの実施形態において、本発明の方法を用いて病原性細菌及び非病原性細
菌、真菌または寄生虫のキメラを作製する。これらの適用においては、組換え核
酸ライブラリーを作製するためには全ゲノムまたは部分ゲノムのシャッフリング
が好ましい。例えば、院内感染に対する特異的かつ広域スペクトルの細菌ワクチ
ンは、病原細菌を、例えばＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓと共に全ゲノ
ムシャッフリングにかけることによって得られ得る。全ゲノムシャッフリングの
ためのプロトコルは例えばＰＣＴ特許出願第ＵＳ９８／００８５２（公開番号Ｗ
Ｏ９８／３１８３７）に記載されている。
【００８４】 単一遺伝子及び全ゲノム類のファミリーシャッフリングを含む本発明の方法は
、ワクチンとしてまたはワクチン抗原送達ビヒクルとして有用な弱毒化細菌種を
生成するためにも用いられ得る。その上、これらの方法を用いて、ワクチンとし
て用いられる細菌種におけるワクチン抗原の発現レベルを改善することができる
。例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａ
ｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）はヒト結核ワクチンとして広く用いられ
ており、それを特に魅力的な生−組換えワクチンビヒクルにする幾つかの特徴を
有する。ＢＣＧはその他のマイコバクテリアのように強力なアジュバントであり
、マイコバクテリアに対する免疫反応は広く研究されている（Ｏｒｍｅ、Ｉｎｔ
．Ｊ．Ｔｕｂｅｒｃ．Ｌｕｎｇ Ｄｉｓ．（１９９７）１：９５−１００）。ヒ
トにおいて２０億を超えるＢＣＧによる免疫が安全に使用されたという長い記録
がある。誕生時に行うことができる数少ないワクチンの一つであり、その免疫反
応は単一用量後、長期間続く。外来遺伝子はＢＣＧにうまく導入され、ＨＩＶ等
、マイコバクテリア以外の疾患に対するＢＣＧベースのワクチンが製造され得る
（Ａｌｄｏｖｉｎｉ及びＹｏｕｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５１：４７９
−８２）。ＤＮＡシャッフリングによる進化のためのその他の有用な細菌種はＭ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｃｃａｅ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）である。これは
以前に乾癬の治療に関連していた（Ｌｅｈｒｅｒら、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ
．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９８）２１：７１−７）。
【００８５】 本発明の方法はキメラ細菌、またはその他の細菌もしくは病原体からの抗原性
決定基を有するその他の病原性生物体の作製を可能にする。例えば、全ゲノムシ
ャッフリングを用いて、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ（Ｍｔ）から誘導される複数の抗原性決定基を有するＢＣＧ様種を生成するこ
とができる。より詳細に述べれば、ＢＣＧ及びＭｔを全ゲノムシャッフリングに
よって交配し、最適ワクチン種をＭｔ特異的抗体によって選択することができる
。或いは、Ｍ．ｖａｃｃａｅとＭｔとのキメラを同様の型のアプローチを用いて
作製することができる。新しいシャッフリングされた種の弱毒化表現型を動物モ
デルで確認することができ、同時にこのような種の免疫原性の分析が可能になる
。実際、最適ワクチン種はインビボ免疫を用いて選択できる。強力なＭｔ特異的
抗体応答をインビボで誘導するが、それらの弱毒化表現型を保持している種を選
択して、新たなラウンドの全ゲノムシャッフリング及び選択にかけることもでき
る。免疫された動物を生−Ｍｔでチャレンジすることにより、防御免疫応答の質
の分析が可能である。
【００８６】 有用な標的のさらなる例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢｕ
ｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｓの全ゲノムシャッフリングを適用して、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の抗原性決定基を有する非病原性バチルス
系統（これは、炭疽に対する防御免疫応答を提供し得る）を作製することがある
が、これらに限定されない。さらに、サルモネラ種のシャッフリング弱毒化系統
及び病原性系統を用いて、弱毒化表現型を有するが病原性サルモネラ由来の免疫
原性決定基を発現する系統（これは、サルモネラ感染症に対する防御免疫応答を
与える）を作製することができる。
【００８７】 ＤＮＡシャッフリングを用いて、弱毒化細菌に発現する抗原の発現レベルを改
善することもできる。哺乳動物細胞に感染する病原体は概して細菌と共に進化し
ないから、細菌におけるウイルス抗原の発現は問題であり、低い発現レベルをも
たらすことがよくある。病原体抗原、特にウイルス抗原の発現、溶解性及び折り
たたみもＢＣＧでは損なわれることが多く、免疫効果を低下させる。ＤＮＡシャ
ッフリングを用いて細菌中のタンパク質の溶解度を改善することができる。例え
ば病原体抗原のライブラリーを作り、細菌において最も効率的に発現した変異体
を選択することができる。例えば、ＨＩＶ抗原ｇｐ１２０をＧＦＰに融合し、そ
の融合タンパク質をＢＣＧまたはＭ．ｖａｃｃａｅに発現させることができる。
ＧＦＰの発現はｇｐ１２０発現の指標であり、例えばフローサイトメトリーに基
づく細胞分類によって、最も明るい細胞を選択できる。
【００８８】 マイコバクテリア及びＤＮＡシャッフリングを用いるこれらのアプローチは、
経口的にまたは鼻孔内に送達されるワクチンを改良する機会も与える。ＢＣＧは
経気ワクチン接種を介した防御免疫応答をもたらすことも判明した（Ｌａｇｒａ
ｎｄｅｒｉｅら、Ｔｕｂｅｒｃｌｅ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅ（１９
９３）７４：３８−４６）。ＤＮＡシャッフリングによるＢＣＧにおける外来抗
原の高められた発現は、経口または吸入のワクチン送達系統として、ＢＣＧの効
率を実質的に改善することができる。目的の抗原をコレラ毒素（ＣＴ）またはＥ
．ｃｏｌｉ．の熱不安的性エンテロトキシン（ＬＴ）等のアジュバントエンテロ
トキシンに融合することによってさらに改善することができ、次いでこれは、細
胞から分泌され得る。最も望ましいアプローチにおいて、エンテロトキシンのラ
イブラリーをＤＮＡシャッフリング（例えばＣＴ及びＬＴのシャッフリング）に
よって作製し、これらのシャッフリングされたエンテロトキシンを目的のシャッ
フリングされたワクチン抗原に融合する。これらのライブラリーは発現された精
製タンパク質としてスクリーニングされるか、またはＢＣＧもしくはＭ．ｖａｃ
ｃａｅに発現させることができる。そしてこれらの系統を、引続いて免疫原性に
ついて動物でスクリーニングする。ＣＴ及びＬＴ等の数種のエンテロトキシンは
アジュバントとして（特に皮膚及び粘膜において）作用することが証明されてい
るので、このアプローチは、経口ワクチン、鼻孔内ワクチン、経皮ワクチン及び
吸入ワクチンの効率をさらに改善することが期待される。
【００８９】 弱毒化ワクチンが免疫応答を誘発する能力のスクリーニングは、当業者に公知
の方法を用いて実施することができる。現在好ましい実施形態において、インビ
トロスクリーニングを用いて弱毒化を試験する。インビトロスクリーニングに、
インビボ試験がさらに続く。さらに、改変細胞の、哺乳動物に接種した際に防御
免疫を誘導する能力が研究される。
【００９０】 本発明の方法は広範囲の細菌細胞及びその他の病原性細胞に対して、弱毒化ワ
クチンを生産するために有用である。例えば、肺炎球菌性細菌、ブドウ球菌性細
菌、及び連鎖球菌性細菌を含む等の病原性グラム陽性球菌に対するワクチンを得
ることができる。病原性グラム陰性球菌も適切な標的である。特に興味深いのは
、髄膜炎菌性細菌及び淋菌性細菌である。
【００９１】 病原性腸内グラム陰性バチルスに対するワクチンも興味深い。例としては、腸
内細菌科（シュードモナス属、アシネトバクテリア属及びエイケネラ（ｅｉｋｅ
ｎｅｌｌａ）属）、類鼻疽、サルモネラ、細菌性赤痢、ヘモフィルス、軟性下疳
、ブルセラ症、野兎病、エルジニア（パスツレラ）、ストレプトバチルスモニリ
ホルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ及びス
ピリルム、リステリア菌、豚丹毒菌、ジフテリア、コレラ、炭疽症、ドノヴァン
症（鼠蹊部肉芽腫）、及びバルトネラ症が挙げられるが、これらに限定されない
。
【００９２】 病原性嫌気性細菌も弱毒化ワクチンの開発の適切な標的である。特に興味深い
のは、例えば、破傷風、ボツリヌス、その他のクロストリジウム属、結核、ライ
、及びその他のマイコバクテリアが挙げられる。病原性スピロヘータ疾患には梅
毒、トレポネーマ症（イチゴ腫、ピンタ、及び性行為外の梅毒）、及びレプトス
ピラ症が挙げられる。
【００９３】 ワクチンの標的にはまた、より強い病原性細菌及び病原性真菌によって生じる
他の感染症が挙げられる：例えば、アクチノミセス症、ノカルジア症、クリプト
コックス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症、及びコクシジオイデス真菌
症；カンジダ症、アスペルギルス症、及びムコール菌症；スポロトリクス症、パ
ラコクシジオイドミコーシス、ペトリエリディオーシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄ
ｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、足菌腫及びクロモミコーシス；ならびに皮膚糸
状菌症が挙げられる。本発明の方法はまた、リケッチア感染症（例えばリケッチ
ア及びリケッチア症）及びマイコプラズマ及びクラミジア感染症（例えば、マイ
コプラズマ肺炎、性病性リンパ肉芽腫、オウム病、及び周産期のクラミジア感染
）に対する弱毒化ワクチンを得るためにも有用である。
【００９４】 その他の標的としては、アメーバ症、マラリア、リーシュマニア症、トリパノ
ソーマ症、トキソプラズマ症、ニューモシスティス、バベシア症、ランブル鞭毛
虫症、旋毛虫症、フィラリア症、住血吸虫症、線虫症、トレマトーデまたは吸虫
感染及び条虫（条虫類）感染症の寄生虫病が挙げられるが、これらに限定されな
い。
【００９５】 （ＩＩ．弱毒化生物体のスクリーニング法） 組換えサイクルの後に、ワクチン接種に関して目的である、所望の特性または
所望の特徴を有する組換え核酸分子をスクリーニングまたは選択する少なくとも
１サイクルを行うのが普通である。スクリーニングまたは選択の性質は、獲得し
なければならない特性または特徴、または改善したい特性または特徴に依存し、
多くの例が以下に述べられる。特定の組換え産物（組換えセグメント）が、出発
物質に比較して新しいまたは改良された特性または特徴を獲得する分子的基礎を
、必ずしも常に理解する必要はない。例えば、本発明の弱毒化ワクチンは、各々
異なる標的役割を有する多くの成分配列（例えば、コード配列、調節配列、標的
配列、安定性付与配列、免疫調節配列及び抗原提示に影響を与える配列等）を有
することができる。これらの成分配列の各々は同時に改変され、そして合わせら
れ得る。その後スクリーニング／選択を行い、例えば、高められた弱毒化および
／または免疫原性を、このような改良をベクターの個々の成分配列のいずれにも
任す必要がなく有するセグメントを、決定することができる。
【００９６】 組換えサイクルがインビトロで行われる場合、組換え産物、すなわち組換えセ
グメントがスクリーニング工程の前に細胞に導入されることが時々ある。組換え
セグメントはスクリーニング前に適切なベクターまたはその他の調節配列に結合
することもできる。インビトロ組換えの産物はスクリーニング前に、ウイルスと
してかまたはスクリーニングの一部として、時々パッケージされる。例えば、弱
毒化ウイルスワクチンは、組換え核酸が、複製を許容しない（ｎｏｎ−ｐｅｒｍ
ｉｓｓｉｖｅ）宿主細胞（例えば、ワクチン接種されり種由来の細胞）への導入
の際に、ウイルス合成を指向できないことによって確認できる。組換えがインビ
ボで行われる場合、組換え産物を組換えが起きた細胞内でスクリーニングできる
場合もある。その他の適用において、組換えセグメントは細胞から抽出され、必
要に応じて、スクリーニング前にウイルスとしてパッケージされる。
【００９７】 スクリーニングのための上記組換え核酸の細胞への導入で、組換え核酸の多数
のコピーを導入することができる。いくつかの適用に関して、改変遺伝子の単一
コピーだけを各細胞に導入することが望ましい。このアッセイの別の好ましい変
法は、染色体の組込み部位の位置の差から生じ得る組換え核酸の転写の変動量を
減らすことを含む。これには、組換え核酸の規定された部位特異的組み込み手段
が必要である。これらの方法を用いて、染色体に部位特異的に統合されるエピソ
ームベクター（これは細胞内で複製し得る）を進化させることもできる。組換え
核酸の単一コピーの組み込みを得る一つの方法は、レトロウイルス類をシャトル
ベクターとして用いることである。レトロウイルス類は単一コピーとして組み込
まれる。しかし、この挿入は部位特異的ではない、すなわちレトロウイルスは染
色体のランダムな位置に挿入される。アデノウイルス及びａｒｓ−プラスミドを
用いて、改変導入遺伝子を行き来させることもできるが、それらは多数のコピー
として組み込まれる。野生型ＡＡＶは染色体ｑ１９に単一コピーとして組み込ま
れるが、一般的に用いられる改変バージョンのＡＡＶはそうではない。同種組換
えも、改変組換えセグメントを染色体に挿入するために用いられるが、この方法
は非効率的で、染色体対に２コピーの組み込むをもたらすかもしれない。
【００９８】 これらの問題を解決するために、本発明のいくつかの実施形態は、部位特異的
組み込みシステムを利用して、ゲノムの特異的な一定部位へ上記導入遺伝子を標
的化した。好ましい実施形態は、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰまたは関連ＦＬＰ／ＦＲＴ部
位特異的組み込みシステムを利用する。Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ系は、Ｃｒｅ組換え酵
素を使用して、ウイルスベクターまたはファージベクターの、「ＬｏｘＰ部位」
と呼ばれる特異的パリンドローム３４塩基対配列への、部位特異的挿入及び部位
特異的切除を媒介する。ＬｏｘＰ部位は、選んだ哺乳動物ゲノムに挿入され得、
例えば、ＬｏｘＰ部位を含む例えばトランスジェニック動物を同種組換えによっ
て作り出すことができる（Ｒｏｈｌｍａｎｎ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ．１４：１５６２−１５６５を参照のこと）。細胞のゲノムが、所望の
位置にＬｏｘＰ部位を含むように操作される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ（例え
ば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための遺伝子を発現するベクターによって発現する
）の存在下で、ＬｏｘＰ部位に近接する組換え核酸に感染によるこのような細胞
の感染が、この組換え核酸のＬｏｘＰ部位への効率的な部位特異的に組み込みを
もたらす。この手段はサイクルからサイクルへと再現され、一定の規定された部
位での単一コピーの組換え配列を与える。このため、インビトロで本発明の方法
により得られる組換えヌクレオチドを細胞に再挿入し、最小のノイズを示す最適
方法で、新しいまたは改良された特性を、インビボ／インサイチュで選択するこ
とができる。この技術はインビボでも使用できる。例えば、Ａｇａｈ（１９９７
）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：１６９−１７９；Ａｋａｇｉ（１９９
７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：１７６６−１７７３；Ｘｉａ
ｏ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２９８５−２９９
１；Ｊｉａｎｇ（１９９７）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ７：３２１−Ｒ３２３、Ｒｏ
ｈｌｍａｎｎ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１５６２−１
５６５；Ｓｉｅｇａｌ（１９９６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４４：７１５−７２６
；Ｗｉｌｄ（１９９６）Ｇｅｎｅ １７９：１８１−１８８を参照されたい。Ｃ
ｒｅの進化は、１９９７年９月２６日出願のＰＣＴ特許出願ＵＳ９７／１７３０
０（公開番号ＷＯ９８／１３４８７）に、さらに詳細に論じられている。
【００９９】 本発明の好適な実施形態において、本発明の弱毒化ワクチンは哺乳動物細胞ま
たは生物体でスクリーニングされる。ひとたび弱毒化系統の群が確認されると、
これらのワクチン系統は、続いて、インビボでその免疫原性について分析される
。このような研究に有用な動物種は、マウス、ラット、モルモット、ネコ、イヌ
、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリであるが、これらに限定されない。これらの実験
は改良された獣医学用ワクチンを同定する際に有用であり、これらは、ヒトワク
チンとしての使用の安全性及び効果に関する情報も提供する。ヒトにおける使用
を目的とする弱毒化ワクチンは、しばしば、ヒトでさらに試験に供される。いく
つかの例において、例えば、治療される患者の問題の免疫原性を最小にするため
に、スクリーニングに使用される細胞はこの患者から得られ得る。治療における
弱毒化ワクチンの使用そのものが、スクリーニングの一ラウンドとして用いられ
得る。すなわち、首尾よく利用されそして／またはある患者の標的細胞によって
発現された弱毒化ワクチンは、これらの標的細胞から回収され、他の患者を治療
するために用いられる。一患者の目的とする標的細胞から回収される弱毒化ワク
チンは、弱毒化、特異的取り込み、免疫原性、安定性等に関して、改良または新
規の、特性または特徴の方向に進化したベクター、すなわち反復組換えによって
改変されたベクターに富む。
【０１００】 スクリーニング工程または選択工程が、改良された弱毒化、および／またはワ
クチン接種において有用な他の新規または改良された所望の特性の獲得の方向に
進化した組換えセグメントのサブ集団（例えば、ウイルスまたは細菌の全ゲノム
または部分的ゲノム、あるいは他の核酸セグメント）を決定する。スクリーニン
グに依存して、組換えセグメントは細胞成分、ウイルス成分またはその他のベク
ターとして、あるいは遊離型で、スクリーニングされ得る。各組換えラウンド後
に、１回以上の、スクリーニングラウンドまたは選択ラウンドを実施することが
できる。
【０１０１】 或る特性をさらに改良することが所望の場合、最初のラウンドのスクリーニン
グ／選択に残った少なくとも一つの組換えセグメント、通常は組換えセグメント
の集合体を、さらなる組換えラウンドに供する。これらの組換えセグメントは互
いに組換えても、本来の基質またはそのさらなる改変体を提示する異種セグメン
トと組換えてもよい。ここでも、組換えは、インビトロでもインビボでも行われ
る。さらに、これまでのスクリーニング工程が細胞の成分としての所望組換えセ
グメントを同定する場合、上記成分はさらにインビボで組換えを受けてもよく、
インビトロでさらに組換えを受けてもよく、インビトロ組換えのラウンドを行う
前に分離されてもよい。逆に、これまでのスクリーニング工程が、裸の形態また
はウイルス成分もしくは他のベクター成分として、所望の組換えセグメントを同
定する場合、これらのセグメントは細胞に導入され、インビボ組換えラウンドを
行うことができる。第二ラウンドの組換えは、実施される方法には無関係に、そ
れまでのラウンドから生成した組換えセグメントに比較して付加的多様性を含む
さらなる組換えセグメントを生成する。
【０１０２】 第二ラウンドの組換えの後には、上記第一のラウンドで述べた原理によって、
さらにスクリーニング／選択のラウンドが続き得る。スクリーニング／選択のス
トリンジェンシーはラウンド間で高まり得る。また、一つより多い特性の改良が
所望される場合、または、一つより多い新規な特性の獲得が所望される場合、ス
クリーニング性質及びスクリーニングすべき特性はラウンド間で変わり得る。次
いで、組換え及びスクリーニングの追加的ラウンドは、組換えセグメントが十分
に進化して、所望の新しいまたは改良された特性または機能を獲得するまで実施
できる。
【０１０３】 選択したシャッフリングされたウイルスゲノムまたは他の病原体ゲノムあるい
はこれらの部分によって、所望の表現型を満足すべき程度に獲得した後、所望の
表現型の保持には本質的にまたは実質的に重要でない変異を除去することが望ま
しいことがよくある（余剰変異）。余剰変異は戻し交配によって除去できる。そ
れは選択したシャッフリングされたゲノムを一つ以上の親ゲノムおよび／または
天然に存在するゲノム（またはこれらの部分）とシャッフリングし、生成したシ
ャフルされた集合物をスクリーニングして、所望の表現型を保持するものを同定
することを含む。この方法を利用することによって（代表的に、親ゲノムまたは
天然に存在するゲノム（またはこれらの部分）に対する１回以上反復したシャッ
フリング及び所望の表現型の保持についての選択またはスクリーニング）、実質
的に所望の表現型（例えば弱毒化）を与えるのに必要な変異のみを組み込んだ選
択されたシャッフラントを作製し、分離することができ、他方、ゲノム（または
その部分）の残りは、親（または野生型）配列に実質的に一致する配列からなる
。戻し交配の一例として、ウイルスゲノムをシャッフルさせ、標的宿主細胞にお
ける弱毒化を選択することができる；生じた選択されたシャッフルラント（ｓｈ
ｕｆｆｌａｎｔ）は、ウイルスの臨床的分離物の一つ以上のゲノムと戻し交配さ
れ、弱毒化の保持に関して選択され得る。このような戻し交配を数サイクル行っ
た後、上記戻し交配は、弱毒化のために必要な変異を含み、それ以外では上記ウ
イルスの臨床的分離物のゲノムに実質的に一致するゲノム配列を有する、ウイル
スゲノムを与える。
【０１０４】 弱毒化ワクチンを得るために有用な手段の型の例、及び所望の特性を有するワ
クチンを同定することに適したスクリーニング／選択技術の例を、次の章に記載
する。
【０１０５】 （ＩＩＩ．弱毒化ワクチンの実証例） 本発明は弱毒化ワクチン、及び広範な種々の特性を有する弱毒化ワクチンを得
る方法を提供する。これらの及び他の所望の特性を有する弱毒化ワクチンを得る
ために、特定の所望される特性に特異的な、適切なスクリーニング方法および／
または選択方法を用いる。スクリーニング方法および／または選択方法を組み合
わせて用いて、所望される改良を一つより多く示す弱毒化ワクチンを得ることが
できる。下記は弱毒化のウイルスワクチン及び細菌ワクチンの型、ならびにこの
ようなワクチンを得る方法の実証例である。他の所望の特性を有する弱毒化ワク
チンを同定することに適するような、異なる選択方法／スクリーニング方法も用
いることができる。類似の方法は、弱毒化の真菌ワクチン及び寄生虫ワクチンの
開発にも有用である。
【０１０６】 （１．非病原性キメラワクチン） いくつかの実施形態において、本発明は、病原性ウイルスまたは他の生物体か
らの一つ以上の免疫原性ポリペプチドをコードする核酸が導入される、キメラウ
イルス、キメラ細菌またはその他のキメラ生物体を提供する。本発明において好
ましい実施形態において、キメラワクチンは非病原性である。病原性ウイルス及
び非病原性ウイルスまたは生物体の両方は同じ種でもよい（例えば、病原性系統
からの免疫原性ポリペプチドのコード領域が、非病原性系統に導入されている）
。これらの方法は、例えば、或る生物体またはウイルスの多くの系統由来の、免
疫原性ポリペプチドを発現する多価ワクチンの開発に有用である。一例として、
ヒトパピローマウイルス系統から誘導されるワクチンは、代表的には、他のＨＰ
Ｖ系統に対して交差防御しない。本発明の方法を用いることによって、多価の交
差防御性ＨＰＶ系統を得ることができる。或いは、病原性ウイルス及び非病原性
ウイルスまたは生物体は異なる種でもよい。一例として、ワクシニアウイルスは
、例えば、ＨＩＶのｇｐ１２０のような免疫原性ポリペプチドをコードする核酸
のための非病原性キャリアとして機能し得る。
【０１０７】 これらの方法は一般的にはウイルスまたは細胞からの一つ以上の核酸セグメン
トの第一セットを一つ以上の核酸セグメントの第二セットで組換えることを含む
。第二セットの核酸セグメントは一般的に一つ以上のポリペプチド、またはその
部分（これらは上記ポリペプチドを含むウイルスまたは細胞に、ワクチン接種の
ために所望の特性を与える）をコードする。例えば、核酸セグメントの第二セッ
トは、ウイルスまたは細胞の病原性株からの免疫原性ポリペプチド、アジュバン
トまたは免疫調節分子等をコードすることができる。
【０１０８】 生成した組換えＤＮＡフラグメントのライブラリーを、次いでスクリーニング
してウイルスまたは細胞に所望特性の改良を与えるものを確認する。本発明の好
ましい実施形態において、組換えフラグメントを含むウイルスまたは細胞をスク
リーニングして上記ウイルスまたは細胞を組み込んだ宿主生物体に存在する生理
的条件下で弱毒化されたか、または弱毒化されたままである（すなわち、非病現
性）ウイルスまたは細胞を同定する。弱毒化のためのスクリーニングはその他の
所望特性の改良のためのスクリーニングの前に、または後に、または同時に行う
ことができる。
【０１０９】 幾つかの実施形態では、組換えはインビボにおいて行われる。例えば病原性細
胞の少なくとも部分的ゲノムライブラリーを含むＤＮＡフラグメントのライブラ
リーを複数の非病原性細胞に導入することができる。病原性細胞からのフラグメ
ントの少なくとも一つが非病原性細胞のゲノムまたはエピソープの一セグメント
で組換えられ、改変細胞を生成する。改変細胞をスクリーニングして、非病原性
ではあるが病原性細胞に対して免疫応答を誘発することができる方向に進化した
ものを確認する。病原性細胞に対する免疫応答を誘発することができる方向に進
化した生成した非病原性細胞は弱毒化ワクチンとしての使用に適切である。
【０１１０】 所望ならば、非病原性であり、かつ病原性細胞に対して免疫応答を誘発する能
力を発達した改変細胞からのＤＮＡを、病原性生物体からのＤＮＡフラグメント
のさらなるライブラリーで組換えることによってさらに改良することができる。
病原性生物体からのフラグメントの少なくとも一つは、改変細胞のゲノムまたは
エピソームのセグメントでの組換えを受け、さらに改変された細胞を産生する。
或いは、非病原性であり、かつ免疫応答を誘発する能力を発達した改変細胞から
のＤＮＡを病原性細胞からのＤＮＡで組換えて、さらに改変された細胞を産生す
ることができる。次いで、上記さらに改変された細胞をスクリーニングし、非病
原性であり、かつ病原性細胞に対して免疫応答を誘発するさらなる能力を進化す
るさらに改変された細胞を同定する。上記組換え及び選択／スクリーニング段階
はさらに改変された細胞が非病原性であり、かつ病原性細胞に対する免疫応答誘
発能力を獲得するまで必要に応じて繰り返すことができる。
【０１１１】 本発明の組換え及び選択／スクリーニングの方法は、キャリアとして使用する
ための弱毒化ウイルスまたは細胞を得る手段だけでなく、増強された抗原の発現
及び抗原の改良された免疫原性等、特性の改良を示すキメラウイルスまたは生物
体を得るために用いることができる手段も提供する。抗原をコードする遺伝子を
、非病原性ウイルスまたはその他のワクチン生物体とは別に組換えに供すること
ができる；或いは、ウイルス全体または部分的ウイルス、細菌または寄生虫ゲノ
ムに対して組換えを行うことができる。抗原発現及び免疫原性を改良する方法は
、同時係属出願の、共通に割り当てられた米国特許出願第０９／２４７，８９０
号（１９９９年２月１０出願）に記載されている。組換え抗原性ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドは、プロモーター、例えば高活性または組織特異的
プロモーター等の制御下に置かれ得る。上記抗原性ポリペプチドを発現するため
に用いられるプロモーター自体、本明細書中に記載の方法に類似の組換え及び選
択法を用いて最適化することができる（例えば１９９９年２月１０日提出の米国
特許出願第０９／２４７，８８８号を参照されたい）。
【０１１２】 幾つかの実施形態において、本発明の方法を使用して、所望の特性を有するウ
イルス様粒子（ＶＬＰ）が得られる。ＶＬＰは、ウイルス複製のために必要なウ
イルス成分を欠き、したがってウイルスの常に弱毒化された形態である。ＶＬＰ
は複数のウイルス株からの抗原を示すことができ、したがって多価ワクチンとし
て有用である。数種のウイルスからのウイルスタンパク質はＶＬＰを形成するこ
とが公知である。これらにはヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ（カング（Ｋａｎ
ｇ）ら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０巻：３５３−６４ページ（１９９９））、
セムリキ森林ウイルス（ノトカ（Ｎｏｔｋａ）ら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０
巻：３４１−５２ページ（１９９９））、ヒトポリオーマウイルス（ゴールドマ
ン（Ｇｏｌｄｍａｎｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３巻：４４６５−９ページ（１
９９９））、ロタウイルス（ジアング（Ｊｉａｎｇ）ら、Ｖａｃｃｉｎｅ １７
巻：１００５−１３ページ（１９９９））、パルボウイルス（カサル（Ｃａｓａ
ｌ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、２９巻、２部、１４１−１５０ページ（１９９９））、イヌパルボ
ウイルス（ハータド（Ｈｕｒｔａｄｏ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０巻：５４２２
−９ページ（１９９６））、及びＥ型肝炎ウイルス（リー（Ｌｉ）ら、Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．７１巻：７２０７−１３ページ（１９９７））がある。
【０１１３】 病原性細胞に対する免疫応答誘発能力のスクリーニングは、当業者に公知の方
法を用いて実施できる。本発明の好ましい実施形態において、上記スクリーニン
グは、哺乳動物に接種した際の改変細胞の防御免疫誘発能力を試験することによ
って行われる。
【０１１４】 （２．高効率の感染性及び防御性について進化した複製不全ウイルスワクチン
） 別の実施形態において、本発明は、高効率で標的細胞に感染するが、ひとたび
その細胞が感染されると、複製は、たった１ラウンドであるか、または全く複製
されないように進化した複製不全ウイルスを提供する。複製不全ウイルスは合理
的デザイン（例えばウイルス複製に関係する遺伝子の標的化された破壊）によっ
てか、または本発明の組換え及びスクリーニング／選択法によってのどちらかに
より得られる。こうして得られた複製不全ウイルスの核酸は組換えられ、次いで
、宿主細胞に良く取り込まれるウイルスについて選択される。スクリーニングは
、例えばウイルスを含む細胞の蛍光活性化細胞分類（Ｍｘのような遺伝子の発現
に基づく）によって達成される。ウイルスはこれらの細胞から回収され、宿主細
胞に再感染され、再分類される。スクリーニング／選択を１回以上反復した後、
個々のコロニーを細胞培養基におけるそれらの複製能力に関して分析した。宿主
細胞内で複製しないものは、ワクチンとしてのさらなる試験（例えば、感染細胞
において“抗ウイルス状態”を誘発する能力の試験）に適する。ここでも戻し交
配を用いて、複製を阻止する変異は含むが、免疫原性を減らす他の変異は含まな
いというウイルスワクチンを得ることができる。
【０１１５】 （３．ポリペプチドコード領域における終止コドンの挿入によって弱毒化した
ワクチン） 別の実施形態において、本発明は弱毒化ワクチン、及び弱毒化ワクチンを得る
方法を提供する。ここでは多数の終止コドンがワクチンウイルスまたはその他の
生物体の核酸内に導入される。このためこれらの弱毒化ワクチンは、複製するた
めに宿主細胞内のサプレッサーｔＲＮＡの存在を必要とする（ドラブキン（Ｄｒ
ａｂｋｉｎ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６巻：９０７−１３ページ（
１９９６）；パーク（Ｐａｒｋ）及びラジュバンダリー（ＲａｊＢｈａｎｄａｒ
ｙ）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８巻：４４１８−２５ページ（１９９８
））。従って、ワクチンウイルスまたはその他の生物体のゲノムに導入される終
止コドンに対応する適切なサプレッサーｔＲＮＡ（例えばアンバー、オーカー、
フレームシフトまたはその他のサプレッサー）を含む産生細胞が用いられる。好
ましくは、上記終止コドンは、天然に存在するウイルスまたは生物体それぞれに
頻繁には利用されない型の終止コドンである。
【０１１６】 終止コドン含有弱毒化ワクチンは、ウイルスまたはその他のワクチン生物体か
らの核酸セグメント、またはフラグメントの混合物を、ウイルスまたは生物体の
複製のために必要なポリペプチドの少なくとも一部をコードする一つ以上のポリ
ヌクレオチド配列内に散在する一つ以上の終止コドンを含むオリゴヌクレオチド
の集団で組換えることによって得られる。例えば、終止コドン含有オリゴヌクレ
オチドのライブラリーを用いることができる。ここで、オリゴの配列はウイルス
タンパク質についての公知の配列情報に基づいて決められる。フラグメントの混
合物は生物体の完全にまたは部分的に断片化したゲノムでよい。組換え核酸セグ
メントのライブラリーはオリゴヌクレオチドを上記ウイルスまたはその他の生物
体の核酸と一緒に組換えに供することによって生成される。この結果、天然に存
在しない終止コドンが細胞またはウイルスのコード領域に挿入され、従って、対
応するサプレッサーｔＲＮＡの非存在下で、成熟前の翻訳停止を起こす。
【０１１７】 組換え核酸セグメントのライブラリーを、次いで、例えば、異なるように導入
された終止コドンで起こる翻訳停止を抑制するサプレッサーｔＲＮＡを含む生産
細胞に導入して接触させることによってスクリーニングする（例えばドラブキン
（Ｄｒａｂｋｉｎ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６巻：９０７−１３ペ
ージ（１９９６）；パーク（Ｐａｒｋ）及びラジュバンダリー（ＲａｊＢｈａｎ
ｄａｒｙ）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８巻、４４１８−２５ページ（１
９９８）を参照されたい）。その後、産生細胞内で増殖するウイルスまたはその
他の生物体類及び生じる子孫を集める。ここで、本発明の好ましい実施形態にお
いて、次いで、複製するそれらについて、非サプレッサー細胞における複製能力
を試験した。接種されるべき哺乳動物の細胞を試験するのが好ましい。非サプレ
ッサー細胞内では複製しない子孫ウイルスまたはその他の生物体は弱毒化ワクチ
ン生物体としての使用に適切である。
【０１１８】 （４．条件つきで複製する変異株の選択） 幾つかの実施形態において、本発明は、接種された宿主哺乳動物において生理
的条件下では増殖できないが、ワクチン産生に用いられる条件のような、許容条
件下では複製し得る弱毒化ワクチンを提供する。許容条件には、産生細胞の性質
、または接種された宿主哺乳動物の細胞内の対応する生理的条件とは異なる増殖
条件等がある。例えば許容条件は、接種された哺乳動物に見いだされる生理的条
件とは異なる温度、ｐＨ、糖含有量、補体成分および／または血清タンパク質の
存在又は非存在等であり得る。許容条件としては接種された宿主哺乳動物には存
在しない必須栄養の存在もあり得る。
【０１１９】 そのようなワクチンを得る方法も本発明によって提供される。細菌ワクチン、
寄生虫ワクチン、及びその他の細胞全体ワクチンでは、これらの方法は一般的に
は組換えＤＮＡフラグメントのライブラリーを細菌細胞集団に導入することを含
む。組換えフラグメントは、細胞のゲノムまたはエピソームに挿入され得る全ま
たは部分的細菌ゲノム、または組換え遺伝子である。次いで、改変細胞をスクリ
ーニングし、宿主生物体に見いだされるような生理的条件下では増殖能力を失う
方向に進化した条件付き欠陥細胞を同定する。条件付き欠陥細胞をその後スクリ
ーニングして許容条件下で複製できる能力に向かって進化した改変細胞を確認す
る。許容条件下では複製するが宿主哺乳動物では複製しない改変細胞は、弱毒化
ワクチン生物体として適切に試験できる。
【０１２０】 弱毒化のさらなる改良が必要ならば、組換え及びスクリーニングのさらなるラ
ウンドを行うことができる。生理的条件下では複製不可能の方向に、複製可能条
件下では複製できる方向に進化した改変細胞からのＤＮＡを、ＤＮＡフラグメン
ト、ゲノム、または部分ゲノムのその他のライブラリーで組換える。組換えＤＮ
Ａを改変細胞に挿入し、さらに改変された細胞を生産する。或いは、所望機能の
方向に進化した改変細胞間でＤＮＡを組換え、さらに改変された細胞を産生こと
ができる。次いで、上記さらに改変された細胞をスクリーニングして、生理的条
件下では複製能力を失い、許容条件下では複製する方向にさらに進化した細胞を
同定する。これらの段階を、さらに改変された細胞が宿主哺乳動物における生理
的条件下では複製能力を失い、許容条件下では複製能力を獲得するまで、必要に
応じて繰り返すことができる。
【０１２１】 条件に敏感な弱毒化ウイルスワクチンを得るために、ウイルスゲノムの組換え
ライブラリーを、ウイルス複製に影響し得る条件に関して標的哺乳動物の条件に
類似する適切な試験細胞に導入することができる。ウイルス含有細胞を、温度、
ｐＨ、糖含有量、またはその他の条件を高めたり低めたりして培養し、そして、
新たなラウンドの組換え及び選択のために、生存しているウイルスを選択した。
変化する温度、またはその他の条件において増殖するウイルスをさらに分析し、
接種すべき哺乳動物に見いだされる温度またはその他の条件では複製しないウイ
ルスを同定する。それに加えて、条件に敏感なウイルスを天然の宿主において、
それらの病原性及び防御的免疫応答誘発能力を分析するのが概ね好ましい。本明
細書に議論するような戻し交配を用いて弱毒化ワクチンを得ることができる。こ
こで、それ以外ではその免疫原性、またはワクチンとしての有効性に関連するそ
の他の特性に関して改変されていないウイルスにおいて、条件感受性を担う変異
遺伝子が見いだされる。
【０１２２】 いくつかの実施形態において、組換え核酸を胚の卵（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｅ
ｇｇ）の尿膜の腔（ａｌｌａｎｔｏｉｄ ｃａｖｉｔｙ）に導入することによっ
て、ウイルスワクチンをスクリーニングする。或いはインビトロ組織培養を用い
ることができる。この選択スキームでは培養細胞として、組織培養において異な
る要求（例えば温度やその他の条件について）を有する種々の種からの細胞の混
合物を用いることができる。これによってインビトロにおける変化する条件下で
培養した際に起こり得る宿主細胞の生存及び増殖の潜在的損失を克服することが
できる。
【０１２３】 （５．変化した宿主細胞特異性） 本発明によって、変化した宿主特異性をあらわすように進化した弱毒化ワクチ
ンもまた、提供される。一つの目的は、ワクチン株の効率的な生産を可能にする
細胞型および／または生物体では特に増殖することができるが、それらが疾患を
起こし得る天然の宿主細胞または生物体では増殖できないウイルス株、細菌株、
または寄生虫株を生成することである。
【０１２４】 一例として、異なる種からの細胞株を用いることによって選択圧を徐々に変え
ることができる。ウイルスまたはその他の生物体を天然の宿主及び系統学的に関
連する種において同時に増殖させることから始めることができる。例えば弱毒化
ヒトウイルスを生成する場合、そのウイルスをサル細胞とヒト細胞の両方におい
て増殖させることによって始めることができる。その後、ウシ細胞株でもまた増
殖する変異体を選択し始め、ヒト細胞を培養系から除去する。シャッフリング及
び選択の反復のラウンドの後、非天然宿主細胞で特異的に増殖する変異体株を見
いだすことができるようである。本発明の好ましい実施形態において、上記変異
株はヒト細胞では複製しない。これらのスクリーニング法はシャッフリングされ
たウイルスのプールしたライブラリー全体を用いて行うことができ、取り扱われ
るサンプル数を有意に減らすことができる。
【０１２５】 その上、多くの細胞系よりもむしろ選択した宿主細胞にのみにおけるウイルス
増殖をスクリーニングすることによって、弱毒化株を選択することができる（す
なわち宿主細胞特異性の制限）。この選択系は、免疫応答を誘発するに十分な、
身体の或る細胞において複製し得るウイルスの産生を可能にするが、この制限さ
れた細胞特異性はウイルスの病原性を減らし、したがって臨床的症状を防止する
。
【０１２６】 宿主細胞における複製を調節する遺伝子及び重要な抗原決定基は異なる遺伝子
によってコードされるようなので、戻し交配は、防御的免疫応答の誘発のために
重要なエピトープの最大数を保持する手段を提供する。
【０１２７】 （６．産生細胞中で速やかに増殖するが、宿主細胞では増殖が低下する） 本発明はまた、産生細胞中で速やかに増殖するが、接種された宿主細胞では増
殖が低下する弱毒化ワクチンを提供する。例えば、まず最初に産生細胞系または
培養条件における増殖に関して選択し、その後組換えウイルスのライブラリーを
作製し、そしてこれらを個々に天然の宿主細胞における増殖について試験する。
天然の宿主細胞で最も遅い増殖速度を有するクローンを選択し、そして、新たな
シャッフリング及び選択のラウンドに供する。産生細胞における高増殖及び宿主
細胞における低増殖についての選択を繰り返す。この方法の利点は、弱毒化及び
高収率産生についての同時の選択及びスクリーニングが行われることである。或
いは、まず最初に宿主細胞で遅い増殖を示す個々のクローンを選択し、次いで、
産生細胞における増殖選択することができる。ここでも、新たなシャッフリング
及び選択のラウンドのために、選択された変異体／キメラは選択される。
【０１２８】 （７．標的細胞または標的細胞レセプターへの付着に基づくスクリーニング） 本発明はまた、標的宿主細胞への減少した接着を示すウイルスワクチンをスク
リーニングして同定する方法も提供する。変異体／キメラウイルスのライブラリ
ーを、ウイルスの侵入及び複製が所望されない型の細胞の存在下でインキュベー
トする。細胞と結合しない、または細胞に入らないウイルスを上澄液から採取す
る。速度論的研究を行い、上記細胞への特異的結合を示すウイルスを最も効率的
に除去する最適なインキュベーション時間を決定することができる。また、それ
らの特異的細胞表面レセプターに結合する能力を保持している変異体／キメラの
最適な除去を達成するために、数回の細胞パンニングが必要とされ得る。
【０１２９】 インタクトな細胞に加えて、所定のウイルスのための細胞表面レセプターが同
定された場合には、精製されたウイルスレセプターを上記パンニングに用いるこ
ともできる。この系では、ウイルスを、溶液中またはプレートに架橋した精製（
例えば、組換え）レセプターと混合する。上記レセプターに結合するウイルスは
、例えば上記レセプターに特異的なモノクローナル抗体を使用することによるか
、または単に、それらをプレートに架橋しているレセプターと結合させることに
よって捕捉する。引き続き、上記ウイルスをその後産生細胞における増殖に関し
て選択し、シャッフリング及び選択を、さらなる最適化のために所望通り繰り返
される。上記選択は、上記特異的レセプターとの結合と、産生細胞における増殖
との間で変動する。
【０１３０】 （８．補体に対する感受性に基づく選択） 弱毒化ウイルスはまた、それらの補体または補体成分に対する感受性に基づい
て選択することもできる。組換えウイルスのライブラリーをＤＮＡシャッフリン
グ等の方法、好ましくはファミリーシャッフリングによって作製する。ウイルス
の個々のクローンを産生細胞中で増殖させ、引き続き、補体または補体成分の存
在下で培養する。補体にさらした際の減少したウイルス力価を示すクローンを、
新たなシャッフリング及び選択のために選択する。補体によって死滅しやすいウ
イルスは、インビボで病理を誘発する能力が多分著しく低下しているようである
が、それらはまだ将来の感染を防御する免疫応答は誘発するようである。
【０１３１】 さらに、精製された補体成分（例えば、Ｃ３またはその成分）に結合するウイ
ルス変異体／キメラを選択することができる。補体成分の上記ウイルスへの結合
は補体仲介性死のカスケードを誘導し得、そしてこれはまた、ウイルスのオプソ
ニン作用を起こす可能性があり、それによってそれらウイルスは単球のような食
細胞によって死滅しやすくなる。補体成分に結合する変異体／キメラの選択は、
例えばパンニングまたはアフィニティークロマトグラフィーによって行われ得る
。
【０１３２】 （９．免疫無防備状態の動物のみにおける増殖に関する選択） 弱毒化ワクチン株についてのさらなる選択系には、免疫無防備状態の宿主のみ
における増殖に関するスクリーニングがある。ある系統の遺伝的免疫無防備状態
の系統、例えば免疫不全マウス系統等が利用可能である。このような系統には非
制限的に、ＳＣＩＤマウス、ヌードマウス、及びＲＡＧ１またはＲＡＧ２遺伝子
をコードする遺伝子の欠乏が与えられたマウス等がある。しかし重要なのは、実
際にはどの宿主種も薬剤処置または照射によって一過性に免疫不全が与えられ得
るということである。免疫抑制薬には、非制限的に、シクロスポリンＡ、ＦＫ５
０６、ＩＬ−１０、可溶性ＩＬ−２レセプター、ステロイド及び、メトトレキセ
ート等の抗増殖癌抑制薬がある。
【０１３３】 個々のウイルス、細菌または寄生虫クローンは、それらの遺伝的免疫不全宿主
または一過性免疫無防備状態の宿主のいずれかにおける増殖能力について試験さ
れた。免疫無防備状態の宿主で十分増殖する個々のクローンでは、次いで、正常
宿主における増殖について試験された。免疫無防備状態の宿主では増殖するが、
免疫応答性宿主では、新たなシャッフリング及び選択のラウンドのために、遅い
増殖を示すクローンを選択される。
【０１３４】 さらに、ウイルスまたはその他の病原体は、免疫無防備状態の宿主（それらが
通常は増殖しない組織）において増殖するかもし得る。これは、免疫無防備状態
の宿主における組織特異性が変化したウイルス、細菌、または寄生虫の変異体／
キメラの選択を可能にする。この選択系において、上記宿主にウイルスまたはそ
の他の生物体のライブラリーを感染させ得、新規の標的組織からウイルス、細菌
、または寄生虫を採取することができる。次いで、これらの組織からの個々のク
ローンを、免疫応答性宿主及び産生細胞における増殖について試験することがで
きる。その他のシャッフリング形式の場合のように、選択された変異体／キメラ
をシャッフリング及び選択のさらなるラウンドに供することができる。
【０１３５】 （１０．死滅する病原体変異体の選択は、Ａｂ応答単独によってか、または正
常血清中の成分により、それらに、より少ないビルレントしか与えない） ウイルス及びその他の感染に対する免疫防御は概して細胞仲介性及び体液性免
疫応答の両方を含む。弱毒化ウイルスまたは細胞株はこれらのメカニズム単独の
どちらか１つによって殺される変異体／キメラをスクリーニングすることによっ
て選択できる。例えば、Ｔ細胞性免疫応答がなくても特異的抗体のみによって殺
されるウイルスまたは細胞変異体を選択できる。先ず最初に、野生型ウイルスま
たは細胞に対する抗血清を免疫化によって作成する。その後、ウイルスまたは細
胞の変異体／キメラのシャッフリングされたライブラリーを上記抗血清と混合し
、そして抗血清によって認識されるウイルスまたは細胞を、さらなる分析のため
に選択する。次いで、これらのクローンについて個々に、上記抗血清がそのウイ
ルスまたは細胞の機能を中和するかどうかを試験する。これらの研究はインビボ
もしくはインビトロのいずれか、または両方で行うことができる。例えば、先ず
最初に上記抗血清または抗血清のプールがインビトロで上記ウイルスまたは細胞
改変体を中和するかどうかを分析し、次いで、これらの個々のクローンを病原性
及び免疫誘発能力についてインビボで試験できる。
【０１３６】 この選択系の変形において、免疫されていない宿主からの血清を用いて、その
宿主に通常存在する血清成分によって中和されるウイルスまたは細胞の改変体を
同定することもできる。上述のように、ウイルス増殖を制限する血清成分として
は補体及び補体成分が挙げられ得る。しかし全血清の使用によって、正常血清に
存在するさらなる作用物質によって死滅に関する進化を可能にし得る。このよう
な変異体／キメラもまた、インビボで弱毒化表現型を有するようである。他の組
換え及びスクリーニング／選択形式におけるように、さらなる最適化が所望であ
れば、上記選択された変異体／キメラを新たなシャッフリング及び選択のラウン
ドに供することができる。
【０１３７】 （１１．最適弱毒化を得るための選択系の組み合わせ） 最適弱毒化は数種の異なる選択メカニズムを組み合わせることによって得られ
得る。例えば、最適弱毒化は、従来的ではない宿主細胞（例えばウイルスまたは
細胞のための通常の宿主以外の種からの細胞系）において、変化した温度で増殖
する変異体を同時に選択することによって達成することができる。ウイルスまた
はその他の生物体の機能においてこのような大きい変化をもたらすためには、段
階的選択圧が重要であるかも知れない。温度は漸進的に容易に高めたり低めたり
され、そして異なる種に由来する細胞の混合物を用いて、非宿主組織において増
殖するように徐々に適応させることができる。
【０１３８】 さらに、インビトロ及びインビボ選択系を組み合わせて用いることができる。
先ず最初に、通常、所定のウイルスの標的細胞である細胞に結合しない変異体を
インビトロで選択する。この形式において、天然の宿主細胞及びウイルスのライ
ブラリーを混合物としてインキュベートし、次いで、結合しない変異体を採取し
、そして宿主細胞によってこのプールから除去されるウイルスが最小になるかま
たは全くなくなるまでこのプロトコルを繰り返す。その後、残った集団をでプー
ルとしてまたは個々の組換えウイルスとしてインビボ分析する。病理及び免疫応
答の誘導を測定する。例えば、変異体ウイルスを動物に注射し、病理を観察し、
病気になる動物を排除し、次いで、残った動物を、野生型ウイルスで攻撃するこ
とによって分析する。弱毒化変異体の接種後、防御免疫を生じた動物は、野生型
感染性ウイルスを用いる攻撃に耐え生き残る。これらは新たなシャッフリング及
び選択のラウンドのために選択され得る。この場合も、野生型ウイルスとの戻し
交配を用いて、免疫学的に重要な残基を最大数残すことができる。
【０１３９】 （１２．母系抗体による認識から逃れ得るワクチン株の進化） 本発明はまた、母系抗体によって認識されないワクチンを生成するのに有用で
ある。低減された母系抗体結合を示すワクチンは、向上した効力を有すると期待
される。このようなワクチンを得るために、潜在的なワクチン生物の全ゲノムま
たは部分ゲノムのいずれかをコードする核酸、あるいは特定の免疫原性ポリペプ
チドをコードする核酸を、本明細書に記載のように、組換えに供する。得られた
組換え核酸は次に細胞またはウイルス中に導入され、これは次に負の選択を受け
て、母系抗体によって認識されるワクチンがライブラリから除去される。母系抗
体によって認識されないワクチンの負の選択のための典型的な方法は、限定され
ないが、母系抗体で被覆されたフラスコまたはカラムを用いた親和性選択を包含
する。
【０１４０】 ファミリーシャッフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）アプローチは、異なる株の
キメラを同時に生成する点で有利である。これらのキメラは次に、至適な免疫原
性およびインビボでの干渉効果についてスクリーニングされ得る。これらの多価
株は、親ウイルスまたは細胞の、全ての異なる、存在および発生する変異体に対
する干渉効果を誘導するので、より強力となりそうである。いくつかの実施形態
において、組換え核酸を含むウイルスまたは細胞のライブラリが生成され、そし
てこれらのライブラリは、最初に、各々の細胞またはウイルスに対して予め免疫
された動物由来の抗体に対する結合の欠損についてスクリーニングされる。選択
されたワクチンの免疫原性は、動物を免疫し、そして次に、このワクチン接種さ
れた動物に、生きているウイルスまたは細胞の異なる株によって抗原投与するこ
とによって、確認される。
【０１４１】 （１３．より安定な弱毒化ワクチン株の進化） 生存生物の固有の不安定さは、製造、貯蔵、および投与の間の弱毒化ワクチン
株の生存率の安定化および保護の点で、難題を与える（Ｂｕｒｋｅら、Ｃｒｉｔ
．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．（１９９９）１６
：１−８３）。いくつかの弱毒化ワクチン株の不安定さのため、ワクチンの貯蔵
寿命は、多くの場合、限定され、そのため、獣医学用途のためのワクチンの実用
性が低下し、あるいは未開地域または熱帯地域でのその使用が制限される。この
ような例には、限定されないが、ウシのための牛疫ワクチン（Ｈｏｕｓｅおよび
Ｍａｒｉｎｅｒ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．（１９９６）８７：２３５−
４４）および水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）ワクチン（Ｆａｎｇｅｔおよび
Ｆｒａｎｃｏｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．（１９９６）８７：１６７−
７１）が含まれる。これらのワクチン株の安定性は、本発明の方法によって向上
し得る。
【０１４２】 ワクチン株のライブラリを、本明細書に記載の組換え法、例えば、ＤＮＡシャ
ッフリングによって生成し、そして得られたライブラリを安定性について分析す
る。異なる温度、処方および時間を用いて、所望の特性を有するウイルスまたは
細胞の増殖のみを可能にする淘汰圧を生じさせ得る。さらに、ウイルスおよび細
胞ライブラリを、凍結乾燥、再構成して、最も安定なウイルスまたは細胞を再構
成後の種々の時間に選択することができる。向上した安定性を示すウイルスまた
は細胞を、シャッフリングおよび選択の新規ラウンドに供し得る。引き続き、免
疫および抗原投与の研究を用いて、弱毒化、免疫原性および安定性の程度をさら
に評価することができる。
【０１４３】 （ＩＶ．弱毒化ワクチンの使用） 本発明の弱毒化ワクチンは、ウイルスまたは細胞性病原体によって引き起こさ
れる種々の疾患および状態を処置および／または予防するのに有用である。本発
明の方法を用いて得られる弱毒化ワクチンは、ワクチン接種におけるその有効性
を増強するために、さらに改変され得る。例えば、弱毒化ワクチン中に、同時係
属中の、同一譲受人に対する、１９９９年２月１０出願の米国特許出願第０９／
２４８，７１６号に記載のような、免疫刺激性配列を組み込むことができる。ワ
クチンベクターは、１９９９年２月１０日出願の米国特許出願第０９／２４７，
８８８号に記載のように、特定のタイプの免疫応答、例えばＴH１またはＴH２応
答を指向するように改変され得る。特定の標的細胞型（例えば、抗原提示細胞ま
たは抗原プロセシング細胞）に対してターゲッティングされるワクチンを用いる
ことが、ときとして有利である。適切なターゲッティング法は、同時係属中の、
同一譲受人に対する、１９９９年２月１０出願の米国特許出願第０９／２４７，
８８６号に記載されている。
【０１４４】 本発明の方法を用いて得られる弱毒化ワクチンは、ワクチン自体に対する予防
的または治療的免疫応答を誘導するための用途のみならず、ワクチンの骨格は、
他の薬学的に有用なタンパク質を細胞中に運ぶためにも用いられ得る。このよう
な分子は、例えば、ワクチン抗原、免疫調節分子、治療的タンパク質などを含む
。
【０１４５】 ワクチン送達のための適切な処方および投薬レジメンは、当業者に周知である
。本発明のワクチンは、哺乳類（ヒトを含む）に送達され、治療的または予防的
免疫応答を誘導し得る。ワクチン送達ビヒクルは、個別の患者に対する投与、典
型的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、頭蓋内、肛門、膣
、経口、頬の経路によって、あるいは吸入され得る）によって、インビボで送達
され得、あるいは局所適用によって投与され得る。あるいは、ワクチンはエキソ
ビボで、細胞、例えば個別の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄
吸引物、組織生検材料）または普遍的なドナーの造血幹細胞に、送達され、次い
で、この細胞を、通常、ベクターを取り込んだ細胞を選択した後に、患者に再び
移植することができる。
【０１４６】 多数の送達方法が当業者に周知である。このような方法は、例えば、リポソー
ムベースの遺伝子送達（ＤｅｂｓおよびＺｈｕ（１９９３）ＷＯ９３／２４６４
０；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ（１９８８）Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅ ６（７）：６８２−６９１；Ｒｏｓｅ、米国特許第５，２７
９，８３３号；Ｂｒｉｎｇｈａｍ（１９９１）ＷＯ９１／０６３０９；およびＦ
ｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８４：７４１３−７４１４）、ならびに、ウイルスベクターの使用（例えば、ア
デノウイルス（例えば、Ｂｅｒｎｓら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．７７２：９５−１０４；Ａｌｉら（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１
：３６７−３８４；およびＨａｄｄａｄａら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９（Ｐｔ３）：２９７−３０６を概説
のために参照）、パピローマウイルス、レトロウイルス（例えば、Ｂｕｃｈｓｃ
ｈｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（５）２７３１−２７３９；Ｊｏｈ
ａｎｎら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（５）：１６３５−１６４０（１９
９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９
；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８；Ｍ
ｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；Ｗｏ
ｎｇ−Ｓｔａａｌら、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００、およびＲｏｓｅｎｂｕｒ
ｇおよびＦａｕｃｉ（１９９３）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ，第３版、Ｐａｕｌ（編）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋおよびその中の参照、ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９
９４）前出参照）、およびアデノ随伴ウイルスベクター（Ｗｅｓｔら（１９８７
）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７；Ｃａｒｔｅｒら（１９８９）米国特
許第４，７９７，３６８号；Ｃａｒｔｅｒら、ＷＯ ９３／２４６４１（１９９
３）；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７
９３−８０１；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９
４：１３５１およびＳａｍｕｌｓｋｉ（前出）をＡＡＶベクターの概観のために
参照；また、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔ
ｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（１１）：３２５１
−３２６０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
、４：２０７２−２０８１；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８
４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６４６６−６４７
０；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）およびＳａｍｕｌｓｋｉら（１９８９
）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８参照）等を含む。
【０１４７】 弱毒化ワクチンのゲノムを含む「裸の」ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、組織
、例えば筋肉中に直接導入することができる。例えば、ＵＳＰＮ５，５８０，８
５９参照。他の方法、例えば「バイオリスティック」またはパーティクル仲介形
質転換（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄら、ＵＳＰＮ４，９４５，０５０；ＵＳＰＮ５
，０３６，００６参照）もまた、本発明に従って、ワクチンを哺乳類の細胞中に
導入するのに適している。これらの方法は、哺乳類中へのＤＮＡのインビボ導入
のためのみならず、哺乳類に再導入するための細胞のエキソビボ修飾のためにも
有用である。ワクチンを送達するための他の方法の場合と同様に、ワクチン投与
は、免疫調節の所望のレベルを維持するために、必要であれば、繰り返される。
【０１４８】 弱毒化ワクチンは、哺乳類に直接投与され得る。本発明の方法を用いて得られ
るワクチンは、予防的および／または治療的処置のために、非経口（例えば、皮
下、筋肉内、皮内、または静脈内）、局所、経口、直腸、鞘内、頬（例えば、舌
下）、または局所投与（エーロゾルまたは経皮）を含む、任意の適切な方法で投
与するための薬剤組成物として処方され得る。例えば、毛髪除去剤の使用による
皮膚の前処置は、経皮送達において有用であり得る。特定の組成物を投与するた
めに１つより多くの経路が用いられ得るが、特定の経路が、多くの場合、他の経
路よりも、より迅速、かつ、より有効な反応を与え得る。
【０１４９】 薬学的に許容可能なキャリアは、一部は、投与される特定の組成物によって決
定され、同様に、組成物を投与するために用いられる特定の方法によって決定さ
れる。従って、多様な、本発明の薬剤組成物の適切な処方が存在する。例えば、
Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍ
ｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、１−３巻（１９９８）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５版、Ｍａｃｋ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉ
ａ（１９８０）および同様の刊行物参照。緩衝化生理食塩水などの種々の水溶性
キャリアが使用され得る。これらの溶液は、滅菌であり、通常、所望されない物
質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る
。組成物は、生理学的条件に近づけるために、必要に応じて、ｐＨ調節および緩
衝剤、毒性調節剤など薬学的に許容可能な補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、
塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含み得
る。これらの処方中の弱毒化ワクチンの濃度は広範囲に変化し得、そして選択さ
れた投与の特定の様式ならびに患者の必要に応じて、流体容積、粘度、体重など
に主として基づいて選択される。
【０１５０】 経口投与に適した処方は、（ａ）液体溶液、例えば、水、生理食塩水またはＰ
ＥＧ４００のような希釈剤中に懸濁した、有効量のパッケージされた核酸；（ｂ
）カプセル、サシェまたは錠剤、各々、所定量の活性成分を、液体、固体、顆粒
またはゼラチンとして含む；（ｃ）適切な液体中の懸濁液；および（ｄ）適切な
乳濁液から構成され得る。錠剤形態は、１つまたはそれ以上の、乳糖、ショ糖、
マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、バレ
イショデンプン、トラガカント、微晶質セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、
コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン
酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填剤、結着剤、
希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、着香料、染料、崩壊剤、および薬学的に適合
性のキャリアを含み得る。トローチ形態は、香味料、通常、ショ糖およびアラビ
アゴムまたはトラガカント中に活性成分を含み得、そして香錠は、ゼラチンおよ
びグリセリンまたはショ糖およびアラビアゴムエマルション、ゲルなどの不活性
基剤中に活性成分を含み得、活性成分に加えて当該分野で公知のキャリアを含み
得る。弱毒化ワクチンは、経口投与される場合、消化から保護されなければなら
ないことが、認識される。これは、典型的には、ワクチンを、これを酸性または
酵素による加水分解に対して耐性にする組成物と複合化することによって、ある
いはワクチンをリポソームのような適切な耐性キャリア中にパッケージングする
ことによって、達成される。ベクターを消化から保護する手段は、当該分野で周
知である。薬剤組成物は、例えばリポソーム中にカプセル化され得、あるいは活
性成分の遅延放出を提供する処方とされ得る。
【０１５１】 弱毒化ワクチンはまた、単独で、あるいは他の適切な成分と組み合わされて、
吸入で投与されるエーロゾル処方に作製され得る（例えば、これは「噴霧」され
得る）。エーロゾル処方は、加圧された許容可能なプロペラント、例えば、ジク
ロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの中に入れられ得る。
【０１５２】 直腸投与のための適切な処方は、例えば、坐剤を含み、これは、坐剤基剤と共
に、パッケージされた核酸からなる。適切な坐剤基剤は、天然または合成のトリ
グリセリドまたはパラフィン炭化水素を包含する。さらに、ゼラチン直腸カプセ
ルを使用することもまた可能であり、これは、パッケージされた核酸と、例えば
、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、およびパラフィン炭化水素を
含む基剤との組合せからなる。
【０１５３】 例えば、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経
路になどによる非経口投与に適した処方は、水性および非水性の等張性滅菌注射
溶液を包含し、これは、酸化防止剤、バッファー、静菌剤、および意図するレシ
ピエントの血液と処方を等張にする溶質、ならびに水性および非水性の滅菌懸濁
液（これは、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含み得る）を
含み得る。本発明の実施において、組成物は、例えば、静脈内注入、経口、局所
、腹腔内、膀胱内または鞘内で、投与され得る。非経口投与および静脈内投与が
、投与の好適な方法である。弱毒化ワクチンの処方は、単位用量または複数用量
の密閉容器、例えば、アンプルおよびバイアルなどの中に入れて、提供され得る
。
【０１５４】 患者に投与される用量は、本発明の文脈中では、患者に、ある期間にわたって
、利益のある治療的および／または予防的応答をもたらすのに十分であるべきで
ある。用量は、使用される特定の弱毒化ワクチンの効力および患者の状態、なら
びに処置される患者の体重または脈管表面積によって決まる。用量のサイズはま
た、特定のワクチンを特定の患者に投与することに付随する副作用の存在、性質
または程度によっても決まる。
【０１５５】 感染または他の状態の処置または予防において投与されるワクチンの有効量の
決定において、医師は、ワクチンの毒性、疾患の進行、および抗ワクチンベクタ
ー抗体の産生を、たとえあるにしても、評価する。一般に、ベクター由来の裸の
核酸と等価な用量は、典型的な７０キログラムの患者に対して約１μｇから１ｍ
ｇであり、そして核酸を送達するために用いられるベクターの用量を計算して、
等価な量の治療的核酸を生じるようにする。投与は、単回用量または分割用量で
達成され得る。
【０１５６】 治療的用途において、組成物は、疾患（例えば、感染性疾患または自己免疫障
害）に罹患した患者に対して、疾患およびその合併症を治癒させるか、あるいは
少なくとも一部、軽減するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適切
な量は、「治療有効用量」と定義される。この使用に有効な量は、疾患の重篤度
ならびに患者の健康の一般的状態に依存する。組成物の単回または複数回投与は
、必要とされる投薬量および頻度ならびに患者による耐性に依存し得る。いずれ
にしても、組成物は、患者を有効に処置するのに十分な量の本発明のタンパク質
を提供すべきである。
【０１５７】 予防的用途において、組成物は、感染性疾患または他の状態の確立に対する防
御を補助し得る免疫応答を誘発するために、ヒトまたは他の哺乳類に投与される
。それに続く、対応する病原体による抗原投与は、ワクチンに対して予め曝露さ
れたことによってプライムされた免疫応答の引き金となる。
【０１５８】 本発明によって提供される弱毒化ワクチンの毒性および治療効力は、標準的な
薬学的手順を用いて、細胞培養物または実験動物中で求められる。ＬＤ50（集団
の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ50（集団の５０％において治療的に
有効な用量）は、本明細書中に記載の手順、さもなくば当業者に公知の手順を用
いて決定され得る。
【０１５９】 本発明の弱毒化ワクチンは、遺伝子ワクチンを哺乳類に投与するための、パッ
ク、ディスペンサー装置、およびキットに包装され得る。例えば、１またはそれ
以上の単位用量形態を含むパックまたはディスペンサー装置が提供される。典型
的には、この化合物が記載された状態の処置に適しているというラベル上の適切
な指示と共に、化合物の投与のための指示が包装と共に提供される。例えば、ラ
ベルは、包装内の活性化合物が、特定の感染性疾患、自己免疫障害、腫瘍の処置
、あるいは哺乳類の免疫応答によって仲介されるかあるいは潜在的にこの哺乳類
の免疫応答に対して感受性の他の疾患または状態の予防または処置に有用あるこ
とを記述し得る。
【０１６０】 （実施例） 以下の実施例は、例示のために提示されるが、本発明を限定しない。
【０１６１】 （実施例１） （ワクチンまたはワクチンベクターとして用いられる弱毒化ウイルスの生成の
ためにＤＮＡシャッフリングを用いる特定の実施例） この実施例は、本発明の方法を用いて、弱毒化ウイルスワクチンまたはワクチ
ンベクターを生成する方法のいくつかの例を示す。
【０１６２】 （Ａ．ウシウイルス性下痢ウイルス） ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）はトガウイルスであり、これは合衆
国における畜牛の最も潜行的かつ破壊的なウイルス病原体である（Ｖａｓｓｉｌ
ｅｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１：４７１−８）。このウイルスは、
免疫抑制、下痢、呼吸困難、流産、子ウシにおける永続的感染を引き起こす。少
なくとも２つの血清型のＢＶＤＶ、ならびに２つの生物型（細胞変性または非細
胞変性）が存在する。ＢＶＤＶ株において天然の多様性が存在するので、このウ
イルスは、ファミリーシャッフリングによる進化のための優れた出発点を提供す
る。このアプローチは、ＢＶＤＶの安定な全長ｃＤＮＡコピーが樹立されている
ため、特に実行可能である（Ｍｅｎｄｅｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８；７２
：４７３７−４５；Ｖａｓｓｉｌｅｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１：
４７１−８）。ＭＤＢＫ細胞のトランスフェクションによりアッセイされるよう
に、これらのｃＤＮＡクローンから転写されるキャップされていないＲＮＡは、
高度に感染性である（＞１０5ＰＦＵ／μｇ）。回収されたウイルスは、プラー
ク形態学、増殖特性、ポリプロテインプロセシング、および親のＢＶＤＶ株に対
する細胞病原性において同様であった（Ｍｅｎｄｅｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１
９９８）７２：４７３７−４５）。
【０１６３】 さらに、感染性ＢＶＤＶと他のウイルス由来の抗原決定基とのキメラの生成の
原理が、合理的な設計を用いて実証されている。より詳細には、ＢＶＤＶの分子
ゲノムクローン中の主要エンベロープ糖タンパク質Ｅ２／ｇｐ５３に対するコー
ディング領域がＳｉｎｇｅｒ株のもので置換され、キメラウイルスを生じさせる
（Ｖａｓｓｉｌｅｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１：４７１−８）。し
かし、キメラウイルスの設計に対するこのようなアプローチは、免疫原性のエン
ベロープタンパク質が他の病原体由来のもので置換された場合に、元のウイルス
に対する免疫原性が失われるという、重大な欠点をもつ。
【０１６４】 親ウイルスの免疫原性が維持されたキメラウイルスを得るために、ＤＮＡを用
いてシャッフリングして、異なるウイルスまたはその免疫原性フラグメントとの
間のキメラを生成する。ＢＶＤＶの異なる血清型の核酸は、例えば、ファミリー
シャッフリングアプローチを用いてシャッフルされる。感染性ｃＤＮＡクローン
全体またはエンベロープタンパク質をコードする核酸のいずれかがシャッフリン
グされ、そしてキメラウイルスのライブラリが生成される。ウイルスゲノム全体
のシャッフリングは、弱毒化および免疫原性に対する解決を同時に見いだされる
ようであるので、有利である。ＭＤＢＫ細胞は、例えば、インビトロでの弱毒化
についてのスクリーニングに適している。なぜなら、野生型ＢＶＤＶはこれらの
細胞中で高度に感染性であり、そしていくつかの株は、細胞変性効果を引き起こ
すからである（Ｍｅｄｅｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：４７３７−
４５）。弱毒化についてスクリーニングし得る別の方法には、例えば、温度感受
性の分析、変化した宿主−細胞特異性、補体に対する感受性に基づく選択、およ
び免疫無防備の動物のみにおける増殖についての選択が含まれる。あるいは、た
だ一つのウイルス株をシャッフルするために選択して、そのウイルスを最初に弱
毒化し、その後、免疫原性領域のファミリーＤＮＡシャッフリングを用いて、強
力な干渉効果免疫を与えるキメラを生成する。
【０１６５】 （Ｂ．マレック病ウイルス（ＭＤＶ）；ＤＮＡシャッフリングによるウイルス
ワクチンの改良された製造） マレック病（ＭＤ）はニワトリのリンパ増殖性疾患であり、これは悪性Ｔ細胞
リンパ腫の形成によって特徴づけられる（Ｍｏｒｉｍｕｒａら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍ
ｅｄ．Ｓｃｉ．１９９８；６０：１−８）。この疾患を予防するための比較的有
効なワクチンが入手可能であるが、このワクチンを製造する方法は、特に、主要
な改良を必要とする。以前に入手可能な弱毒化ＭＤＶワクチンは、一次ニワトリ
胚線維芽細胞中で増殖され、このワクチンは、凍結された、ウイルス感染細胞製
剤である。細胞を含まないワクチンもまた試験されているが、その免疫原性は細
胞を伴うワクチンと比べて劣っている。さらに、ＭＤＶは、過去４０年間にわた
って、より強い発癌性を獲得するように、顕著に進化しており、これらのウイル
スのうちの中には、現在入手可能なワクチンによっては適切に制御されないもの
もある（Ｂｉｇｇｓ，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．
Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．（１９９７）３５２：１９５１−６２）。ＭＤＶに対するワ
クチンの開発はまた、複数の血清型の存在によって妨害されている。異なる血清
型の混合物がワクチン調製に用いられている。例えば、血清型１、２および３の
弱毒株に基づくワクチンであるが、疾患の進行をもたらす失敗が報告されており
、これは、新規なより効果的なワクチンの製造の必要性を示唆している（Ｚｅｌ
ｎｉｋ、Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）３９：５３−６３）。
【０１６６】 ＤＮＡシャッフリングによるＭＤＶの分子進化は、それがなければワクチンの
製造、弱毒化および免疫原性に関連する問題の、解決を提供する。細胞を含まな
いワクチン製剤の生成は、製造プロセスにおける主要な改良を提供する。組換え
ＭＤＶ核酸、またはそのフラグメントのライブラリが生成され、そして細胞を使
わない方法で、細胞培養物中での効率的な増殖についてスクリーニングされる。
他の種由来の細胞株を用いて、適正な弱毒化に同時に到達することができる。細
胞を含まないウイルスは次に、卵中（ｉｎ ｏｖｏ）またはニワトリ中でのその
免疫原性について、分析される。これらの細胞を含まない製剤は、ワクチンの製
造および貯蔵に対して主要な改良を提供する。なぜなら、現在のワクチン製剤は
、細胞の安定性を保証するために、液体窒素容器の中に入れて輸送されなければ
ならないからである。
【０１６７】 ファミリーＤＮＡシャッフリングは、キメラ抗原およびウイルスの生成を可能
にするので、このアプローチは、全てまたは大部分の異なる血清型のＭＤＶに対
して効率的な干渉効果を提供する、ワクチン株を生成するのに有用である。さら
に、母系抗体は、ワクチンを妨害し、そのため、その効力を低減し（Ｓｈａｒｍ
ａおよびＧｒａｈａｍ、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．（１９８２）２６：８６０−７０
；Ｎａｚｅｒｉａｎら、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．（１９９６）４０：３６８−７６
）、そしてＤＮＡシャッフリングは新規な抗原変異体を生成することができるた
め、このアプローチにより、先にワクチン接種された動物の母系抗体によって認
識されないワクチン株を生成することが可能になる。ワクチン株の大きなライブ
ラリを生成することによって、いくつかの異なる免疫原性変異体が見いだされる
。これは、異なる世代への、抗原可変ワクチンによるワクチン接種を可能とし、
免疫化によって誘導される母系抗体による妨害を低減する。母系抗体による低減
された妨害のスクリーニングは、インビトロで、ワクチン接種された動物由来の
血清を用いて、行うことができる。例えば、パニングのような、負の選択技術を
用いて、免疫された動物由来の抗体により認識される全ての株を除去する。残っ
た株の抗原性および免疫原性は、次に、インビボでの実験により確認できる。保
護的免疫性は、ニワトリに異なる生ＭＤＶ血清型で抗原投与することによって分
析される。
【０１６８】 （Ｃ．感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）としても知られる、ウシヘル
ペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）） ウシヘルペスウイルス１（ＢＨＶ−１）はまた、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス
（ＩＢＲＶ）とも呼ばれ、広範囲の細胞型の中で複製し、そして疾患の発現には
、気道疾患、結膜炎、外陰部膣炎、流産、亀頭包皮炎、髄膜脳炎、消化管疾患お
よび胎児全身感染が含まれる（ＬｕｐｔｏｎおよびＲｅｅｄ、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ
．Ｒｅｓ．（１９８０）４１：３８３）。ＢＨＶ−１に対する免疫応答は、動物
を毒性のウイルス、従来の生または死菌ワクチン、遺伝子操作された生ウイルス
ワクチン、サブユニットワクチンに曝露した後に、より最近では、免疫原性抗原
をコードするプラスミドで免疫された後に、観察されている（Ｂａｂｉｕｋら、
Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９６）５３：３１−４２）。ＢＨＶ−１ま
たはその糖タンパク質に対する曝露は、ウイルスに対する特異的応答を誘導し、
これは、ウイルスを中和し、そしてウイルス感染細胞を殺すことができる。ウイ
ルス感染細胞の殺傷は、ウイルス抗原が感染細胞の細胞表面に発現した後に起こ
る（Ｂａｂｉｕｋら、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９６）５３：３１−
４２）。ＢＨＶ−１は、ウイルス血症によって感染宿主に広がり得、より広範囲
の組織および器官へ接近し、そして多様な症状を引き起こし得る（Ｅｎｇｅｌお
よびＡｃｋｅｒｍａｎｎ、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９６）５３：３
−１５）。ヘルペスウイルスは、また、ニューロン細胞またはリンパ細胞中で潜
伏期を確立し、そして潜伏期の間は、少数のウイルス抗原が合成されるのみであ
る。再活性化されると、ウイルスは、複製の溶菌化サイクルを再び確立する。一
次ウイルス感染の間に活発な免疫応答が誘導されることが多いが、これらのメカ
ニズムは、ヘルペスウイルスが潜伏期の間、そしてそれより少ない程度で、また
再活性化の間にも、宿主の免疫系から逃れるのを助ける（同上）。
【０１６９】 弱毒化ＢＨＶ−１株の進化は、ウイルス、またはウイルスの貫通および増殖に
重要なウイルス成分の標的化された進化の、ランダムＤＮＡシャッフリングによ
って達成される。このようなウイルス成分の１つの例は、糖タンパク質Ｈである
（Ｍｅｙｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７９：１９８３−７）
。ｇＨは、ウイルスの構造成分であり、糖タンパク質ｇＬと複合体を形成する。
ｇＨ欠損ＢＨＶ−１での実験は、ｇＨがウイルスの感染サイクルにおいて重要で
あり、ウイルスの侵入および細胞から細胞への広がりに関与するが、ウイルスの
接着には関与しないことを実証した（同上）。ＤＮＡシャッフリングによる分子
進化に対して有用なＢＨＶ−１の成分の別の例は、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）であ
り、これもまた、ウイルスの侵入に関与する必須成分であることが示されている
（Ｈａｎｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９９）２５７：１９１−１９７）。ｇ
Ｄが欠けたＢＨＶ−１ウイルス（ＢＨＶ−１ ｇＤ−／−）は、ＢＬ−３細胞に
結合することができるが、これはもはやアポトーシスを誘導できない（同上）。
さらに、ｇＤに対する免疫は、ウシにおけるＢＨＶ−１複製に対する耐性を与え
ることが示されている（ＺｈｕおよびＬｅｔｃｈｗｏｒｔｈ、Ｖａｃｃｉｎｅ（
１９９６）１４：６１−９）。
【０１７０】 ＤＮＡシャッフリングは、ｇＨまたはｇＤの分子進化を引き起こして、病因に
おける重要な事象である、細胞から細胞へと広がる能力が変更されたＢＨＶ−１
改変体が生成するようにするために、用いられる。ひとまとめにして考えて、ｇ
ＤおよびまたはｇＨのファミリーＤＮＡシャッフリングは、ウイルスを同時に弱
毒化し、そして複数の血清型に対しての保護を提供するキメラウイルスを生成す
る手段を提供する。
【０１７１】 より詳細には、このアプローチにおいて、ウイルス、あるいはｇＨまたはｇＤ
のようなそのフラグメントがシャッフルされて、ライブラリーが生成される。シ
ャッフルされたフラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いてウイルス骨
格に取り込まれ得る。ウイルスのライブラリーは、次に弱毒化について選択され
る。選択に対する多くの異なるアプローチを取ることができ、これらのうちのい
くつかは、野生型ウイルスの弱毒化の試みの間に、すでに記載されている。この
ような選択技術は、また、弱毒化されたＤＮＡシャッフルされたワクチン株の選
択にも適用できる。これらの方法は、ウシ細胞培養中の迅速な継代（Ｓｃｈｗａ
ｒｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（１９５７）９６：
４５３）、あるいはブタまたはイヌの細胞培養への適応による（Ｓｃｈｗａｒｔ
ｚら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（１９５８）９７：６８
０；Ｚｕｓｃｈｅｋら、Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．（１９６１）
１３９：２３６）。さらに、ウイルスは、細胞培養中で、低い温度（３０℃）で
増殖するように、あるいは温度感受性変異体の選択によって（５６℃で４０分）
、適応し得る（Ｉｎａｂａ、Ｊ．Ｊｐｎ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．（１９
７５）２８：４１０；Ｂａｒｔｈａ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．（１９７
４）２６：５）。
【０１７２】 鼻腔内投与されたＢＨＶ−１はまた、インビトロで培養されたウサギ細胞にお
ける連続継代によって弱毒化され、あるいはＨＮＯ2による処理と、その後の温
度感受性変異体の選択によって改変され得る（Ｔｏｄｄ，Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．
（１９７４）１５：２５７；Ｚｙｇｒａｉｃｈら、Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．（
１９７４）１６：３２８）。これらの選択技術はまた、シャッフルされたウイル
スの弱毒化株を同定するのにも有用である。シャッフルされたウイルスのライブ
ラリーは、弱毒化に加えて、更なる改良を有するウイルスを含み得る。以前に記
載された弱毒化技術と比べた重大な利点は、異なる血清型間の効率的なキメラ現
象が達成され得るという事実であり、これにより、インビボで改良された免疫応
答を与える交差防御（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）株を生成することが
可能となる。動物における免疫応答の効力の分析は、血清中の免疫パラメータを
分析し、そしてリンパ球を免疫された動物中で循環させることによって行われ得
る。さらに、保護的および交差防御免疫応答は、免疫された動物に異なる血清型
の野生型ウイルスを抗原投与することによって、研究され得る。最も強力なイン
ビボでの交差防御免疫応答と組み合わせて、最も弱毒化を示したウイルスが、所
望ならば、更なる回のシャッフリングおよび選択のために選択される。
【０１７３】 （Ｄ．感染性気管支炎ウイルス） 感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）は、コロナウイルス科のメンバーであり、
非常に伝染性の強い呼吸器および生殖器の疾患をニワトリに引き起こす。ＩＢＶ
は一本鎖の２７．６ｋｂのポジティブセンスＲＮＡゲノムを有する。バクテリオ
ファージＴ７プロモーターの下流でのＩＢＶの全長クローンの構築が、記載され
ている（Ｐｅｎｚｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：８６６０−８）
。インビトロでのＴ７転写ＲＮＡの２つの異なる構築物からＩＢＶヘルパーウイ
ルス感染細胞中へのエレクトロポレーションの結果、ＲＮＡは複製およびパッケ
ージングされる（Ｐｅｎｚｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：８６６
０−８）。
【０１７４】 ＩＢＶの３つの構造タンパク質は、スパイク糖タンパク質（Ｓタンパク質）、
膜糖タンパク質（Ｍタンパク質）およびヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパ
ク質）である（Ｊｉａら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）１４０：２５９
）。ＩＢＶには少なくとも１０の血清型がある。マサチューセッツ、コネチカッ
ト、アーカンソーおよびカリフォルニア血清型が、合衆国において、最も持続的
である。変異および交差が、新しい血清型の生成についての共通のメカニズムで
あり、ウイルスが天然に存在する免疫、あるいはワクチン接種によって誘導され
る免疫から逃れる手段を提供する（Ｋｅｃｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）
６２：１８１０）。より免疫原性であり、かつ交差防御のあるワクチン株が必要
とされ、そして分子進化技術は、インビトロおよびインビボでのスクリーニング
を用いて所望の特性についてスクリーニングされ得る新規なキメラを生成するた
めの改良された、より速い手段を提供する。
【０１７５】 ＩＢＶ株のライブラリーは、シャッフリングによって生成され、そして所望の
クローンは、ライブラリー全体、そのプール、または個別のクローンを分析する
ことによって、そのライブラリーから選択される。より詳細には、弱毒化の程度
は、例えば、気管器官培養（ＴＯＣ）および卵管器官培養（ＯＯＣ）を用いて研
究され得る（ＲａｊおよびＪｏｎｅｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９７）１５：１６
３−８）。Ｃｉｌｉｏｓｔａｓｉｓ（ＣＤ５０）、免疫蛍光染色（ＩＦＩＤ５０
）および器官培養感染性（ＯＣＩＤ５０）は、弱毒化と関連することが示され、
弱毒化について呼吸器ウイルス生ワクチンの候補をスクリーニングするのに有用
な方法である（同上）。これらの方法は、また、シャッフルされたＩＢＶの弱毒
株を選択するときにも有用である。その後の、動物における免疫化および抗原投
与の研究を用いて、弱毒化、免疫原性および交差防御の程度が更に評価され得る
。
【０１７６】 （Ｅ．ＤＮＡシャッフリングによる安定な黄熱病ワクチン株の進化） これらのワクチン株の安定性は、ＤＮＡシャッフリング技術によって改良され
得る。この実施例は、黄熱病（ＹＦ）ウイルスの進化を記載し、これは、ワクチ
ン株の例であり、この安定性は、本明細書に記載の方法によって改良され得る。
ＹＦは、急性の、蚊によって媒介されるウイルス性出血熱であり、アフリカおよ
び南アメリカにかけて、再出現している。全体で１８，７３５の黄熱病の症例お
よび４，５２２の死亡が、１９８７年から１９９１年にかけて報告されている。
これは、１９４８年からの任意の５年ごとの期間の中で最も多い黄熱病活性の報
告量を示す（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、ＪＡＭＡ（１９９６）２７６：１１５７−
６２）。アフリカにおいて、これらの症例のうちの多くの割合が、子供に生じて
いる。黄熱病に対する効率的なワクチンが入手可能であるが、世界の再貧国では
、ワクチンに対する資金調達は困難である（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、ＪＡＭＡ（
１９９６）２７６：１１５７−６２）。
【０１７７】 ＹＦワクチンの安定性は、発展途上国および熱帯地域における主要な問題であ
る。安定剤を含まない凍結乾燥ワクチン株は、−２０℃より高い温度に曝露する
と、急速に劣化する（Ｍｏｎａｔｈ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．（１９９
６）８７：２１９−２５）。糖、アミノ酸、および二価カチオンのような添加剤
は、ワクチン調製物の安定性を高めた。しかし、凍結乾燥した場合の、これらの
ワクチン処方物の比較的良好な安定性にもかかわらず、ワクチンは、再構成の後
は不安定であり、そして１時間後には捨てなければならない（Ｍｏｎａｔｈ、Ｄ
ｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．（１９９６）８７：２１９−２５）。再構成の後
のワクチンの安定性の向上は、コストを大いに低下させ、ワクチンの供給を広げ
、そして劣化したワクチンの使用による、ワクチンの失敗の頻度をも低下させる
。
【０１７８】 この実施例において、ＹＦの感染性ｃＤＮＡクローンが、例えば、ＤＮＡシャ
ッフリングによる組換えに供される。得られたウイルスライブラリーを、安定性
について分析する。選択を、所望により、異なる温度、処方および期間で行い、
目的の条件下で安定である、適切なＹＦウイルスを得る。このような条件下で増
殖し得るウイルスのみが、選択を生き残る。さらに、ウイルスライブラリーは、
凍結乾燥、再構成され得、そして再構成の後、種々の期間で、最も安定なウイル
スが選択され得る。向上した安定性を示すウイルスが、新たな回のシャッフリン
グおよび選択ラウンドに供され得る。その後の免疫化および抗原投与の研究は、
弱毒化、免疫原性および安定性の程度をさらに評価する。
【０１７９】 （Ｆ．Ａ型インフルエンザウイルス） Ａ型インフルエンザによる流行性感染は、一般集団、特に高齢者および他のハ
イリスク患者におけるかなりの罹病率および死亡率に関連し続けている（Ｃａｌ
ｆｅｅおよびＨａｙｄｅｎ、Ｄｒｕｇｓ（１９９８）５６：５３７−５３）。比
較的効率的なウイルスが入手可能であるにもかかわらず、数万もの死者が、毎年
生じている。防御効力の不完全さおよびウイルスの抗原のバリエーションのせい
で、免疫プログラムによる疾患の効率的な制御は達成されていない。ウイルスが
受ける抗原変化のため、および抗体応答は時間が経つと顕著に低下するため、ワ
クチン接種は毎年行われなければならない（Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎら、Ｖａｃ
ｃｉｎｅ（１９９９）１７：１３５５−８）。
【０１８０】 Ａ型インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属しており、これ
らは分節を持つ、ネガティブ鎖のウイルスである。このファミリーの更なるメン
バーは、Ｂ型インフルエンザおよびＣ型インフルエンザウイルスである。ウイル
スの複製は、ｍＲＮＡの合成の後に起こり、ウイルスタンパク質の合成を必要と
する。完全な感染性の分節を持つネガティブ鎖のウイルスが、クローン化ｃＤＮ
Ａから成功裡に回収されている（ＢｒｉｄｇｅｎおよびＥｌｌｉｏｔｔ、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：１５４００−４
）。バクテリオファージＴ７プロモーターおよびデルタ型肝炎ウイルスリボザイ
ム配列が隣接した、３つのＢｕｎｙａｍｗｅｒａ ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ ＲＮ
Ａゲノムセグメントの全長ｃＤＮＡコピーをコードするプラスミドは、親のｃＤ
ＮＡクローンの性質を有する感染性ウイルスをコードすることができた（Ｂｒｉ
ｄｇｅｎおよびＥｌｌｉｏｔｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ（１９９６）９３：１５４００−４）。同様に、原型的な、分節を持たない
、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスである全長の感染性水疱性口内炎ウイルス（ＶＳ
Ｖ）が、ｃＤＮＡクローンから回収された（Ｗｈｅｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：８３８８−９２）。これら
のデータは、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスの全ゲノムをシャッフリングする実行
可能性を示す。さらに、外来遺伝子は、Ａ型インフルエンザゲノム中へ成功裡に
導入されており（Ｌｕｙｔｊｅｓら、Ｃｅｌｌ（１９８９）５９：１１０７−１
３）、このことは、Ａ型インフルエンザウイルスゲノムが、成功裡に操作され得
ることを示している。感染性Ａ型インフルエンザウイルスは、ＰＢ２ポリメラー
ゼ遺伝子をコードするｃＤＮＡのトランスフェクションの後に回収され、次にＲ
ＮＡ転写物がトランスフェクトされる。（Ｓｕｂｂａｒａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．（１９９３）６７、７２２３−８）。それゆえ、全ウイルスゲノムシャッフリ
ングの代わりに、Ａ型インフルエンザの新規弱毒化ワクチン株が、ウイルスの個
別のセグメントをシャッフリングすることによって生成され得、Ａ型インフルエ
ンザウイルスの進化におけるＤＮＡシャッフリングアプローチの実行可能性を示
す。
【０１８１】 インフルエンザウイルスＡ型のライブラリーは、全ゲノム、またはそのセグメ
ント（例えば、ＰＢ２ポリメラーゼ遺伝子）をシャッフリングすることによって
、生成される。インフルエンザウイルスには大きな抗原多様性があるので、免疫
原性タンパク質をコードするセグメント、例えば、ヌクレオカプシド、マトリッ
クスタンパク質、ヘマグルチニン、核タンパク質またはノイラミニダーゼは、Ｄ
ＮＡシャッフリングによる分子進化に対して、さらなる標的を提供する。生弱毒
化インフルエンザウイルスＡ型ワクチンは、弱毒化遺伝子をドナーウイルスから
インフルエンザウイルスＡ型の新しい流行性改変体に移すことによって、広く生
産されており（Ｓｕｂｂａｒａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：７２
２３−８）、シャッフルされたセグメントは、目的の他のインフルエンザ株に戻
して導入され得る。シャッフルされたウイルスは、多段階スクリーニングプロセ
スを用いて選択され得、これは製造された細胞中での増殖のための選択、温度感
受性変異株の同定、ポリクローナル抗体による複数エピトープの存在についての
スクリーニング、インビボでの強力な交差防御免疫応答の分析、あるいは上記の
全てを含む。最良の改変体が、所望の場合、シャッフリングおよびスクリーニン
グの新ラウンドのために選択され得る。
【０１８２】 （Ｇ．ＲＳウイルス（呼吸器合胞体ウイルス）（ＲＳＶ）） ＲＳウイルス（呼吸器合胞体ウイルス）（ＲＳＶ）は、乳児期および幼児期の
間の下気道感染の最も重要な原因である（ＤｏｍａｃｈｏｗｓｋｅおよびＲｏｓ
ｅｎｂｅｒｇ、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９９）１２：２
９８−３０９）。ＲＳＶ感染は、高齢者および免疫抑制個体においては、致命的
であり得る（Ｗｙｄｅ、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．（１９９８）３９：６３
−７９）。感染は、通常、抗ＲＳＶ中和抗体の発生をもたらすが、これらは、乳
児の初期感染の間は、最適以下であることが多い。その後の曝露の際の再感染は
普通であり、有効なワクチンが非常に所望されている。
【０１８３】 機能性の、感染性ＲＳＶが、発現されたクローン化ｃＤＮＡから回収されてい
る。ＲＳＶは、ｃＤＮＡクローンから、ウイルスポリメラーゼタンパク質、リン
タンパク質、およびヌクレオカプシドタンパク質と共発現することによって、機
能性形態で発現した（Ｙｕら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．（１９９５）６９：２１４１−９
）。このようなｃＤＮＡクローンは、ＤＮＡシャッフリングによる分子進化のた
めの、優れた出発点を提供する。いくつかの異なるＲＳＶの抗原性基が同定され
ており（Ｓａｎｚら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．（１９９４）３３：２０３−１７）
、７８％という非常に高い致死率が、免疫無防備状態の患者において観察されて
いる（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９９２）１６
５：９８７−９３）。従って、複数の異なるＲＳＶの変異体に対する防御を提供
する効果的なワクチンが非常に望まれている。
【０１８４】 ＲＳＶの抗原の不均一性は、ワクチンの開発に対する難題であるが、これらの
天然に存在する病原体の改変体は、ＲＳＶのファミリーシャッフリングライブラ
リーを生成するために用いられ得る、存在する配列のプールを提供する。ＲＳＶ
ウイルスのライブラリーは、種々のＲＳＶ単離体由来の感染性ｃＤＮＡクローン
のシャッフリングによって生成される。得られたＲＳＶ変異体を、弱毒化および
そのワクチンとしての特性についてスクリーニングする。ウイルスの安定性は、
インビトロで、ワクチン株を長期間貯蔵することによって、選択され得る。さら
に、弱毒化は、動物モデルで、疾患の欠如について、あるいは症状の軽減レベル
について評価される。これらの弱毒株をさらに、インビボでの防御的な免疫応答
を誘発するその能力について分析する。これは、免疫化された動物に、生の野生
型病原体を抗原投与し、そして異なる株をその弱毒化のレベルおよび防御的免疫
応答を誘導する効力について評点することによって、達成され得る。所望の特性
を有する至適な株が、シャッフリングおよびスクリーニングの新ラウンドのため
に選択され得る。
【０１８５】 （Ｈ．イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）） イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）は、麻疹ウイルス属のウイルスであり、
飼い犬を含む広範囲の肉食動物種において、神経系に影響を与え、しばしば致死
的な全身性疾患を引き起こす。古典的な血清学は、診断および予後の値のデータ
を提供し、また、子犬の至適なワクチン接種年齢の予想に用いられ得る。なぜな
ら、母系の抗体はワクチンを妨害し得るからである（ＡｐｐｅｌおよびＨａｒｒ
ｉｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．（１９８８）１９３：３３２−
３）。いくつかの抗原的に異なるＣＤＶの株が同定されており（Ｏｈａｓｈｉら
、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）６０：１２０９−１２；Ｃａｒｐ
ｅｎｔｅｒら、Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．（１９９
８）６５（２−４）：２５９−６６）、そしてウイルスは、しばしば、肉食動物
間で宿主種を越えて見られる（同上）。異なる株の抗原的不均一性は、ワクチン
開発についての難題であるが、これはまた、本発明の方法を用いて、インビトロ
で更なる進化を可能とする、優れた遺伝的多様性を提供する。
【０１８６】 感染性麻疹ウイルスはｃＤＮＡから再構成されており（Ｃａｔｈｏｍｅｎら、
ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９８）１７：３８９９−９０８）、ＤＮＡシャッフリング
を用いて、弱毒化麻疹ウイルス種（例えば、ＣＤＶの弱毒化ワクチン株）を生成
することが可能であることを示している。より安定かつ免疫原性のウイルスが非
常に望まれる。さらに、母系抗体がＣＤＶワクチンを妨害し得るので、このよう
な抗体によって認識されないワクチンが、改良された効力を有すると期待される
（ＡｐｐｅｌおよびＨａｒｒｉｓ、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．（１９８８
）１９３：３３２−３）。ＣＤＶウイルスのライブラリーは、感染性ｃＤＮＡの
ＤＮＡシャッフリングによって生成され、そして得られたウイルスは、そのワク
チンとしての特性についてスクリーニングされる。イヌにおけるインビボでの研
究を用いて、野生型ウイルスによる免疫された動物への抗原投与の際に有効な免
疫応答を提供する弱毒株（阻害された臨床的疾患を引き起こすか、あるいは臨床
的疾患を引き起こさない株）を同定する。さらに、ウイルスは、ワクチン株を長
期間貯蔵することによって、インビトロでの向上した安定性について選択され得
る。更なる改良が望まれるならば、所望の特性を有する株を、シャッフリングお
よびスクリーニングの新ラウンドに供し得る。
【０１８７】 （実施例２） （弱毒化アルファウイルスの進化；空気伝搬（ａｉｒｂｏｒｎｅ）ワクチン接
種のためのビヒクルとしてのＶＥＥ） 本実施例は、空気伝搬投与に適したワクチンのためのビヒクルとして有用な、
弱毒化アルファウイルスを進化させるためのＤＮＡシャッフリングの使用を記載
する。
【０１８８】 アルファウイルスは、２６のエンベロープで包まれたウイルスの属であり、ヒ
トおよび家畜を含むいくつかの種において、疾患を引き起こす。蚊および吸血性
節足動物が媒介動物として働く（ＳｔｒａｕｓｓおよびＳｔｒａｕｓｓ、Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９４）５８：４９１−５６２）。アルファウイル
スは、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ）、セムリキ森林ウイルス（Ｓ
ＦＶ）およびシンドビスウイルス（ＳＩＮ）を含み、これらのウイルスの広い宿
主範囲および優れた感染性のため、これらもまた、ワクチンベクターの目的の標
的である。高力価の組換えアルファウイルスストックの世代は、いくつかの核、
細胞質、膜間連および分泌タンパク質の高レベル発現を、多様な細胞系および一
次細胞培養中で、可能にしている（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓ
ｉｇｎａｌ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．（１９９９）１９：６７３−８６）
。
【０１８９】 少なくとも８つのアルファウイルスの＋鎖ＲＮＡゲノムの完全配列が決定され
ており、そして他のいくつかについて、部分配列が知られている（Ｓｔｒａｕｓ
ｓおよびＳｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９４）５８：４
９１−５６２）。重要なことには、感染性ＲＮＡがそこから回収され得るされる
全長ｃＤＮＡクローンが、ＶＥＥ、ＳＦＶおよびＳＩＮを含む４つのアルファウ
イルスについて構築されている（Ｄａｖｉｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）
１７１：１８９−２０４；Ｐｏｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：４５９８−６０３；Ａｔｋｉｎｓら、Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６）５：３３−８）。従って、ＶＥＥ、ＳＩＮお
よびＳＦＶは、ＤＮＡシャッフリングによって弱毒化され得る特に良好なアルフ
ァウイルスの例である。本実施例においてはＶＥＥを詳細に記載するが、アルフ
ァウイルス間の構造的および機能的関連性の程度が高いので、他のアルファウイ
ルスに対して同様のアプローチを用いることができる。
【０１９０】 ＶＥＥは、ヒトおよびげっ歯類の両方に、エーロゾル吸入によって、高度に感
染性であるという点で、普通ではないアルファウイルスである。従って、ＶＥＥ
の弱毒株は、エーロゾル処方でワクチンを送達するためのビヒクルを提供する。
これは、ヒトまたは動物の大集団に同時に迅速なワクチン接種を可能とする。不
活化または弱毒化組換え病原体でのエーロゾルワクチン接種は、肺疾患に対する
局所防御を誘導するための効率的な方法であることが示されており、そしてエー
ロゾルワクチン接種はまた、感染性疾患に対して防御することも示されている（
ＨｅｎｓｅｌおよびＬｕｂｉｔｚ、Ｂｅｈｒｉｎｇ．Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．（１
９９７）９８：２１２−９）。ＶＥＥは、他の病原性有機体から抗原を送達する
ためのベクターとしても使用され得、ＶＥＥの弱毒株のエーロゾル媒介ワクチン
接種は種々の疾患に対する、非常に有効かつ迅速なワクチン接種プロトコルを提
供すると期待されている。ＶＥＥは、中枢神経系の外の、その一次標的がリンパ
組織であることによってもまた、普通ではないウイルスであり、従って、弱毒化
改変体は、ワクチンまたは薬学的に有用なタンパク質を免疫系に標的化する手段
を提供し得る。
【０１９１】 遺伝的および血清学的に同定され得る少なくとも７つのＶＥＥのサブタイプが
存在する。疫学的データに基づいて、ウイルスは２つの主カテゴリ、Ｉ−ＡＢ株
およびＩ−Ｃ株（これらは、ＶＥＥ動物間流行病／流行病に関連する）、ならび
に残りの血清型（これらは、第１に、動物流行性の脊椎動物−蚊サイクルに関連
し、特定の生態学的ゾーンにおいて循環している）に分けられる（Ｊｏｈａｎｓ
ｔｏｎおよびＰｅｔｅｒｓ、Ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版、
Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６）。
【０１９２】 組換えＶＥＥウイルスのライブラリーが作り出され、そして弱毒化表現型を示
す組換えウイルスを同定するためにスクリーニングされる。ライブラリーは、感
染性ｃＤＮＡクローン全体か、あるいは病原性または防御において役割を果たす
ことが知られている領域（例えば、エンベロープタンパク質）のいずれかをＤＮ
Ａシャッフリングに供することによって生成される。これらのライブラリーおよ
びその個別のキメラ／変異体は、次に、広い交差反応性でありかつ防御的な抗体
応答を誘導する能力についてスクリーニングされる。あるいは、またはさらに、
ライブラリーをスクリーニングして、哺乳動物をエーロゾル送達によって免疫す
る能力を有する組換えウイルスを同定する。ライブラリーはエーロゾル処方で送
達され、そして次に、十分に弱毒化された株の指標として、特異的な抗体を発生
し、感染を生き延びる動物中で、至適なウイルスが同定される。ライブラリーが
、異なる血清型のＶＥＥのファミリーシャッフリングによって生成される場合、
最も交差反応性の株は、種々の血清型の生の野生型病原体で免疫化された動物に
抗原投与することによって同定され得る。
【０１９３】 さらに、ＶＥＥは外来抗原を送達するためのビヒクルとして作用し得るので、
他の病原体由来の抗原をコードする化ＶＥＥ株は、種々の疾患に対するワクチン
接種において有用であり得る。パッケージングされた細胞株を用いて、ウイルス
の構造タンパク質が外来抗原によって置換されている場合でさえも、生物学的に
活性なベクター粒子の生産を可能にし得る（Ｐｏｌｏら、前出）。これらのパッ
ケージング細胞は、有効な免疫化を、例えば、エーロゾル媒介免疫を通じて、媒
介することが示された構造タンパク質をコードするように操作され得る。例とし
て、ＶＥＥエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を、ハンタウイルス糖タ
ンパク質をコードするもので置き換える。ＶＥＥは空気伝搬抗原投与によってマ
ウスを感染させることが知られているので、このアプローチは、ハンタウイルス
感染に対する野生型マウスのエーロゾル媒介ワクチン接種のための方法を提供し
、これは、流行地域でハンタウイルスに遭遇するヒトのリスクを大幅に軽減する
はずである。この方法の顕著な利点は、マウスが空気伝搬抗原投与によってＶＥ
Ｅに感染し得るので、一次スクリーニングにおいて実験室の設定が有用であるこ
とである（ＷｒｉｇｈｔおよびＰｈｉｌｌｐｏｔｔｓ、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．
（１９９８）１４３：１１５５−６２）。最も良好なクローンを、所望であれば
、シャッフリングおよび選択の新ラウンドに供する。
【０１９４】 （実施例３） （伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）） 伝染性ファブリーキウス嚢病（ＩＢＤ）は１９５７年に発生し、急速に広がり
、そして米国のブロイラー全体および市販の卵生産地域で１９６５年までに確認
された（ＬａｓｈｅｒおよびＤａｖｉｓ、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．（１９９７）４
１：１１−９）。伝染性ファブリーキウス嚢病（ＩＢＤＶ）はファブリーキウス
嚢を攻撃し、免疫抑制と死を引き起こす。ＩＢＤの急性期、それに続く免疫抑制
、および広範囲に広がるＩＢＤウイルス（ＩＢＤＶ）の分布が、この疾患の主要
な経済的重大性に寄与する（Ｓａｉｆ，Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．（１９９８）７７
：１１８６−９）。生弱毒化ワクチンが開発され、かなり良好な効力を示した（
ＬａｓｈｅｒおよびＤａｖｉｓ、前出）。しかし、１９８０年代中期には、デラ
ウエア変異体のような新規な変異体が出現し、そして毒性の増した変異体がヨー
ロッパおよびアジアで１９８９年に同定された（同上）。さらに、先天性免疫は
、ワクチンの効力を顕著に低下させ（Ｂａｙｙｒａｒｉら、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ
．（１９９６）４０：５８８−９９）、改良された効力のワクチンが所望されて
いる。
【０１９５】 ＩＢＤＶは二本鎖ＲＮＡウイルスであり、ビルナウイルス科アビビルナウイル
ス属に属する（ＮａｇａｒａｊａｎおよびＫｉｂｅｎｇｅｅ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅ
ｔ．Ｒｅｓ．（１９９７）６１：８１−８）。ゲノムは、２つのセグメントから
なり、ＡおよびＢと名付けられている。ＩＢＤＶのセグメントＡおよびＢをコー
ドするｃＤＮＡクローンは、生存ウイルス子孫を産生することが示されている。
独立した全長ｃＤＮＡクローンが構築され、これはＲＮＡセグメントＡおよびＢ
のコーディング領域および非コーディング領域の全体を含んでいた（Ｍｕｎｄｔ
およびＶａｋｈａｒｉａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ、Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（
１９９６）９３：１１１３１−６）。これらのｃＤＮＡはＤＮＡシャッフリング
の優れた出発点を提供する。さらに、ＮＳタンパク質はインビトロおよびインビ
トロでウイルスの病原性に重要な役割を果たすウイルス複製に対して重要ではな
いので（Ｙａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：２６４７−５４）、Ｎ
Ｓタンパク質をコードするセグメントは、ＤＮＡシャッフリングによる進化に対
して特に有用な標的である。さらに、いくつかのＩＢＤＶの天然の変異体の存在
が（ＮａｇａｒａｊａｎおよびＫｉｂｅｎｇｅ、前出）、異なる血清型の弱毒株
およびキメラを生成するためのファミリーＤＮＡシャッフリングのための、天然
の多様性の源を提供する。
【０１９６】 組換えＩＢＤＶ核酸のライブラリーは、ＡおよびＢセグメントの両方のシャッ
フリングによって生成される。さらに、シャッフルされたＮＳ遺伝子を含むウイ
ルスのライブラリーは、ＮＳ遺伝子をシャッフリングすることによって生成され
、これは次に、ウイルスゲノム中に取り込まれて戻される。ウイルスのライブラ
リーは、最初に、インビトロで弱毒化についてスクリーニングされる。しかし、
ニワトリは大量に入手可能なので、一次スクリーニングは弱毒化および免疫原性
についてインビボで行われる。より詳細には、ウイルスまたはウイルスのプール
を卵に、１日齢で注射し、または、７−１４日齢で飲み水に適用する。臨床的疾
患を引き起こさない弱毒ウイルスが同定され、そして免疫された動物は次に、生
野生型ウイルスの抗原投与に対する防御的免疫応答についてスクリーニングされ
る。所望であれば、最も優れたウイルスをシャッフリングおよび選択の新ラウン
ドに供する。
【０１９７】 （実施例４） （イヌパルボウイルス；母系抗体による妨害を逃れ得るワクチン株の進化） イヌパルボウイルスは、新しく発生したイヌの病原体で、１９７０年代後期に
同定された（ＰｏｌｌｏｃｋおよびＣｏｙｎｅ、Ｖｅｔ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ
Ａｍ．Ｓｍａｌｌ．Ａｎｉｍ．Ｐｒａｃｔ．（１９９３）２３：５５５−６８
）。パルボウイルス性腸炎は、最初は、全てのイヌにおける流行性疾患として見
いだされたが、この疾患は、今は、主として、１から６月齢のイヌで生じる。母
系抗体による妨害が、ワクチンの失敗の大部分の原因である（同上；Ｗａｎｅｒ
ら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９６）８：４２７−３７）
。母系由来赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価もまた、弱毒ＣＰＶワクチンの効力に相
関することが示されている。（Ｈｏａｒｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９７）１５
：２７３−５）。母系抗体による子犬の鼻内ワクチン接種は、妨害を回避するた
めにいくらか成功をおさめていることが示されているが、このような抗体の存在
下で改良された免疫原性を有するワクチンが所望される（Ｂｕｏｎａｖｏｇｌｉ
ａら、Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｍｅｄ．（１９９４）４１：３
−８）。分子ウイルス学的方法はまた、ウイルスの抗原的不均一性、およびワク
チン開発における挑戦に加えて、ウイルスの連続的進化を明らかにした。
【０１９８】 この実施例において、イヌパルボウイルス株を進化させ、スクリーニングして
、ワクチンとして用いたときに、母系抗体を妨害しないものを同定する。全ワク
チン株、またはワクチンの免疫原性抗原のみのいずれかをシャッフルし、そして
ネガティブ選択して、母系抗体に認識されるワクチンをライブラリーから除去す
る。例えば、母系抗体で被覆されたフラスコまたはカラムを用いた親和性選択を
用いる。ＣＰＶの複数の異なる株由来のエピトープを有する株を同定するために
、ＣＰＶの異なる株間を識別するモノクローナル抗体（Ｓａｇａｚｉｏら，Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９８）７３：１９７−２００）を、これらの
抗体特異性が母系抗体の主要成分でない限り、用い得る。これらの多価株は、Ｃ
ＰＶの、全ての異なる、存在する、および出現した株に対する交差防御を誘導す
る点で、より強力でありそうである。
【０１９９】 パルボウイルスの分子感染クローンが生成されている（Ｂｌｏｏｍら、Ｊ．Ｖ
Ｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９７５−８８）。このようなクローンは、ファ
ミリーＤＮＡシャッフリングのための適切な基質を提供する。ファミリーシャッ
フリングアプローチは、異なる株のキメラを同時に生成し得るという利点を有す
る。これらのキメラは、次に、至適な免疫原性および交差防御について、インビ
ボでスクリーニングされ得る。１つのアプローチにおいて、イヌパルボウイルス
のライブラリーが生成され、そしてこれらのライブラリーは最初に、予めＣＰＶ
に対して免疫されたイヌ由来の抗体に対する結合の欠如についてスクリーニング
される。選択されたワクチンの免疫原性は、イヌを免疫し、そして次にワクチン
接種された動物に異なる生ＣＰＶの株を抗原投与することによって確認され得る
。母系抗体に対する結合の低いワクチンは、改良された効力を有することが予期
され、そしてキメラワクチンは、交差防御免疫応答を提供することが予期される
。
【０２００】 （実施例５） （フラビウイルス；デングウイルスのキメラ弱毒ワクチン株の進化） デングウイルスは、蚊に刺されることによって、年に５０００万−１億人に伝
搬する。ウイルスは、デング出血熱（ＤＨＦ）のような重篤な臨床的発現を引き
起こす。デングウイルスには４つの主要血清型があり、すなわち、デング１、２
、３および４である。４つのデングウイルス血清型の広がりは、ＤＨＦの発生率
の増大をもたらし、２５０億の人々が感染の危険にあると推定されている（Ｃａ
ｒｄｏｓａ、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．（１９９８）５４：３９５−４０５）。
デング感染に対する有効なワクチンは現在、入手可能ではない。
【０２０１】 デングウイルスのエンベロープタンパク質は、免疫応答を提供することが示さ
れており、これは同じウイルス株での更なる抗原投与から防御する。しかし、サ
ブユニットワクチンに応答して産生される中和抗体のレベルは比較的低く、そし
て生ワクチンの抗原投与からの防御は、常に観察されるとは限らない。例えば、
デング−２ウイルスのエンベロープタンパク質をコードする遺伝子ワクチンを注
射したマウスは、インビトロ中和アッセイによって分析したときに、中和抗体を
発生するが、マウスはデング−２ウイルスの抗原投与を生き延びない（Ｋｏｃｈ
ｅｌら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９７）１５：５４７−５５２）。しかし、デング
−４ウイルス構造タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスで免疫された
マウスにおいて、防御的免疫応答が観察された（Ｂｒａｙら（１９８９）Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．６３：２８５３）。さらに、生弱毒デング−２ワクチンは、同一源の
抗原投与に対して、サルを防御した（Ｖｅｌｚｉｎｇら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９
９９）１７：１３１２−２０）。これらのデータは、生弱毒化デングワクチンが
、デングワクチンの開発に対する効率的なアプローチであることを示唆する。し
かし、デングの４つの株全てに対する中和抗体を誘導する四価ワクチンは、個体
が異なる血清型のデングウイルスに遭遇したときに、疾患の抗体媒介増強を回避
する必要がある。ファミリーＤＮＡシャッフリングは、４つ全ての血清型に対し
て防御するキメラウイルスの弱毒化および生成を同時に可能にする技術を提供す
る。
【０２０２】 デングウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンが生成され、そして免疫原性のエン
ベロープ遺伝子が配列決定され、シャッフリングのための良好な出発点を与える
（Ｌａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８
８：５１３９−４３；Ｌａｎｃｉｏｔｔｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９
９４）７５：６５−７５；Ｋｉｎｎｅｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９７）２３
０：３００−８；Ｐｕｒｉら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ（１９９８）１７：８５
−８）。
【０２０３】 この実施例において、デングウイルスをコードする全ｃＤＮＡをシャッフルし
て、適切な弱毒化を得る。あるいは、ウイルスの選択された領域をシャッフルし
て、弱毒株を生成する。シャッフリングのための有用な標的となるこのようなウ
イルス遺伝子としては、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１およびＮＳ３遺伝子が挙げられる（
Ｐｒｙｏｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７９：２６３１−９；Ｖ
ａｌｌｅおよびＦａｌｇｏｕｔ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：６２４−
３２）。さらに、全ての４つの血清型のエンベロープ遺伝子を別々にシャッフル
して、交差防御性抗原を生成し得、これを次に、弱毒クローン中に戻して取り込
むことができる。有効なキメラ現象はまた、全感染性ｃＤＮＡクローンをファミ
リーシャッフリングすることによって達成され得ると予想される。異なるデング
ウイルスのＥタンパク質は、そのアミノ酸の６２％から７７％が共通である。デ
ング１およびデング３は最も密接に関連し（７７％同一）、デング２（６２％）
およびデング４（６７％）が続く。これらの同一性は、有効なファミリーシャッ
フリングを可能とする十分な範囲内である。
【０２０４】 最初に、適切な弱毒化についてのスクリーニングをインビトロで行い得る。例
えば、一次イヌ腎臓細胞の継代を用い得る（Ｐｕｒｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．（１９９７）７８：２２８７−９１）。また、温度感受性変異体を選択する
こともできる。弱毒ワクチン株によって提供される免疫原性および交差防御は、
さらに、種々の生野生型病原体を抗原投与したマウスにおいて研究され得る。所
望であれば弱毒化のレベルを確認するために、更なる研究が、大きい非ヒト霊長
類で行われる。これは、免疫応答の同時研究を可能にする。サルにおける感染性
はヒトに相関することが示されており、サルモデルは適切な弱毒株を選択するの
に有用であることを示す（Ｍａｒｃｈｅｔｔｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ
．Ｈｙｇ．（１９９０）４３：２１２−８）。最終的に、弱毒化された、シャッ
フルされたワクチンは、異なるデング血清型による感染に対するその防御能力に
ついて試験される。
【０２０５】 （実施例６） （フラビウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）） Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、世界で１−２億に達すると見積もられる
相当数の感染個体において硬変および肝細胞癌をもたらす主要な健康問題である
（Ｍａｒｔｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）３７：１１４５９−
６８）。ＨＣＶ感染に対するワクチンまたは有効な処置は、利用可能ではない。
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の異なる株の抗原的不均一性は、ＨＣＶに対する有
効なワクチンの開発における主たる問題点である。ＨＣＶの１つの株に対して特
異的な抗体またはＣＴＬは、他の株に対して防御しない。ＨＣＶのいくつかの株
に対して同時に防御する多価ワクチン抗原は、ＨＣＶに対する有効なワクチンの
開発の際の主たる重要性である。
【０２０６】 ＨＣＶは、全長ｃＤＮＡが構築されているので、ＤＮＡシャッフリングによる
弱毒化に対する特に適切な標的であり（Ｙａｎａｇｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）９４：８７３８−４３）、感染性ＨＣ
ＶのｃＤＮＡは感染血液試料から得られ得る（Ａｉｚａｋｉら、Ｈｅｐａｔｏｌ
ｏｇｙ（１９９８）２７：６２１−７）。それゆえ、天然に存在するＨＣＶの多
様性は、感染個体の血液から直接単離され得、ファミリーＤＮＡシャッフリング
の優れた出発点を提供する。
【０２０７】 ＤＮＡシャッフリングによるＨＣＶの弱毒化のいくつかのアプローチが利用可
能である。第１に、全ｃＤＮＡクローンがシャッフルされ、そして以下に記載の
方法を用いて、ライブラリーがスクリーニングされる。第２に、ポリメラーゼ遺
伝子が、他の関連ウイルス、例えば、他のフラビウイルス由来のもので置換され
得る。デングウイルスのようなフラビウイルス由来のポリメラーゼ遺伝子は、組
織培養細胞中でのＨＣＶの複製を可能にし得る。これは野生型ＨＣＶでは不可能
である。ＨＣＶのＮＳ５Ｂタンパク質は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであ
り、ウイルスの複製に必要とされる（Ｂｅｈｒｅｎｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９
９６）１５：１２−２２）。他のフラビウイルスがインビトロで容易に複製する
ので、他のフラビウイルスファミリーメンバー由来のＲＮＡ−ポリメラーゼ遺伝
子は、インビトロでＨＣＶを複製させることができる。重要なことには、フラビ
ウイルス由来のポリメラーゼ遺伝子のファミリーＤＮＡシャッフリングを用いて
、インビトロで最も強力に複製することが可能な遺伝子を至適化し得る。シャッ
フルされたポリメラーゼ遺伝子によるＨＣＶウイルスのライブラリーの生成は、
インビトロで効率的に増殖するウイルスを同定するためチャンスを向上させる。
ＤＮＡシャッフリングの別の有用な標的は、ＨＣＶの内部リボソーム侵入部位で
あり、これはウイルスの翻訳に必用とされる（Ｈｏｎｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
（１９９９）７３：１１６５−７４）。この領域は異なるフラビウイルス中で比
較的保存されていることが示されており、ファミリーシャッフリングが特に魅力
的なアプローチであることを示している（同上）。
【０２０８】 シャッフルされたＨＣＶのライブラリーは、全ゲノムまたはその断片のシャッ
フリングによって生成され、通常、インビトロおよびインビボでの増殖について
スクリーニングされる。ファミリーＤＮＡシャッフリングは、キメラウイルスお
よびウイルスタンパク質の同時生成を可能とする。これは、ＨＣＶの異なる株に
対する交差防御を増大させると予想される。弱毒化に対する１つの重要なアプロ
ーチは、上記のような組織培養細胞中で増殖する変異体の選択である。特に有意
な選択は、インビボで生じる選択である。患者およびチンパンジーから急性期の
間に単離されたウイルスクローンは超可変領域に同一配列を有し、そして患者由
来の感染性クローンは、チンパンジーにおいて感染性であった（Ａｉｚａｋｉら
、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９８）２７：６２１−７）。従って、チンパンジ
ーモデルは、弱毒化のレベルおよび動物における免疫応答を分析する場合に有用
である。選択されたＨＣＶ変異体の弱毒化の程度は、このようにして、チンパン
ジーにおいて容易に分析され得る。次にこの動物に種々の野生型ＨＣＶ単離体を
抗原投与して、最も防御的かつ交差防御的ワクチン株を検出する。最も優れた変
異体は、所望の場合、シャッフリングおよびスクリーニングの新ラウンドのため
に選択され得る。
【０２０９】 （実施例７） （ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス） ブタ生殖器および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は近年単離されたウ
イルスであり、ブタの生産者、獣医師、および動物健康研究者に対して挑戦し続
けてきた。感染の罹患率は高く、群の約６０％から８０％であり、そして感染の
臨床的影響は農場によって広範囲に異なる（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｖｅｔ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９７）５５：１８７−９６）。多くの群において、感
染は無症状であり、そして生産性は外観上、影響を受けない。しかし、いくつか
の感染群は、ときおり、若いブタにおける呼吸器系疾患の発生、周期的な生殖器
疾患の発生、または重篤な、慢性疾患の問題を、特に若いブタにおいて、報告し
ている。これらの群では、ウイルスまたは細菌性病原体、例えば、Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ
、またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓによる二次感染が、典型的
に、ＰＲＲＳＶ感染と同時に生じている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｖｅｔ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９７）５５：１８７−９６）。
【０２１０】 存在するワクチン候補株が、インビボで、持続し、そして弱毒体へと変異し得
ることの証拠がある（Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．（１
９９９）６０：３３４−４）。さらに、ＰＲＲＳＶの異なる単離体は、その抗原
特性が実質的に異なり、ワクチン開発における障害を増大していることを示した
（Ｐｉｒｚａｄｅｈら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．（１９９８）６２：１７
０−７）。異種株に対する防御は乏しく（ｖａｎ Ｗｏｅｎｓｅｌら、Ｖｅｔ．
Ｒｅｃ．（１９９８）１４２：５１０−２）、改良されたワクチンに対する必要
性が明白である。
【０２１１】 ＤＮＡシャッフリングを用いて、ＰＲＲＳＶの改良された弱毒化ワクチン株が
生成される。ＰＲＲＳＶのクローニングされたゲノム長ｃＤＮＡ由来の感染性転
写物が生成されている（Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８
）７２：３８０−７）。従って、種々の単離体由来のこのような感染性ｃＤＮＡ
クローンのファミリーＤＮＡシャッフリングは、異なる血清型に対して同時に防
御するキメラを生成する手段を提供する。さらに、異なる単離体の遺伝子の不均
一性は、臨床的疾患無しに有効な保護を提供する至適な弱毒株の生成のための優
れた出発プールを提供する。一例として、ブタ肺胞肺マクロファージまたはＣＬ
２６２１細胞を、弱毒化のレベルに向けたウイルスを増殖するために用い得る（
Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｕｇ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：３８０−７）。
さらに、ＢＨＫ−２１細胞は、ｃＤＮＡクローンによって容易にトランスフェク
トされるので、初期スクリーニングにおいて有用である（Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｕ
ｇ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：３８０−７）。弱毒株の次の分析は、
ブタまたは他の適切な試験動物において行われ得る。例えば、ブタを弱毒株で免
疫化し、そして病気にならなかった動物を野生型ウイルスで抗原投与して、ワク
チンの効力を評価する。最も効率的な防御を提供した弱毒ウイルスを、所望であ
れば、シャッフリングおよび選択の新ラウンドに供し得る。
【０２１２】 （実施例８） （ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）） ＨＩＶ感染の予防のための安全かつ有効なワクチンの開発は、少なくとも一部
には、ＨＩＶ−１およびその病原性に関連する複雑さのために、非常に困難であ
ることが証明されている（Ｈｕｌｓｋｏｔｔｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９８）
１６：９０４−１５）。以前の研究は、ヒトにおけるＨＩＶ感染が、宿主免疫系
によって排除され得ることを示唆し、防御的免疫応答を誘導するが、疾患を引き
起こさない弱毒化されたウイルスを生成することが可能であるとの結論を支持し
ている。さらに、ある個体は１５年を越えて感染を生き延び、少なくともある個
体では免疫応答がＨＩＶ−１感染を制御し得ることをさらに示唆している（同上
）。生の弱毒ウイルスは、ＨＩＶ−１感染のサルモデルにおいて最も成功したワ
クチンである（Ｂｅｒｋｈｏｕｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）７３：１１
３８−４５）。
【０２１３】 種々のＨＩＶ単離体由来の多数の感染性分子クローンが構築されており（Ｓｒ
ｉｎｉｖａｓａｎら、Ｇｅｎｅ（１９８７）；５２：７１−８２；Ｓａｕｅｒｍ
ａｎｎら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（１９９０）
６：８１３−２３；Ｃｏｌｌｍａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）６６：７
５１７−２１）、それゆえ、ＨＩＶの弱毒ワクチン株の進化を達成するために、
ファミリーＤＮＡシャッフリングを用いるための、適切な基質を提供する。ＨＩ
Ｖウイルスのライブラリーは、全分子クローンまたはその断片のファミリーシャ
ッフリングによって生成される。ＤＮＡシャッフリングによる進化のための有用
なＨＩＶ領域は、ＧａｇおよびＥｎｖ構造タンパク質ＭＡ（マトリックス）、Ｃ
Ａ（キャプシド）、ＮＣ（ヌクレオキャプシド）、ｐ６、ＳＵ（表面）、および
ＴＭ（膜透過）；Ｐｏｌ酵素ＰＲ（プロテアーゼ）、ＲＴ（逆転写酵素）、およ
びＩＮ（インテグラーゼ）；遺伝子調節タンパク質ＴａｔおよびＲｅｖ；および
不随タンパク質Ｎｅｆ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、およびＶｐｕをコードする遺伝子であ
る（ＦａｎｋｅｌおよびＹｏｕｎｇ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１
９９８）６７：１−２５；ＴｕｒｎｅｒおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．（１９９９）２８５：１−３２）。これらのタンパク質のいずれかをコ
ードする核酸は、ＤＮＡシャッフリングによってターゲッティングされ得る。さ
らに、組合せライブラリーは、異なるウイルス遺伝子のシャッフルされたライブ
ラリーを組み合わせることによって作製され得る。
【０２１４】 シャッフルされたライブラリーは、インビトロおよびインビボ法を用いて減毒
についてスクリーニングされ得る。インビトロ法としては、限定されないが、宿
主細胞特異性が変化した株の選択、温度感受性変異体の選択、およびヒト宿主細
胞に侵入できるが、複製しない変異体の選択が挙げられる。インビボ法としては
、野生型ウイルスに感染しない動物中で増殖する変異体の選択が挙げられる。チ
ンパンジーモデルは、選択された変異体の弱毒化の程度に向けられる、優れたイ
ンビボ系を提供する（Ｍｕｒｔｈｙら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏ
ｖｉｒｕｓｅｓ（１９９８）Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ２７１−６）。チンパンジーは
また、ＡＩＤＳをもたらす生ウイルスで抗原投与され得るので、このモデルは、
同時に、ワクチンの効力に向けられる機会を与える。ＨＩＶの弱毒化された、シ
ャッフルされたワクチン株で免疫されたチンパンジーは、種々の野生型株で抗原
投与されて、防御および交差防御のレベルが分析される。次の抗原投与に対する
効率的な防御で、弱毒化の至適レベルを示すクローンを、所望であれば、シャッ
フリングおよび選択の更なるラウンドのために選択し得る。
【０２１５】 （実施例９） （多価ＨＰＶワクチンの進化） （背景） 粘膜／生殖器ＨＰＶは、世界的に最も一般的な性感染症の１つであり、合衆国
だけで１年で約５５０万人の新規症例が診断されている。推定４千万人の感染個
体が合衆国単独で報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｗｅｅｋｌｙ Ｐｌｕｓ，１
９９８年６月２９日）。約２０の異なるＨＰＶのタイプが、粘膜領域に感染し、
その大部分は、「ハイリスク」ＨＰＶタイプとして分類される。なぜなら、９０
％を越える子宮頚癌（Ｂｏｓｃｈら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．
８７：７９６−８０２（１９９５））、ならびに他の肛門性器および口唇の悪性
疾患に関連しているからである。ヒトパピローマウイルス感染は、子宮頚癌の第
１の原因であり（Ｂｏｓｃｈら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８７
：７９６−８０２（１９９５））、肛門、膣、外陰部、口唇および皮膚の癌にも
関係している。合衆国単独で、年間１５，０００の女性が子宮頚癌と診断され、
その結果、５，０００人が毎年死亡している（Ｕ．Ｓ．ＣＤＣ）。異なるＨＰＶ
タイプとヒトの疾患との関係の要約を表２に概略を示した（出典：Ｍ．Ｓｔａｎ
ｌｅｙ、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：１−１５、１９９４）
。性的に活動的な女性の５０％までが、いわゆる「ハイリスク」ＨＰＶに感染し
ていると推定されている。現在の所、効力のある処置はない。
【０２１６】
【表２】 パピローマウイルスは、小さい、エンベロープに包まれていないＤＮＡウイル
スであり、７．８ｋｂのサイズの環状ゲノムを有する。ウイルスの初期および後
期タンパク質の発現、ならびにエピソームの複製は、ウイルスと宿主の転写およ
び複製因子の複雑な相互作用によって調節される（ＢｅｒｎａｒｄおよびＡｐｔ
，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３０：２１０（１９９４））。「ハイリスク
」ＨＰＶのウイルスの初期タンパク質Ｅ６およびＥ７は、強力な癌遺伝子であり
、ガン細胞中で構造的に発現する。従って、これらは、治療用ワクチン開発のた
めの腫瘍抗原として働き得る。組換えＥ６およびＥ７タンパク質によるマウスの
ワクチン接種は、Ｅ６／Ｅ７発現腫瘍による抗原投与に対する、ＣＴＬ仲介防御
的免疫応答を誘発することが示されている（Ｈａｒｉｈａｒａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ
．Ｏｎｃｏｌ．、１２：１２２９−３５（１９９８））。
【０２１７】 ２つの構造タンパク質、Ｌ１およびＬ２は、パピローマウイルス属のウイルス
を形成し、これらは、後期ウイルスライフサイクルにおいて発現する。ウイルス
は、７２個のカプソマーから構成され、それらの各々は、５個のＬ１分子で形成
される。主要なキャプシドタンパク質Ｌ１の、少量のキャプシドタンパク質Ｌ２
に対する割合は、３０：１と推定される。ＨＰＶが細胞培養物中で生産的に増殖
できないことが、実験的ワクチン接種のために十分な量のウイルスを生成する試
みの厳しい妨げになっている。パピローマウイルスＬ１タンパク質が、他のウイ
ルス遺伝子産物および上皮分化の非存在下で発現する場合、ウイルス様粒子（Ｖ
ＬＰ）に自己アセンブル（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅ）する固有の能力を有す
るという発見は、近年の予防的ワクチン開発の近年の混乱を駆り立てた技術的突
破口であった（Ｋｉｒｎｂａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９：１２１８０−８４（１９９２））。パピローマウイルスＶＬ
Ｐは、防御的免疫を誘導するに有効なウイルス代理物として動物モデル中で用い
られた。これらは、感染性なしで、必須の立体配置的エピトープを提供する。全
てのパピローマウイルスの種特異性が理由で、予防的抗ＨＰＶワクチンを試験す
るための実験系は存在しない。しかし、実験的な動物のワクチン接種は、各々、
ワタオウサギパピローマウイルス、ウシパピローマウイルスおよびイヌ口内パピ
ローマウイルスによる感染後に、家畜のウサギ、ウシおよびイヌの抗体媒介防御
をもたらした（ＬｏｗｙおよびＳｃｈｉｌｌｅｒ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ、１４２３：Ｍ１−８、１９９８、およびその中の引用文献）。
抗体によるＰＶの付着後（ｐｏｓｔ−ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）中和もまた実証さ
れ得る。
【０２１８】 ヒトパピローマウイルスの有効な免疫監視機構は達成が困難であり得る。性器
粘膜表面の天然のＨＰＶ感染は免疫原性が低く、おそらく、非溶解性ウイルスの
ライフサイクルおよびウイルスとその天然宿主との共進化を反映している。ＨＰ
Ｖに感染した個体は、後期ウイルスタンパク質およびウイルスの初期癌遺伝子の
両方について、通常、血清反応陽性であるが、抗体力価は低い。上皮親和性の性
器ＨＰＶについては、ウイルスサイクル中に血液由来相（ｂｌｏｏｄ−ｂｏｒｎ
ｅ ｐｈａｓｅ）がないので、循環する抗体が関連するのは、粘膜表面上でのそ
の利用可能性に制限される。アフリカミドリザルにおける、ウイルス様粒子（Ｖ
ＬＰ）による全身性免疫が、血清および頸膣部の分泌物中の両方で中和ＩｇＧを
誘導するということが実証されたことにより、ＶＬＰ免疫がヒトにも同様の結果
をもたらす可能性が高い（Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７６：１
１４１−１１４５（１９９７））。しかし、誘発された免疫応答のいかなる増強
も、より優れた臨床的利益をもたらす。
【０２１９】 ＨＰＶ偽型アッセイは、ＶＬＰベースの予防的ワクチンが、タイプ特異的であ
り、交差的防御を媒介しないことを示した（Ｒｏｄｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、
７０：５８７５−３３８３（１９９６））。従って、効率的な予防ワクチンは、
いくつかのＨＰＶタイプ由来の抗原決定基を含むべきである。最近の実験研究は
、ワクチン開発の代替標的として、少ない方のキャプシドタンパク質Ｌ２に向け
られている。マウスにＬ２タンパク質で免疫することによって、幾分かの程度の
交差中和を有する中和抗体の誘導が導かれた。しかし、抗体力価は、ＶＬＰ免疫
によって誘導される力価と比較して非常に低かった。
【０２２０】 免疫療法は、ＨＰＶ感染および関連疾患の予防および処置の両方のための、新
規、かつ、より有効な手段を提供し得る。ワクチン開発における現在の試みの大
半は、より多価の「ハイリスク」タイプのうちの２つである、ＨＰＶ−１６およ
びＨＰＶ−１８に向けられている。この２つは悪性癌において最も一般的に見い
だされる。しかし、インビトロ中和アッセイは、ＨＰＶの免疫監視機構がタイプ
特異的であることを示した（Ｒｏｄｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５８７５−
５８８３（１９９６））。従って、２つの主要ＨＰＶタイプである、ＨＰＶ−１
６およびＨＰＶ−１８の根絶は、多数の血清学的に異なる遺伝子型の進化を駆動
し得る。さらに、ヒト種と共進化した、異なるＨＰＶ−タイプ特異的改変体は、
有効な予防的ワクチン開発において考慮する必要がある。ＨＰＶ−タイプの中の
少数の改変体が癌の発症のリスクに、より強く関連し得るという、疫学的証拠が
ある。（Ｘｉら、Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８９：７９６−８
０２（１９９７））。従って、広範囲に防御的なＨＰＶワクチンは、多価でなけ
ればならない。
【０２２１】 交差防御的な多価ＶＬＰワクチンの合理的な設計は、ウイルス表面に露出した
抗原性エピトープに関与する構造、局在性および配列に関する情報が無ければ、
非常に困難である。さらに、ＨＰＶ免疫監視機構を研究するための直接的なアプ
ローチは、動物モデルが無いので、不可能である。パピローマウイルスは、その
宿主と共に進化し、厳密に種特異的である。
【０２２２】 （多価ＨＰＶワクチンの進化） この実施例において、ＨＰＶワクチンの開発を阻んだチャレンジに、再帰的回
数のＤＮＡファミリーシャッフリングおよびスクリーニングによる分子育種の使
用によって、取り組む。シャッフリングは、感染の態様も機構も理解を必要とせ
ず、単に所望の改良についての機能的スクリーニングに依存するので、臨床的お
よび商業的に適切な製品を迅速に生産する可能性が最も高いツールである。関連
の「ハイリスク」ＨＰＶ由来の抗原性配列の組換えを使用して、機能的に多様な
キメラ配列（ここから改良された免疫原性および交差反応性の特性に基づいて最
良のものが選択される）の大きなプールを生成する。例えば、強力な多価ＶＬＰ
ワクチンを、異なるＬ１タンパク質由来の抗原性エピトープをコードする核酸お
よび／またはＬ２遺伝子のシャッフリングによって生成して、交差中和エピトー
プおよび抗体力価を改良し得る。
【０２２３】 抗原をコードする核酸を用いて、複雑な高品質の抗原ライブラリーを生成する
。このライブラリーはインビトロおよびインビボで、主要な「ハイリスク」ＨＰ
Ｖタイプに対する優れた交差的防御抗原の選択について、高スループット（ＨＴ
Ｐ）スクリーニングアッセイによってスクリーニングされる。適切なストラテジ
ーの例を図３にまとめる。天然に存在する多様なＨＰＶウイルス抗原は、ＤＮＡ
シャッフリングによって複雑な抗原ライブラリーを生成するように組み合わされ
る。次に、ＨＴＰインビトロアッセイ系を、ＶＬＰの産生およびその後のスクリ
ーニングのために用いて、抗原性エピトープディスプレイについてのライブラリ
ーを富化する。次いで、引き続く中和アッセイでのインビボ抗原ライブラリーの
スクリーニングは、広範なスペクトルのＶＬＰワクチンにの選択を可能にする。
【０２２４】 （Ａ．キメラＬ１抗原ライブラリーの生成） 最初に、異なるＬ１遺伝子を「ハイリスク」ＨＰＶおよび関連の改変体から単
離して、複合ライブラリーを生成する。パピローマウイルスは異なる上皮に対す
る特異的親和性を有する関連ウイルスの大きなファミリーである。ウイルスゲノ
ムの配列アラインメントに基づいて、パピローマウイルスをいくつかの異なるグ
ループに分けることができる。１０８個の異なるパピローマウイルスＬ１遺伝子
について算定された系統樹は、３つのスーパーグループ（粘膜／性器、皮膚／Ｅ
Ｖ、および特定の動物ＰＶ）および２４のサブグループを含む（図４）。系統学
的関係は、ウイルスの類似の組織親和性（皮膚、粘膜／口唇、肛門性器）、なら
びにそれらが誘導する病原的病変（良性または悪性の腫瘍）によって反映される
。８つの「ハイリスク」ＨＰＶタイプ（ＨＰＶ−１８、３９、４５およびＨＰＶ
−１６、３１、３３、３５、５２）が悪性癌の大半、そして系統樹の２つの異な
るサブグループ（Ａ７およびＡ９、図４）のクラスターに見いだされる。
【０２２５】 しかし、この２つのサブグループ間の系統学的距離は、首尾良いＤＮＡファミ
リーシャッフリングで所望されるよりも大きい。従って、各サブグループについ
て１つ、２つの異なるライブラリーを生成する。ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１
８は、ＨＰＶに関連した癌の８０％に関連し、主要なテンプレートとして用いら
れ、そして関連のタイプ由来の異なる量の配列がシャッフリング反応に付加され
る。
【０２２６】 ＨＰＶ−１６のＬ１遺伝子は、密接に関連する改変体ＨＰＶ−３１、３３，３
５、５２ならびに異なるＨＰＶ−１６改変体と共にプールされ、そしてＨＰＶ−
１８遺伝子は、ＨＰＶ−４５およびＨＰＶ−３９と共にプールされる。関連Ｌ１
遺伝子のプールを、本明細書に記載の確立されたＤＮＡファミリーシャッフリン
グプロトコルに従って、ランダムな断片化と、その後の、プライマーレス（ｐｒ
ｉｍｅｒｌｅｓｓ）ＰＣＲ反応中での再アセンブリに供する（Ｃｒａｍｅｒｉら
、Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８（１９９８）も参照）。さらなる配列不均一性
は、さらに異なる「ハイリスク」ＨＰＶタイプ（例えば、ＨＰＶ−５１、５６お
よび６６、サブグループＡ５およびＡ６、図４）由来の相同配列をアセンブリ反
応中に、相同な末端を有する短いオリゴヌクレオチドの形態で、スパイキング（
ｓｐｉｋｉｎｇ）することによって、付加され得る。再アセンブリされたＬ１キ
メラを、Ｌ１遺伝子に隣接するプライマーでのＰＣＲによって増幅し、そしてシ
ャトルベクター中にサブクローニングした。シャトルベクターはＥ．ｃｏｌｉ中
での高スループットＤＮＡ増幅、および哺乳動物細胞中でのタンパク質発現を可
能とする。ライブラリーの複雑度は、ランダムに選択されたクローンの制限分析
および配列決定によって推定される。定量での目標は、９０〜１００％のキメラ
配列を有する大きなライブラリー（１０5より大きい）を得ることである。同じ
実験ストラテジーをＬ２遺伝子に適用し得る。
【０２２７】 （Ｂ．インビトロスクリーニングアッセイにおける高スループットの開発） 次の工程は、Ｌ１およびＬ２キメラを提示する抗原性エピトープの選択のため
のＨＴＰアッセイ系の樹立である。最終的な目標は、インビボで広範囲に反応性
の抗体を誘導する能力について最も優れたＬ１およびＬ２キメラを選択すること
である。しかし、ＤＮＡファミリーシャッフリングは、「間違って」アセンブル
された遺伝子を生成し得、これはタンパク質発現の失敗を生じさせる。従って、
Ｌ１およびＬ２タンパク質発現について、および免疫原性エピトープを提示する
能力について、インビトロでライブラリーをプレスクリーニングすることは、そ
の後のインビボスクリーニングの際に不要な動物実験を避けるのに役立つ。
【０２２８】 インビトロアッセイにおける高スループットの一般的ストラテジーを図５に概
略を示す。キメラＬ１およびＬ２遺伝子を、Ｌ１、Ｌ２タンパク質発現およびＶ
ＬＰアセンブリのために、哺乳動物細胞中にトランスフェクトする。細胞溶解物
をランダムクローンから調製して、ライブラリー品質を免疫ブロッティングまた
は単純なプレートＥＬＩＳＡアッセイによってチェックする。ライブラリーが所
望の「ノックアウト」率よりも高いことを示したならば、主タイプであるＨＰＶ
−１６およびＨＰＶ−１８から最も異なるＬ１遺伝子をより低い割合で用いて、
より穏和なシャッフリング条件を適用し得る。
【０２２９】 インビトロスクリーニングアッセイは、通常、以下の構成要素を包含する： （ｉ）哺乳動物細胞中での発現およびＥ．ｃｏｌｉ中での増幅のために、シャ
ッフルされたＬ１およびＬ２遺伝子は、強力な真核生物プロモーターと連結され
、そして細菌の複製起点および薬物選択マーカーを含むプラスミドベクター中に
クローニングされる。Ｌ１について、強力なプロモーター、例えば、ＣＭＶプロ
モーターまたはＤＮＡシャッフリングを用いて改良されたプロモーターを用いる
ことが特に望ましい。Ｌ１の高発現は、効率的なＶＬＰアセンブリのために十分
に高い発現レベルを得るために所望され得る。
【０２３０】 （ｉｉ）異なる哺乳動物細胞株を異なるトランスフェクション因子で試験して
、トランスフェクション効率を至適化する。８０〜９０％の効率が望ましい。ヒ
ト２９３細胞が、しばしば適切である。トランスフェクション効率レベルおよび
プロモーター強度は、対照プラスミド（例えば、ＧＦＰを発現するもの）を用い
て試験され得、これは迅速な蛍光の読み出しを可能とする。ライブラリーのラン
ダムなクローンを選択された細胞株中にトランスフェクトする。ＥＬＩＳＡまた
はウェスタンブロッティングを用いて、細胞溶解物をＬ１およびＬ２タンパク質
発現について試験する。
【０２３１】 （ｉｉｉ）好ましいスクリーニングアッセイは、免疫認識に基づき、そのため
に特異的抗体が必要とされる。いくつかの実施形態について、インビトロスクリ
ーニングアッセイには、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８のＬ１およびＬ２タン
パク質に対する抗体を使用することで十分である。なぜなら、これらは悪性癌中
で最も優勢であり、そして選択されたキメラは、これらの２つのタイプに対する
高レベルな抗体を誘導する特性を有するべきだからである。関連のＨＰＶタイプ
に対する抗原の交差的防御は、最後のインビボスクリーニングアッセイにおいて
試験される。
【０２３２】 Ｌ１／Ｌ２タンパク質および立体配置的Ｌ１ ＶＬＰエピトープに対するポリ
クローナル抗血清の生成のために、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ-１８のＬ１およ
びＬ２遺伝子を、細菌発現ベクター（例えば、ｐＥＴ−３ａ）（そこからタンパ
ク質が適切な細菌株（ＢＬ２１／ＤＥ３、ＨＭＳ１７４／ＤＥ３）中で十分な量
で発現し得る）中にクローニングする。ＨＰＶ−Ｌ１タンパク質が、その後のタ
ンパク質精製工程の間に、ＶＬＰ中に再アセンブリされ得ることが示されている
（Ｃｒｉｐｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２９８８−２９９５（１９９７））。
精製されたＬ１およびＬ２タンパク質およびショ糖勾配精製Ｌ１ ＶＬＰを用い
て、立体配置的抗原性エピトープに対する抗体の誘導のために、ウサギまたはマ
ウスに注射し得る。
【０２３３】 （Ｃ．ＨＴＰインビトロスクリーニングアッセイ） 立体配置的抗原性エピトープを露出するＬ１／Ｌ２タンパク質を生じるキメラ
クローンの選択および富化のために、ライブラリーをインビトロで次回のスクリ
ーニングに供する。インビトロスクリーニングアッセイの模式図を図５に示す。
タンパク質発現およびＶＬＰ形成のために、ライブラリーを哺乳動物細胞中にト
ランスフェクトする。次のスクリーニングのために、Ｌ１／Ｌ２タンパク質およ
びＶＬＰを好ましくは粗細胞溶解物から精製する。Ｌ１ ＶＬＰについての高ス
ループット精製を達成するために、キメラＬ１／Ｌ２タンパク質の発現を指示す
る発現ベクターを異種抗原性エピトープ（例えば、ヘキサヒスチジンタグ）との
融合物として用い得る。このような異種アミノ酸配列の存在は、Ｌ１タンパク質
からＶＬＰへの自己アセンブリおよび立体配置的抗原性エピトープの提示を妨げ
ない（Ｐｅｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４０：１８００−１８０５（１９９８
））。ヘキサヒチジンタグのタンパク質キメラのＣ末端への融合は、ＨＴＰプレ
ートアッセイにおけるタンパク質精製の効率的かつ迅速な方法を提供する。ヘキ
サヒスチジンタグは生理学的ｐＨで荷電せず、タンパク質の構造および機能をめ
ったに妨害しない。Ｈｉｓタグは、コードする短い配列をシャッフルされた産物
の最終増幅のために用いられる３’−ＰＣＲプライマーに６ヒスチジン残基を単
に付加することによって、シャッフルされたキメラのＣ末端部分に連結され得る
。
【０２３４】 Ｅ．ｃｏｌｉ中でのシャッフルされたライブラリーの増幅後に、個別のクロー
ン由来のプラスミドＤＮＡは、高スループット９６ウェル様式で自動的に調製さ
れ得る。１日当たり６００〜８００またはそれ以上のプラスミドの精製を可能に
する自動化プラスミド精製プロトコルは実行可能である。ＤＮＡの量および純度
もまた、プレート上で分析され得る。ライブラリーは、９６ウェル様式に播種さ
れた哺乳動物細胞中にトランスフェクトされ、一度に１０００個までの個々のト
ランスフェクションを可能とする。粗溶解産物を、２日間にわたる細胞培養の後
に調製する。溶解産物を、ニッケル−ニトリロ三酢酸でコーティングした新しい
９６ウェルプレート（Ｎｉ−ＮＴＡ ＨｉｓＳｏｒｂプレート、Ｑｉａｇｅｎ）
に移し、６×Ｈｉｓタグ化Ｌ１／Ｌ２タンパク質およびＶＬＰをプレート上で効
率的に固定化する。プレートを抗ＨＰＶ−１６ Ｌ１／Ｌ２抗体および抗ＨＰＶ
−１８ Ｌ１／Ｌ２抗体および検出結合体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ）と共にインキュベートし、そして自動化プレート読み出しによって分析
する。ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８の野生型遺伝子はアッセイのポジティブ
コントロールとして役立つ。ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８は交差反応性エピ
トープを提示せず、バックグラウンドコントロールとして用いられ得る。インビ
トロアッセイの定量の目標は、その後のマウスにおける免疫刺激のために、各ラ
イブラリーから１０００個以上のキメラを選択することである。
【０２３５】 （Ｄ．ＶＬＰ産生およびスクリーニングのための代替的アッセイ） 代替のＨＴＰアッセイが、ＶＬＰがプラスミドＤＮＡを１０ｋｂのサイズまで
パッケージングする能力を使用することにより設定され得る（Ｓｔａｕｆｆｅｒ
ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５２９−５３６（１９９８））。光子放出
タンパク質を発現するマーカー遺伝子（例えば、ＧＦＰ、ＬａｃＺ、ルシフェラ
ーゼ）をＬ１発現プラスミド中にクローニングし、これをＶＬＰアセンブリの間
にパッケージングする。１つの細胞株中でのＶＬＰ産生の後、９６ウェルプレー
トからの全ての細胞をプールし、そしてＶＬＰを単一の反応で精製し得る。その
後の、ＶＬＰと哺乳動物細胞とのインキュベーションは、Ｌ１キメラについての
マーカー移動（ｔｒａｎｓｆｅｒ）をもたらし、このＬ１キメラは感染性ＶＬＰ
にアセンブルされる能力を有する。マーカー遺伝子を発現する細胞は蛍光顕微鏡
およびプレートＥＬＩＳＡによって容易にモニターされ得、そしてＦＡＣＳソー
ティングによって選択され得る。プラスミドＤＮＡはＨｉｒｔ調製によって精製
され得、次にＥ．ｃｏｌｉ中で増幅され得る。この直接スクリーニングアッセイ
は、よりストリンジェントであるが、選択はＤＮＡをパッケージングし得るＶＬ
Ｐについてのみである。そのため、ＤＮＡをパッケージングする能力を失ったが
、強力な免疫原性エピトープを発現する改変体は、見逃され得る。
【０２３６】 他の代替のトランスフェクションプロトコルおよび低スループット（ＬＴＰ）
クロマトグラフＶＬＰ精製工程（アフィニティークロマトグラフィー、キャピラ
リー電気泳動またはショ糖遠心分離）もまた用いられ得る。
【０２３７】 （Ｅ．シャッフルされたライブラリーのインビボ分析） インビトロアッセイ由来の予備選択されたキメラライブラリークローンを用い
て、マウスに免疫する。２つの異なる適用経路が想定され得る：（１）Ｌ２タン
パク質および精製Ｌ１ ＶＬＰの注射（これは他の実験研究において首尾良く使
用されている）、および（２）裸のＤＮＡ送達（これは簡便な工業的規模でのワ
クチン製造、および非侵襲的皮膚適用、特に将来の臨床適用のために、利点を与
える）。裸のＤＮＡワクチン接種は、十分な立体配置的Ｌ１エピトープの送達お
よび、実験ウサギモデルにおける免疫防御を生じさせた（Ｓｕｎｄａｒａｍ、Ｖ
ａｃｃｉｎｅ １５：６６４−６７１（１９９７））。
【０２３８】 最初にインビボスクリーニング実験を、皮膚への裸のＤＮＡの適用を用いて実
施し得る。このアッセイが十分に高感度でない場合には、ＶＬＰを発現および精
製し得る。Ｌ１タンパク質は定量的に、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（または酵母）中
で発現され得、インビトロでＶＬＰ中にアセンブリされ、そしてショ糖／ＣｓＣ
ｌ勾配によって注射用に精製され得る。裸のＤＮＡ送達アプローチを実験系で用
いることは、インビボでＶＬＰ中にアセンブリする能力が最も高いＬ１キメラに
ついて同時に選択することを可能にするという、更なる利点を有する。
【０２３９】 プラスミドまたはＶＬＰをプールし、そして次回のスクリーニングで逆重畳す
ることは、強力な免疫原を同定するために必要とされる小動物の数を低減し得る
。マウスにおいて中和抗体の誘導をもたらす最も低い濃度のプラスミドまたはＶ
ＬＰは、ＨＰＶ−１６野生型のＬ１およびＬ２プラスミドまたはタンパク質を用
いて評価される。１０または２０クローンのライブラリーのプールを少数の実験
で用いて、次回のスクリーニングラウンドでプールし、そして逆重畳するストラ
テジーが実行可能かどうか試験し得る。異なるプールと野生型対照との間で有意
差が検出され得ない場合には、ライブラリー免疫のために単一のクローンが用い
られ得る。
【０２４０】 （Ｆ．中和アッセイおよび交差的防御免疫の分析） 免疫化されたマウス由来の血清を収集し、そして９６ウェルプレートアッセイ
において、野生型ＶＬＰの交差中和効率を試験する。パピローマウイルスＬ１／
ＶＬＰは、天然のウイルスがマウス赤血球を培養物中で凝集体化させる能力を保
持し、そしてＶＬＰに対して惹起された抗体は、凝集を阻害し得る（Ｒｏｄｅｎ
ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３２９８−３２０１（１９９６））。従って、赤血
球凝集素阻害アッセイ（ＨＩＡ）は、信頼でき、かつ高感度である中和アッセイ
の代理を提供する。全ての野生型ハイリスクＨＰＶ由来のＶＬＰが、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ中での発現によって調製され得、そしてマウス赤血球と共に９６ウェルプレー
トに播種される。収集した血清を段階希釈に添加して、中和力価および交差中和
能力を評価する。抗野生型抗原と比べて中和力価が向上した抗体を誘導し、かつ
他の関連の野生型ＶＬＰと交差反応性である、プール実験由来のＬ１およびＬ２
キメラを次に、次回のインビボスクリーニングで逆重畳し得る。選択されたクロ
ーンの改良された性質は、上記のようなマーカー遺伝子の移動を用いる直接中和
アッセイにおいて確認し得る。
【０２４１】 新規抗原の質をさらに改良するために、２回目のシャッフリングおよびスクリ
ーニングが、好ましくは適用されて、最良の改変体を得る。改良された改変体（
広範囲な関連のＨＰＶに対して強力な交差反応性免疫を誘導するものとして定義
される）は再度シャッフルされ、そしてスクリーニングされる。シャッフルされ
たキメラは野生型遺伝子と戻し交配されて、さらに抗体力価を改良し得る。戻し
交配は、改良された配列を大過剰モル量の親配列と共にシャッフリングすること
によって行われ、そして交差的防御抗体応答を提供する表現型に必須の変異は維
持しつつ、シャッフルされたキメラ／変異体を親または野生型の配列に戻して育
種させる手段を提供する。天然の変異の除去に加えて、分子戻し交配は、また、
改良された改変体中の多くの変異のうちのどれが、その表現型に最も寄与するか
を特徴づけるためにも、用いられ得る。これは、他のいかなる方法によっても、
効率的なライブラリー様式で達成され得ない。
【０２４２】 本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示目的のみのためである
こと、そして、それに照らした種々の改変または変更は当業者に示唆され、そし
て本願の精神および範囲内ならびに添付の請求の範囲の範囲内に含まれることが
理解される。本明細書で引用した全ての刊行物、特許、および特許出願は、全て
の目的のために、本明細書中に参照として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、種々の変異または離れたゲノム部分を有するウイルスゲノムのファミ
リーのコレクションの組換えシャッフリングの略図である；離れたゲノムセグメ
ント（例えば異なるウイルス単離体のゲノムから得られる）は蔭をつけたボック
スによって示す。
【図２】 図２は、本発明の組換え法を用いて得られるキメラウイルスワクチンをスクリ
ーニングするプロトコルの図式を示す。
【図３】 図３は、本発明の方法を用いて多価ウイルスワクチンを開発する戦略の概要を
示す。ＨＰＶは典型例として用いられる。図の右側の矢印は、前段階を首尾よく
遂行した後に続く各操作を指し示す。左側の点線の矢印は、前段階の操作が次の
段階に行けなかった場合に別法の段階の概略を示す。
【図４】 図４は、パピローマウイルスの系統樹を示す（資料：Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌ
ｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｃｏｍｐ．１９９７）。
【図５】 図５は、改良された抗原をコードする組換え核酸を確認するための高処理量（
ＨＴＰ）インビトロスクリーニングアッセイを示す。
【図６】 図６は、抗原ライブラリー免疫及び交差中和（ｃｒｏｓｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉ
ｚａｔｉｏｎ）アッセイのためのプロトコルの図式を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ステマー， ウィレム ピー． シー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 95032， ロス ガトス， キャシー コート 108 (72)発明者 デルカーデイル， ステファン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94002， ベルモント， モンロー アベニュー 2049 (72)発明者 アプト， ドリス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94068， サニーベイル， ナンバー３， タマラ ック レーン 917 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA13 AA14 BA31 BA32 CA06 DA02 EA02 FA06 GA11 HA11 4B063 QA06 QA20 QQ10 QQ43 QR66 QS38 QX02 4C085 AA03 AA04 BA01 DD01 DD72

Claims (99)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 弱毒化について、ウイルスまたは細胞を生成およびスクリー
    ニングする方法であって、該方法は、以下： （１）１つ以上の核酸セグメントの第一のセットを、１つ以上の核酸セグメン
    トの少なくとも第二のセットを用いて組換えて、組換え核酸のライブラリーを形
    成する工程であって、該１つ以上の核酸セグメントが、ウイルスまたは細胞の完
    全または部分的なゲノムライブラリーを含む、工程； （２）１つ以上のウイルスまたは細胞を、宿主生物体に存在する生理学的条件
    下での弱毒化について、スクリーニングする工程であって、該１つ以上のウイル
    スまたは細胞は、該組換え核酸のライブラリーの１つ以上のメンバーを含む、工
    程；および （３）１つ以上のウイルスまたは細胞をスクリーニング工程であって、該１つ
    以上のウイルスまたは細胞は、病原性因子に対する免疫応答を誘導する能力につ
    いて弱毒化されている、工程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記（２）のスク
    リーニング工程が、前記（３）のスクリーニング工程と同時に、または該（３）
    のスクリーニング工程の後に実施される、方法。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、ここで、弱毒化されたワク
    チンが細胞を含み、そして前記組換え核酸のライブラリーが前記第二のセットの
    １つ以上の核酸セグメントを複数の細胞に導入することによって作製され、それ
    によって、該第二のセットの少なくとも１つの核酸セグメントが、該細胞のゲノ
    ムまたはエピソーム中の核酸セグメントとの組換えを受ける、方法。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の方法であって、ここで、弱毒化されたワク
    チンが、細菌、真菌または寄生生物を含む、方法。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の方法であって、ここで、ウイルスが、産生
    され、そしてスクリーニングされる、方法。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上の核
    酸セグメントの第一のセットが、ウイルスの完全または部分的なゲノムライブラ
    リーを含み、該ウイルスの完全または部分的なゲノムライブラリーは、以下から
    なる群から選択される型である、方法：インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全
    ウイルス、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、パ
    ルボウイルスＢ１９、１型単純疱疹ウイルス、２型単純疱疹ウイルス、サイトメ
    ガロウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、脳炎ウ
    イルス、ＲＳウイルス、ネコカリチウイルス属、伝染性ファルビキウス病ウイル
    ス、デング熱ウイルス１型、２型、３型および４型、豚コレラウイルス、コクサ
    ッキーウイルスＢ３、ウマ動脈炎ウイルス、黄熱病ウイルス、ヒト星状ウイルス
    、ならびにブタ生殖および呼吸性症候群ウイルス。
  7. 【請求項７】 請求項５に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上の核
    酸セグメントの第一のセットが、ウイルスの完全または部分的なゲノムライブラ
    リーを含み、該ウイルスの完全または部分的なゲノムライブラリーが、以下から
    なる群から選択されるファミリーのメンバーである、方法：ピコルナウイルス、
    トガウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、ブンヤ
    ウイルス、アレナウイルス、レトロウイルス、パポバウイルス、パルボウイルス
    、疱疹ウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、デルタウイルス、フラ
    ビウイルス、フィロウイルス、オルトミクソウイルス、およびレオウイルス。
  8. 【請求項８】 請求項５に記載の方法であって、ここで、ウイルス様粒子が
    、産生され、そしてスクリーニングされ、各ウイルス様粒子が、以下からなる群
    から選択されるウイルスの型の１つ以上のポリペプチドを含む、方法：ヒトパピ
    ローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ヒトポリオー
    マウイルス、ロタウイルス、パルボウイルスおよびＥ型肝炎ウイルス。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載の方法であって、ここで、該方法は、以下： （４）（３）において同定される１つ以上の弱毒化細胞またはウイルス由来の
    １つ以上の核酸セグメントを、１つ以上の核酸セグメントのさらなるセットと組
    換えて、組換え核酸のさらなるライブラリーを形成する工程； （５）宿主生物体中に存在する生理学的条件下でさらなる弱毒化について、組
    換え核酸のさらなるライブラリーの１つ以上のメンバーを含む１つ以上のウイル
    スまたは細胞をスクリーニングする工程；および （６）（４）および（５）を繰り返して、該宿主生物体中に存在する生理学的
    条件下で、疾患を繰り返すかまたは疾患を引き起こす能力を失った、さらに弱毒
    化されたウイルスまたは細胞についてスクリーニングする工程、 をさらに包含する、方法。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上の
    核酸セグメントのさらなるセットが、（３）において同定される１つ以上の弱毒
    化細胞またはウイルス由来の核酸を含む、方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記第二のセッ
    トの１つ以上の核酸セグメントが病原性因子由来である、方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上の
    核酸セグメントの第二のセットが、少なくとも１つの異種細胞またはウイルス型
    由来の実質的に完全なゲノムライブラリーを含む、方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上の
    核酸セグメントの第二のセットが、少なくとも１つの異種細胞またはウイルス型
    由来の部分的なゲノムライブラリーを含む、方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上の
    核酸セグメントの第二のセットの１つ以上が、異種生物由来の免疫原性決定基を
    コードする、方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記第一および
    第二のセットの１つ以上の核酸セグメントが、１つ以上の異なる個々の細胞また
    はウイルス由来の核酸配列または遺伝子の天然の改変体を含む、方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１に記載の方法であって、（３）において同定され
    る１つ以上の弱毒化されたウイルスまたは細胞が、接種された宿主生物体におい
    て存在する場合、疾患または他の有害な効果を繰り返すか、または引き起こすこ
    とができない、方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の方法であって、ここで、１つ以上の弱
    毒化ウイルスまたは細胞の天然の単離物が、該天然の単離物によって感染された
    宿主生物体に存在する場合、疾患または他の有害な効果を繰り返し得るか、また
    は引き起こし得る、方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１に記載の方法であって、ここで、該方法が、以下
    ： 前記１つ以上の核酸セグメントを、ウイルスまたは細胞の野生型株由来の核酸
    のライブラリーを用いて組換えることによって、（３）において同定される１つ
    以上の弱毒化されたウイルスまたは細胞の１つ以上の核酸セグメントを戻し交配
    して、組換え核酸のさらなるライブラリーを形成する工程；および 接種された宿主生物体に存在する生理学的条件下で、弱毒化について、該組換
    え核酸のさらなるライブラリーの１つ以上のメンバーを含む１つ以上のウイルス
    および細胞をスクリーニングする工程、 をさらに包含する、方法。
  19. 【請求項１９】 前記野生型株由来の前記核酸のライブラリーが、ウイルス
    または細胞の完全または部分的なゲノムライブラリーを含む、請求項１８に記載
    の方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１８に記載の方法であって、ここで、該方法は、さ
    らに、病原性因子に対する免疫応答を誘導する能力について、１つ以上の戻し交
    配された弱毒化ウイルスまたは細胞をスクリーニングする工程を包含する、方法
    。
  21. 【請求項２１】 請求項１に記載の方法であって、ここで、（２）が、宿主
    細胞または宿主組織に結合する減少した能力について、前記組換え核酸のライブ
    ラリーの１つ以上のメンバーを含む１つ以上のウイルスまたは細胞をスクリーニ
    ングする工程、を包含する、方法。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の方法であって、ここで、前記ウイルス
    が、前記宿主細胞または宿主組織の精製または組換え産生されたレセプターを使
    用するパニングによってスクリーニングされる、方法、
  23. 【請求項２３】 請求項１に記載の方法であって、ここで、（２）は、相補
    成分に結合する能力の減少について、前記組換え核酸のライブラリーの１つ以上
    のメンバーを含む１つ以上のウイルスまたは細胞をスクリーニングする工程を包
    含する、方法。
  24. 【請求項２４】 請求項１に記載の方法であって、ここで、（２）は、体液
    媒介免疫応答または細胞媒介免疫応答に対する感受性の増加について、前記組換
    え核酸のライブラリーの１つ以上のメンバーを含む１つ以上のウイルスまたは細
    胞をスクリーニングする工程、を包含する、方法。
  25. 【請求項２５】 請求項２４に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上
    のウイルスまたは細胞が、該１つ以上のウイルスまたは細胞の天然の単離物に特
    異的に結合する１つ以上の抗体に、該１つ以上のウイルスまたは細胞を接触させ
    ることによってスクリーニングされる、方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２５に記載の方法であって、ここで、該方法が、さ
    らに、前記１つ以上の抗体に結合する前記１つ以上のウイルスまたは細胞を試験
    して、該１つ以上の抗体によって不活性化される１つ以上のウイルスまたは細胞
    についてスクリーニングする工程、を包含する、方法。
  27. 【請求項２７】 （２）が、１つ以上の母系抗体に結合することの不能性に
    ついて、前記組換え核酸のライブラリーの１つ以上のメンバーを含む１つ以上の
    ウイルスまたは細胞をスクリーニングする工程、を包含する、請求項１に記載の
    方法。
  28. 【請求項２８】 請求項１に記載の方法であって、ここで、該方法は、さら
    に、前記１つ以上の弱毒化されたウイルスまたは細胞の産生のために使用される
    許容条件下で増殖する能力について、該１つ以上の弱毒化されたウイルスまたは
    細胞をスクリーニングする工程、を包含する、方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記許容条件
    は、以下からなる群から選択される性質において、前記生理学的条件とは異なる
    、方法：温度、ｐＨ、糖含量、無防備状態の免疫応答、相補体または相補体成分
    に非存在、および１つ以上の血清タンパク質の存在または非存在。
  30. 【請求項３０】 請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記許容条件
    が、免疫無防備状態宿主生物体を含む、方法。
  31. 【請求項３１】 請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記許容条件
    が、前記生理学的条件下では存在しない栄養素を含む培地を含む、方法。
  32. 【請求項３２】 請求項２８に記載の方法であって、該方法は、（１）の前
    に、１つ以上のプロデューサー細胞または培養条件において急激に増殖する１つ
    以上の細胞またはウイルスについてスクリーニングする工程、を包含する、方法
    。
  33. 【請求項３３】 請求項２８に記載の方法であって、ここで： 前記許容条件は、１つ以上のサプレッサーｔＲＮＡ分子の存在を含み； 前記１つ以上の核酸セグメントの第一および第二のセットは、以下： ａ）１つ以上のポリヌクレオチドの第一のセットであって、該セットは、ポ
    リペプチドの全てまたは一部をコードし、そして、該ポリペプチドは、前記１つ
    以上のウイルスまたは細胞の複製に関連する、セット；および ｂ）１つ以上のオリゴヌクレオチドの第二のセットであって、該セットは、
    該ポリペプチドの一部または全てをコードするポリヌクレオチド配列内に分散さ
    れた１つ以上の終止コドンを含む、セット、 を含み； ここで、該１つ以上のオリゴヌクレオチドは、１つ以上のポリペプチドコード
    ポリヌクレオチドとの組換えを受けて、組換え核酸のライブラリーを形成し、該
    ライブラリーは、１つ以上の組換え核酸を含み、ここで、少なくとも１つの天然
    には存在しない終止コドンが、該ポリペプチドの一部または全てをコードする該
    ポリヌクレオチド配列内に分散され； 前記（２）のスクリーニングする工程が、該組換え核酸のライブラリーを１つ
    以上のサプレッサーｔＲＮＡ分子と接触させる工程、および該１つ以上のサプレ
    ッサーｔＲＮＡ分子の存在下では増殖するが、該１つ以上のサプレッサーｔＲＮ
    Ａ分子の非存在下では増殖しない１つ以上の子孫ウイルスまたは細胞を回収する
    工程を包含し、ここで、該１つ以上のサプレッサーｔＲＮＡは、該少なくとも１
    の天然には存在しない終止コドンにおける翻訳の終結を抑制する、方法。
  34. 【請求項３４】 請求項３３に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上
    のサプレッサーｔＲＮＡ分子が、１つ以上の弱毒化されたウイルスの増殖のため
    に使用されるサプレッサー細胞に存在する、方法。
  35. 【請求項３５】 前記第一のセットが、前記１つ以上のウイルスの部分的ま
    たは完全なゲノムライブラリーを含む、請求項３３に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 請求項３３に記載に方法であって、ここで、前記１つ以上
    のサプレッサーｔＲＮＡ分子が、前記１つ以上の弱毒化されたウイルスまたは細
    胞で接種される哺乳動物の１つ以上の細胞に存在しない、方法。
  37. 【請求項３７】 請求項３３に記載の方法であって、ここで、該方法は、以下
    ： （４）（３）において同定される１つ以上の弱毒化されたウイルスまたは細胞
    由来の１つ以上の組換え核酸セグメントを、オリゴヌクレオチドの１つ以上のさ
    らなるセットを用いて組換えて、組換え核酸のさらなるライブラリーを作製する
    工程； （５）該組換え核酸のさらなるライブラリーを、該１つ以上のサプレッサーｔ
    ＲＮＡ分子と接触させる工程、および１つ以上の子孫ウイルスまたは細胞を回収
    する工程； （６）該１つ以上のサプレッサーｔＲＮＡ分子の非存在下で、該１つ以上の子
    孫ウイルスまたは細胞を培養して、該１つ以上のサプレッサーｔＲＮＡ分子の非
    存在下で複製することができない１つ以上の弱毒化されたウイルスまたは細胞に
    ついてスクリーニングする工程； （７）（４）〜（６）を繰り返して、該１つ以上のサプレッサーｔＲＮＡ分子
    の存在下で複製する能力の所望の程度および該１つ以上のサプレッサーｔＲＮＡ
    分子の非存在下で複製することの不能性の所望の程度を有する更なる子孫ウイル
    スまたは細胞についてスクリーニングする工程、 をさらに包含する、方法。
  38. 【請求項３８】 請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記許容条件
    が、プロデューサー細胞または生物を含み、ここで、前記ウイルスまたは細胞の
    天然の単離物は、増殖せず、そして該方法は、前記組換え核酸のライブラリーの
    １つ以上のメンバーを含む１つ以上のウイルスまたは細胞を、該プロデューサー
    細胞または生物に導入して、該プロデューサー細胞または生物において増殖し得
    る１つ以上の弱毒化されたウイルスまたは細胞についてスクリーニングする工程
    を包含する、方法。
  39. 【請求項３９】 請求項３８に記載の方法であって、ここで、前記プロデュ
    ーサー細胞はサル細胞を含み、そして該方法は、該サル細胞において増殖するが
    、ヒト細胞において増殖しない１つ以上の弱毒化されたウイルスまたは細胞につ
    いてスクリーニングする工程を包含する、方法。
  40. 【請求項４０】 請求項３８に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上
    のウイルスまたは細胞は、１つ以上のプロデューサー細胞および生物の１つ以上
    の細胞の混合集団に導入され、そして該方法は、さらに、その後の組換えを実施
    する工程および該生物の細胞の非存在下で、１つ以上のプロデューサー細胞の集
    団においてスクリーニングする工程を包含する、方法。
  41. 【請求項４１】 請求項３８に記載の方法であって、該方法は、さらに、そ
    の後の組換えを実施する工程、および１つ以上のプロデューサー細胞の第二の型
    の集団において、スクリーニングする工程を包含する、方法。
  42. 【請求項４２】 請求項１または４７に記載の方法によって得られる弱毒化
    されたウイルスまたは細胞。
  43. 【請求項４３】 ワクチン組成物であって、該ワクチン組成物は、請求項４
    ２に記載の弱毒化されたウイルスまたは細胞、または該弱毒化されたウイルスま
    たは細胞から得られたポリヌクレオチド、およびキャリアを含む、ワクチン組成
    物。
  44. 【請求項４４】 請求項１に記載の方法であって、さらに、（３）において
    同定される１つ以上のウイルスまたは細胞、または該１つ以上のウイルスまたは
    細胞のポリペプチドを、宿主生物体に投与する工程を包含する、方法。
  45. 【請求項４５】 請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記宿主生物
    体は、前記１つ以上のウイルスまたは細胞が投与される前に、前記病原性因子で
    感染されない、方法。
  46. 【請求項４６】 請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記宿主生物
    体は、前記１つ以上のウイルスまたは細胞が投与される前に、前記病原性因子で
    感染される、方法。
  47. 【請求項４７】 １つ以上の許容条件下で複製する能力について、細胞を生
    成し、そしてスクリーニングする方法であって、該方法は、以下： （１）核酸のライブラリーを、複数の細胞に導入する工程であって、それによ
    って、該核酸の少なくとも１つが、該細胞のゲノムまたはエピソームにおいて、
    核酸セグメントとの組換えを受けて、１つ以上の組換え核酸を含む１つ以上の改
    変細胞を生成する工程； （２）該１つ以上の改変細胞をスクリーニングして、１つ以上の条件的に欠損
    した細胞を同定する工程であって、該１つ以上の条件的に欠損した細胞は、宿主
    生物体において見出されるような生理学的条件下で増殖する能力を欠失する方向
    に進化した、工程；および （３）該１つ以上の条件的に欠損した細胞をスクリーニングして、１つ以上の
    許容条件下で複製する能力を維持する１つ以上の条件的に欠損した細胞を同定す
    る工程、 を包含する、方法。
  48. 【請求項４８】 請求項４７に記載の方法であって、ここで、該方法は、さ
    らに、以下： （４）少なくとも１つの組換え核酸を、核酸のさらなるライブラリーを用いて
    組換える工程であって、該少なくとも１つの組換え核酸は、生理学的条件下で、
    複製することが不能であるように進化した前記１つ以上の改変細胞由来であり、
    該核酸の少なくとも１つは、該改変細胞のゲノムまたはエピソームのセグメント
    との組換えを受け、１つ以上のさらなる改変細胞を生成する、工程、または１つ
    以上の核酸を、該１つ以上の改変細胞間で組換える工程であって、該１つ以上の
    改変細胞は、１つ以上のさらに改変された細胞を生成する所望の機能に進化した
    、工程； （５）該１つ以上のさらに改変された細胞を、生理学的条件下で、複製する能
    力を欠失する方向にさらに進化し、かつ１つ以上の許容条件下で複製する能力を
    維持する１つ以上のさらに改変された細胞についてスクリーニングする工程； （６）該１つ以上のさらに改変された細胞が、宿主生物体において生理学的条
    件下で複製する能力を失い、かつ該１以上の許容条件下で複製する能力を維持す
    るまで、必要とされる回数、（４）および（５）を繰り返す工程、 を包含する、方法。
  49. 【請求項４９】 弱毒化について、キメラウイルスまたは細胞を生成し、そ
    してスクリーニングする方法であって、該方法は、以下： （１）ウイルスまたは細胞由来の１つ以上の核酸セグメントの第一のセットを
    、１つ以上の核酸セグメントの少なくとも第二のセットを用いて組換えて、組換
    え核酸のライブラリーを形成する工程であって、ここで、該第二のセットの１つ
    以上の核酸セグメントが、１つ以上のウイルスまたは細胞に、ワクチン接種のた
    めに所望される少なくとも１つの性質を与え、該１つ以上のウイルスまたは細胞
    は、該１つ以上の核酸セグメントを含む、工程； （２）１つ以上のウイルスまたは細胞を、該１つ以上のウイルスまたは細胞を
    接種された宿主生物体で示される生理学的条件下で、弱毒化についてスクリーニ
    ングする工程であって、該１つ以上のウイルスまたは細胞は、該組換え核酸のラ
    イブラリーの１つ以上のメンバーを含む、工程；および （３）１つ以上のウイルスまたは細胞をスクリーニング工程であって、該１つ
    以上のウイルスまたは細胞は、ワクチン接種のために所望される性質の改善のた
    めに弱毒化されている、工程、 を包含する、方法。
  50. 【請求項５０】 請求項４７または４９に記載の方法であって、さらに、（
    ３）において同定される１つ以上のウイルスまたは細胞、あるいは該１つ以上の
    ウイルスまたは細胞のペプチドを、宿主生物体に投与する工程を包含する、方法
    。
  51. 【請求項５１】 請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記（２）の
    スクリーニングする工程が、前記（３）のスクリーニングする工程と同時にか、
    または該（３）のスクリーニングする工程の後に実施される、方法。
  52. 【請求項５２】 請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記ワクチン
    接種のために所望される性質が、インビトロでの前記弱毒化さえたキメラウイル
    スまたは細胞の増加した安定性であり、そして（３）が、組換え核酸を含む１つ
    以上のウイルスまたは細胞を所望の保存条件に晒す工程を包含する、方法。
  53. 【請求項５３】 請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上
    の核酸セグメントの第一のセットが、１つ以上の非病原性細胞またはウイルスの
    完全または部分的なゲノムライブラリーを含む、方法。
  54. 【請求項５４】 請求項５３に記載の方法であって、ここで、前記組換えが
    、前記１つ以上の核酸セグメントの第二のセットを、複数の非病原性細胞に導入
    することによって実施され、それによって、該１つ以上の核酸セグメントの第二
    のセットの少なくとも１つのメンバーが、該非病原性細胞のゲノムまたはエピソ
    ームのセグメントとの組換えを受けて、１つ以上の改変された細胞を生成し；そ
    して該１つ以上の改変された細胞が、１つ以上のさらに弱毒化されたキメラ細胞
    についてスクリーニングされ、該１つ以上のさらに弱毒化されたキメラ細胞は、
    非病原性であり、そしてワクチン接種のために所望される性質の改善を示す、方
    法。
  55. 【請求項５５】 請求項５３に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上
    の非病原性細胞が、以下からなる群から選択される、方法：Ｌａｃｔｏｃｏｃｃ
    ｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ）、Ｍ
    ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｃｃａｅ、非病原性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、
    および非病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ種。
  56. 【請求項５６】 請求項５５に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上
    の非病原性細胞が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓまたはＭ．ｖａｃ
    ｃａｅであり、そして前記１つ以上の核酸セグメントの第二のセットが、Ｍ．ｔ
    ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの完全または部分的なゲノムライブラリーを含む、方法
    。
  57. 【請求項５７】 請求項４９に記載の方法であって、ここで、該方法は、さ
    らに、以下： （４）（３）に同定される１つ以上の弱毒化されたキメラ細胞またはウイルス
    由来の１つ以上の組換え核酸を、１つ以上の核酸セグメントのさらなるセットを
    用いて組換えて、組換え核酸のさらなるライブラリーを形成する工程； （５）１つ以上のウイルスまたは細胞を、さらに改善された弱毒化または所望
    の性質について、スクリーニングする工程であって、該１つ以上のウイルスまた
    は細胞は、該組換え核酸のさらなるライブラリーの少なくとも１つのメンバーを
    含む、工程； （６）弱毒化されたキメラウイルスまたは細胞についてスクリーニングするた
    めに、（４）および（５）を繰り返す工程であって、該弱毒化されたキメラウイ
    ルスまたは細胞は、病原性損失の所望のレベルまたはワクチン接種のために所望
    される性質の改善を達成した、工程、 を包含する、方法。
  58. 【請求項５８】 請求項５７に記載の方法であって、ここで、（５）におけ
    るワクチン接種のために所望される前記性質が、（３）におけるワクチン接種に
    ために所望される前記性質とは、異なる、方法。
  59. 【請求項５９】 請求項５７に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上
    の核酸セグメントのさらなるセットが、１つ以上のポリペプチドをコードする１
    つ以上のポリヌクレオチドを含み、該１つ以上のポリヌクレオチドは、該１つ以
    上のポリペプチドを含むウイルスまたは細胞に、ワクチン接種のために所望され
    る性質の改善を与える、方法。
  60. 【請求項６０】 請求項５７に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上
    の核酸セグメントのさらなるセットが、前記１つ以上の細胞またはウイルスの少
    なくとも１つの野生型株の完全または部分的なゲノムライブラリーを含み、そし
    てワクチン接種のために所望される性質の改善が、前記１つ以上の弱毒化された
    キメラウイルスまたは細胞からの、１つ以上の必要以上の変異の除去を包含する
    、方法。
  61. 【請求項６１】 請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記核酸セグ
    メントの第二のセットが、１つ以上の病原性細胞またはウイルスの１つ以上のポ
    リヌクレオチドを含み、該１つ以上のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの免
    疫抗原性ポリペプチドまたはその一部をコードし、そして前記所望の性質が、宿
    主生物体中の該１つ以の病原性細胞またはウイルスに対する予防的または治療的
    免疫応答の誘導を含み、該宿主生物体は、該１つ以上の弱毒化されたキメラ細胞
    またはウイルスの少なくとも１つを接種されている、方法。
  62. 【請求項６２】 請求項６１に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上
    の病原性細胞またはウイルスに対して免疫応答を誘導する能力についてスクリー
    ニングする工程が、前記１つ以上の弱毒化されたキメラ細胞またはウイルスのイ
    ンビボで保護免疫を誘導する能力について試験することによって実施される、方
    法。
  63. 【請求項６３】 請求項６１に記載の方法であって、ここで、前記核酸セグ
    メントの第二のセットが、前記１つ以上の病原性細胞またはウイルスの実質的に
    完全または部分的なゲノムライブラリーを含む、方法。
  64. 【請求項６４】 請求項６１に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上
    の病原性細胞が、以下からなる群から選択される、方法：グラム陽性球菌、グラ
    ム陰性球菌、腸グラム陰性球菌、嫌気性細菌、病原性真菌、および寄生生物。
  65. 【請求項６５】 請求項６４に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上
    の病原性細胞が、以下： 肺炎球菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、髄膜炎菌、淋菌、腸内細菌、類鼻疽、サル
    モネラ、細菌性赤痢、ヘモフィルス、軟性下疳、ブルセラ症、ツラレミア、エル
    ジニア、ストレプトバシラス、リステリア菌および豚丹毒菌からなる群から選択
    される細菌細胞、および ジフテリア、コレラ、炭疽、ドノヴァン症、バルトネラ症、破傷風、ボツリス
    ム、結核、らい病、梅毒、トレポネーマ症およびレプトスピラ症からなる群から
    選択される状態の原因物質 を含む、方法。
  66. 【請求項６６】 請求項６１に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上
    の病原性細胞が、以下の群から選択される状態の原因物質を含む、方法：放線菌
    症、ノカルジア症、クリプトコックス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症
    、コクシジオイデス真菌症、カンジダ症、アスペルギルス症、ムコール菌症、ス
    ポロトリクス症、パラコクシジオイデス真菌症、ペトリエリジオーシス、トルロ
    プシス症、菌腫、クロモミコーシス、皮膚糸状菌症、リケッチア感染、マイコプ
    ラスマ感染およびクラミジア感染、アメーバ症、マラリア、リーシュマニア症、
    トリパノソーマ症、トキソプラスマ症、ニューモシスティス、バベシア症、ジア
    ルジア鞭毛虫症、旋毛虫症、フィラリア症、住血吸虫症、線虫感染、トレマトー
    デ感染または吸虫類感染、および条虫（条虫類）感染。
  67. 【請求項６７】 請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記第一また
    は第二のセットのいずれかまたは両方の前記１つ以上の核酸セグメントの少なく
    とも１つが、ポリペプチドをコードし、ここで、該ポリペプチドは、免疫調節分
    子、アジュバンド、免疫原性ポリペプチドおよび治療タンパク質からなる群から
    選択される、方法。
  68. 【請求項６８】 請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記ワクチン
    接種のために所望の性質が、免疫原性ポリペプチドの改善された発現、弱毒化さ
    れたワクチンの特異的取り込み、増加した安定性、および／または増加した免疫
    原性を含む、方法。
  69. 【請求項６９】 請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上
    の核酸セグメントの第一および第二のセットのいずれかまたは両方が、少なくと
    の１つのウイルスポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含み
    、該少なくとも１つのウイルスポリペプチドは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に会
    合され得る、方法。
  70. 【請求項７０】 請求項６９に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上
    の核酸セグメントの第一のセットの１つ以上のポリヌクレオチドによってコード
    される前記少なくとも１つのウイルスポリペプチドは、非病原性ウイルス株のウ
    イルスポリペプチドであり、そして該１つ以上の核酸セグメントの第二のセット
    の１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる前記少なくとも１つのウイル
    スポリペプチドは、１つ以上の病原性ウイルス株のウイルスポリペプチドである
    、方法。
  71. 【請求項７１】 請求項７０に記載の方法であって、ここで、前記少なくと
    も１つの非病原性ウイルス株および前記少なくとも１つの病原性ウイルス株が、
    異なる種を含む、方法。
  72. 【請求項７２】 請求項５０に記載の方法であって、ここで、（３）におい
    て同定される前記１つ以上のウイルスまたは細胞が、病原性因子に対する免疫応
    答を誘導し、そして前記宿主生物体は、該１つ以上のウイルスまたは細胞が投与
    される前に、該病原性因子によって感染されない、方法。
  73. 【請求項７３】 請求項５０に記載の方法であって、ここで、（３）におい
    て同定される前記１つ以上のウイルスまたは細胞が、病原性因子に対する免疫応
    答を誘導し、そして前記宿主生物体は、該１つ以上のウイルスまたは細胞が投与
    される前に、該病原性因子によって感染されない、方法。
  74. 【請求項７４】 条件付き感受性について、ウイルスまたは細胞を生成およ
    びスクリーニングする方法であって、該方法は、以下： （１）ウイルスまたは細胞の完全または部分的なゲノムライブラリーを含む１
    つ以上の核酸の第一のセットを、１つ以上の核酸の少なくとも第二のセットを用
    いて組換えて、組換え核酸のライブラリーを形成する工程； （２）該組換え核酸のライブラリーの少なくとも１つのメンバーを少なくとも
    １つの宿主細胞に導入する工程； （３）該組換え核酸を含む該少なくとも１つの宿主細胞を、１つ以上の条件の
    第一のセット下で、培養する工程；および （４）（３）の該少なくとも１つの宿主細胞由来の該組換え核酸を、該１つ以
    上の条件の第一のセット下で複製する、少なくとも１つの条件付き感受性組み換
    え核酸についてスクリーニングする工程、 を包含する、方法。
  75. 【請求項７５】 請求項７４に記載の方法であって、ここで、該方法は、さ
    らに、以下： （５）少なくとも１つの条件付き感受性組み換え核酸を含む少なくとも１つの
    宿主細胞を、１つ以上の条件の第二のセット下で培養する工程；および （６）（５）の該少なくとも１つの宿主細胞由来の該少なくとも１つの条件付
    き感受性組み換え核酸を、該１つ以上の条件の第二のセット下で複製しない少な
    くとも１つの条件付き感受性組換え核酸についてスクリーニングする工程、 を包含する、方法。
  76. 【請求項７６】 請求項７５に記載の方法であって、該方法は、さらに、以
    下； （７）前記１つ以上の条件の第一のセット下で複製する少なくとも１つの条件
    付き感受性組換え核酸を、核酸のさらなるライブラリーを用いて組換えて、さら
    なる組換え核酸を生成する工程；および （８） 該１つ以上の条件の第一のセット下で複製するが、前記１つ以上の条
    件の第二のセット下では複製しない少なくとも１つのさらなる組換え核酸につい
    て、該さらなる組換え核酸をスクリーニングする工程、 を包含する、方法。
  77. 【請求項７７】 請求項７６に記載の方法であって、ここで、該方法は、さ
    らに、以下： （９）前記１つ以上の条件の第二のセット下で複製する能力を失っているが、
    前記１つ以上の条件の第一のセット下で複製する能力を維持している少なくとも
    １つのさらなる組換え核酸についてスクリーニングするために、（７）および（
    ８）を繰り返す工程を包含する、方法。
  78. 【請求項７８】 請求項７４に記載の方法であって、ここで、該方法は、さ
    らに、前記１つ以上の条件の第一のセット下で複製する前記少なくとも１つの組
    換え核酸を、宿主生物体における免疫応答を誘導する能力を有する少なくとも１
    つの組換え核酸についてスクリーニングする工程を包含する、方法。
  79. 【請求項７９】 条件付き感受性について、ウイルスまたは細胞を生成およ
    びスクリーニングする方法であって、該方法は、以下： （１）ウイルスまたは細胞の完全または部分的なゲノムライブラリーを含む１
    つ以上の核酸の第一のセットを、１つ以上の核酸の少なくとも第二のセットを用
    いて組換えて、組換え核酸のライブラリーを形成する工程； （２）該組換え核酸のライブラリーの少なくとも１つのメンバーを少なくとも
    １つの宿主細胞に導入する工程； （３）該組換え核酸を含む該少なくとも１つの宿主細胞を、１つ以上の条件の
    第一のセット下で、培養する工程；および （４）（３）の該少なくとも１つの宿主細胞由来の該組換え核酸を、該１つ以
    上の条件の第一のセット下で複製しない少なくとも１つの条件付き感受性組み換
    え核酸についてスクリーニングする工程、 を包含する、方法。
  80. 【請求項８０】 請求項７９に記載の方法であって、ここで、該方法は、さ
    らに、以下： （５）少なくとも１つの条件付き感受性組み換え核酸を含む少なくとも１つの
    宿主細胞を、１つ以上の条件の第二のセット下で培養する工程；および （６）（５）の該少なくとも１つの宿主細胞由来の該少なくとも１つの条件付
    き感受性組み換え核酸を、該１つ以上の条件の第二のセット下で複製する少なく
    とも１つの条件付き感受性組換え核酸についてスクリーニングする工程、 を包含する、方法。
  81. 【請求項８１】 請求項７９に記載の方法であって、ここで、該方法は、さ
    らに、前記１つ以上の条件の第二のセット下で複製する前記少なくとも１つの組
    換え核酸を、宿主生物体における免疫応答を誘導する能力を有する少なくとも１
    つの組換え核酸についてスクリーニングする工程を包含する、方法。
  82. 【請求項８２】 条件付き感受性について、ウイルスまたは細胞を生成およ
    びスクリーニングする方法であって、該方法は、以下： （１）ウイルスまたは細胞の完全または部分的なゲノムライブラリーを含む１
    つ以上の核酸の第一のセットを１つ以上の核酸の少なくとも第二のセットを用い
    て組換えて、組換え核酸のライブラリーを形成する工程； （２）該組換え核酸のライブラリーの少なくとも１つのメンバーを少なくとも
    １つの宿主細胞に導入する工程； （３）（２）の該少なくとも１つの宿主細胞由来の該組換え核酸を、少なくと
    も１つの減少した複製組換え核酸についてスクリーニングする工程であって、該
    少なくとも１つの減少した複製組換え核酸は、該ライブラリーが作製された核酸
    と比較して、宿主生物体において示される生理学的条件下で複製する能力が減少
    した、工程；および （４）少なくとも１つの減少した複製組換え核酸を、該ライブラリーが複製さ
    れた核酸と比較して、該宿主生物体において存在しない条件下で複製する能力を
    維持するか、または増加した能力を有する少なくとも１つの減少した複製組換え
    核酸を同定するために、スクリーニングする工程、 を包含する、方法。
  83. 【請求項８３】 請求項８２に記載の方法であって、該方法は、さらに、以
    下： （５）前記宿主生物体において存在する生理学的条件下で複製する能力が減少
    した少なくとも１つの減少した複製組換え核酸を、核酸のさらなるライブラリー
    を用いて組換えて、少なくとも１つのさらなる組換え核酸を作製する工程； （６）該少なくとも１つのさらなる組換え核酸を、該ライブラリーが作製され
    た核酸と比較して、宿主生物体において存在する生理学的条件下で複製する能力
    がさらに減少し、そして該宿主生物体において存在しない条件下で複製する能力
    を維持するか、または増加した能力を有する、少なくとも１つのさらなる組換え
    核酸についてスクリーニングする工程、 を包含する、方法。
  84. 【請求項８４】 請求項８３に記載の方法であって、ここで、該方法は、さ
    らに、以下： （７）宿主生物体において存在する生理学的条件下で複製する能力を失い、そ
    して該宿主生物体において存在しない条件下で、複製する能力を維持しているか
    、または増加した能力を有する、少なくとも１つのさらなる組換え核酸について
    スクリーニングするために、（５）および（６）を繰り返す工程、 を包含する、方法。
  85. 【請求項８５】 請求項４４、４７、または４９に記載の方法であって、こ
    こで、前記宿主生物体が、哺乳動物を含む、方法。
  86. 【請求項８６】 請求項８５に記載の方法であって、ここで、前記哺乳動物
    がヒトである、方法。
  87. 【請求項８７】 請求項１または４９に記載の方法であって、ここで、前記
    核酸セグメントの第一および第二のセットの前記核酸セグメントが、ＤＮＡ配列
    を含む、方法。
  88. 【請求項８８】 請求項１または４９に記載の方法であって、ここで、前記
    組換え核酸のライブラリー中の少なくとも１つの組換え核酸が、全長核酸を含む
    、方法。
  89. 【請求項８９】 免疫応答を誘導する能力について、ウイルスまたは細胞を
    生成およびスクリーニングする方法であって、該方法は、以下： （１）少なくとも１つの弱毒化されたウイルスまたは細胞の完全または部分的
    なゲノムライブラリーを含む１つ以上の核酸の第一のセットを１つ以上の核酸の
    少なくとも第二のセットを用いて組換えて、組換え核酸のライブラリーを形成す
    る工程；および （２）該組換え核酸のライブラリーの少なくとも１つのメンバーを含む少なく
    とも１つの弱毒化されたウイルスまたは細胞を、病原性因子に対して免疫応答を
    誘導し得る少なくとも１つの弱毒化されたウイルスまたは細胞を同定するために
    、スクリーニングする工程であって、該免疫応答は、該ライブラリーが作製され
    た核酸によって誘導される免疫応答よりも大きい、工程、 を包含する、方法。
  90. 【請求項９０】 請求項１または４９に記載の方法であって、ここで、前記
    第一および第二のセットのいずれかまたは両方の前記１つ以上の核酸セグメント
    の少なくとも１つが、少なくとも１つの抗原をコードする、方法。
  91. 【請求項９１】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記第一および
    第二のセットのいずれかまたは両方の１つ以上の核酸セグメントが、以下からな
    る群から選択されるプロセスによって作製される、方法：ＤＮＡシャッフリング
    、反復配列組換え、誤りがちのＰＣＲ、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発、ウ
    ラシル媒介変異誘発、修復欠失宿主変異誘発、ドープドヌクレオチド変異誘発、
    全遺伝子合成による変異誘発、カセット変異誘発、誤りがちの複製、化学的変異
    誘発、ミューテーター株複製変異誘発、校正活性を欠くポリメラーゼを介する変
    異誘発、ギャップド二本鎖ＤＮＡを使用する変異誘発、欠失変異誘発、相同組換
    え、ホスホチオネート−改変ＤＮＡ変異誘発、ポイントミスマッチ修復、および
    制限選択および制限精製。
  92. 【請求項９２】 請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記１つ以上
    の核酸セグメントの第一のセットは、少なくとも１つの非病原性ウイルスまたは
    細胞の部分的または完全なゲノムライブラリーを含み、そして前記１つ以上の核
    酸セグメントの第二のセットは、病原性ウイルスまたは細胞由来の少なくとも１
    つの核酸セグメントを含む、方法。
  93. 【請求項９３】 請求項９２に記載の方法であって、ここで、前記非病原性
    ウイルスまたは細胞および前記病原性ウイルスまたは細胞が、異なる種由来であ
    る、方法。
  94. 【請求項９４】 請求項９２に記載の方法であって、ここで、前記非病原性
    ウイルスまたは細胞および前記病原性ウイルスまたは細胞が、同じ種由来である
    、方法。
  95. 【請求項９５】 請求項９２に記載の方法であって、ここで、組換えを、前
    記１つ以上の核酸セグメントの第二のセットを少なくとも１つの非病原性細胞に
    導入することによって実施し、それによって、該１つ以上の核酸セグメントの第
    二のセットの少なくとも１つのメンバーが、該少なくとも１つの非病原性細胞の
    ゲノムまたはエピソームのセグメントとの組換えを受けて、少なくとも１つの改
    変された細胞を生成し；そして該少なくとも１つの改変された細胞を、非病原性
    であり、かつワクチン接種のために適切な性質の改善を示す１つ以上の弱毒化さ
    れたキメラ細胞についてスクリーニングする、方法。
  96. 【請求項９６】 請求項９２に記載の方法であって、（３）の前記スクリー
    ニングする工程が、前記１つ以上の弱毒化されたウイルスまたは細胞を、非病原
    性であり、かつワクチン接種のために適切な性質の改善を示す１つ以上の弱毒化
    されたキメラウイルスまたは細胞についてスクリーニングする工程を包含する、
    方法。
  97. 【請求項９７】 請求項１または４９に記載の方法であって、ここで、前記
    核酸セグメントの第一および第二のセットの前記核酸セグメントが、ＤＮＡ配列
    を含む、方法。
  98. 【請求項９８】 請求項１に記載の方法であって、ここで、組換え核酸のラ
    イブラリーの１つ以上のメンバーを含む前記１つ以上のウイルスが、ウイルス様
    粒子を含む、方法。
  99. 【請求項９９】 請求項６に記載の方法であって、ここで、前記脳炎ウイル
    スが、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、および／またはベネズエラウ
    マ脳脊髄炎ウイルスを含む、方法。
JP2001505941A 1999-06-25 2000-06-20 弱毒化したワクチンの操作のための方法および組成物 Withdrawn JP2003503039A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/344,655 US6121736A (en) 1998-07-10 1999-06-25 Control apparatus for motor, and motor unit having the control apparatus
US09/344,655 1999-06-25
PCT/US2000/016984 WO2001000234A2 (en) 1999-06-25 2000-06-20 Methods and compositions for engineering of attenuated vaccines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003503039A true JP2003503039A (ja) 2003-01-28

Family

ID=23351426

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001505941A Withdrawn JP2003503039A (ja) 1999-06-25 2000-06-20 弱毒化したワクチンの操作のための方法および組成物

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1196552A2 (ja)
JP (1) JP2003503039A (ja)
AU (1) AU5880900A (ja)
CA (1) CA2377084A1 (ja)
WO (1) WO2001000234A2 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2007060725A1 (ja) * 2005-11-24 2009-05-07 財団法人阪大微生物病研究会 組換え多価ワクチン
JP2014236748A (ja) * 2014-08-26 2014-12-18 一般財団法人阪大微生物病研究会 組換え多価ワクチン
JP2019514366A (ja) * 2016-04-26 2019-06-06 ロンドン スクール オブ ハイジーン アンド トロピカル メディシンＬｏｎｄｏｎ Ｓｃｈｏｏｌ Ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ ＆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ レオウイルス科ワクチン

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6537776B1 (en) 1999-06-14 2003-03-25 Diversa Corporation Synthetic ligation reassembly in directed evolution
US6764835B2 (en) 1995-12-07 2004-07-20 Diversa Corporation Saturation mutageneis in directed evolution
MX348657B (es) * 2008-09-26 2017-06-21 Ambrx Inc Microorganismos y vacunas dependientes de replicacion de aminoacidos no naturales.
CA2800824A1 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Novel modified live-attenuated vaccines (mlv) and subunit vaccines created by dna shuffling against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv)
CA2892221A1 (en) * 2012-12-19 2014-06-26 Intervet International B.V. Canine parvovirus type 2c isolates and methods of use
US10174295B1 (en) * 2017-08-01 2019-01-08 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Composition of matter: engineering of Escherichia coli phage K1E
CN108641993A (zh) * 2018-05-17 2018-10-12 新疆农垦科学院 一种食品级表达牛病毒性腹泻病毒e2蛋白的重组乳酸菌口服疫苗株
KR20210087058A (ko) * 2018-10-31 2021-07-09 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 이종 스파이크 단백질을 갖는 4/91 ibv 백신
CN110184242B (zh) * 2019-06-11 2021-08-20 武汉生物制品研究所有限责任公司 柯萨奇病毒a组6型(cva6)的小鼠强毒力攻毒株及其应用
GB202009701D0 (en) * 2020-06-25 2020-08-12 Theolytics Ltd Generation of diverse viral libraries
CN113061581A (zh) * 2021-03-22 2021-07-02 华中农业大学 一种山羊源牛疱疹病毒1型毒株及其应用
CN116036253B (zh) * 2022-11-24 2023-12-26 畜科生物工程有限公司 一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗及其制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6117679A (en) * 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
WO1999023107A1 (en) * 1997-10-31 1999-05-14 Maxygen, Incorporated Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2007060725A1 (ja) * 2005-11-24 2009-05-07 財団法人阪大微生物病研究会 組換え多価ワクチン
JP2014236748A (ja) * 2014-08-26 2014-12-18 一般財団法人阪大微生物病研究会 組換え多価ワクチン
JP2019514366A (ja) * 2016-04-26 2019-06-06 ロンドン スクール オブ ハイジーン アンド トロピカル メディシンＬｏｎｄｏｎ Ｓｃｈｏｏｌ Ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ ＆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ レオウイルス科ワクチン
JP7053488B2 (ja) 2016-04-26 2022-04-12 ロンドン スクール オブ ハイジーン アンド トロピカル メディシン レオウイルス科ワクチン

Also Published As

Publication number Publication date
CA2377084A1 (en) 2001-01-04
WO2001000234A2 (en) 2001-01-04
AU5880900A (en) 2001-01-31
EP1196552A2 (en) 2002-04-17
WO2001000234A3 (en) 2001-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dos Santos Impact of virus genetic variability and host immunity for the success of COVID-19 vaccines
TWI686475B (zh) 對抗腸病毒感染之基於腺病毒載體之疫苗
WO2022218325A1 (zh) 一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用
JP2003503039A (ja) 弱毒化したワクチンの操作のための方法および組成物
WO2022007742A1 (zh) 一种重组的伪狂犬病病毒及其疫苗组合物
AU2005279303B2 (en) Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle
US20200171141A1 (en) Compositions and Methods for Generating an Immune Response to LASV
JP2024028744A (ja) コロナウイルススパイクタンパク質の改変されたｓ１サブユニット
JP3602759B2 (ja) 弱毒型のウシウィルス性下痢性ウィルス
Kapoor et al. Equine herpesviruses: a brief review
JP7387623B2 (ja) 標的タンパク質を安定して発現できる組換えウイルス
KR20110045072A (ko) 마킹된 소 바이러스성 설사 바이러스 백신
Chen et al. Immunity induced by recombinant attenuated IHNV (infectious hematopoietic necrosis virus)‐GN438A expresses VP2 gene‐encoded IPNV (infectious pancreatic necrosis virus) against both pathogens in rainbow trout
WO2022027749A1 (zh) 耐热表型稳定遗传、携带负标记的重组口蹄疫病毒无毒株及o/a型口蹄疫二价灭活疫苗
EP3960850A1 (en) Attenuated african swine fever virus with deleted gene and use of same as vaccine
TWI728173B (zh) 病毒疫苗
JP7350864B2 (ja) 異種スパイクタンパク質を有するｈ５２ ｉｂｖワクチン
CN110013547B (zh) 一株重组小反刍兽疫病毒h基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法
EP1632247A1 (en) Nucleic acid sequences encoding FMDV proteins capable of associating into a virus-like particle
JP2024500225A (ja) 安定細胞株において効率的な増殖を可能にする、アフリカ豚熱ワクチンにおけるゲノム欠失
EP4036226A1 (en) Attenuated african swine fever virus and its use as a vaccine
US9402891B2 (en) Norovirus immunogens and related materials and methods
US20230355738A1 (en) Bacteriophage-based, needle and adjuvant-free, mucosal covid-19 vaccine
JP7053488B2 (ja) レオウイルス科ワクチン
EP1650308A1 (en) Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 20070904