JPWO2007060725A1 - 組換え多価ワクチン - Google Patents

Abstract

組換え水痘帯状疱疹ウイルス、およびその製造方法、ならびに組換え水痘帯状疱疹ウイルスを含む薬学的組成物を提供すること、さらに、水痘帯状疱疹ウイルスゲノム遺伝子の特定の遺伝子にＢＡＣベクター配列を含むベクター、およびそのようなベクターを含む細胞、ならびに水痘帯状疱疹ウイルスゲノムと相同組換えし得るフラグメント、およびＢＡＣベクター配列を含む核酸カセット、ならびに多価ワクチンを提供することが課題である。特定のウイルス遺伝子にＢＡＣベクター配列挿入した組換え水痘帯状疱疹ウイルス製造方法を開発することによって上記課題を解決した。

Description

本発明は、組換え水痘帯状疱疹ウイルス、特にＢＡＣ（大腸菌人工染色体）を用いて調製した組換え水痘帯状疱疹ウイルス、およびそのようなウイルスを含む薬学的組成物に関する。さらに、本発明は、水痘帯状疱疹ウイルスゲノム遺伝子とＢＡＣベクター配列とを含むベクター、ならびにそのようなベクターを含む細胞に関する。さらに、本発明は、組換え水痘帯状疱疹ウイルスを製造する方法に関する。また、本発明は、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムと相同組換えし得るフラグメント、およびＢＡＣベクター配列を含む核酸カセットに関する。

水痘帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ；ＶＺＶ）は、ヒトヘルペス科に属するウイルスであり、二つの異なる臨床像を呈する疾患（水痘および帯状疱疹）の原因である。このウイルスの初期感染は水痘（水疱瘡）を引き起こす。その後、ウイルスは、神経節に潜伏感染し、長い年月を経た後、何らかの誘因によって再活性化され、帯状疱疹（ウイルス粒子が形成され、神経を伝わって表皮細胞に達し、神経分布領域に水痘を形成する症状）を引き起こす。

ＶＺＶのゲノムは、二本鎖ＤＮＡであって、約１２５０００塩基からなる。全塩基配列は、Ｄａｖｉｓｏｎらによって決定されており、ゲノム上には少なくとも７２の遺伝子が存在することが知られている。

ＶＺＶのワクチンの開発は困難であり、ＶＺＶワクチンＯｋａ株は、高橋ら（特公昭５３−４１２０２号）によって開発された世界で唯一の水痘帯状疱疹ウイルス用ワクチンである。現行の弱毒生水痘ワクチンは、弱毒水痘ウイルスＯｋａ株に由来のウイルスをシードに用いて製造され、世界の諸国で広く実用に供されている（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒ Ｖａｒｉｃｅｌｌａ Ｖａｃｃｉｎｅ（Ｌｉｖｅ）Ａｄｏｐｔｅｄ １９８４；Ｒｅｖｉｓｅｄ １９９３：ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．８４８，ｐｐ．２２−３８，１９９４）。このＯｋａ株は、典型的な水痘を呈した患児から、分離されたウイルス（Ｏｋａ原株）を、ヒト胎児肺細胞を用いて３４℃で１２代、モルモット胎児細胞を用いて１１代継代した後、ヒト二倍体細胞で数代継代して得られたものである。Ｏｋａ原株は、強い病原性を有するのに対して、Ｏｋａワクチン株（Ｏｋａ株）は、健常児に接種してもほとんど副作用は認められない。そのため、Ｏｋａ株は、病原性のほとんどないワクチン株として有用である。

ウイルスワクチンは、その継代培養とともに、遺伝子型が変化する可能性を有する。また、Ｏｋａ株自体の調製過程において多数の継代培養がされていることから、Ｏｋａ株自体も遺伝的に多様性を有する可能性がある。実際に、ワクチンの安全性と有効性とを確保するために、ワクチン製造工程での継代によるウイルスの遺伝的変異を考慮し、製造承認された水痘シードウイルスの継代数の制限、即ち、シード承認時の継代数を０代としてそこから総継代数１０代以内のウイルスをワクチンに用いるとするシードロットシステムが制定されている。

一方、水痘ワクチンの効果の追跡や市販後調査（ＰＭＳ：Ｐｏｓｔ−ＭａｒｋｅｔｉｎｇＳｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）、また、疫学の観点から、自然感染による水痘患者から分離した水痘ウイルス新鮮野外株と上記Ｏｋａ株に由来のワクチン株との間のウイルス学的相違の解析が必要となり、免疫学および遺伝子工学等を駆使した解析が、既に種々試みられている。例えば、水痘ウイルス株間での遺伝子構造やＤＮＡ塩基配列の違い（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５９，６６０−６６８，１９８６；同前，６７，１７５９−１８１６，１９８６）、制限酵素Ｐｓｔ Ｉサイトの有無（ＪａｐａｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５９，２３３−２３７，１９８９）、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いるＲＦＬＰ（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）に基づく判定（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６６，１０１６−１０２０，１９９２）、上記ＰｓｔＩサイトの有無とＲＦＬＰとの組合わせ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３３，６５８−６６０，１９９５）等による試行が報告されている。しかし、これらはいずれも、新鮮野外株とＯｋａ株に由来のワクチン株とを鑑別するための条件を提起しているものであるが、Ｏｋａ株自体の遺伝的多様性の問題から、信頼性に欠け、確定的ではなく、そのため、ワクチンの品質管理において問題がある。更に、水痘ウイルスのｇｅｎｅ１４領域を用いる水痘ウイルスＯｋａ株の同定方法（米国特許第６，０９３，５３５号）や、ｇｅｎｅ６２領域を用いる弱毒生水痘ワクチン用ウイルス株の同定方法（国際公開番号ＷＯ００／５０６０３）等も知られているが、いずれの技術も、水痘ウイルスＯｋａ株（強毒親株）、これより派生したワクチン株（弱毒Ｏｋａ株）、及びＯｋａ株以外の水痘ウイルス株の三者間の相違の検定を可能にしたものの、弱毒生水痘ワクチンの品質管理及び品質保証のための製剤基準としては必ずしも十分ではない。

現状では、ワクチンの品質を評価および確認するための方法、例えば、シードウイルスやワクチンウイルスのゲノムＤＮＡの直接的ないしは定量的な遺伝子解析による品質管理は行われていないので、生ワクチン用の弱毒株の品質管理及び品質保証の精度は算出不能であり曖昧である。従って、品質管理及び品質保証の精度を高めることは、弱毒生水痘ワクチンの有効性・安全性・均質性を確保し保証する上で極めて重要である。しかし、上述の通り、未だその方法は確立されておらず、解決すべき急務の課題として残されていた。

また、Ｏｋａ株よりも優れた改変体水痘帯状疱疹ウイルスワクチンを開発するために、変異導入による組換え水痘帯状疱疹ウイルスおよびその作製方法も求められていた。

さらに、ＢＡＣベクター配列を用いるウイルスワクチンの製造方法においては、ＢＡＣベクター配列を導入するための非必須遺伝子の同定が必要である。さらに、ＢＡＣベクターを用いて多価ワクチンを製造する場合には、多数の抗原をウイルスゲノム上に挿入することが必要であるという問題も存在する。

従って、多価ワクチンの製造のためのＢＡＣベクター由来のベクターの開発が求められている。
特公昭５３−４１２０２号 米国特許第６，０９３，５３５号 国際公開番号ＷＯ ００／５０６０３ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ＶａｒｉｃｅｌｌａＶａｃｃｉｎｅ（Ｌｉｖｅ）Ａｄｏｐｔｅｄ １９８４；Ｒｅｖｉｓｅｄ １９９３：ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．８４８，ｐｐ．２２−３８，１９９４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５９，６６０−６６８，１９８６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７，１７５９−１８１６，１９８６ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，５９，２３３−２３７，１９８９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６６，１０１６−１０２０，１９９２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３３，６５８−６６０，１９９５

本発明の課題は、水痘帯状疱疹ウイルスワクチンの品質管理及び品質保証の精度を高め、弱毒生水痘ワクチンの有効性・安全性・均質性を確保し保証することにある。本発明の課題は、Ｏｋａ株よりも優れた改変体水痘帯状疱疹ウイルスワクチンを開発するために、変異導入による組換え水痘帯状疱疹ウイルスを作製する方法を確立して、そのようなウイルスを提供することにある。さらに、本発明の課題は、上記利点を有する多価ワクチンを提供することにある。

ＢＡＣベクターを用いて多価ワクチンを製造する場合には、ウイルスゲノム配列中に多種の抗原をコードする遺伝子を挿入する必要がある。しかし、外来遺伝子の挿入によってゲノムサイズが大きくなりすぎると、ゲノムＤＮＡがカプシドにパッケージされず、組換えウイルスが作製できないことが知られている。そこで、多数の抗原遺伝子をＯｋａワクチン株に挿入するためには、Ｏｋａワクチン株の非必須遺伝子をノックアウトして、ゲノムＤＮＡサイズを減少させる必要があると考えられる。

その一方で、従来、非必須遺伝子であると予測された遺伝子の中には、ノックアウトするとウイルスの増殖に影響を与える遺伝子があることが、本発明において、予想外に見出された。

従って、本発明の課題は、ウイルス産生量の減少などの問題を生じない、ＢＡＣベクターを用いた多価ワクチンの製造方法を提供することにある。

本発明者らは、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの特定の遺伝子をＢＡＣベクター配列の挿入配列として用いる組換え水痘帯状疱疹ウイルス製造方法を開発することによって、本発明を完成した。

従って、本発明は、以下を提供する。
（項目１）水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの非必須領域内にＢＡＣベクター配列の少なくとも一部が挿入されている、組換え水痘帯状疱疹ウイルスであって、ここで該非必須領域が、以下の領域からなる群から選択される、組換え水痘帯状疱疹ウイルス：
遺伝子１３のＯＲＦ内の領域、遺伝子５６のＯＲＦ内の領域、遺伝子５８のＯＲＦ内の領域、遺伝子１３のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５６のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５７のＯＲＦに隣接する領域および、遺伝子５８のＯＲＦに隣接する領域。
（項目２）項目１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルスであって、遺伝子１３、遺伝子５６、遺伝子５７、および遺伝子５８からなる群から選択される遺伝子を少なくとも２つ欠損する、組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
（項目３）項目１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルスであって、遺伝子１３、遺伝子５６、遺伝子５７、および遺伝子５８からなる群から選択される遺伝子を少なくとも３つ欠損する、組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
（項目４）前記ＢＡＣベクター配列が組換えタンパク質依存性組換え配列を含む、項目１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
（項目５）前記ＢＡＣベクター配列が、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ウエストナイルウイルス、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、および日本脳炎ウイルスからなる群から選択されるウイルスの遺伝子を含む、項目１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
（項目６）前記ＢＡＣベクター配列が、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、および風疹ウイルスからなる群から選択されるウイルスの遺伝子を含む、項目１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
（項目７）前記ＢＡＣベクター配列が、ムンプスウイルスの遺伝子、麻疹ウイルスの遺伝子、および風疹ウイルスの遺伝子を含む、項目６に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
（項目８）前記ムンプスウイルスの遺伝子が、ＨＮ遺伝子、Ｆ遺伝子、および、Ｎ遺伝子からなる群から選択される、項目６に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
（項目９）前記麻疹ウイルスの遺伝子が、Ｈ遺伝子、Ｆ遺伝子、および、Ｎ遺伝子からなる群から選択される、項目６に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
（項目１０）前記風疹ウイルスの遺伝子が、Ｃ遺伝子、Ｅ１遺伝子、および、Ｅ２遺伝子からなる群から選択される、項目６に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
（項目１１）前記水痘帯状疱疹ウイルスゲノムが野生株由来である、項目１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
（項目１２）前記水痘帯状疱疹ウイルスゲノムが変異株由来である、項目１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
（項目１３）前記水痘帯状疱疹ウイルスゲノムがＯｋａワクチン株由来である、項目１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
（項目１４）前記水痘帯状疱疹ウイルスゲノムが遺伝子６２および遺伝子６に変異を有する、項目１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
（項目１５）前記遺伝子６２が、配列番号１の塩基配列において、少なくとも以下（ａ）〜（ｄ）の塩基置換：
（ａ）２１１０番塩基がＧ；
（ｂ）３１００番塩基がＧ；
（ｃ）３８１８番塩基がＣ；および
（ｄ）４００６番塩基がＧ、
ならびに前記遺伝子６が、配列番号４の塩基配列において、少なくとも５７４５番塩基がＧである塩基置換、
を有する、項目９に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
（項目１６）項目１に記載のウイルスを含有する薬学的組成物。
（項目１７）ワクチンの形態である、項目１６に記載の薬学的組成物。
（項目１８）項目１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルスから単離される、ベクター。
（項目１９）項目１８に記載のベクターを含む、細胞。
（項目２０）細菌である、項目１９に記載の細胞。
（項目２１）Ｅ．ｃｏｌｉである、項目２０に記載の細菌。
（項目２２）哺乳動物細胞である、項目１９に記載の細胞。
（項目２３）ヒト由来の細胞である、項目２２に記載の哺乳動物細胞。
（項目２４）項目２２に記載の哺乳動物細胞によって産生された、ウイルス。
（項目２５）項目２４に記載のウイルスを含有する薬学的組成物。
（項目２６）組換え水痘帯状疱疹ウイルスの製造方法であって、以下の工程：
項目１８に記載のベクターを、哺乳動物宿主細胞に導入する工程；および
該哺乳動物宿主細胞を培養して、組換え水痘帯状疱疹ウイルスを産生させる工程、
を包含する、方法。
（項目２７）前記哺乳動物宿主細胞がヒト由来の細胞である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）項目２６に記載の方法であって、前記２つの組換えタンパク質依存性組換え配列間での組換えを起こす工程をさらに包含する、方法。
（項目２９）項目１８に記載のベクターに変異を導入する方法であって、以下の工程：
該ベクターを細菌宿主細胞に導入する工程；
水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの一部からなるフラグメントを含むプラスミドベクターを該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該フラグメントは少なくとも１つの変異を有する、工程；
該細菌宿主細胞を培養する工程；
該培養した細菌宿主細胞から、ＢＡＣベクター配列を有するベクターを単離する工程、
を包含する、方法。
（項目３０）項目１８に記載のベクターに変異を導入する方法であって、以下の工程：
該ベクターを細菌宿主細胞に導入する工程；
水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの一部からなる第１のフラグメントを含む第１のプラスミドベクターを該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該第１のフラグメントは少なくとも１つの変異を有する、工程；
水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの一部からなる第２のフラグメントを含む第２のプラスミドベクターを該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該第２のフラグメントは少なくとも１つの変異を有し、そして該第２のフラグメントは該第１のフラグメントとは異なる、工程；
該細菌宿主細胞を培養する工程；
該培養した細菌宿主細胞から、ＢＡＣベクター配列を有するベクターを単離する工程、
を包含する、方法。
（項目３１）細菌細胞内において水痘帯状疱疹ウイルスゲノムと相同組換えし得る第１のフラグメント、ＢＡＣベクター配列、および細菌細胞内において水痘帯状疱疹ウイルスゲノムと相同組換えし得る第２のフラグメントを含む核酸カセットであって、ここで、該ＢＡＣ配列の両端の各々がそれぞれ第１のフラグメントおよび第２のフラグメントと連結し、そして、ここで、前記第１および第２のフラグメントが、各々独立して水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの以下の領域からなる群から選択される領域由来である、核酸カセット：
遺伝子１３のＯＲＦ内の領域、遺伝子５６のＯＲＦ内の領域、遺伝子５８のＯＲＦ内の領域、遺伝子１３のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５６のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５７のＯＲＦに隣接する領域および、遺伝子５８のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５６，５７，５８の連続する領域。
（項目３２）前記第１のフラグメントおよび第２のフラグメントが少なくとも１ｋｂである、項目３１に記載の核酸カセット。
（項目３３）前記第１のフラグメントおよび第２のフラグメントが少なくとも１．５ｋｂである、項目３１に記載の核酸カセット。
（項目３４）前記第１のフラグメントおよび第２のフラグメントが少なくとも２ｋｂである、項目３１に記載の核酸カセット。
（項目３５）前記第１のフラグメントおよび第２のフラグメントが、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの配列に対して、少なくとも８０％同一である、項目３１に記載の核酸カセット。
（項目３６）項目３１に記載の核酸カセットであって、ここで、前記第１および第２のフラグメントが異なる領域に由来する、核酸カセット。
（項目３７）前記ＢＡＣベクター配列が組換えタンパク質依存性組換え配列を含む、項目３１に記載の核酸カセット。
（項目３８）前記ＢＡＣベクター配列が選択マーカーを含む、項目３１に記載の核酸カセット。
（項目３９）前記水痘帯状疱疹ウイルスゲノムが野生株由来である、項目３１に記載の核酸カセット。
（項目４０）前記水痘帯状疱疹ウイルスゲノムが変異株由来である、項目３１に記載の核酸カセット。
（項目４１）前記水痘帯状疱疹ウイルスゲノムがＯｋａワクチン株由来である、項目３１に記載の核酸カセット。
（項目４２）前記ＢＡＣベクター配列が配列番号３に記載の核酸配列を有する、項目３１に記載の核酸カセット。

本発明によって、組換え水痘帯状疱疹ウイルス、およびその製造方法が提供される。例えば、本発明によって、ＢＡＣ（大腸菌人工染色体）を用い、ウイルスの特定の遺伝子をＢＡＣベクターの挿入部分として、単一のウイルス株から組換え水痘帯状疱疹ウイルスを作製する方法、およびその方法によって作製された組換え水痘帯状疱疹ウイルスが提供される。また、本発明によって、組換え水痘帯状疱疹ウイルスを含む薬学的組成物がまた提供される。

さらに、本発明によって、水痘帯状疱疹ウイルスゲノム遺伝子とＢＡＣベクター配列とを含むベクター、およびそのようなベクターを含む細胞、ならびに水痘帯状疱疹ウイルスゲノムと相同組換えし得るフラグメント、およびＢＡＣベクター配列を含む核酸カセットが提供される。

図１は、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの構造を模式的に示す図である。 図２は、相同組換えによって、遺伝子１３のＯＲＦ領域にムンプスウイルス抗原を挿入する方法を模式的に示す。

配列番号１：遺伝子６２の核酸配列
配列番号２：遺伝子６２のアミノ酸配列
配列番号３：プラスミドＰＨＡ−２の配列
配列番号４：水痘帯状疱疹ウイルスＤｕｍａｓ株
配列番号５：配列番号４の１１３４位〜１８５０位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子２）
配列番号６：配列番号４の８６０７位〜９３８６位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子７）
配列番号７：配列番号４の１０６４２位〜１０９０２位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子９Ａ）
配列番号８：配列番号４の１１００９位〜１１９１７位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子９）
配列番号９：配列番号４の１２１６０位〜１３３９２位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子１０）
配列番号１０：配列番号４の１３５９０位〜１６０４９位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子１１）
配列番号１１：配列番号４の１６２１４位〜１８１９９位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子１２）
配列番号１２：配列番号４の１８４４１位〜１９３４６位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子１３）
配列番号１３：配列番号４の２４１４９位〜２５５１６位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子１７）
配列番号１４：配列番号４の３０７５９位〜３３８７５位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子２１）
配列番号１５：配列番号４の３４０８３位〜４２３７４位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子２２）
配列番号１６：配列番号４の４４５０６位〜４６２６３位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子２６）
配列番号１７：配列番号４の５０８５７位〜５４４７１位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子２９）
配列番号１８：配列番号４の５４６５１位〜５６９６３位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子３０）
配列番号１９：配列番号４の５７００８位〜５９６１４位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子３１）
配列番号２０：配列番号４の５９７６６位〜６０１９７位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子３２）
配列番号２１：配列番号４の６４８０７位〜６５８３２位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子３６）
配列番号２２：配列番号４の６６０７４位〜６８５９９位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子３７）
配列番号２３：配列番号４の７０６３３位〜７１３５５位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子３９）
配列番号２４：配列番号４の７１５４０位〜７５７３０位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子４０）
配列番号２５：配列番号４の７５８４７位〜７６７９７位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子４１）
配列番号２６：配列番号４の７８１７０位〜８０２００位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子４３）
配列番号２７：配列番号４の８０３６０位〜８１４５１位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子４４）
配列番号２８：配列番号４の８２７１９位〜８３３１８位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子４６）
配列番号２９：配列番号４の８４６６７位〜８６３２２位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子４８）
配列番号３０：配列番号４の８７８８１位〜９０３８８位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子５１）
配列番号３１：配列番号４の９０４９３位〜９２８０８位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子５２）
配列番号３２：配列番号４の９５９９６位〜９８６４１位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子５５）
配列番号３３：配列番号４の１１０５８１位〜１１１４１７位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子６３）
配列番号３４：配列番号４の１１１５６５位〜１１２１０７位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子６４）
配列番号３５：配列番号４の１１３０３７位〜１１４２１８位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子６６）
配列番号３６：配列番号４の１１４４９６位〜１１５５６０位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子６７）
配列番号３７：配列番号４の１１５８０８位〜１１７６７９位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子６８）
配列番号３８：配列番号４の１２０７６４位〜１２４６９６位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子７１）
配列番号３９：配列番号４の部分配列（遺伝子２７）
配列番号４０：配列番号３９の１位〜９９９位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子２７）
配列番号４１：配列番号４の部分配列（遺伝子４７）
配列番号４２：配列番号４１の１位〜１５３０位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子４７）
配列番号４３：配列番号４の部分配列
配列番号４４：配列番号４３の１位〜２４３位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子４９）
配列番号４５：配列番号４の部分配列
配列番号４６：配列番号４５の１位〜７３２位に５’→３’方向でコードされるアミノ酸配列（遺伝子５６）
配列番号４７：配列番号４の配列の相補鎖配列
配列番号４８：配列番号４の１１８４８０位〜１１９３１６位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の５５６９位〜６４０５位に対応する）（遺伝子７０）
配列番号４９：配列番号４の１１７７９０位〜１１８３３２位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の６５５３位〜７０９５位に対応する）（遺伝子６９）
配列番号５０：配列番号４の１１２３３２位〜１１２６４０位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の１２２４５位〜１２５５３位に対応する）（遺伝子６５）
配列番号５１：配列番号４の１０５２０１位〜１０９１３３位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の１５７５２位〜１９６８４位に対応する）（遺伝子６２）
配列番号５２：配列番号４の１０３０８２位〜１０４４８５位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の２０４００位〜２１８０３位に対応する）（遺伝子６１）
配列番号５３：配列番号４の１００３０２位〜１０１２１９位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の２３６６６位〜２４５８３位に対応する）（遺伝子５９）
配列番号５４：配列番号４の９９４１１位〜９９６２６位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の２５２５９位〜２５４７４位に対応する）（遺伝子５７）
配列番号５５：配列番号４の９２８５５位〜９３８５０位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の３１０３５位〜３２０３０位に対応する）（遺伝子５３）
配列番号５６：配列番号４の６８６６８位〜７０２９３位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の５４５９２位〜５６２１７位に対応する）（遺伝子３８）
配列番号５７：配列番号４の６３９７７位〜６４７５３位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の６０１３２位〜６０９０８位に対応する）（遺伝子３５）
配列番号５８：配列番号４の６２１７１位〜６３９１０位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の６０９７５位〜６２７１４位に対応する）（遺伝子３４）
配列番号５９：配列番号４の６０３２１位〜６２１３８位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の６２７４７位〜６４５６４位に対応する）（遺伝子３３）
配列番号６０：配列番号４の４７０５２位〜５０６３６位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の７４２４９位〜７７８３３位に対応する）（遺伝子２８）
配列番号６１：配列番号４の４４１４８位〜４４６１８位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の８０２６７位〜８０７３７位に対応する）（遺伝子２５）
配列番号６２：配列番号４の４３２１２位〜４４０２１位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の８０８６４位〜８１６７３位に対応する）（遺伝子２４）
配列番号６３：配列番号４の４２４３１位〜４３１３８位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の８１７４７位〜８２４５４位に対応する）（遺伝子２３）
配列番号６４：配列番号４の２９０２４位〜３０４７５位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の９４４１０位〜９５８６１位に対応する）（遺伝子２０）
配列番号６５：配列番号４の２６５１８位〜２８８４５位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の９６０４０位〜９８３６７位に対応する）（遺伝子１９）
配列番号６６：配列番号４の２５５７３位〜２６４９３位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の９８３９２位〜９９３１２位に対応する）（遺伝子１８）
配列番号６７：配列番号４の２２５６８位〜２３７９４位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の１０１０９１位〜１０２３１７位に対応する）（遺伝子１６）
配列番号６８：配列番号４の２１２５８位〜２２４７８位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の１０２４０７位〜１０３６２７位に対応する）（遺伝子１５）
配列番号６９：配列番号４の１９４３１位〜２１１１３位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の１０３７７２位〜１０５４５４位に対応する）（遺伝子１４）
配列番号７０：配列番号４の９４７７位〜１０６６７位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の１１４２１８位〜１１５４０８位に対応する）（遺伝子８）
配列番号７１：配列番号４の５３２６位〜８５７７位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の１１６３０８位〜１１９５５９位に対応する）（遺伝子６）
配列番号７２：配列番号４の４２５２位〜５２７４位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の１１９６１１位〜１２０６３３位に対応する）（遺伝子５）
配列番号７３：配列番号４の２７８３位〜４１４１位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の１２０７４４位〜１２２１０２位に対応する）（遺伝子４）
配列番号７４：配列番号４の１９０８位〜２４４７位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の１２２４３８位〜１２２９７７位に対応する）（遺伝子３）
配列番号７５：配列番号４の５８９位〜９１５位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の１２３９７０位〜１２４２９６位に対応する）（遺伝子１）
配列番号７６：配列番号４７の部分配列
配列番号７７：配列番号７６の１位〜１０５６位および４５５６位〜５７４０位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の４６８４７位〜４８０３４位および４２２９２位〜４３３４７位に対応する）（遺伝子４２および遺伝子４５）
配列番号７８：配列番号４７の部分配列
配列番号７９：配列番号７８の１位〜１３０５位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の１２３５８０位〜１２４８８４位に対応する）（遺伝子５０）
配列番号８０：配列番号４７の部分配列
配列番号８１：配列番号８０の１位〜２３０７位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の１２２５７８位〜１２４８８４位に対応する）（遺伝子５４）
配列番号８２：配列番号４７の部分配列
配列番号８３：配列番号８２の１位〜６６３位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の１２４２２２位〜１２４８８４位に対応する）（遺伝子５８）
配列番号８４：配列番号４７の部分配列
配列番号８５：配列番号８４の１位〜４２７位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の１２４４５８位〜１２４８８４位に対応する）（遺伝子６０）
配列番号８６：配列番号４７の部分配列
配列番号８７：配列番号８６の１位〜９０３位に３’→５’方向でコードされるアミノ酸配列（配列番号４７の６０３２１位〜６１２２９位に対応する）（遺伝子３３．５）

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。

本明細書において使用される場合、水痘帯状疱疹ウイルスの「必須遺伝子」とは、水痘帯状疱疹ウイルスが増殖するために必須の遺伝子をいう。また、水痘帯状疱疹ウイルスの「非必須遺伝子」とは、水痘帯状疱疹ウイルスが増殖するために必須ではない遺伝子であり、たとえ欠損したとしても、水痘帯状疱疹ウイルスが増殖し得る遺伝子をいう。水痘帯状疱疹ウイルスの非必須遺伝子としては、例えば、以下が挙げられるが、これらに限定されない：遺伝子１１、遺伝子１２、遺伝子１３、遺伝子５６、および、遺伝子５８。これら遺伝子の中でＢＡＣベクターの挿入に適切な遺伝子は、例えば、遺伝子１３、遺伝子５６、および、遺伝子５８が挙げられるが、これらに限定されない。

ウイルスゲノム中の遺伝子が必須遺伝子である場合、その遺伝子の破壊によってウイルスは増殖できなくなる。従って、ウイルスゲノム中の任意の遺伝子を破壊して、そのウイルスの増殖を検出することによって、その遺伝子が必須遺伝子か非必須遺伝子かを決定することができる。

本明細書において水痘帯状疱疹ウイルスの「野生株」とは、人工的な改変を受けていない、天然より単離された水痘帯状疱疹ウイルス株をいう。野生株の例としては、Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．およびＳｃｏｔｔ，Ｊ．Ｅ．（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７（Ｐｔ ９），１７５９−１８１６（１９８６））が同定したＤｕｍａｓ株が挙げられるが、これに限定されない。このＤｕｍａｓ株の核酸配列を配列番号４に記載する。このＤｕｍａｓ株のＯＲＦの番号および位置は、以下のとおりである。
ＯＲＦ番号 読み枠の方向 ゲノム上の位置 アミノ酸残基数
ＯＲＦ１ ３’→５’方向 ５８９〜９１５ アミノ酸１−１０８
ＯＲＦ２ ５’→３’方向 １１３４〜１８５０ アミノ酸１−２３８
ＯＲＦ３ ３’→５’方向 １９０８〜２４４７ アミノ酸１−１７９
ＯＲＦ４ ３’→５’方向 ２７８３〜４１４１ アミノ酸１−４５２
ＯＲＦ５ ３’→５’方向 ４２５２〜５２７４ アミノ酸１−３４０
ＯＲＦ６ ３’→５’方向 ５３２６〜８５７７ アミノ酸１−１０８３
ＯＲＦ７ ５’→３’方向 ８６０７〜９３８６ アミノ酸１−２５９
ＯＲＦ８ ３’→５’方向 ９４７７〜１０６６７ アミノ酸１−３９６
ＯＲＦ９ ５’→３’方向 １１００９〜１１９１７ アミノ酸１−３０２
ＯＲＦ９Ａ ５’→３’方向 １０６４２〜１０９０２ アミノ酸１−８７
ＯＲＦ１０ ５’→３’方向 １２１６０〜１３３９２ アミノ酸１−４１０
ＯＲＦ１１ ５’→３’方向 １３５９０〜１６０４９ アミノ酸１−８１９
ＯＲＦ１２ ５’→３’方向 １６２１４〜１８１９９ アミノ酸１−６６１
ＯＲＦ１３ ５’→３’方向 １８４４１〜１９３４６ アミノ酸１−３０１
ＯＲＦ１４ ３’→５’方向 １９４３１〜２１１１３ アミノ酸１−５６０
ＯＲＦ１５ ３’→５’方向 ２１２５８〜２２４７８ アミノ酸１−４０６
ＯＲＦ１６ ３’→５’方向 ２２５６８〜２３７９４ アミノ酸１−４０８
ＯＲＦ１７ ５’→３’方向 ２４１４９〜２５５１６ アミノ酸１−４５５
ＯＲＦ１８ ３’→５’方向 ２５５７３〜２６４９３ アミノ酸１−３０６
ＯＲＦ１９ ３’→５’方向 ２６５１８〜２８８４５ アミノ酸１−７７５
ＯＲＦ２０ ３’→５’方向 ２９０２４〜３０４７５ アミノ酸１−４８３
ＯＲＦ２１ ５’→３’方向 ３０７５９〜３３８７５ アミノ酸１−１０３８
ＯＲＦ２２ ５’→３’方向 ３４０８３〜４２３７４ アミノ酸１−２７６３
ＯＲＦ２３ ３’→５’方向 ４２４３１〜４３１３８ アミノ酸１−２３５
ＯＲＦ２４ ３’→５’方向 ４３２１２〜４４０２１ アミノ酸１−２６９
ＯＲＦ２５ ３’→５’方向 ４４１４８〜４４６１８ アミノ酸１−１５６
ＯＲＦ２６ ５’→３’方向 ４４５０６〜４６２６３ アミノ酸１−５８５
ＯＲＦ２７ ５’→３’方向 ４６１２７〜４７１２８ アミノ酸１−３３３
ＯＲＦ２８ ３’→５’方向 ４７０５２〜５０６３６ アミノ酸１−１１９４
ＯＲＦ２９ ５’→３’方向 ５０８５７〜５４４７１ アミノ酸１−１２０４
ＯＲＦ３０ ５’→３’方向 ５４６５１〜５６９６３ アミノ酸１−７７０
ＯＲＦ３１ ５’→３’方向 ５７００８〜５９６１４ アミノ酸１−８６８
ＯＲＦ３２ ５’→３’方向 ５９７６６〜６０１９７ アミノ酸１−１４３
ＯＲＦ３３ ３’→５’方向 ６０３２１〜６２１３８ アミノ酸１−６０５
ＯＲＦ３３．５ ３’→５’方向 ６０３２１〜６１２２９ アミノ酸１−３０１
ＯＲＦ３４ ３’→５’方向 ６２１７１〜６３９１０ アミノ酸１−５７９
ＯＲＦ３５ ３’→５’方向 ６３９７７〜６４７５３ アミノ酸１−２５８
ＯＲＦ３６ ５’→３’方向 ６４８０７〜６５８３２ アミノ酸１−３４１
ＯＲＦ３７ ５’→３’方向 ６６０７４〜６８５９９ アミノ酸１−８４１
ＯＲＦ３８ ３’→５’方向 ６８６６８〜７０２９３ アミノ酸１−５４１
ＯＲＦ３９ ５’→３’方向 ７０６３３〜７１３５５ アミノ酸１−２４０
ＯＲＦ４０ ５’→３’方向 ７１５４０〜７５７３０ アミノ酸１−１３９６
ＯＲＦ４１ ５’→３’方向 ７５８４７〜７６７９７ アミノ酸１−３１６
ＯＲＦ４２＋４５ ３’→５’方向
７６８５１〜７８０３８および８１５３８〜８２５９３ アミノ酸１−７４７
ＯＲＦ４３ ５’→３’方向 ７８１７０〜８０２００ アミノ酸１−６７６
ＯＲＦ４４ ５’→３’方向 ８０３６０〜８１４５１ アミノ酸１−３６３
ＯＲＦ４６ ５’→３’方向 ８２７１９〜８３３１８ アミノ酸１−１９９
ＯＲＦ４７ ５’→３’方向 ８３１６８〜８４７００ アミノ酸１−５１０
ＯＲＦ４８ ５’→３’方向 ８４６６７〜８６３２２ アミノ酸１−５５１
ＯＲＦ４９ ５’→３’方向 ８６２２６〜８６４７１ アミノ酸１−８１
ＯＲＦ５０ ３’→５’方向 ８６５７５〜８７８８２ アミノ酸１−４３５
ＯＲＦ５１ ５’→３’方向 ８７８８１〜９０３８８ アミノ酸１−８３５
ＯＲＦ５２ ５’→３’方向 ９０４９３〜９２８０８ アミノ酸１−７７１
ＯＲＦ５３ ３’→５’方向 ９２８５５〜９３８５０ アミノ酸１−３３１
ＯＲＦ５４ ３’→５’方向 ９３６７５〜９５９８４ アミノ酸１−７６９
ＯＲＦ５５ ５’→３’方向 ９５９９６〜９８６４１ アミノ酸１−８８１
ＯＲＦ５６ ５’→３’方向 ９８５６８〜９９３０２ アミノ酸１−２４４
ＯＲＦ５７ ３’→５’方向 ９９４１１〜９９６２６ アミノ酸１−７１
ＯＲＦ５８ ３’→５’方向 ９９６０７〜１００２７２ アミノ酸１−２２１
ＯＲＦ５９ ３’→５’方向 １００３０２〜１０１２１９ アミノ酸１−３０５
ＯＲＦ６０ ３’→５’方向 １０１１７０〜１０１６４９ アミノ酸１−１５９
ＯＲＦ６１ ３’→５’方向 １０３０８２〜１０４４８５ アミノ酸１−４６７
ＯＲＦ６２ ３’→５’方向 １０５２０１〜１０９１３３ アミノ酸１−１３１０
ＯＲＦ６３ ５’→３’方向 １１０５８１〜１１１４１７ アミノ酸１−２７８
ＯＲＦ６４ ５’→３’方向 １１１５６５〜１１２１０７ アミノ酸１−１８０
ＯＲＦ６５ ３’→５’方向 １１２３３２〜１１２６４０ アミノ酸１−１０２
ＯＲＦ６６ ５’→３’方向 １１３０３７〜１１４２１８ アミノ酸１−３９３
ＯＲＦ６７ ５’→３’方向 １１４４９６〜１１５５６０ アミノ酸１−３５４
ＯＲＦ６８ ５’→３’方向 １１５８０８〜１１７６７９ アミノ酸１−６２３
ＯＲＦ６９ ３’→５’方向 １１７７９０〜１１８３３２ アミノ酸１−１８０
ＯＲＦ７０ ３’→５’方向 １１８４８０〜１１９３１６ アミノ酸１−２７８
ＯＲＦ７１ ５’→３’方向 １２０７６４〜１２４６９６ アミノ酸１−１３１０
上記の表で、「５’→３’方向」とは、ＯＲＦが配列番号４の核酸配列と同一の方向にあることを示し、「３’→５’方向」とは、ＯＲＦが配列番号４の核酸配列と逆の方向にあることを示す。上記ＯＲＦの核酸配列および／またはアミノ酸配列と相同な配列を同定することによって、当業者は、Ｄｕｍａｓ株以外の株由来のゲノム中のＯＲＦを同定することを容易になし得る。

本明細書において「変異株」とは、野生株であるウイルス株に、変異誘発、多数回の継代培養などによって変異誘発をした水痘帯状疱疹ウイルス株をいう。水痘帯状疱疹ウイルス株に変異誘発する場合、この変異誘発は、ランダムな変異導入であっても、部位特異的変異導入であってもよい。

本明細書において使用する場合、「弱毒化ウイルス」とは、ウイルス変異株の一種であって毒性が野生株より減弱化されているものをいう。ウイルス変異株が毒性が野生株より減弱化されているか否かを決定する方法、すなわち、水痘帯状疱疹ウイルスの病原性を試験する方法について、２つの方法が確立されている。

動物モデルを用いる方法として、ヒトの皮膚を移植した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを作製し、これに水痘帯状庖疹ウイルスを感染させることによって、病原性についての評価をする方法が周知である（Ｊ．Ｖｉｒｏ１．１９９８Ｆｅｂ；７２（２）：９６５−７４，）。

これに対し試験管内で病原性の評価を行う方法としては、ポアサイズが３μｍのトランスウェルで仕切られた二層のウェルの下側に単層培養のヒトメラノーマ細胞を入れ、上側に水痘帯状疱疹ウイルスを感染させた臍帯血単核球（ＣＢＭＣ）をそれぞれ入れ、７〜８日培養した後のメラノーマ細胞のＣＰＥ（細胞変性効果）の程度を観察する方法もまた周知である（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００ Ｆｅｂ；７４（４）：１８６４−７０）。

また、病原性を直接確認する方法ではないが、本発明者らのこれまでの結果（Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００２ Ｎｏｖ；７６（２２）：１１４４７−５９）から、ウイルスの病原性と増殖性には密接な関連があることが理解されているため、ｉｎｆｅｃｔｉｕｓ ｃｅｎｔｅｒ ａｓｓａｙによってｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅ１１の増殖性を調べることによっても間接的に病原性について評価を行うことができる。

人工的にウイルスを弱毒化する方法は、公知である。例えば、配列番号１に記載の遺伝子６２において、少なくとも以下（ａ）〜（ｄ）の塩基置換：
（ａ）２１１０番塩基がＧ；
（ｂ）３１００番塩基がＧ；
（ｃ）３８１８番塩基がＣ；および
（ｄ）４００６番塩基がＧ、
ならびに配列番号４に記載の遺伝子６において、少なくとも５７４５番塩基がＧである塩基置換、
を有する水痘帯状疱疹ウイルスを、弱毒化ウイルスとして使用可能である。

上記水痘帯状疱疹ウイルスを用いる代わりに、（ａ）〜（ｄ）の塩基置換に加え、以下の（ｅ）〜（ｇ）の少なくとも１以上の塩基置換：
（ｅ）１２５１番塩基がＧ；
（ｆ）２２２６番塩基がＧ；および
（ｇ）３６５７番塩基がＧ
を有する弱毒水痘ウイルス株を使用することが可能である。

さらに、本発明において、上記水痘帯状疱疹ウイルスを用いる代わりに、（ａ）〜（ｇ）の少なくとも１以上の塩基置換に加え、以下の（ｈ）〜（ｏ）の少なくとも１以上の塩基置換：
（ｈ）１６２番塩基がＣ；
（ｉ）２２５番塩基がＣ；
（ｊ）５２３番塩基がＣ；
（ｋ）１５６５番塩基がＣ；
（ｌ）１７６３番塩基がＣ；
（ｍ）２６５２番塩基がＣ；
（ｎ）４０５２番塩基がＣ；および
（ｏ）４１９３番塩基がＣ
を有する弱毒水痘ウイルス株を使用することが可能である。

あるいは、「弱毒化ウイルス」として、例えば、遺伝子６２に、以下からなる群から選択される塩基置換の少なくとも１つを有するウイルスを使用し得る：
（ａ）２１１０番塩基がＧ；
（ｂ）３１００番塩基がＧ；
（ｃ）３８１８番塩基がＣ；
（ｄ）４００６番塩基がＧ；
（ｅ）１２５１番塩基がＧ；
（ｆ）２２２６番塩基がＧ；
（ｇ）３６５７番塩基がＧ；
（ｈ）１６２番塩基がＣ；
（ｉ）２２５番塩基がＣ；
（ｊ）５２３番塩基がＣ；
（ｋ）１５６５番塩基がＣ；
（ｌ）１７６３番塩基がＣ；
（ｍ）２６５２番塩基がＣ；
（ｎ）４０５２番塩基がＣ；および
（ｏ）４１９３番塩基がＣ。

本明細書において使用される用語「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。

本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。

本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。本明細書において遺伝子の「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、遺伝子の塩基配列を３塩基ずつに区切った時の３通りの枠組の１つであって、開始コドンを有し、そして途中に終止コドンが出現せずある程度の長さを持ち、実際にタンパク質をコードする可能性のある読み枠をいう。水痘帯状疱疹ウイルスゲノムは、その全塩基配列が決定されており、少なくとも７１個の遺伝子が同定されており、その遺伝子の各々がオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有することが公知である。

本明細書において、水痘帯状疱疹ウイルスゲノム内の遺伝子の「ＯＲＦ内の領域」とは、水痘帯状疱疹ウイルスゲノム内にある遺伝子においてＯＲＦを形成する塩基の存在する領域をいう。

本明細書において、水痘帯状疱疹ウイルスゲノム内の遺伝子の「ＯＲＦに隣接する領域」とは、水痘帯状疱疹ウイルスゲノム内にある遺伝子においてＯＲＦの近傍にある塩基の存在する領域であって、その遺伝子または他の遺伝子のＯＲＦ内の領域に該当しない領域をいう。

本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。

本明細書では塩基配列の同一性の比較および相同性の算出は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。

本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。

アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。

本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、６００、７００、８００、９００、１０００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。

ＢＡＣベクター内の遺伝子がコードするポリペプチドは、天然型のポリペプチドと実質的に同一の作用を有する限り、アミノ酸配列中の１以上（例えば、１または数個）のアミノ酸が置換、付加および／または欠失していてもよく、糖鎖が置換、付加および／または欠失していてもよい。

本明細書において使用する場合、「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含する。

あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。親水性指標もまた、改変体作製において考慮される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。

本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。

「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。

本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドをコードする遺伝子を含むＢＡＣベクターを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。

本明細書において使用されるポリペプチドの核酸形態は、そのポリペプチドのタンパク質形態を発現し得る核酸分子をいう。この核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。

このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。

本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。

高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は種々のレベルの構成に関して記述され得る。この構成の一般的な議論については、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）、ならびに、ＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐａｒｔ Ｉ：Ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照。本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｗｉｌｅｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら （１９８７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。

本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、原核生物細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体等の宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。

「ＢＡＣベクター」とは、大腸菌のＦプラスミドをもとにして作製されたプラスミドで、約３００ｋｂ以上の巨大なサイズのＤＮＡ断片を大腸菌などの細菌内で安定に保持し増殖させることが可能なベクターである。ＢＡＣベクターは、少なくともＢＡＣベクターの複製に必須の領域を含む。その複製に必須の領域としては、例えば、Ｆプラスミドの複製開始点であるｏｒｉＳまたはその改変体が挙げられる。

本明細書において「ＢＡＣベクター配列」とは、ＢＡＣベクターとしての機能に必須の配列を含む配列をいう。必要に応じて、ＢＡＣベクター配列は、「組換えタンパク質依存性組換え配列」および／または「選択マーカー」をさらに含み得る。

本明細書において核酸の「組換え」とは、用語「相同組換え」と互換可能に使用され、２つの異なる相同な核酸分子の会合によって開始し、乗り換えが起こり、核酸の新しい組み合わせが生じることをいう。本明細書において使用する場合、相同組換えには、「組換えタンパク質依存的組換え」および「組換えタンパク質非依存的組換え」の両方が含まれる。「組換えタンパク質依存的組換え」とは、組換えタンパク質存在下において生じるが、組換えタンパク質非存在下では生じない、相同組換えをいう。「組換えタンパク質非依存的組換え」とは、組換えタンパク質の存在の有無に関わらずに生じる、相同組換えをいう。本明細書において「組換えタンパク質依存性組換え配列」とは、組換えタンパク質依存的組換えを生じる配列をいい、「組換えタンパク質非依存性組換え配列」とは、組換えタンパク質非依存的組換えを生じる配列をいう。組換えタンパク質依存性組換え配列は、組換えタンパク質存在下では、組換えを生じるが、組換えタンパク質非存在下では、組換えを生じない。組換えタンパク質は、好ましくは、組換えタンパク質依存性組換え配列に特異的に作用し、組換えタンパク質依存性組換え配列以外の配列には作用しない。

代表的な組換えタンパク質依存性組換え配列と、組換えタンパク質との対としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：バクテリオファージＰ１由来のｌｏｘＰ（ｌｏｃｕｓ ｏｆ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｏｆ Ｐ１）配列とＣｒｅ（ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）タンパク質との組み合わせ、Ｆｌｐタンパク質とＦＲＴ部位との組み合わせ、φＣ３１とａｔｔＢ，ａｔｔＰとの組み合わせ（Ｔｈｏｒｐｅ，Ｈｅｌｅｎａ Ｍ．；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓｔｕａｒｔ Ｅ．；Ｓｍｉｔｈ， Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｃ．Ｍ．、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｇｅ φＣ３１．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （２０００），３８（２），２３２−２４１．）、リソルバーゼとｒｅｓ部位との組み合わせ（Ｓａｄｏｗｓｋｉ Ｐ．，Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ： ｃｈａｎｇｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒｓ ａｎｄ ｄｏｉｎｇ ｔｈｅ ｔｗｉｓｔ． Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８６年２月；１６５（２）３４１−７）（一般的には、Ｓａｕｅｒ Ｂ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ： ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４ Ｏｃｔ；５（５）：５２１−７．を参照のこと）。

本明細書において使用する場合、「選択マーカー」とは、ＢＡＣベクターを含む宿主細胞を選択する指標として機能する遺伝子をいう。選択マーカーとしては、蛍光マーカー、発光マーカー、および薬剤選択マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。「蛍光マーカー」としては、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。「発光マーカー」としては、ルシフェラーゼのような発光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。「薬剤選択マーカー」としては、以下からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない：ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、メタロチオネイン（ＭＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＭＰＤ１，２）、キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＵＭＰシンターゼ、Ｐ−グリコプロテイン、アスパラギンシンテターゼ、およびオルニチンデカルボキシラーゼ。これら薬剤選択マーカーと使用される薬剤との組み合わせは、例えば、以下のとおりである：ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）とメソトレキセート（ＭＴＸ）との組み合わせ、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）遺伝子とメチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）との組み合わせ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＣＡＤ）遺伝子とＮ−ホスホンアセチル−Ｌ−アスパラギン酸（Ｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｎａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）（ＰＡＬＡ）との組み合わせ、ＭＴ遺伝子とカドミウム（Ｃｄ２^＋）との組み合わせ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子とアデノシン、アラノシン、２’−デオキシコホルマイシンとの組み合わせ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＭＰＤ１，２）遺伝子とアデニン、アザセリン、コホルマイシンとの組み合わせ、キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子と、マイコフェノール酸との組み合わせ、ＵＭＰシンターゼ遺伝子と６−アザウリジン、ピラゾフラン（ｐｙｒａｚｏｆｕｒａｎ）との組み合わせ、Ｐ−グリコプロテイン（Ｐ−ｇｐ，ＭＤＲ）遺伝子と多剤薬剤との組み合わせ、アスパラギンシンテターゼ（ＡＳ）遺伝子とβ−アスパルチルヒドロキサム酸またはアルビジイン（ａｌｂｉｚｚｉｉｎｎ）との組み合わせ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子とα−ジフルオロメチル−オルニチン（ＤＦＭＯ）。

本明細書において使用する場合、「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など）のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、植物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。植物の場合、本発明に用いる植物の発現ベクターはさらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いてその植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。

本明細書において使用する場合、「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。

「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、タバコＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定されない。

本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡのＯＲＦ内の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。

本明細書において、本発明のプロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の発生のいずれの段階にあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、本明細書の実施例と同様の条件でノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。

「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。動物細胞において使用する場合、エンハンサーとしては、ＳＶ４０プロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好ましい。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。

本明細書において使用する場合、「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。

本発明において使用する場合、用語「形質転換」、「形質導入」および「トランスフェクション」は、特に言及しない限り互換可能に使用され、宿主細胞への核酸の導入を意味する。形質転換方法としては、宿主細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法、リン酸カルシウム法などの種々の周知の技術が挙げられる。

「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。

原核細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する原核細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０などが例示される。

動物細胞としては、ヒト・ＭＲＣ−５細胞、ヒト・ＨＥＬ細胞、ヒト・ＷＩ−３８細胞、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、ヒト・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト大腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ細胞、ヒト大腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５などが例示される。

本明細書において「動物」は、当該分野において最も広義で用いられ、脊椎動物および無脊椎動物を含む。動物としては、哺乳綱、鳥綱、爬虫綱、両生綱、魚綱、昆虫綱、蠕虫綱などが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、臓器（器官）の一部であり得る。臓器（器官）内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有していてもよい。

本明細書において、「器官（臓器）」とは、１つ独立した形態をもち、１種以上の組織が組み合わさって特定の機能を営む構造体を形成したものをいう。植物では、カルス、根、茎、幹、葉、花、種子、胚芽、胚、果実などが挙げられるがそれらに限定されない。動物では、胃、肝臓、腸、膵臓、肺、気管、鼻、心臓、動脈、静脈、リンパ節（リンパ管系）、胸腺、卵巣、眼、耳、舌、皮膚等が挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において、「トランスジェニック」とは、特定の遺伝子をある生物に組み込むことまたはそのような遺伝子が組み込まれた生物（例えば、植物または動物（マウスなど）を含む）をいう。

本発明の生物が、動物の場合、トランスジェニック生物は、マイクロインジェクション法（微量注入法）、ウィルスベクター法、ＥＳ細胞法（胚性幹細胞法）、精子ベクター法、染色体断片を導入する方法（トランスゾミック法）、エピゾーム法などを利用したトランスジェニック動物の作製技術を使用して作製することができる。そのようなトランスジェニック動物の作成技術は当該分野において周知である。

本明細書において使用される場合、「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ物質、あるいは宿主細胞またはウイルスなどを、特定の操作および／または評価方法で多数の候補から選抜することをいう。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られたウイルスもまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。

本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」は、互換可能に用いられ、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。チップとしては、例えば、ＤＮＡチップ、プロテインチップ、細胞チップなどが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において「アレイ」とは、１以上（例えば、１０００以上）の標的物質を含む組成物（例えば、ＤＮＡ、タンパク質、細胞）が整列されて配置されたパターンまたはパターンを有する基板（例えば、チップ）そのものをいう。アレイの中で、小さな基板（例えば、１０×１０ｍｍ上など）上にパターン化されているものはマイクロアレイというが、本明細書では、マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。従って、上述の基板より大きなものにパターン化されたものでもマイクロアレイと呼ぶことがある。例えば、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望の細胞のセットで構成される。アレイは好ましくは同一のまたは異なるウイルスを含む細胞を少なくとも１０^２個、より好ましくは少なくとも１０^３個、およびさらに好ましくは少なくとも１０^４個、さらにより好ましくは少なくとも１０^５個を含む。これらの細胞は、好ましくは表面が１２５×８０ｍｍ、より好ましくは１０×１０ｍｍ上に配置される。形式としては、９６ウェルマイクロタイタープレート、３８４ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートの大きさのものから、スライドグラス程度の大きさのものが企図される。固定される標的物質を含む組成物は、１種類であっても複数種類であってもよい。そのような種類の数は、１個〜スポット数までの任意の数であり得る。例えば、約１０種類、約１００種類、約５００種類、約１０００種類の標的物質を含む組成物が固定され得る。

基板のような固相表面または膜には、上述のように任意の数の標的物質（例えば、細胞のような生体分子）が配置され得るが、通常、基板１つあたり、１０^８個の生体分子まで、他の実施形態において１０^７個の生体分子まで、１０^６個の生体分子まで、１０^５個の生体分子まで、１０^４個の生体分子まで、１０^３個の生体分子まで、または１０^２個の生体分子までの個の生体分子が配置され得るが、１０^８個の生体分子を超える標的物質を含む組成物が配置されていてもよい。これらの場合において、基板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、標的物質を含む組成物（例えば、細胞）のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じ小さくあり得る（これは、１−２ｎｍの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上の生体分子の数によって決定される。

アレイ上には、生体分子の「スポット」が配置され得る。本明細書において「スポット」とは、標的物質を含む組成物の一定の集合をいう。本明細書において「スポッティング」とは、ある標的物質を含む組成物のスポットをある基板またはプレートに作製することをいう。スポッティングはどのような方法でも行うことができ、例えば、ピペッティングなどによって達成され得、あるいは自動装置で行うこともでき、そのような方法は当該分野において周知である。

本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを伴うスポットとの関連づけに適切であり、そしてすべての各々のアドレスにおける存在物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状を採り得る。アドレスを定める形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得るか、または不規則な形であり得る。したがって、「アドレス」は、抽象的な概念を示し、「スポット」は具体的な概念を示すために使用され得るが、両者を区別する必要がない場合、本明細書においては、「アドレス」と「スポット」とは互換的に使用され得る。

各々のアドレスを定めるサイズは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のアドレスの数、標的物質を含む組成物の量および／または利用可能な試薬、微粒子のサイズおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依存する。大きさは、例えば、１−２ｎｍから数ｃｍの範囲であり得るが、そのアレイの適用に一致した任意の大きさが可能である。

アドレスを定める空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の適用に適合するように設計される。アドレスは、密に配置され得、広汎に分散され得るか、または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグループ化され得る。

本明細書において使用される場合、「支持体」とは、細胞、細菌、ウイルス、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを担持することができる物質をいう。支持体の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される細胞などに結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。

支持体として使用するための材料には、固体表面を形成し得る任意の物質が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、支持体は、疎水性結合を行う部分を含む。支持体は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、尿素樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。あるいは、支持体として、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。

本発明の水痘帯状疱疹ウイルスは、感染症の処置、予防、および／または治療のための薬学的組成物の成分としても使用することが可能である。

本明細書において薬剤の「有効量」とは、その薬剤が目的とする薬効が発揮することができる量をいう。本明細書において、そのような有効量のうち、最小の濃度を最小有効量ということがある。そのような最小有効量は、当該分野において周知であり、通常、薬剤の最小有効量は当業者によって決定されているか、または当業者は適宜決定することができる。そのような有効量の決定には、実際の投与のほか、動物モデルなどを用いることも可能である。本発明はまた、このような有効量を決定する際に有用である。

本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬のような農薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤および／または農学的もしくは薬学的アジュバント。

本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報（例えば、疾患に関する情報）を元に、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被検体の部位の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモニタリング方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）のモニタリングが挙げられる。１週間−１ヶ月に１回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好ましい。

本明細書において「指示書」は、本発明の治療方法などを医師、患者など投与を行う人に対して記載したものである。この指示書は、本発明の医薬などを例えば、放射線治療直後または直前（例えば、２４時間以内など）に投与することを指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。

必要に応じて、本発明の治療では、２種類以上の薬剤が使用され得る。２種類以上の薬剤を使用する場合、類似の性質または由来の物質を使用してもよく、異なる性質または由来の薬剤を使用してもよい。このような２種類以上の薬剤を投与する方法のための疾患レベルに関する情報も、本発明の方法によって入手することができる。

本発明では、いったん類似の種類（例えば、ヒトに対するマウスなど）の生物、培養細胞、組織などに関し、ある特定の糖鎖構造の分析結果と、疾患レベルとが相関付けられた場合、対応する糖鎖構造の分析結果と、疾患レベルとが相関付けることができることは、当業者は容易に理解する。そのような事項は、例えば、動物培養細胞マニュアル、瀬野ら編著、共立出版、１９９３年などに記載され支持されており、本明細書においてこのすべての記載を援用する。

（本明細書において用いられる一般的技術）
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、糖鎖科学、マイクロフルイディクス、微細加工、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。

微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１ ５ Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。

本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、糖鎖科学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，ＮＹ，１０１５８（２０００）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２３０、２４２、２４７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９４；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。

１つの局面において、本発明は、組換え水痘帯状疱疹ウイルスを提供する。好ましくは、この水痘帯状疱疹ウイルスは、そのゲノム配列中にＢＡＣベクター配列を含む。ＢＡＣベクター配列を含む水痘帯状疱疹ウイルスゲノムを構築することによって、ＢＡＣ分子として細菌内において水痘帯状疱疹ウイルスゲノムを取り扱うことが可能となる。使用されるＢＡＣベクター配列は、好ましくは、Ｆプラスミド由来の複製開始点を含むが、Ｆプラスミド由来の複製開始点以外の配列であってもよく、３００ｋｂ以上の配列を細菌人工染色体として細菌細胞内において保持および増殖が可能である限り、任意の複製開始点を利用することができる。本発明のＢＡＣベクターは、細菌宿主細胞、好ましくは、大腸菌細胞において保持、および／または増幅することが可能である。好ましくは、このＢＡＣベクターの一部は、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの非必須領域内に挿入され、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムを含むＢＡＣとして操作が可能になる。この水痘帯状疱疹ウイルスゲノムを含むＢＡＣは、哺乳動物細胞に導入された場合、組換え水痘帯状疱疹ウイルスを産生、増殖することが可能である。組換え水痘帯状疱疹ウイルスの宿主細胞としては、野生型水痘帯状疱疹ウイルス株が増殖し得る任意の哺乳動物細胞を使用することができる。好ましくは、この宿主細胞は、ヒト由来であり、限定されることはないが、例えば、ヒト・ＭＲＣ−５細胞、ヒト・ＨＥＬ細胞、ヒト・ＷＩ−３８細胞である。

（多価ワクチン）
本発明のＢＡＣは、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムにコードされるタンパク質以外の任意の抗原タンパク質をコードする遺伝子を含み得る。抗原タンパク質は、限定されることはないが、好ましくは、水痘帯状疱疹ウイルス以外のウイルスのタンパク質であり、その結果、本発明に従って、多価ワクチンが提供される。抗原タンパク質が由来する水痘帯状疱疹ウイルス以外のウイルスとしては、例えば、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ウエストナイルウイルス、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、および日本脳炎ウイルスからなる群から選択されるウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一つの局面においては、水痘帯状疱疹ウイルス以外のウイルスとしては、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、および風疹ウイルスからなる群から選択されるウイルスが挙げられるが、これに限定されない。一つの局面においては、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムを含む単一のＢＡＣベクターが、ムンプスウイルスの遺伝子、麻疹ウイルスの遺伝子、および風疹ウイルスの遺伝子を含む。好ましくは、ムンプスウイルスの遺伝子は、ＨＮ遺伝子、Ｆ遺伝子、および、Ｎ遺伝子からなる群から選択される。好ましくは、麻疹ウイルスの遺伝子は、Ｈ遺伝子、Ｆ遺伝子、および、Ｎ遺伝子からなる群から選択される。好ましくは、風疹ウイルスの遺伝子は、Ｃ遺伝子、Ｅ１遺伝子、および、Ｅ２遺伝子からなる群から選択される。好ましくは、インフルエンザウイルスの遺伝子は、ＨＡ遺伝子である。好ましくは、ＳＡＲＳコロナウイルスの遺伝子は、Ｓ（スパイク）遺伝子である。好ましくは、ウエストナイルウイルスの遺伝子は、Ｐｒ遺伝子、および、Ｅ遺伝子からなる群から選択される。好ましくは、日本脳炎ウイルスの遺伝子は、Ｐｒ遺伝子、および、Ｅ遺伝子からなる群から選択される。これらウイルスの遺伝子は公知であるので、ＰＣＲ法およびハイブリダイゼーション法などの周知技術を用いて、当業者は、これらウイルスの遺伝子を単離することが可能である。

（水痘帯状疱疹ウイルスゲノムを含むＢＡＣベクターの作製方法）
水痘帯状疱疹ウイルスゲノムと、ＢＡＣベクターを用いて、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムを含むＢＡＣベクターを作製するためには、相同組換えを用いる方法など、種々の周知の方法を使用することが可能である。

相同組換えを用いる方法としては、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムと相同な配列を連結した環状ＢＡＣベクター配列を有する核酸を用いる方法が挙げられる。

水痘帯状疱疹ウイルスゲノムと相同な配列を連結した環状ＢＡＣベクター配列を有する核酸を用いる、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムを含むＢＡＣベクターの作製方法は、代表的には、（１）その核酸を、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムとともに、宿主内（例えば、ヒト株化細胞内）に導入し、（２）宿主細胞を培養して、環状ＢＡＣベクター配列に連結された相同配列と、水痘帯状疱疹ウイルスゲノム配列との間で相同組換えを起こし、（３）この相同組換えによって生じた、ＢＡＣベクター配列を組み込んだ水痘帯状疱疹ウイルスゲノム配列を含む宿主細胞を選択し、（４）その宿主細胞を培養して、環状ウイルスＤＮＡを抽出する、という工程を包含する。

また、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムと、ＢＡＣ配列を用いて、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムを含むＢＡＣを作製するためには、相同組換えを用いることなく、核酸の制限酵素断片を用いるなどの、種々の周知の方法を使用することも可能である。

水痘帯状疱疹ウイルスゲノム内において、ＢＡＣベクター配列を導入するための非必須領域は、以下の領域からなる群から選択される：
遺伝子１３のＯＲＦ内の領域、遺伝子５６のＯＲＦ内の領域、遺伝子５７のＯＲＦ内の領域、遺伝子５８のＯＲＦ内の領域、遺伝子１１のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子１２のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子１３のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５６のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５７のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５８のＯＲＦに隣接する領域、および、遺伝子５６，５７，５８の連続する領域。

好ましくは、この非必須領域は、遺伝子１３のＯＲＦ内の領域、遺伝子５６のＯＲＦ内の領域、遺伝子５７のＯＲＦ内の領域、遺伝子５８のＯＲＦ内の領域、遺伝子１３のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５６のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５７のＯＲＦに隣接する領域、および、遺伝子５８のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５６，５７，５８の連続する領域である。なぜなら、遺伝子１３、遺伝子５６と遺伝子５８、遺伝子５６，５７，５８の連続する領域は、水痘帯状疱疹ウイルスゲノム上で欠損したとしても、ウイルスの増殖に影響しないことが本発明によって明らかとなったからである。
あるいは、ＢＡＣベクター配列の一部は、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの遺伝子６２のＯＲＦ内の領域に挿入されていてもよい。

本発明において使用されるＢＡＣベクター配列は、好ましくは、組換えタンパク質依存性組換え配列、および／または選択マーカーを含む。好ましくは、選択マーカー配列は薬剤選択マーカー、および／またはグリーン蛍光タンパク質をコードする遺伝子である。なぜなら、簡便に所望の遺伝子の存在を確認できるからである。

本発明において出発物質として使用される水痘帯状疱疹ウイルスは、野生株由来であっても、変異株由来であってもよい。好ましくは、出発物資としての水痘帯状疱疹ウイルスは、弱毒化されたウイルス、例えば、Ｏｋａワクチン株または遺伝子６２に変異を有する水痘帯状疱疹ウイルスを用いる。弱毒化した水痘帯状疱疹ウイルスとしては、以下からなる群から選択される遺伝子６２の変異の１つ、または２つ以上の変異の組み合わせを有するウイルスが挙げられる：
（ａ）２１１０番塩基がＧ；
（ｂ）３１００番塩基がＧ；
（ｃ）３８１８番塩基がＣ；
（ｄ）４００６番塩基がＧ；
（ｅ）１２５１番塩基がＧ；
（ｆ）２２２６番塩基がＧ；
（ｇ）３６５７番塩基がＧ；
（ｈ）１６２番塩基がＣ；
（ｉ）２２５番塩基がＣ；
（ｊ）５２３番塩基がＣ；
（ｋ）１５６５番塩基がＣ；
（ｌ）１７６３番塩基がＣ；
（ｍ）２６５２番塩基がＣ；
（ｎ）４０５２番塩基がＣ；および
（ｏ）４１９３番塩基がＣ。

本発明のさらなる局面において、上記ウイルスを製造するために使用されるベクター、および上記ウイルスの製造方法もまた提供される。本発明の別の局面において、上記ウイルスを含む薬学的組成物、およびワクチンの形態である薬学的組成物が提供される。

本明細書の組換え水痘帯状疱疹ウイルスは、ワクチンとして有用である。なぜなら、野生型ウイルスと同様の構造を有するタンパク質を多数含むからである。

本発明のさらなる局面において、本発明のワクチンを産生するためのベクターに変異を導入する方法が提供される。この方法は、以下の工程：該ベクターを細菌宿主細胞に導入する工程；水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの一部からなるフラグメントを含むプラスミドベクターを該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該フラグメントは少なくとも１つの変異を有する、工程；該細菌宿主細胞を培養する工程；該培養した細菌宿主細胞から、ＢＡＣベクター配列を有するベクターを単離する工程、を包含する。上記方法においては、細菌宿主細胞内において、本発明のワクチンを産生するためのベクターと水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの一部からなるフラグメントを含むプラスミドベクターとの間で相同組換えが起こり、その結果、本発明のワクチンを産生するためのベクターが、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの一部からなるフラグメント上の変異を有する。

上記の方法において、ベクターを細菌宿主細胞に導入する工程としては、エレクトロポーレーションなどの種々の周知の方法を使用することが可能である。同様にして、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの一部からなるフラグメントを含むプラスミドベクターを細菌宿主細胞に導入することができる。また、このフラグメントに変異を導入する方法としては、ＰＣＲを用いる変異導入方法が周知であり、例えば、プルーフリーディング機能を有さない耐熱性ポリメラーゼを４つのヌクレオチドの１つが少ない条件で用いることによって、ランダムに変異を導入することが可能である。また、変異塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって、所望の位置に所望の変異を導入することも可能である。この細菌細胞を培養することによって、本発明のワクチンを産生するためのベクターと水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの一部からなるフラグメントを含むプラスミドベクターとの間で相同組換えが起こり、その結果、本発明のワクチンを産生するためのベクターが、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの一部からなるフラグメント上の変異を有する。細菌宿主細胞からＢＡＣベクター配列を調製するためには、アルカリ法のような種々の周知の方法および市販のキットを使用することが可能である。

本発明の別の局面において、本発明のワクチンを産生するためのベクターに変異を導入するさらなる方法が提供される。この方法は、以下の工程：該ベクターを細菌宿主細胞に導入する工程；水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの一部からなる第１のフラグメントを含む第１のプラスミドベクターを該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該第１のフラグメントは少なくとも１つの変異を有する、工程；水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの一部からなる第２のフラグメントを含む第２のプラスミドベクターを該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該第２のフラグメントは少なくとも１つの変異を有し、そして該第２のフラグメントは該第１のフラグメントとは異なる、工程；該細菌宿主細胞を培養する工程；該培養した細菌宿主細胞から、ＢＡＣベクター配列を有するベクターを単離する工程、を包含する。

本発明の一つの局面において、本発明のワクチンを製造するために使用され得る核酸カセットが提供される。この核酸カセットは、好ましくは、細菌細胞内において水痘帯状疱疹ウイルスゲノムと相同組換えし得る第１のフラグメント、ＢＡＣベクター配列、および細菌細胞内において水痘帯状疱疹ウイルスゲノムと相同組換えし得る第２のフラグメントを含む核酸カセットであって、ここで、該ＢＡＣ配列の両端の各々がそれぞれ第１のフラグメントおよび第２のフラグメントと連結している。ここで、第１のフラグメントおよび第２のフラグメントは、好ましくは、少なくとも１ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも２ｋｂである。この第１のフラグメントおよび第２のフラグメントは、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの配列に対して、好ましくは、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一である。

好ましくは、この第１および第２のフラグメントが、各々独立して水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの以下の領域からなる群から選択される領域由来であるか、以下の領域からなる群から選択される領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％同一である：
遺伝子１３のＯＲＦ内の領域、遺伝子５６のＯＲＦ内の領域、遺伝子５７のＯＲＦ内の領域、遺伝子５８のＯＲＦ内の領域、遺伝子１１のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子１２のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子１３のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５６のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５７のＯＲＦに隣接する領域、および、遺伝子５８のＯＲＦに隣接する領域。

好ましくは、この第１および第２のフラグメントは、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの異なる領域に由来する。この第１および第２のフラグメントは、各々独立して、遺伝子１３のＯＲＦ内の領域、遺伝子５６のＯＲＦ内の領域、遺伝子５７のＯＲＦ内の領域、遺伝子５８のＯＲＦ内の領域、遺伝子１１のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子１２のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子１３のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５６のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５７のＯＲＦに隣接する領域、および、遺伝子５８のＯＲＦに隣接する領域由来であってもよい。好ましくは、相同組換えを制御し、そして所望の遺伝子を簡便に検出するために、ＢＡＣベクター配列は組換えタンパク質依存性組換え配列、および／または選択マーカーを含む。この選択マーカーは薬剤選択マーカーであっても、グリーン蛍光タンパク質のような蛍光タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。代表的には、このＢＡＣベクター配列は、配列番号３に記載の核酸配列を有する。

（変異型組換え水痘帯状疱疹ウイルスの調製）
本発明の方法を用いて、変異導入した水痘帯状疱疹ウイルスゲノムを有する変異型水痘帯状疱疹ウイルスを、簡便に調製することが可能である。

そのような変異導入は、例えば、以下の方法を用いて行うことができる：
大腸菌内に、（ａ）ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡプラスミド、および（ｂ）変異核酸として、任意の変異を有する水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの部分配列を持つシャトルベクターまたはＰＣＲ産物、を導入する。ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡプラスミドと、その変異核酸との間で組換えを起こすことによって、ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡプラスミドに変異を導入することができる。また、トランスポゾンを用いることによっても、ランダムに変異を導入することが可能である。そして変異が導入されたＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡプラスミドは、大腸菌内で容易に選択および増幅させることができる。そして、変異を持つＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡからウイルスを産出させることによって、組換え水痘帯状疱疹ウイルスを得ることができる（Ｍａｒｋｕｓ Ｗａｇｎｅｒ、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１０、Ｎｏ．７、２００２年７月）。その具体例を以下に列挙する：
（１）変異核酸として、変異水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子を含む温度感受性シャトルベクターを用いる場合；
第１に、シャトルベクターとＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡプラスミドを、第１の相同的領域を介して、組換えさせ、シャトルベクターとＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡプラスミドとが連結した、共挿入体を生じる。次に、シャトルベクターの複製オリジンが温度感受性であることから、シャトルプラスミドが除かれる。第２の組換え事象において、共挿入された部分が取り除かれる。第２の組換え事象が、第１の相同的領域を介して生じる場合、組換えに使用したＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡと同一の配列を有するプラスミドが生成される。これに対して、第２の組換え事象が、第１の相同領域とは異なる第２の相同領域を介して生じる場合、シャトルベクター上の変異を有する変異型ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡプラスミドが得られる。第１の相同領域と、第２の相同領域とがほぼ同じ長さである場合、第２の組換え事象が第２の相同領域で起こる確率は、第２の組換え事象が第１の相同領域で起こる確率とほぼ同じである。そのため、得られるＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡプラスミドの、約２分の１が組換えに用いた配列と同一の配列を有するプラスミドであり、約２分の１がシャトルベクターに導入した変異を有するプラスミドである。
（２）直鎖状ＤＮＡフラグメントを用いる場合；
この方法では、例えば、プロファージＲａｃ由来のｒｅｃＥＴの組換え機能を用いるか、またはバクテリオファージλ由来のｒｅｄαβの組換え機能を利用し、直鎖状ＤＮＡフラグメントを用いて、環状ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡ分子に変異を導入する。具体的には、標的配列に隣接する選択マーカーおよび相同配列を含む直鎖状ＤＮＡフラグメントを、ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡとともに、相同組換えを生じ得る大腸菌に導入する。大腸菌内での直鎖状ＤＮＡの分解を避けるために、エクソヌクレアーゼ欠損の大腸菌を使用するか、またはバクテリオファージ由来のエクソヌクレアーゼ阻害剤であるｒｅｄγ（ｇａｍ）を発現させることが好ましい。直鎖状ＤＮＡは、その両端にＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡプラスミドと相同な領域を有する。その相同な領域を介して相同組換えを生じることによって、直鎖状ＤＮＡフラグメント内の所望の配列をＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡ内に導入することができる。ｒｅｃＥＴ、またはｒｅｄαβ組換え機能を使用する場合、これらの組換え機能は、２５〜５０ヌクレオチド程度の長さの相同配列によって相同組換えを生じることから、ｒｅｃＡ媒介性相同組換えよりも、簡便に使用することができる。
（３）トランスポゾンを用いる場合；
トランスポゾンエレメントが大腸菌内の核酸にランダムに挿入する機能を用いる。例えば、トランスポゾンエレメントとＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡを大腸菌に導入し、ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡ内にランダムにトランスポゾンエレメントを挿入することによって、挿入変異を生じる。

さらに、例えば、ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡのような組換え水痘帯状疱疹ウイルスを有する宿主細胞自体を、変異剤（例えば、ニトロソグアニジン）によって処置をすることによって、組換え水痘帯状疱疹ウイルスゲノム内にランダムな変異を導入することも可能である。

（処方）
本発明はまた、有効量の治療剤・予防剤の被験体への投与・接種による、疾患または障害（例えば、感染症）の処置および／または予防の方法を提供する。治療剤・予防剤は、薬学的に受容可能なキャリア型（例えば、滅菌キャリア）と組み合せた、本発明の組成物を意味する。

治療剤・予防剤を、個々の患者の臨床状態（特に、治療剤・予防剤単独処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ＧＭＰ＝ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。

一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤・予防剤の合計薬学的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、本発明の細胞生理活性物質について、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与する場合、代表的には、治療剤・予防剤を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。

治療剤・予防剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与し得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。

本発明の治療剤・予防剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤・予防剤の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。

非経口投与のために、１つの実施態様において、一般に、治療剤・予防剤は、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化、および治療剤・予防剤に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。

一般に、治療剤・予防剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。

キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。

治療的投与に用いられるべき任意の薬剤は、有効成分としてのウイルス以外の生物・ウイルスを含まない状態、すなわち、無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成される。一般に、治療剤・予防剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。

治療剤・予防剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）治療剤・予防剤水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥した治療剤・予防剤を、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。

本発明はまた、本発明の治療剤・予防剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。さらに、治療剤・予防剤を他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。

本発明の治療剤・予防剤は、単独または他の治療剤・予防剤と組み合わせて投与され得る。本発明の治療剤・予防剤と組み合わせて投与され得る治療剤・予防剤としては、化学療法剤、抗生物質、ステロイドおよび非ステロイドの抗炎症剤、従来の免疫治療剤・予防剤、他のサイトカインおよび／または増殖因子が挙げられるが、これらに限定されない。組み合わせは、例えば、混合物として同時に；同時にまたは並行してだが別々に；あるいは経時的のいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療用混合物として共に投与されるという提示、およびまた、組み合わされた薬剤が、別々にしかし同時に、例えば、同じ個体に別々の静脈ラインを通じて投与される手順を含む。「組み合わせて」の投与は、一番目、続いて二番目に与えられる化合物または薬剤のうち１つの別々の投与をさらに含む。

特定の実施態様において、本発明の治療剤・予防剤は、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、および／またはプロテーアーゼインヒビターとの組み合わせで投与される。

さらなる実施態様において、本発明の治療剤・予防剤は、抗生物質と組合わせて投与される。使用され得る抗生物質としては、アミノグリコシド系抗生物質、ポリエン系抗生物質、ペニシリン系抗生物質、セフェム系抗生物質、ペプチド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質が挙げられるが、これらに限定されない。

さらなる実施態様において、本発明の治療剤・予防剤は、単独または抗炎症剤と組合わせて投与される。本発明の治療剤・予防剤とともに投与され得る抗炎症剤としては、グルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎｅ）、ベンダザック、ベンジドアミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモル ファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセプロール、パラニリン、ペリゾキサル、ピフオキシム、プロキアゾン、プロキサゾール、およびテニダップが挙げられるが、これらに限定されない。

さらなる実施形態において、本発明の治療剤・予防剤は、他の治療レジメまたは予防レジメ（例えば、放射線治療）と組み合わせて投与される。

以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１：ＢＡＣベクターを挿入する領域（遺伝子）の選択）
ＢＡＣベクターを利用して、外来抗原遺伝子を挿入した組換えウイルスを作製する場合、多数の外来遺伝子を挿入することによってゲノムサイズが大きくなる。ゲノムサイズが大きくなりすぎると、ゲノムＤＮＡがカプシドにパッケージされず、組換えウイルスが作製できないことが知られている。そこで、多数の抗原遺伝子をＯｋａワクチン株に挿入するためには、Ｏｋａワクチン株の非必須遺伝子をノックアウトして、ゲノムＤＮＡサイズを減少させる必要があると考えられる。また、ノックアウトしてもウイルスが増殖できる非必須遺伝子は、ＢＡＣベクター配列または他のウイルス由来の抗原タンパク質をコードする遺伝子などのような外来配列を挿入する部位としても適切である。

そこで、水痘ウイルスＯｋａ原株ゲノムをＢＡＣベクターに挿入した組換えＤＮＡ（Ｐ−Ｏｋａ株ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡ）を用いて、遺伝子７のＯＲＦ（ＨＳＶ ＵＬ５１ホモログ）、遺伝子１３のＯＲＦ（チミジンシンセターゼ）、遺伝子２１のＯＲＦ（ヌクレオカプシド）、遺伝子４８のＯＲＦ（プロテインキナーゼ）、遺伝子４６のＯＲＦ（ＨＳＶ ＵＬ１６ホモログ）、遺伝子５６のＯＲＦ（ＨＳＶ ＵＬ４ホモログ）、遺伝子５８のＯＲＦ（ＨＳＶ−１ ＵＬ３ホモログ）、遺伝子６６のＯＲＦ（プロテインキナーゼ）遺伝子が、それぞれ非必須遺伝子なのか必須遺伝子なのかを調べた。

（方法）
カナマイシン遺伝子の両端に、ノックアウトの標的となる遺伝子の配列を、標的となる遺伝子のゲノム内での配向と同一方向になるように連結し、ノックアウトベクターを作製した。このノックアウトベクターを、Ｐ−Ｏｋａ株ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡを保持した大腸菌内に導入し、ノックアウトベクターとＰ−Ｏｋａ株ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡとの間で相同組換えを起こさせ、標的遺伝子をノックアウトした。

（結果）
遺伝子１３のＯＲＦ、遺伝子５６のＯＲＦ、遺伝子５８のＯＲＦ、および、遺伝子５６ＯＲＦ−遺伝子５７ＯＲＦ−遺伝子５８ＯＲＦの連続した領域を欠損させたＰ−Ｏｋａ株ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡをＭＲＣ−５細胞にトランスフェクションしたところ組換えウイルスが発生した。従って、これらの遺伝子は、非必須遺伝子であることが判明した。遺伝子１３および５７のＯＲＦに関しては、非必須遺伝子であると考えられていたが、今回に実験によって確認された。従来、必須遺伝子であると考えられていた遺伝子２１をノックアウトしたところ、組換えウイルスを得ることはできなかった。これに対して、従来、非必須遺伝子であると考えられていた遺伝子７、遺伝子４６、遺伝子４８、および遺伝子６６を欠損したところ、組換えウイルスを得ることができなかった。

今回の実験によって非必須遺伝子であることが実証された遺伝子の中で、遺伝子５６欠損Ｐ−ＯｋａのプラークサイズをＰ−Ｏｋａと比較したところ、遺伝子５６欠損Ｐ−ＯｋａをＭＲＣ−５細胞に感染させた場合のプラークサイズは、他の非必須遺伝子を欠損した場合よりもやや小さかったが、有意差はなかった。

以上の結果より、構造のみから、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子がウイルス増殖に必須か否かを判断することは、困難であることが判明した。今回の結果から、従来、非必須遺伝子であると考えられていた遺伝子１３、遺伝子５７に加えて、遺伝子５６、および遺伝子５８が、非必須遺伝子であり、ノックアウトしても、ウイルス増殖が影響を受けないことが判明した。特に、遺伝子５８は、欠損したとしても、ウイルス増殖が何ら影響を受けなかった。従って、遺伝子１３および５７に加えて、遺伝子５６、および遺伝子５８、特に５６から遺伝子５８の連続した領域が、ノックアウトおよび外来配列（例えば、ＢＡＣベクター配列およびその他の抗原をコードする遺伝子配列）の挿入部位として好適な遺伝子であることが判明した。

（実施例２：遺伝子１３のＯＲＦ中にムンプスウイルスＨＮ遺伝子を挿入することによる、多価ワクチンの製造）
実施例１において、遺伝子１３が、ノックアウト、および／または外来配列の挿入に適切な遺伝子であることが判明したので、この遺伝子１３のＯＲＦ中にムンプスウイルスＨＮ遺伝子を挿入することによる、多価ワクチンの製造を行った。

ムンプスウイルスのＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子を、野外流行株である岩崎株から、ＰＣＲを用いて増幅した。クローニングした岩崎株のＦ遺伝子およびＨＮ遺伝子のアミノ酸配列を解析したところ、Ｆ遺伝子は野外株やワクチン株と比較的高い相同性を示したが（＞９８．５％）、ＨＮ遺伝子は１９９０年代後半以降の野外株とは相同性が高く１９９０年代前半以前の野外株やワクチン株とは相同性が低かった（約９６％）。

次に、クローニングした遺伝子の上流に作動可能にヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター／エンハンサー配列を連結した。ＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子を用いたプラスミドを、それぞれ、ｐＤＥＳＴ２６／ＭｅＶ−ＨＮおよびｐＤＥＳＴ２６／ＭｅＶ−Ｆと命名した。ヒトサイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー配列は、ＮＦ−κＢ結合部位、ＡＰ−１結合部位、およびＴＡＴＡボックスを有する（図１）。

ｐＤＥＳＴ２６／ＭｅＶ−ＦおよびｐＤＥＳＴ２６／ＭｅＶ−ＨＮを２９３細胞にトランスフェクションし、数種類の抗ＭｅＶ抗体と蛍光抗体法で反応させた。その結果、ｐＤＥＳＴ２６／ＭｅＶ−Ｆをトランスフェクションした２９３細胞はどの抗体とも反応しなかったが、ｐＤＥＳＴ２６／ＭｅＶ−ＨＮをトランスフェクションした細胞は幾つかの抗ＭｅＶ抗体（中和活性を持つ抗体も含まれる）と反応した。

このムンプスウイルスＨＮ遺伝子とＣＭＶプロモーター／エンハンサーを結合した核酸配列の両端に、遺伝子１３の上流および下流を連結したベクターを作製した（塩基番号は、Ｐ−Ｏｋａでの塩基番号である。配列番号４に示されるＤｕｍａｓ株の場合は、それぞれ、１７０３７〜１８４４０、および、１９３４７〜２０３５０に対応する。）。このベクターを、Ｐ−Ｏｋａ株ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡを保持した大腸菌内に導入し、ベクターとＰ−Ｏｋａ株ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡとの間で相同組換えを起こさせ、遺伝子１３のＯＲＦと、ムンプスＨＮ遺伝子とＣＭＶプロモーター／エンハンサーとの連結配列とを相同組換えした（図２）。相同組換えが生じたことを、ＰＣＲおよび制限酵素消化によって、確認した。

次に、相同組換えによって作製されたＢＡＣベクターを、エレクトロポーレーションによってＭＲＣ−５細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞のプラークサイズは、遺伝子１３を破壊していないウイルスを用いた場合と同様であった。

ムンプスウイルスのＨＮ遺伝子産物を検出するために、ＦＩＴＣ標識した抗ムンプスウイルスＨＮタンパク質抗体（マウス免疫グロブリン／ＦＩＴＣ ヤギ Ｆ（ａｂ’）２、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｄｅｎｍａｒｋ Ａ／Ｓ，Ｐｒｏｄｕｋｔｉｏｎｓｖｅｊ ４２，ＤＫ−２６００ Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）およびＡｌｅｘａ５９４標識した抗ムンプスウイルスＨＮタンパク質抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ（登録商標）５９４、ヤギの抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）のＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）の各々を用いて、トランスフェクション細胞中でのＨＮ遺伝子の発現を確認した。その結果、いずれの標識抗体を用いても、ＨＮタンパク質の発現が確認された。

本実施例によって、ウイルスの増殖を阻害することなく、簡便に、水痘帯状疱疹ウイルスおよびムンプスウイルスの両方に対する多価ワクチンが製造できた。

（実施例３）
（病原性の弱い変異型組換え水痘帯状疱疹ウイルス株の作製）
本発明に従い、以下の方法を用いることによって、変異型組換え水痘帯状疱疹ウイルスを調製し、変異ウイルスの中から病原性の弱い変異水痘帯状疱疹ウイルス株を得ることが可能である。

（１：変異型組換え水痘帯状疱疹ウイルスの調製）
変異型組換え水痘帯状疱疹ウイルスの調製方法としては、例えば、変異遺伝子を含む核酸とＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡプラスミドとの間で相同組換えを起こすことによって、変異型組換え水痘帯状疱疹ウイルスを調製する方法が挙げられる。ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡプラスミドと相同組換えを起こすために用いられる変異遺伝子は、ランダムな変異を有していても、部位特異的な変異を有していてもよい。これら各々を用いることによって、ランダムな変異を有する変異型組換え水痘帯状疱疹ウイルスの集団、および部位特異的な変異を有する変異型組換え水痘帯状疱疹ウイルスを得ることができる。以下、その各々についてより詳細に説明する。

（１．１：ランダムな変異を有する変異型組換え水痘帯状疱疹ウイルスの調製）
水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの遺伝子６２に変異を有するウイルスのいくつかが弱毒化ウイルスであることが公知である。そのため、本実施例においては、ＰＣＲを用いてランダムに変異を導入した遺伝子６２を作製する。ＰＣＲを用いる変異導入方法は周知であり、例えば、プルーフリーディング機能を有さない耐熱性ポリメラーゼを４つのヌクレオチドの１つが少ない条件で用いることによって、ランダムに変異を導入することが可能である。必要に応じて、変異型６２遺伝子に薬剤耐性遺伝子のようなマーカー遺伝子を連結させてもよい。

このようにして調製された変異型遺伝子６２を、エレクトロポーレーション法に従って、ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡプラスミドとともに大腸菌に導入した。そして、変異型配列６２をＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡに対して相同組換えを起こさせる。その後、相同組換えを生じた水痘帯状疱疹ウイルスのＤＮＡを単離し、大腸菌に導入し、相同組換えを起こしたＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡを含む大腸菌を得る。

得られた複数の大腸菌は、各々異なる変異を有する遺伝子６２を含むＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡを有する。そこで、各大腸菌に含まれる変異型ＶＺＶ−ＢＡＣ−ＤＮＡにより産生される水痘帯状疱疹ウイルスの病原性の程度を、下記の（２：水痘帯状疱疹ウイルスの病原性の試験方法）を用いてスクリーニングする。

（１．２：部位特異的変異を有する変異型組換え水痘帯状疱疹ウイルスの調製）
所望の部位特異的変異を導入する方法も、当該分野において周知である。例えば、所望の変異を有するプライマーを用いてＰＣＲを行い、その所望の変異を有する遺伝子断片を調製し、その後、その変異遺伝子断片を用いて、さらにＰＣＲを行うことによるか、または制限酵素などの酵素処理を行うことによって、所望の変異を有する遺伝子全長を調製する。

このようにして調製された変異遺伝子について、上記（１．１．）の手順を用いて、部位特異的変異を有する変異型組換え水痘帯状疱疹ウイルスを調製する。

（２：水痘帯状疱疹ウイルスの病原性の試験方法）
水痘帯状疱疹ウイルスの病原性を試験する方法について、２つの方法が確立されている。

動物モデルを用いる方法として、ヒトの皮膚を移植した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを作製し、これに水痘帯状庖疹ウイルスを感染させることによって、病原性についての評価をする方法が周知である（Ｊ．Ｖｉｒｏ１．１９９８Ｆｅｂ；７２（２）：９６５−７４，）。

これに対し試験管内で病原性の評価を行う方法としては、ポアサイズが３μｍのトランスウェルで仕切られた二層のウェルの下側に単層培養のヒトメラノーマ細胞を入れ、上側に水痘帯状疱疹ウイルスを感染させた臍帯血単核球（ＣＢＭＣ）をそれぞれ入れ、７〜８日培養した後のメラノーマ細胞のＣＰＥ（細胞変性効果）の程度を観察する方法もまた周知である（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００ Ｆｅｂ；７４（４）：１８６４−７０）。

また、病原性を直接確認する方法ではないが、本発明者らのこれまでの結果（Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００２ Ｎｏｖ；７６（２２）：１１４４７−５９）から、ウイルスの病原性と増殖性には密接な関連があることが理解されているため、ｉｎｆｅｃｔｉｕｓ ｃｅｎｔｅｒ ａｓｓａｙによってｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅ１１の増殖性を調べることによっても間接的に病原性について評価を行うことができる。

（実施例４）
（ワクチンの製造）
培養面積２１０ｃｍ^２のルー瓶20本のＭＲＣ−５細胞培養に、実施例２で得た組換え水痘帯状疱疹ウイルスを接種の後、培養する。培養終了後、培養液を捨て、各ルー瓶内の感染細胞を200mlのＰＢＳ（−）にて２回洗浄する。次いで、２０ｍ１の０．０３％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ−３Ｎａを各ルー瓶内の感染細胞に重層し、細胞をルー瓶内壁面から剥離させ浮遊させる。各ルー瓶内の感染細胞浮遊液をプールし、２，０００ｒｐｍにて１０分間、４℃で遠心し、感染細胞のペレットを採取する。これを１００ｍｌのＰＢＳ（−）に再浮遊の後、凍結融解を１回、行う。次に、氷水浴中で超音波処理（２０ＫＨｚ、１５０ｍＡ、０．３秒／ｍｌ）後、３，０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心し、細胞遊離ウイルスを含有の上清を採取し、これを生ワクチン原液とする。この原液から検定用として３０ｍｌをサンプリングし、残りの原液７０ｍｌに、ＰＢＳ（−）に溶解したサッカロース及びゼラチン加水分解物をワクチン安定化剤として最終濃度が５％（ｗ／ｖ）及び２．５％（ｗ／ｖ）になるよう添加混合し、１４０ｍｌの生ワクチン最終バルクを調製する。この最終バルクから検定用として３０ｍｌをサンプリングの後、残りバルクを３ｍｌ容のバイヤル瓶に０．５ｍｌずつ分注し、凍結乾燥の後、窒素ガスを充填しゴム栓で封をしバイヤル瓶内部を気密密閉する。この生ワクチン小分品は、４℃で保存し、使用の直前に注射用蒸留水０．５ｍｌを添加し乾燥内容物を完全に溶解し用いる。一方、サンプリングした上記のワクチン原液と最終バルク、及び小分品２０本につき、検定試験を行う。この検定試験は、安全性、有効性及び均質姓を確認し、生ワクチンとしての適格性を確定するため、厚生省告示第１９５号に規定の生物学的製剤基準（１９８９年）「乾燥弱毒生水痘 ワクチン」に準拠し、かつ、同じく規定の基準「組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチン（酵母由来）」をも考慮し、実施する。この検定試験の結果、上記の小分品は、そのウイルス含量が２×１０^４ＰＦＵ（プラーク形成単位）／０．５ｍｌであり、かつ、上記基準に規定の各種試験に合格した場合、適格性を備えた生ワクチンとしてその後の使用に供する。

（実施例５）
（組換え水痘帯状疱疹ウイルスワクチンの免疫原性の判定）
実施例４で製造した組換え水痘帯状疱疹ウイルスワクチン株の免疫原性を、モルモットを用いて測定する。比較対照として、Ｏｋａ株生ワクチンを使用する。これ等の各ワクチンを３週令の平均体重２５０ｇのモルモット３匹にそれぞれ皮下接種する。ワクチン接種は、接種量が組換え株及びＯｋａ株生ワクチンでは、３，０００ＰＦＵ又は２，０００ＰＦＵ／モルモットになるよう各ワクチンをＰＢＳ（−）で希釈調整して行う。ワクチン接種後、４、６及び８週目に、各被接種モルモットの大腿部静脈から部分採血し、その血中抗体価を測定する。抗体価の測定には、中和試験法 （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ６１， ２５５−２６９， １９８２）を、採用する。組換え水痘帯状疱疹ウイルスワクチンがＯｋａ株と同程度に、ＶＺＶ抗体を誘導することを確認する。これらの結果から、免疫原性が良好な組換え水痘帯状疱疹ウイルスワクチンを選択する。

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

本発明によって、例えば、ＢＡＣ（大腸菌人工染色体）を用い、組換え水痘帯状疱疹ウイルス抗原および他のウイルス抗原を含むワクチンを作製する方法、およびその方法によって作製された組換え水痘帯状疱疹ウイルスが提供される。また、本発明によって、組換え水痘帯状疱疹ウイルスなどの抗原を含む多価ワクチンがまた提供される。

さらに、本発明によって、水痘帯状疱疹ウイルスゲノム遺伝子とＢＡＣベクター配列とを含むベクター、およびそのようなベクターを含む細胞、ならびに水痘帯状疱疹ウイルスゲノムと相同組換えし得るフラグメント、およびＢＡＣベクター配列を含む核酸カセットが提供される。

Claims (42)

1. 水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの非必須領域内にＢＡＣベクター配列の少なくとも一部が挿入されている、組換え水痘帯状疱疹ウイルスであって、ここで該非必須領域が、以下の領域からなる群から選択される、組換え水痘帯状疱疹ウイルス：
   遺伝子１３のＯＲＦ内の領域、遺伝子５６のＯＲＦ内の領域、遺伝子５７のＯＲＦ内の領域、遺伝子５８のＯＲＦ内の領域、遺伝子１３のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５６のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５７のＯＲＦに隣接する領域および、遺伝子５８のＯＲＦに隣接する領域。
2. 請求項１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルスであって、遺伝子１３、遺伝子５６、遺伝子５７、および遺伝子５８からなる群から選択される遺伝子を少なくとも２つ欠損する、組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
3. 請求項１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルスであって、遺伝子１３、遺伝子５６、遺伝子５７、および遺伝子５８からなる群から選択される遺伝子を少なくとも３つ欠損する、組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
4. 前記ＢＡＣベクター配列が組換えタンパク質依存性組換え配列を含む、請求項１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
5. 前記ＢＡＣベクター配列が、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ウエストナイルウイルス、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、および日本脳炎ウイルスからなる群から選択されるウイルスの遺伝子を含む、請求項１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
6. 前記ＢＡＣベクター配列が、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、および風疹ウイルスからなる群から選択されるウイルスの遺伝子を含む、請求項１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
7. 前記ＢＡＣベクター配列が、ムンプスウイルスの遺伝子、麻疹ウイルスの遺伝子、および風疹ウイルスの遺伝子を含む、請求項６に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
8. 前記ムンプスウイルスの遺伝子が、ＨＮ遺伝子、Ｆ遺伝子、および、Ｎ遺伝子からなる群から選択される、請求項６に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
9. 前記麻疹ウイルスの遺伝子が、Ｈ遺伝子、Ｆ遺伝子、および、Ｎ遺伝子からなる群から選択される、請求項６に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
10. 前記風疹ウイルスの遺伝子が、Ｃ遺伝子、Ｅ１遺伝子、および、Ｅ２遺伝子からなる群から選択される、請求項６に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
11. 前記水痘帯状疱疹ウイルスゲノムが野生株由来である、請求項１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
12. 前記水痘帯状疱疹ウイルスゲノムが変異株由来である、請求項１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
13. 前記水痘帯状疱疹ウイルスゲノムがＯｋａワクチン株由来である、請求項１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
14. 前記水痘帯状疱疹ウイルスゲノムが遺伝子６２および遺伝子６に変異を有する、請求項１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
15. 前記遺伝子６２が、配列番号１の塩基配列において、少なくとも以下（ａ）〜（ｄ）の塩基置換：
    （ａ）２１１０番塩基がＧ；
    （ｂ）３１００番塩基がＧ；
    （ｃ）３８１８番塩基がＣ；および
    （ｄ）４００６番塩基がＧ、
    ならびに前記遺伝子６が、配列番号４の塩基配列において、少なくとも５７４５番塩基がＧである塩基置換、
    を有する、請求項１４に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルス。
16. 請求項１に記載のウイルスを含有する薬学的組成物。
17. ワクチンの形態である、請求項１６に記載の薬学的組成物。
18. 請求項１に記載の組換え水痘帯状疱疹ウイルスから単離される、ベクター。
19. 請求項１８に記載のベクターを含む、細胞。
20. 細菌である、請求項１９に記載の細胞。
21. Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項２０に記載の細菌。
22. 哺乳動物細胞である、請求項１９に記載の細胞。
23. ヒト由来の細胞である、請求項２２に記載の哺乳動物細胞。
24. 請求項２２に記載の哺乳動物細胞によって産生された、ウイルス。
25. 請求項２４に記載のウイルスを含有する薬学的組成物。
26. 組換え水痘帯状疱疹ウイルスの製造方法であって、以下の工程：
    請求項１８に記載のベクターを、哺乳動物宿主細胞に導入する工程；および
    該哺乳動物宿主細胞を培養して、組換え水痘帯状疱疹ウイルスを産生させる工程、
    を包含する、方法。
27. 前記哺乳動物宿主細胞がヒト由来の細胞である、請求項２６に記載の方法。
28. 請求項２６に記載の方法であって、前記２つの組換えタンパク質依存性組換え配列間での組換えを起こす工程をさらに包含する、方法。
29. 請求項１８に記載のベクターに変異を導入する方法であって、以下の工程：
    該ベクターを細菌宿主細胞に導入する工程；
    水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの一部からなるフラグメントを含むプラスミドベクターを該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該フラグメントは少なくとも１つの変異を有する、工程；
    該細菌宿主細胞を培養する工程；
    該培養した細菌宿主細胞から、ＢＡＣベクター配列を有するベクターを単離する工程、
    を包含する、方法。
30. 請求項１８に記載のベクターに変異を導入する方法であって、以下の工程：
    該ベクターを細菌宿主細胞に導入する工程；
    水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの一部からなる第１のフラグメントを含む第１のプラスミドベクターを該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該第１のフラグメントは少なくとも１つの変異を有する、工程；
    水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの一部からなる第２のフラグメントを含む第２のプラスミドベクターを該細菌宿主細胞に導入する工程であって、ここで、該第２のフラグメントは少なくとも１つの変異を有し、そして該第２のフラグメントは該第１のフラグメントとは異なる、工程；
    該細菌宿主細胞を培養する工程；
    該培養した細菌宿主細胞から、ＢＡＣベクター配列を有するベクターを単離する工程、
    を包含する、方法。
31. 細菌細胞内において水痘帯状疱疹ウイルスゲノムと相同組換えし得る第１のフラグメント、ＢＡＣベクター配列、および細菌細胞内において水痘帯状疱疹ウイルスゲノムと相同組換えし得る第２のフラグメントを含む核酸カセットであって、ここで、該ＢＡＣ配列の両端の各々がそれぞれ第１のフラグメントおよび第２のフラグメントと連結し、そして、ここで、前記第１および第２のフラグメントが、各々独立して水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの以下の領域からなる群から選択される領域由来である、核酸カセット：
    遺伝子１３のＯＲＦ内の領域、遺伝子５６のＯＲＦ内の領域、遺伝子５７のＯＲＦ内の領域、遺伝子５８のＯＲＦ内の領域、遺伝子１３のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５６のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５７のＯＲＦに隣接する領域、遺伝子５８のＯＲＦに隣接する領域、および、遺伝子５６，５７，５８の連続する領域。
32. 前記第１のフラグメントおよび第２のフラグメントが少なくとも１ｋｂである、請求項３１に記載の核酸カセット。
33. 前記第１のフラグメントおよび第２のフラグメントが少なくとも１．５ｋｂである、請求項３１に記載の核酸カセット。
34. 前記第１のフラグメントおよび第２のフラグメントが少なくとも２ｋｂである、請求項３１に記載の核酸カセット。
35. 前記第１のフラグメントおよび第２のフラグメントが、水痘帯状疱疹ウイルスゲノムの配列に対して、少なくとも８０％同一である、請求項３１に記載の核酸カセット。
36. 請求項３１に記載の核酸カセットであって、ここで、前記第１および第２のフラグメントが異なる領域に由来する、核酸カセット。
37. 前記ＢＡＣベクター配列が組換えタンパク質依存性組換え配列を含む、請求項３１に記載の核酸カセット。
38. 前記ＢＡＣベクター配列が選択マーカーを含む、請求項３１に記載の核酸カセット。
39. 前記水痘帯状疱疹ウイルスゲノムが野生株由来である、請求項３１に記載の核酸カセット。
40. 前記水痘帯状疱疹ウイルスゲノムが変異株由来である、請求項３１に記載の核酸カセット。
41. 前記水痘帯状疱疹ウイルスゲノムがＯｋａワクチン株由来である、請求項３１に記載の核酸カセット。
42. 前記ＢＡＣベクター配列が配列番号３に記載の核酸配列を有する、請求項３１に記載の核酸カセット。