CN101967466A - Orf7缺陷型水痘病毒株、含有该毒株的疫苗及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒学和生物药学领域。具体而言，本发明提供了缺陷型水痘病毒株、含有该毒株的疫苗及其应用，为水痘-带状疱疹病毒的治疗和预防提供良好的候选疫苗药物。

Description

ORF7缺陷型水痘病毒株、含有该毒株的疫苗及其应用 
技术领域
本发明涉及病毒学和生物药学领域。具体而言，本发明提供了缺陷型水痘病毒株、含有该毒株的疫苗及其应用，为水痘-带状疱疹病毒的治疗和预防提供良好的候选疫苗药物。 
技术背景
水痘-带状疱疹病毒(Varicella zoster virus：VZV，简称“水痘病毒”或“VZV”)是严格种属特异性的病毒，是导致人患水痘或带状疱疹的致病因子。美国专利3985615中公开了P-Oka株通过豚鼠胚胎组织(GPEC)多次传代，产生减毒的V-Oka病毒，制备预防水痘的V-Oka活疫苗。美国专利4000256中叙述了用人胚成纤维细胞WI-38株传代培养VZV病毒10-80次生产VZV减毒疫苗。迄今为止，只有P-Oka株经细胞传代获得的“水痘病毒减毒冈株”(特公昭53-41202号公报)；Lancet 2：1288-1290，1974)为WHO批准的唯一用于预防水痘或带状疱疹疫苗制备的毒株，该毒株制备的疫苗在全球得到了广泛使用[Requirement for Varicella Vaccine(Live)Adopted 1984：WHOTechnical Report Series，No.725，pp.102-104，1985]。 
水痘病毒减毒冈株鉴定的专利CN1163604C，从分子水平上揭示该毒株是由多个不同序列组成的混合株。野毒株可能存在于其中，源于V-Oka疫苗接种者产生V-Oka株的带状疱疹已有报道。故该减毒株的潜在危害性还是存在的，但是，现在还没有其它抗VZV的疫苗株上市。该病毒具有严格种属特异性，人是其唯一的自然宿主，病毒基因的功能研究难度较大；再者该病毒对细胞具有强烈的依赖性，获得可用于转化的VZV病毒DNA非常困难，故该病毒的研究进展较为缓慢。 
随着分子遗传学研究的飞速发展，基因操作手段的不断革新，基 因插入或删除成为发现新基因或研究基因功能的重要手段，突破了VZV基因研究的瓶颈。1993年Jeffrey I.等在“Generation ofvaricella-zoster virus(VZV)and viral mutants from cosmid DNA s：VZV thymidylate synthetase is not essential for replication invitro”一文中通过科斯质粒(Cosmid)实现对腺苷合成酶基因的操作，揭示将终止密码子引入腺苷合成酶基因导致该酶不表达，但不影响病毒生长速率和对阿昔洛韦的敏感性。这项研究开创了体外VZV基因操作方法，为基因功能研究奠定了基础。2000年George W等在“OpenReading Frame S/L of Varicella-Zoster Virus Encodes aCytoplasmic Protein Expressed in Infected Cells”一文中描述了通过基因部分结构删除的方法发现了VZV新基因，即ORF S/L。随着细菌人工染色体(BAC)在研究中的应用，组织培养技术的进步，异种生物间器官移植屏障的突破(联合免疫缺陷型小鼠的开发)，拓宽了种属特异的VZV基因功能研究的空间，可以在体外或动物体内进行VZV基因功能研究。2004年Kazuhiro N.等在“Cloning of thevaricella-zoster virus genome as aninfectious bacterialartificial chromosome in Escherichia coli”一文中揭示被克隆到BAC载体上的VZV Oka株全基因组，可以在大肠杆菌和人胚肺细胞中增殖，BAC可被一同转化到人胚肺细胞中的Cre酶精确切除，产生的重组VZV病毒具有p-Oka同样结构，完全具有亲本病毒的特性。BAC的应用为VZV的功能研究带来了极大便利，加速了VZV基因功能研究进程。2007年Zhang Z.等利用BAC载体和基因同源重组技术揭示多个基因的体内外功能。 
发明内容
本申请人以含P-Oka全基因组的BAC(VZV-BAC)为基础，通过基因重组手段，获得ORF7缺失的病毒株VZV-7D，保藏号为：CGMCC3207，保藏日期为2009年7月28日，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所(邮编100101)，该保藏的病毒株VZV-7D的分类命名为水痘病毒。体内外证实该病毒株不感染皮肤和感觉神经节，故不存在再活化产生带状疱疹的潜在危害；该毒株可在MRC-5、Mewo细胞上生长，且同P-Oka株生长一致；该毒株保留了P-Oka株的所有糖蛋白，其免疫原性理应同P-Oka株的免疫力相同；该毒株是通过Kanr筛选到的单一克隆株，不存于混合型V-Oka株的潜在危害；由于整个ORF7删除，VZV-7D株不可能产生回复突变，因而，以VZV-7D株制备减毒活疫苗更为安全和有效。而且，VZV-7D至少可以克隆10kb的外源基因而不影响其本身生长和增殖，故可以用作外源基因表达载体，制备用于诊断、预防和治疗的生物制品。 
申请人如下进行了P-Oka株ORF7缺失株(VZV-7D)的制备。因为水痘-带状疱疹病毒(VZV)的ORF7位于病毒基因组的8607-9386bp之间，编码一个29kDa的蛋白，可能位于皮层结构中，它的功能仍不清楚。VZV ORF7蛋白与单纯疱疹病毒(HSV)中的UL51为同源蛋白。HSV UL51基因编码一个磷酸化蛋白，分子量约为27，29和30kDa，在感染后期表达，与病毒出细胞体有关(Daikoku，Ikenoya et al，1998)。一项研究报告指出HSV UL51蛋白定位于感染细胞的高尔基体标志蛋白上，UL51蛋白通过N-端第9位的半胱氨酸铆钉到高尔基体上(Nozawa，Daikoku，et al，2003)。UL-51无效突变揭示其在HSV复制循环中的作用。最近的研究显示突变株病斑较小，最大滴度比野生株降了100倍。电子显微镜显示核衣壳的形成不受UL51删除影响，但是，病毒出核周质腔受到严重影响，这现象揭示UL51蛋白涉及到HSV病毒颗粒的成熟和出核(Nozawa，Kawaguchi et al.2005)。通过伪狂犬病毒(PrV)UL51缺失突变揭示此基因表达产物也具有相似的功能。一步生长曲线揭示PrV-De lt aUL51F不仅滴度稍有下降，而且病斑减小明显，只有野生株大小的30％。细胞质内的衣壳大量存在，病毒无包被或处于包被不同阶段，所以，研究结果推断UL51蛋白参与病毒的外出，对病毒复制不是必需的(Klupp，Granzow et al.2005)。 
本发明以来自斯坦福大学医学院Dr.Ann Arvin实验室的P-Oka临床分离株为材料，以VZV-BAC(P-Oka)为框架，应用细菌同源重组原理产生重组克隆。全长ORF7被Kanr基因取代而产生7D-VZVBAC。7D-VZVBAC与含Cre酶的重组质粒一同电转MRC-5细胞，产生无ORF7的水痘病毒(VZV-7D)克隆株。 
VZV ORF7删除突变体构建基于luc VZV BAC(Zhang et al.2007)。操 作过程见图1。A.大肠杆菌DY380株提供高效同源重组系统，所需同源序列短至40bp。同源重组酶受温度控制，32℃抑制/42℃激活。B.删除ORF7，设计的两条引物包含20bp的卡那霉素抗性基因同源核苷酸序列和ORF7删除区起始或终止密码子相连的40bp同源序列。 
上游引物(F)： 
GAT TTA TCC ATA GTT CAA TAC GTT GGA AAG CCA GTC AAT CGC TCT TGTTGG CTA GTG CGT A(SEQ ID NO：1)， 
下游引物(R)： 
AAA CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TTC TGC CAGTGT TAC AAC CAA(SEQ ID NO：2)。 
卡那霉素抗性基因从质粒pGEM-or iV/kan1上扩增(Netterwald，Yang etal.2005)，PCR产物用DpnI酶进行消化，用Qiagen凝胶提取试剂盒进行回收。C.以1.6ky，250μF的BioRad Gene Pulser II电转仪将大约200ng的PCR产物转进载有VZVLuc BAC的DY380菌体中。D.利用重组酶42℃激活/32℃抑制的特性，完成Kanr基因与ORF7的同源重组，ORF7被Kanr基因取代，在32℃下从含有30μg/ml卡那霉素的琼脂板上选择单克隆的重组子，从大肠杆菌中分离水痘病毒突变株(ORF7缺失)VZV-BAC的DNA。E.所得病毒基因组完整性由HindIII酶切检验，重组DNA经PCR检验。F.7D-BACDNA在DY380中增殖并被纯化提取。G.所得的7D-BACDNA单独电转染至(Marchini，Liu et al.2001)MRC-5细胞，产生7D-BAC，BAC上带的GFP可以用于病毒在细胞中生长增殖研究或与Cre表达载体一同电转染至(Marchini，Liu et al.2001)MRC-5细胞，BAC被Cre酶从其两端的loxP酶切位点完全切除，产生VZV-7D病毒。VZV-7D在Mewo细胞或MRC-5细胞中的生长特性同P-Oka一致，也没有改变病毒在胸腺组织的生长增殖特性，但是，缺失突变的VZV-7D不感染皮肤、神经瘤细胞和感觉神经节，这为疫苗的开发带来了希望。含有荧光素酶基因的VZV-7D(VZV-7DLuc)按照Zhang等(Journal of Virology，Sept，2007，p，9024-9033)描述的方法进行构建。VZV-7DLuc可用于体内VZV-7D功能研究的监测。目前尚无任何VZV-7D的学术报道。据此完成了本发明。 
附图说明
图1：水痘ORF-7缺陷型(7D)病毒制备。 
图2：ORF7缺失的VZV病毒鉴定。 
图3、水痘ORF-7回复突变(VZV-7R)病毒制备。 
图4、VZV-7D在人体MeWo细胞中生长曲线。 
图5、7D在人胸腺组织培养(TOC)系统中的生长曲线分析。 
图6、VZV-7D在人皮肤组织培养(SOC)系统中的生长曲线分析。 
图7、VZV-7D的背根神经节培养。 
图8、BAC-VZV构建及Mewo细胞中培养。 
具体实施方案
实施例1：VZV-7D的鉴定 
VZV-7D感染长成单层的MRC-5细胞，用含2％牛血清的MEM培养基培养，约80％细胞病变发生时，弃培养基，收获病变细胞，提取DNA，以P-Oka为对照进行试验。PCR扩增ORF-10和ORF-7基因，用HindIII消化VZV-7D和P-Oka株的DNA。PCR产物和HindIII消化产物用0.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳产物见图2。VZV-7D对ORF-10的PCR产物同P-Oka一致，但在ORF-7上没有条带，证实ORF-7缺失。HindIII对病毒的酶切图谱上，VZV-7D和P-Oka间看不出差别 
实施例2：VZV-7D的回复突变体(VZV-7R)制备 
ORF7缺失正确与否不仅可以用HindIII酶切鉴定，而且可以通过基因的同源重组获得完整的VZV加以验证。即应用细菌同源重组机理拯救出完整的VZV，见图3。利用Invitrogen的高保真Taq DNA聚合酶试剂盒PCR扩增ORF7片段，并将其克隆到质粒pGEM-lox-zeo的NotI和BglII位点之间，从而形成pGEM-zeo-ORF7质粒。该克隆片段通过测序分析鉴定正确，且通过PCR扩增没有错误密码子被引入ORF7编码框中。之后以pGEM-zeo-ORF7质粒为模板用下述引物PCR扩增zeoR-ORF7编码框。 
正向引物： 
GAT TTA TCCATA GTTCAA TAC GTT GGA AAG CCA GTC AAT CAT GCA GAC GGT GTG TGC CAG(SEQ ID NO：3)； 
反向引物： 
AAA CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TGG ATG GAT CCATAA CTT CGT(SEQ IDNO：4)， 
得到的PCR产物是两端各含一段40bp大小与水痘病毒基因组同源的基因，与kanR编码框顺序相连，位于ORF7缺失的位点。将得到的这段嵌合PCR产物按上文提到的方法电转化到携带有ORF7D BAC的DY380菌体中。重组体要通过含有50μg/ml的zeocin(Invitrogen)和12.5μg/ml的氯霉素的琼脂平板32℃培养筛选。正确的VZV克隆通过它们对抗生素的敏感状况而筛选获得。正确的克隆应该是氯霉素抗性、潮霉素抗性、zeoc in抗性、卡那霉素敏感性以及氨苄霉素敏感性。这些克隆进一步被酶切消化和PCR分析确证正确。鉴定正确的克隆(即携带有ORF7缺失或者1uc VZV BAC拯救子的大肠杆菌DY 380)接种于含12.5μg/ml的氯霉素的500mlLB培养基中32℃培养20小时。VZVBAC的DNA通过BAC DNA大量提取试剂盒(BD Biosciences，Palo Alto，CA)分离得到，并且利用转染试剂FuGene6(Roche，Indi anapolis，IN)按照使用说明转染到MRC-5细胞。6孔板中的一孔(35-mm)在转染时DNA与转染试剂的使用比例为1.5μg：6μl。一般情况转染后3天可见水痘病毒病斑。为从水痘病毒基因组中去除BAC载体(两侧有loxP酶切位点)，可将Cre表达载体与VZV BAC DNA一起共转染(Marchini，Liu et al.2001)MRC-5细胞，利用Cre酶的特性而精确切除BAC，产生完整的VZV。 
水痘ORF-7回复突变病毒具有同P-Oka病毒相同的生长和增殖特性。说明ORF-7的功能可以通过回复突变手段得到恢复。 
实施例3：VZV-7D病毒的Mewo细胞培养 
六孔板中长成单层的Mewo细胞分别用VZV-7D、VZV-7R和P-Oka株感染，以未感染的Mewo细胞作对照，Mewo细胞在37℃下用含2％牛血清的MEM培养基培养。感染24小时后，D-luciferin加到培养的细胞孔中，终浓度为150μg/ml，37℃培养10分钟，不同孔的生物荧光用体内成像系统IVIS(50Series；Xenogen Corporation，Alameda，CA)同时测量光子数，每天测量3孔感染细胞，测量后，细胞用病毒培养液取代D-luciferin物质继续培养。 病毒荧光量每24小时测量一次，连续测量7天。用3孔测量的数据均值对时间绘制生长曲线。结果见图4。 
人MeWo细胞不被感染或者被水痘-带状疱疹病毒野生株(1ucVZV)或者7D突变株或者7D回复株(1uc 7R)感染、培养7天。感染后每天用IVIS系统测量光子数，用3孔测量的均值对时间绘制生长曲线，图中标出3孔测量数据的误差线。本试验表明VZV-7D和VZV-7R和野生株一样都可以在MeWo细胞中正常生长。 
实施例4、7D病毒在人胸腺组织的培养 
人胸腺-肝脏联合移植体异体移植到雄性的CB-17SCID/beige鼠内。人胸腺-肝脏联合移植体构建和使用按Jennifer F.M(Journal of Virology，Sept.1995，p.5236 5242)描述的方法进行。移植3月后，人胸腺-肝脏移植体经外科手术暴露后，直接注射2×103至4×103PFU的Mewo培养的含有荧光素酶的VZV-7D和P-Oka，10-20μl细胞悬液，每种病毒感染3只小鼠，以未感染鼠为对照，感染后每天测量荧光量。腹腔注射250μl荧光素酶底物，即D-luciferin10分钟后，用生物荧光体内成像系统IVIS在移植区按实施例3的方法测量荧光量，每种病毒测量3只小鼠。结果见图5。 
培养的人胸腺组织不受病毒感染或者受VZV野生株或者VZV-7D株感染，培养7天。感染后每天用IVIS系统测量光子数。用3只鼠测量的光子数均值对时间绘制生长曲线。图中显示3只测量数据的误差线。本试验表明7D缺陷株像野生株一样能在胸腺组织(T-细胞)中生长。 
实施例5：7D病毒的皮肤培养 
人胚胎皮肤完整结构按Jennifer F.M(Journal of Virology，Sept.1995，p.5236 5242)描述的方法，异体移植到联合免疫缺陷(SC ID)小鼠皮下。移植4周后，三种含荧光素酶的VZV-7D、VZV-7R和P-Oka株感染皮肤，每种病毒感染3只小鼠，以未感染鼠为对照，感染后每天测量荧光量。腹腔注射250μl荧光素酶底物，即D-luciferin10分钟后，用生物荧光体内成像系统IVIS在移植区按实施例3的方法测量荧光量，每种病毒测量3只小鼠。结果见图6。 
培养的人皮肤组织被病毒野生株或者7D缺失株或者7D回复突变株感染、以不被感染的鼠为对照，培养7天。感染后每天用IVIS系统测量光子数，用3只测量的光子均值对时间绘制生长曲线。图中标出3只测量数据的误差线。实验证实VZV-7D在皮肤中有严重生长缺陷，这种功能缺陷在VZV-7D株回复突变后可以被恢复。 
实施例6：VZV-7D病毒的背根神经节培养 
用无菌的外科剪刀和镊子分离妊娠20周胚胎的宫颈段和胸段脊骨的背根神经节(DRG)，分离的背根神经节用含1％青霉素/链霉素的冰浴1XPBS瞬时洗涤，然后转到冰浴的培养基(DEM，含15％热灭活的胎牛血清和1％青霉素/链霉素)，将每个背根神经节单独放到六孔板中胶原覆盖的盖玻片上，加0.5ml培养基，培养5天，其间换培养基一次。六孔细胞板中制备50％Mewo细胞培养物，用于滴度检测和生长曲线分析。第6天收获P-Oka，VZV-7D和VZV-7R新近感染的Mewo细胞，于培养基悬浮至1ml。每个背根神经节单独饲养在六孔板中胶原包被的盖玻片上。10μl悬液用于病毒滴度检测，2μl用于Mewo细胞感染的生长曲线。其余细胞悬液用力通过27针管20次，细胞碎片通过4000rpm离心10min沉淀。上清均分，用于感染背根神经节，-120μl/样品，另外，2滴(20μl)细胞悬液用于感染另一个背根神经节，37℃5％CO2下培养3小时后，背根神经节用1×PBS洗涤，再补加新鲜培养基。每24小时检测一次荧光素酶活性。样品用含150μg/ml的D-luciferin 37℃培养10分钟后，用IVIS仪器和软件分析光子数。检测结果见图7，结果表明VZV-7D在Mewo上生长正常，而在背根神经节中几乎不生长。 
VZV-7D不感染背根神经节细胞，这为开发安全的减毒活疫苗奠定了坚实基础。 
实施例7：VZV-7D病毒可作为外源基因的表达载体 
细菌人工染色体载体(BAC)PUSF-6，含有原核生物的Ori、repE、parA、pa rB基因，Camr基因，gfp基因，两个500bp分别与ORF60和ORF61同源的VZV片段a和b，图A灰框，还有两个loxP位点(图A白框)，全长约为10kb。用BamHI消化BAC pUSF-6，产生用于重组的线性片段。P-Oka遗传物质由125kb个核苷酸组成，包括UL、US和末端及中间重复序列。由P-Oka全基因组构建的4个具 有重叠区段的科斯质粒，pvFsp73、pvSpe14、pvPme19、pvSpe23。pUSF-6电转至含pvSpe23的DY380菌体，通过同源重组插入pvSpe23的ORF60和ORF61之间，形成pvSpe23-pUSF-6，提取pvSpe23-pUSF-6的VZV-BAC DNA与其它3个科斯质粒的VZV片段共转染Mewo细胞，同源重组产生VZV-BAC。重组VZV-BAC病毒在Mewo细胞中复制，产生绿色荧光斑点。见图8C，其生长繁殖速度同p-Oka一致，见图8D。BAC的插入没有影响病毒本身的生长特应，而且BAC上载的GFP可以表达。故VZV-7D可以作为其他生物遗传物质的表达载体。 
序列表
<110>新泽西医学院北京万泰生物药业股份有限公司厦门大学
<120>ORF7缺陷型水痘病毒株、含有该毒株的疫苗及其应用
<130>IDC090012
<160>4
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gatttatcca tagttcaata cgttggaaag ccagtcaatc gctcttgttg gctagtgcgt    60
a                                                                    61
<210>2
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
aaacatacac cagaaacgtt tttagttttt atttcaatat tctgccagtg ttacaaccaa    60
<210>3
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gatttatcca tagttcaata cgttggaaag ccagtcaatc atgcagacgg tgtgtgccag    60
<210>4
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
aaacatacac cagaaacgtt tttagttttt atttcaatat ggatggatcc ataacttcgt    60

Claims (6)

1.水痘病毒ORF7全部或部分缺失、插入终止密码子、碱基取代等结构改变引起的功能丧失。
2.水痘缺陷性病毒7D研制方法：
a)通过BAC手段克隆水痘病毒DNA全序列，在通过细菌内重组获得ORF7缺失的水痘缺陷型病毒(7D-BAC)；
b)通过Cre酶的作用在Mewo细胞或MRC-5细胞中删除BAC，产生用于疫苗生产的VZV-7D株；
c)在水痘病毒ORF-7缺失基础上的联合缺失突变的水痘缺陷性病毒。
3.根据权利要求1所述的水痘缺陷型病毒7D制备的活疫苗：
a)预防水痘的7D活疫苗，
b)预防带状疱疹的7D活疫苗。
4.根据权利要求2所述的VZV-7D培养的细胞株包括
a)Mewo细胞、MRC-5细胞、2BS细胞、WI-38细胞和Vero细胞
b)但不仅限于a)所列的细胞株。
5.根据权利要求1所述的以7D为载体的生物制品：
a)外源基因插入位点为ORF7所在的位置；
b)外源基因插入位点为ORF7之外的位点；
c)插入的外源基因大小可以为10kb或更大的DNA片段；
d)插入的外源基因可以为荧光蛋白等基质蛋白；
e)插入的外源基因可以为HBsAg、HIV、HCV等病毒的衣壳蛋白；
f)插入的外源基因也可以为细菌的膜蛋白或鞭毛或菌毛蛋白等。
6.根据权利要求1所述的以7D为载体表达的生物活性物质：
a)所述的生物活性物质为用于诊断的蛋白；
b)所述的生物活性物质可以为预防水痘外的预防其他疾病的疫苗；
c)所述的生物活性物质可以为包括含预防水痘的其他治疗性生物原料。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113683704B (zh) * 2021-07-28 2023-05-30 安徽智飞龙科马生物制药有限公司 一种水痘-带状疱疹病毒r-gE融合蛋白、重组水痘-带状疱疹疫苗及其制备方法和应用
CN113755494B (zh) * 2021-08-11 2023-04-07 西北工业大学 一种抗水痘-带状疱疹病毒的siRNAs及其应用
CN113789326B (zh) * 2021-08-11 2023-04-07 西北工业大学 一种抗水痘-带状疱疹病毒的重组siRNAs及其生产方法和应用
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5341202B2 (zh) * 1974-03-12 1978-11-01
US4000256A (en) 1975-04-30 1976-12-28 Merck & Co., Inc. Varicella vaccine and process for its preparation
KR100350169B1 (ko) * 1992-06-04 2004-05-20 머크 앤드 캄파니 인코포레이티드 약독화된바리셀라조스터바이러스백신의제조방법,및이를위한세포의단층배양방법및조성물
JP3946045B2 (ja) * 2000-01-31 2007-07-18 財団法人阪大微生物病研究会 弱毒生水痘ワクチンの品質管理方法
AU2003295398A1 (en) * 2002-11-05 2004-06-07 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Safer attenuated virus vaccines with missing or diminished latency of infection
CA2558586A1 (en) * 2004-03-05 2005-09-15 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Recombinant varicella-zoster virus
WO2007060725A1 (ja) * 2005-11-24 2007-05-31 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University 組換え多価ワクチン
CN100513559C (zh) * 2006-05-29 2009-07-15 北京生物制品研究所 新的水痘病毒毒株、水痘减毒活疫苗及其制备方法
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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