JP3946045B2 - 弱毒生水痘ワクチンの品質管理方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は弱毒生水痘ワクチンの品質管理方法に関する。更に詳細には、水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡを塩基配列の解析に付し、特定の塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認することを特徴とする弱毒生水痘ワクチンの品質管理方法に関する。本発明の品質管理方法を用いると、弱毒生水痘ワクチンの有効成分となる弱毒水痘ウイルスの生水痘ワクチンとしての適格性を極めて正確に検定し、ワクチンの品質を管理することが可能となる。
【０００２】
【従来の技術】
衆知の通り、現行の弱毒生水痘ワクチンは、弱毒水痘ウイルス岡株（日本国特公昭53-41202号又は米国特許第3,985,615号）に由来のウイルスをシードに用いて製造され、世界の諸国で広く実用に供されている（Requirements for Varicella Vaccine (Live) Adopted 1984; Revised 1993: WHO Technical Report Series, No. 848, pp. 22-38, 1994）。また、ワクチンの安全性と有効性とを確保するため、ワクチン製造工程での継代によるウイルスの遺伝的変異を考慮し、製造承認された水痘シードウイルスの継代数の制限、即ち、シード承認時の継代数を０代としてそこから総継代数１０代以内のウイルスをワクチンに用いるとするシードロットシステムが制定されている。換言すれば、従来の弱毒生水痘ワクチンの品質管理及び品質保証は、各ワクチン製造者によるシードロットシステムの遵守に依存しているため、当業者が追跡検定できる方法によるものではない。
【０００３】
一方、水痘ワクチンの効果の追跡や市販後調査(PMS: Post-Marketing Surveillance)、また、疫学の観点から、自然感染による水痘患者から分離した水痘ウイルス新鮮野外株と上記岡株に由来のワクチン株との間のウイルス学的相違の解析が必要となり、免疫学や遺伝子工学等を駆使した解析が、既に種々試みられている。例えば、水痘ウイルス株間での遺伝子構造やＤＮＡ塩基配列の違い(Journal of Virology, 59, 660-668, 1986; Journal of General Virology，67, 1759-1816, 1986)、制限酵素Pst Iサイトの有無(Japanese Journal of Experimental Medicine, 59, 233-237, 1989)、ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)を用いるＲＦＬＰ(Restriction Fragment Length Polymorphism)に基づく判定(Journal of Virology, 66, 1016-1020, 1992)、上記Pst Iサイトの有無とＲＦＬＰとの組合わせ(Journal of Clinical Microbiology, 33, 658-660, 1995)等による試行が報告されている。しかし、これらはいずれも、新鮮野外株と岡株に由来のワクチン株とを鑑別するための条件を提起しているに過ぎず、信頼性に欠け、確定的ではない。更に、水痘ウイルスのgene 14領域を用いる水痘ウイルス岡株の同定方法（米国特許第6,093,535号）や、gene 62領域を用いる弱毒生水痘ワクチン用ウイルス株の同定方法（国際公開番号WO 00/50603）等も知られているが、いずれの技術も、水痘ウイルス岡株（強毒親株）、これより派生したワクチン株（弱毒岡株）、及び岡株以外の水痘ウイルス株の三者間の相違の検定を可能にしたものの、弱毒生水痘ワクチンの品質管理及び品質保証のための製剤基準としては必ずしも十分ではない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
現在、弱毒生水痘ワクチンの有効成分として用いる弱毒水痘ウイルスは、前述の通り、各ワクチン製造者がシードロットシステムを遵守するという約束によって品質が管理されている。換言すれば、第３者が追跡検定し、ワクチンの品質を評価および確認するための方法、例えば、シードウイルスやワクチンウイルスのゲノムＤＮＡの直接的ないしは定量的な遺伝子解析による品質管理は行われていないので、生ワクチン用の弱毒株の品質管理及び品質保証の精度は算出不能であり曖昧である。従って、品質管理及び品質保証の精度を高めることは、弱毒生水痘ワクチンの有効性・安全性・均質性を確保し保証する上で極めて重要である。しかし、上述の通り、未だその方法は確立されておらず、解決すべき急務の課題として残されていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
このような状況下にあって、本発明者らは、弱毒生水痘ワクチンの品質管理を極めて正確且つ定量的に行うための新規な方法を開発すべく鋭意研究を行った。即ち、本発明者らは、弱毒水痘ウイルス岡株の１２万塩基を超える全ゲノム塩基配列を決定し、得られた塩基配列を強毒株及び親岡株（強毒株）の全ゲノム塩基配列と比較し、弱毒水痘ウイルス岡株の有する遺伝子変異を同定した。その結果、ある水痘ウイルス株のゲノムＤＮＡに後記する特定の塩基が保存されているか否かを評価決定することによって、特定の塩基が保存されているウイルスが弱毒水痘ワクチンウイルスとして許容されるウイルス株であることを正確に検定することができることを知見した。本発明はこの知見に基いて完成されたものである。
【０００６】
したがって、本発明の１つの目的は、弱毒生水痘ワクチンの品質管理を行うための新規な方法を提供することである。
【０００７】
本発明の他の１つの目的は、上記の品質管理方法によって品質管理されている弱毒生水痘ワクチンを提供することである。
【０００８】
本発明の更に他の１つの目的は、上記の品質管理方法に用いられる方法で同定される、弱毒水痘ワクチンウイルスとして許容されるウイルス株を提供することである。
【０００９】
本発明の上記及びその他の諸目的、諸特徴ならびに諸利益は、添付の配列表及び図面を参照しながら述べる次の詳細な説明及び請求の範囲の記載から明らかになる。
【００１０】
配列表のフリーテキスト
配列番号３と４は、水痘ワクチンウイルスの第560番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーであり；
配列番号５と６は、水痘ワクチンウイルスの第5,745番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーであり；
配列番号７と８は、水痘ワクチンウイルスの第26,125番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーであり；
配列番号９と１０は、水痘ワクチンウイルスの第94,167番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーであり；
配列番号１１と１２は、水痘ワクチンウイルスの第105,356番塩基、第105,544番塩基、第124,353番塩基及び第124,541番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーであり；
配列番号１３と１４は、水痘ワクチンウイルスの第105,705番塩基、第106,262番塩基、第123,635番塩基及び第124,192番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーであり；
配列番号１５と１６は、水痘ワクチンウイルスの第107,136番塩基、第107,252番塩基、第122,645番塩基及び第122,761番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーであり；そして
配列番号１７と１８は、水痘ワクチンウイルスの第108,111番塩基及び第121,786番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーである。
【００１１】
先ず、本発明に関し、この明細書で用いる「用語」を次の（ａ）〜（ｇ）の通り定義する。
【００１２】
（ａ） ＶＺＶ： 水痘及び帯状疱疹の原因となるウイルスであり、屡々単に水痘ウイルスと呼ばれる水痘・帯状疱疹ウイルス(Varicella-Zoster Virus)の略語である。
【００１３】
（ｂ） 水痘ワクチンウイルス及び水痘ワクチン： 水痘ワクチンウイルスはワクチンの有効成分であり、弱毒化されている。水痘ワクチンはＶＺＶ感染又は該感染による発症の予防に有効なワクチン。
【００１４】
（ｃ） 弱毒岡株： 弱毒水痘ウイルス岡株（日本国特公昭53-41202号及び米国特許第3,985,615号参照)及びこの株に由来の弱毒水痘ウイルスを意味する。該弱毒岡株は、寄託番号ＶＲ−７９５として１９７５年３月１４日にＡＴＣＣに寄託されている。
【００１５】
（ｄ） 親岡株： 分離当初の野生（強毒）の水痘ウイルス岡株。
【００１６】
（ｅ） 品質管理： ワクチン等の有効性、安全性及び均質性を確保するために、原材料、製造工程途中の中間製品及び最終製品に対して各種試験あるいは検定を行い、ワクチン等としての適格性を確認かつ確保すること。弱毒生水痘ワクチンについては、現在、薬事法（昭和35年法律第145号）第42条第1項に基づく厚生省告示第217号「生物学的製剤基準」に定める「乾燥弱毒生水痘ワクチン」についての諸規定あるいは検定基準、また、ＷＨＯによる前述の“Requirements for Varicella Vaccine (Live)”に記載の規定に準拠して品質管理が行われている。
【００１７】
（ｆ）ＤＮＡ塩基配列の塩基番号： 本発明おいては、水痘ウイルスのＤＮＡ塩基配列の塩基番号は全て配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株の全長ゲノムＤＮＡの塩基配列（Journal of General Virology, 67, 1759-1816, 1986及び GenBank（National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894, USA）, Accession No. X04370）の塩基番号システムに従っている。尚、本発明においては、特に記載のない限り、塩基配列はセンス鎖の配列である。
【００１８】
（ｇ） ＤＮＡの変異： 弱毒岡株のゲノムＤＮＡの変異は、弱毒岡株と、Dumas株及び強毒親岡株との間で各ＤＮＡ塩基配列のホモロジー検索を行い、弱毒岡株において変異している塩基を同定した。例えば、「Dumas株の第5,745番塩基Ａ、及びこれに対応する親岡株塩基のＡが、弱毒岡株ではＧに変異している。この変異に伴い、アミノ酸がSerからProへ非同義置換している。」という形で表記している。
【００１９】
本発明によれば、弱毒生水痘ワクチンの正確な品質管理方法が提供される。
次に、本発明の理解を容易にするために、まず本発明の基本的特徴及び好ましい態様を列挙する。
１．水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡを塩基配列の解析に付し、以下の５塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認することを特徴とする弱毒生水痘ワクチンの品質管理方法。
第5,745番目のＧ、第105,356番目のＣ、第105,544番目のＧ、第106,262番目のＣ、及び第107,252番目のＣ（但し、塩基番号は配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡの塩基配列の塩基番号システムに従う）
【００２０】
２．以下のプライマーを用いるＲＦＬＰ法によって、該５塩基の保存を確認することを特徴とする前項１に記載の品質管理方法。
第5,745番目のＧの確認には配列番号５と６に記載のプライマーを１組として用い、第105,356番目のＣ及び第105,544番目のＧの確認には配列番号１１と１２に記載のプライマーを１組として用い、第106,262番目のＣの確認には配列番号１３と１４に記載のプライマーを１組として用い、第107,252番目のＣの確認には配列番号１５と１６に記載のプライマーを１組として用いる。
【００２１】
３．更に、以下の４塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認することを特徴とする前項１又は２に記載の品質管理方法。
第122,645番目のＧ、第123,635番目のＧ、第124,353番目のＣ、及び第124,541番目のＧ（但し、塩基番号は配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡの塩基配列の塩基番号システムに従う）。
【００２２】
４．以下のプライマーを用いるＲＦＬＰ法によって、該４塩基の保存を確認することを特徴とする前項３に記載の品質管理方法。
第124,353番目のＣ及び第124,541番目のＧの確認には配列番号１１と１２に記載のプライマーを１組として用い、第123,635番目のＧの確認には配列番号１３と１４に記載のプライマーを１組として用い、第122,645番目のＧの確認には配列番号１５と１６に記載のプライマーを１組として用いる。
【００２３】
５．更に、以下の４９塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認することを特徴とする前項１〜４のいずれかに記載の品質管理方法。
第560番目のＣ、第703番目のＹ、第763番目のＹ、第2,515番目のＹ、第10,900番目のＹ、第12,779番目Ｙ、第19,431番目のＹ、第26,125番目のＧ、第31,732番目のＹ、第38,036番目のＹ、第39,227番目のＫ、第58,595番目のＲ、第59,287番目のＲ、第64,067番目のＲ、第71,252番目のＹ、第82,225番目のＲ、第84,091番目のＲ、第87,280番目のＲ、第87,306番目のＹ、第89,734番目のＲ、第90,535番目のＲ、第94,167番目のＣ、第97,748番目のＲ、第97,796番目のＹ、第101,089番目のＲ、第105,169番目のＲ、第105,310番目のＲ、第105,705番目のＣ、第106,710番目のＲ、第107,136番目のＣ、第107,599番目のＲ、第107,797番目のＲ、第108,111番目のＣ、第108,838番目のＲ、第109,137番目のＲ、第109,200番目のＲ、第111,650番目のＲ、第118,247番目のＹ、第120,697番目のＹ、第120,760番目のＹ、第121,059番目のＹ、第121,786番目のＧ、第122,100番目のＹ、第122,298番目のＹ、第122,761番目のＧ、第123,187番目のＹ、第124,192番目のＧ、第124,587番目のＹ、及び第124,728番目のＹ（但し、塩基番号は配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡの塩基配列の塩基番号システムに従い、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、及びＫはＧ又はＴをそれぞれ意味する）。
【００２４】
６．以下のプライマーを用いるＲＦＬＰ法によって、該４９塩基のうち第560番目のＣ、第26,125番目のＧ、第94,167番目のＣ、第105,705番目のＣ、第107,136番目のＣ、第108,111番目のＣ、第121,786番目のＧ、第122,761番目のＧ及び第124,192番目のＧの保存を確認することを特徴とする前項５に記載の品質管理方法。
第560番目のＣの確認には配列番号３と４に記載のプライマーを１組として用い、第26,125番目のＧの確認には配列番号７と８に記載のプライマーを１組として用い、第94,167番目のＣの確認には配列番号９と１０に記載のプライマーを１組として用い、第105,705番目のＣ及び第124,192番目のＧの確認には配列番号１３と１４に記載のプライマーを１組として用い、第107,136番目のＣ及び第122,761番目のＧの確認には配列番号１５と１６に記載のプライマーを１組として用い、第108,111番目のＣ及び第121,786番目のＧの確認には配列番号１７と１８に記載のプライマーを１組として用いる。
【００２５】
７．更に、該水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡの下記に定義される２つのori領域中の欠失変異を確認することを特徴とする前項１〜６のいずれかに記載の品質管理方法。
該２つのori領域は、配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第110,087〜110,350番塩基及びアンチセンス鎖では第119,547〜119,810番塩基に対応する領域であり、該欠失変異は、該Dumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第110,219〜110,227番塩基の部分及びアンチセンス鎖では第119,670〜119,678番塩基の部分に起きており、各欠失変異は５’末端から３’末端方向にみてＡＴＡＴＡＴＡＴＡである部分の欠失である。
【００２６】
８．更に、該水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡの下記に定義されるＲ１の全領域の反復配列が５’末端から３’末端方向にみてａｂｂａｂｂａ’ｂｂｂ’ａｂａｂａｂｘ（但し、ａは塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡを表わし、ａ’は塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＴＧＡＣＧＡＣＧＡを表わし、ｂは塩基配列ＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡを表わし、ｂ’は塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡを表わし、ｘはＧＧＡを表わす。）であることを確認することを特徴とする前項１〜７のいずれかに記載の品質管理方法。
該Ｒ１の全領域は、配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡにおいて、第13,937〜14,242番塩基に対応する領域である。
【００２７】
９．更に、該水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡの下記に定義される２つのＲ４のそれぞれの全領域の各々の反復配列が、５’末端から３’末端方向にみてａａａａａａａａａａａａｘ（但し、ａは塩基配列ＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＴＡを表わし、ｘは塩基配列ＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧを表わす。）であることを確認することを特徴とする前項１〜８のいずれかに記載の品質管理方法。
該２つのＲ４のそれぞれの全領域は、配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第109,762〜109,907番塩基及びアンチセンス鎖では第119,990〜120,135番塩基に対応する領域である。
【００２８】
１０．前項１〜９のいずれかに記載の品質管理方法によって品質管理されている弱毒生水痘ワクチン。
【００２９】
１１．前項１〜９のいずれかに記載の品質管理方法に用いられる方法で同定される、弱毒水痘ワクチンウイルスとして許容されるウイルス株。
【００３０】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明者らは、本発明の品質管理方法を完成させる経緯において、配列番号２に示す弱毒岡株（寄託番号ＶＲ−７９５として１９７５年３月１４日にＡＴＣＣ（American Type Culture Collection; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA）に寄託されている。）のゲノムＤＮＡの全長塩基配列を初めて決定した。更に、得られた弱毒岡株ゲノムＤＮＡ塩基配列を用い、Dumas株、親岡株及び弱毒岡株の３株間相互のゲノムＤＮＡ全長塩基配列に関するホモロジー検索を行った。その結果、表１に示した弱毒岡株の有する塩基変異（Dumas株及び/又は親岡株と異なる塩基）を解明し、更に塩基変異を解析して同義置換（コードするアミノ酸が不変）及び非同義置換（コードするアミノ酸が置換される）、非コード領域（noncoding region）の変異（ncr変異）、終止コドン変異（オーカー/アンバー変異）、反復配列の反復数や配列サイズ並びにその配列順序の相違、及びori領域（倒置反復配列、図１参照）における変異を見出した。以下に詳細に説明するように、本発明者らの見出した弱毒岡株の有する変異は弱毒岡株を他の水痘ウイルス株、特に強毒株と区別する際に有用であり、従って弱毒水痘生ワクチンの品質管理に用いることができる。
【００３１】
表１に示した弱毒岡株の有する塩基変異の中で重要な変異はＸＸＹ型とＸＸ（Ｘ／Ｙ）型の変異である。ＸＸＹ型変異とは、Dumas株の塩基と対応する親岡株の塩基が同じである（即ち、共に“Ｘ”である）が、対応する弱毒岡株の塩基は変異している（即ち、“Ｙ”に変異している）変異、即ち、弱毒株に固有の変異である。ＸＸ（Ｘ／Ｙ）型変異とは、Dumas株と親岡株では塩基が同じである（即ち、共に“Ｘ”である）が、弱毒岡株では変異しているものと変異していないものの両方が混在している。（即ち、変異していない“Ｘ”又は変異した“Ｙ”である）。弱毒岡株のゲノムには、ＸＸＹ型の変異が１８塩基、ＸＸ（Ｘ／Ｙ）型の変異が４０塩基存在した。この合計５８塩基の変異のうち、コード領域における変異は４９塩基、非コード領域における変異は８塩基、そして、終止コドンの変異が１塩基であった。更にコード領域における変異のうちアミノ酸の非同義置換を伴う変異が２９塩基存在し、同義置換を伴う変異が２０塩基であった。更に詳細に検討すると、ＸＸＹ型変異である１８塩基のうち、アミノ酸の非同義置換を伴う変異は９塩基であり、同義置換を伴う変異は８塩基であり、非コード領域の変異が１塩基であった。
【００３２】
ＸＸＹ型であり、且つアミノ酸の非同義置換を伴う弱毒岡株に固有の変異は、gene 6の第5,745番塩基のＧ；gene 62の第105,356番塩基のＣ、第105,544番塩基のＧ、第106,262番塩基のＣと第107,252番塩基のＣ；及びgene 71の第122,645番塩基のＧ、第123,635番塩基のＧ、第124,353番塩基のＣと第124,541番塩基のＧである。これらの弱毒岡株に固有の変異は水痘ウイルスの弱毒化や安全性に深くかかわる塩基だと考えられるため、非常に重要である。上記した９塩基のうち４塩基はgene 62に存在し、４塩基はgene 71に存在するが、gene 62とgene 71は互いに倒置反復配列の関係にあるため（図１参照）、本発明においては、水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡを塩基配列の解析に付し、上記のgene 6の１塩基及びgene 62の４塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認することによって弱毒生水痘ワクチンの品質管理を行う。又、品質管理の精度を向上させるためには、更に、上記のgene 71の４塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認することが好ましい。
【００３３】
更に本発明においては、水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡにおいて弱毒岡株に固有の５８塩基すべてが変異することなく保存されていることを確認することが好ましい。具体的には、上記のＸＸＹ型であり、且つアミノ酸の非同義置換を伴う弱毒岡株に固有の９塩基の他に、以下の４９塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認する：
第560番目のＣ、第703番目のＹ、第763番目のＹ、第2,515番目のＹ、第10,900番目のＹ、第12,779番目Ｙ、第19,431番目のＹ、第26,125番目のＧ、第31,732番目のＹ、第38,036番目のＹ、第39,227番目のＫ、第58,595番目のＲ、第59,287番目のＲ、第64,067番目のＲ、第71,252番目のＹ、第82,225番目のＲ、第84,091番目のＲ、第87,280番目のＲ、第87,306番目のＹ、第89,734番目のＲ、第90,535番目のＲ、第94,167番目のＣ、第97,748番目のＲ、第97,796番目のＹ、第101,089番目のＲ、第105,169番目のＲ、第105,310番目のＲ、第105,705番目のＣ、第106,710番目のＲ、第107,136番目のＣ、第107,599番目のＲ、第107,797番目のＲ、第108,111番目のＣ、第108,838番目のＲ、第109,137番目のＲ、第109,200番目のＲ、第111,650番目のＲ、第118,247番目のＹ、第120,697番目のＹ、第120,760番目のＹ、第121,059番目のＹ、第121,786番目のＧ、第122,100番目のＹ、第122,298番目のＹ、第122,761番目のＧ、第123,187番目のＹ、第124,192番目のＧ、第124,587番目のＹ、及び第124,728番目のＹ（但し、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、及びＫはＧ又はＴをそれぞれ意味する）。
【００３４】
本発明者らの行ったDumas株、親岡株及び弱毒岡株の３株間相互のゲノムＤＮＡ全長塩基配列に関するホモロジー検索によって、弱毒岡株に固有の変異として、上記した５８塩基の変異の他にも、ori領域内の欠失変異、gene 11内の反復領域Ｒ１の変異、及び非コード領域内の反復領域Ｒ４の変異が確認された。
【００３５】
水痘ウイルスゲノムにおいては、倒置反復配列の関係にある２つのori領域が存在する（図１参照）。これらのori領域は、Dumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第110,087〜110,350番塩基及びアンチセンス鎖では第119,547〜119,810番塩基に対応する領域である。表４にセンス鎖の塩基配列を示した。表４からも明らかなように、弱毒岡株の有するori領域の欠失変異は、Dumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第110,214〜110,227番塩基の部分及びアンチセンス鎖では第119,670〜119,683番塩基の部分に起きており、各欠失変異は５’末端から３’末端方向にみて塩基配列ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡである部分の欠失である。本発明においては、この変異の存在を更に確認することが好ましい。具体的には、センス鎖では第110,219〜110,227番塩基及びアンチセンス鎖では第119,670〜119,678番塩基に相当するＡＴＡＴＡＴＡＴＡである部分の欠失の有無によって確認することができる。
【００３６】
gene 11内の反復領域Ｒ１は、Dumas株のゲノムＤＮＡの第13,937〜14,242番塩基に対応する領域であり、表５にその塩基配列を示した。表５から明らかなように、弱毒岡株のＲ１領域の反復配列はDumas株の反復配列とも、親岡株の反復配列とも異なる。従って、品質管理を行う際に、更に、水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡのＲ１領域の塩基配列が弱毒岡株のＲ１領域の塩基配列と同じであることを確認することが好ましい。具体的には、水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡのＲ１の全領域の反復配列が５’末端から３’末端方向にみてａｂｂａｂｂａ’ｂｂｂ’ａｂａｂａｂｘ（但し、ａは塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡを表わし、ａ’は塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＴＧＡＣＧＡＣＧＡを表わし、ｂは塩基配列ＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡを表わし、ｂ’は塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡを表わし、ｘはＧＧＡを表わす。）であることを確認する。
【００３７】
水痘ウイルスゲノムにおいては、非コード領域内に、倒置反復配列の関係にある２つの反復領域Ｒ４が存在する（図１参照）。これらのＲ４領域は、Dumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第109,762〜109,907番塩基及びアンチセンス鎖では第119,990〜120,135番塩基に対応する領域である。表７にＲ４領域の５’末端から３’末端方向にみた塩基配列を示した。表７からも明らかなように、弱毒岡株のＲ４領域の反復配列はDumas株の反復配列とも、親岡株の反復配列とも異なる。従って、品質管理を行う際に、更に、水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡのＲ４領域の塩基配列が弱毒岡株のＲ４領域の塩基配列と同じであることを確認することが好ましい。具体的には、水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡのＲ４の全領域の反復配列が５’末端から３’末端方向にみてａａａａａａａａａａａａｘ（但し、ａは塩基配列ＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＴＡを表わし、ｘは塩基配列ＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧを表わす。）であることを確認する。
【００３８】
又、gene 22内の反復領域Ｒ３においても、表６に示したような変異が確認された。しかし、表６から明らかなように、弱毒岡株及び親岡株のＲ３領域の反復配列には多様なばらつきが存在することが判明した。
【００３９】
本発明の方法は、上記した弱毒岡株に固有の塩基変異に基づいて完成されたものである。従って、本発明の品質管理方法に用いられる方法は、弱毒生水痘ワクチンの品質管理（即ち、ワクチン用シードウイルス、ワクチンの原料となる弱毒水痘ウイルスや生ワクチンが変異しているか否かの検出）のみならず、弱毒生水痘ワクチン（水痘ワクチンの有効成分となるウイルス）として許容されるウイルス株の同定や、強毒株（親岡株や自然野外株）等の解析にも用いることができる。更に、本発明の方法は、予防接種効果の追跡調査並びに水痘及び帯状疱疹の疫学についての研究における極めて正確かつ有用な技術を提供し、水痘及び帯状疱疹への予防対策に的確な手段を与えることができる。
【００４０】
以下、本発明の品質管理方法を実施するための具体的な方法について説明する。
水痘ウイルスサンプルのゲノムＤＮＡの調製： 本発明の品質管理方法を実施する際に用いる水痘ウイルスサンプルとしては、弱毒生水痘ワクチンの有効成分として用いるウイルス浮遊液やワクチン原液、任意のＶＺＶを培養したウイルス浮遊液、自然感染した水痘患者の水疱液等を用いることができる。ゲノムＤＮＡを得るためには、上記ウイルスサンプルから直接常法により抽出・精製することができる。又、ウイルスサンプルとして用いるＶＺＶを細胞に接種し、ＶＺＶを培養した感染細胞から常法により抽出・精製することもできる（ＤＮＡの抽出・精製方法については、”Current Protocol in Molecular Biology”, Volume 1, Chapter 2, 2.0.1-2.6.12, John Wiley & Sons, Inc., 1987-2000（加除式）に詳述されている）。尚、ＶＺＶの培養には、例えば、ＷＩ−３８細胞やＭＲＣ−５細胞等を用いることができる。また、新鮮野外株や流行株ウイルスを分離・増幅・調製するための材料としては、自然感染し、発症後３日以内の水痘患者から採取した水疱液の使用が望ましい。
【００４１】
ＰＣＲプライマーの調製： 任意のＶＺＶゲノムＤＮＡの塩基配列の増幅は、ＰＣＲ法によって行うことができる。初めに、増幅しようとする目的領域のセンス鎖及びアンチセンス鎖の各５’末端側の連続した約１５〜３０塩基からなるポリヌクレオチドをそれぞれＤＮＡ合成装置で合成し、１組のＰＣＲプライマーとする。プライマーをデザインするにあたっては、配列番号２に記載した弱毒水痘ウイルス岡株の全長ゲノムＤＮＡ配列や「従来技術」の項で前述した特許公報（米国特許第6,093,535号や国際公開公報WO 00/50603）などを参照することができる。
【００４２】
ＰＣＲ産物の塩基配列の決定： 実験操作の省力化を図るには、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製することなく、ＰＣＲ産物のダイレクトＤＮＡシークエンス法を用いることが好ましい（この方法は、“Current Protocol in Molecular Biology”, Volume 3, Chapter 15, 15.2.1-15.2.11，同前に詳述されている）。尚、その際の塩基配列の決定は、常法、例えば、Dideoxy法や、Cycle Sequence Kit（日本国、宝酒造社製）、DNA Sequencing Kit（米国、Perkin Elmer Applied Biosystems社製）等を用いて行うことができる。
【００４３】
ＤＮＡ塩基配列のホモロジー検索： ＤＮＡ塩基配列のホモロジー検索は市販の遺伝情報処理ソフトウェアを用いて行うことができる。例えば、GENETYX-WIN（ver. 3.1）（日本国、ソフトウェア開発（株）製）、DNASIS（ver. 3.7）（日本国、日立ソフトウェア（株）製）、FASTA（http://www.ddjb.nig.ac.jp/）、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を用いることができる。ホモロジー検索によって水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡに本明細書に開示した弱毒岡株に固有の塩基配列が存在するか否かを確認することができる。
【００４４】
ＲＦＬＰ法による塩基変異の確認： 上記のようにウイルスサンプルのゲノムＤＮＡ（全長又は部分）の塩基配列を決定してホモロジー検索を行う他に、弱毒岡株に固有の塩基が変異を受けることなく保存されていることをＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法で確認することもできる。具体的には、変異を確認したい領域のセンス鎖及びアンチセンス鎖の各５’末端側の連続した約１５〜３０塩基からなるポリヌクレオチドをそれぞれＤＮＡ合成装置により合成して１組のＰＣＲプライマーとする。この１組を同時に使用して目的の領域を増幅し、得られたサンプルＤＮＡを制限酵素で消化した後、アガロースゲル電気泳動にかけ、検出されるＤＮＡ断片のサイズの違いに基づいて変異を判定することができる。本発明の品質管理方法を実施する際には、ホモロジー検索よりも簡便なＲＦＬＰ法を行うことが好ましい。尚、ＸＸＹ型であり、且つアミノ酸の非同義置換を伴う弱毒岡株に固有の９塩基（第5,745番目のＧ、第105,356番目のＣ、第105,544番目のＧ、第106,262番目のＣ、第107,252番目のＣ、第122,645番目のＧ、第123,635番目のＧ、第124,353番目のＣ及び第124,541番目のＧ）及びその他の変異である４９塩基のうち、第560番目のＣ、第26,125番目のＧ、第94,167番目のＣ、第105,705番目のＣ、第107,136番目のＣ、第108,111番目のＣ、第121,786番目のＧ、第122,761番目のＧ及び第124,192番目のＧについては、表８に記載の８組のプライマー（配列番号３〜１８の塩基配列）を用いるＲＦＬＰ法によって変異の有無を確認することができる。表８のプライマーを用いて得られるＰＣＲ産物の制限酵素サイトとその各断片について、表９にまとめた。例えば、gene 6の変異（弱毒岡株のgene 6の第5,745塩基のＧ）は、制限酵素Alu Iサイトの有無で検出することができる。具体的には、表８に示すプライマー01-N12と01-R13とをペアで用いるＰＣＲで水痘ワクチンウイルスサンプルゲノムＤＮＡの第5,372〜6,134番塩基である763 bpのＤＮＡ断片を増幅し、Alu Iで消化した後、アガロースゲル電気泳動にかける。強毒株のＰＣＲ産物の場合には、Alu Iで170 bp、205 bp及び388 bpの３断片に開裂するのに対し、弱毒岡株のそれは170 bpと593 bpの２断片に開裂するので、水痘ワクチンウイルスサンプルから増幅したＤＮＡ断片の開裂パターンから水痘ワクチンウイルスサンプルがワクチン株として許容されうるウイルスであるか否かを判断することができる。
【００４５】
本発明の品質管理方法を実施する際には、ＸＸＹ型であり、且つアミノ酸の非同義置換を伴う弱毒岡株に固有の９塩基について、以下のプライマーを用いるＲＦＬＰ法によって確認することが好ましい。第5,745番目のＧの確認には配列番号５と６に記載のプライマーを１組として用い、第105,356番目のＣ、第105,544番目のＧ、第124,353番目のＣ及び第124,541番目のＧの確認には配列番号１１と１２に記載のプライマーを１組として用い、第106,262番目のＣ及び第123,635番目のＧの確認には配列番号１３と１４に記載のプライマーを１組として用い、並びに第107,252番目のＣ及び第122,645番目のＧの確認には配列番号１５と１６に記載のプライマーを１組として用いる。尚、gene 62とgene 71は互いに倒置反復配列の関係にあるため（図１参照）、上記９塩基のうち少なくとも５塩基（gene 6の１塩基、及びgene 62の４塩基）についてＲＦＬＰ法によって確認することにより品質管理を行うことができる。
【００４６】
上記したように、弱毒岡株の全長ゲノムＤＮＡ配列（配列番号２）及び弱毒岡株に固有の塩基変異は本発明者らの研究によって初めて明らかになったものである。弱毒岡株に固有の塩基変異は、水痘ウイルスの弱毒化に重要な変異であると考えられることから、ＶＺＶ野生株や流行株などの強毒株のゲノムＤＮＡに塩基置換を導入したり、強毒株にアミノ酸変異を誘導することによって弱毒株を作製することができる。このような塩基及びアミノ酸変異の誘導に関する遺伝子工学については、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90(15), 7376-7380, 1998に記載の方法を採用することができる。具体的には、上記した弱毒岡株に固有の５８塩基の変異を指標として強毒株などに変異を導入することが可能であり、特にアミノ酸の非同義置換を伴う９塩基の置換が有用である。また、gene 62とgene 71が互いに倒置反復配列の関係にあることを考慮すると（図１参照）、上記置換のうち少なくともgene 6の変異とgene 62又はgene 71の変異からなる５塩基の置換が特に重要であると考えられる。
【００４７】
【発明の実施の形態】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００４８】
【実施例１】
弱毒岡株（弱毒ワクチン株）及びその親株（親岡株；弱毒化していないので強毒）をそれぞれＭＲＣ−５細胞に接種して培養した感染細胞を得た。得られた感染細胞から、各水痘ウイルスゲノムＤＮＡをフェノール及びクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、更にエタノール沈殿により精製し、ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡを鋳型とし、合計８８種（４４組）の合成プライマーを用いて各ウイルス株の全長ゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物を調製した。次に各ＰＣＲ産物の塩基配列を５２０種の合成プライマーを用いたダイレクトＤＮＡシークエンス法により決定した。尚、これにはDNA Sequencing Kit（米国、Perkin Elmer Applied Biosystems社製）を用いた。得られた弱毒岡株及び親岡株の各全長ゲノムＤＮＡ配列につき、配列番号１に記載のDumas株（強毒）の全長ゲノムＤＮＡ配列を基準としてホモロジー検索を行った。ホモロジー検索にはDNASIS（version 3.7）（日本国、日立ソフトウェア（株）製）を用いた。ホモロジー検索によって明らかとなった結果を表１〜７にまとめた。
【００４９】
表１に、Dumas株−親岡株−弱毒岡株の３株間において互いに塩基の変異が検出された塩基番号、遺伝子番号、塩基の変異、及びその変異に伴うアミノ酸変異をそれぞれ列記した。尚、この表において、Ｙはピリミジン塩基（即ち、Ｃ又はＴ）、Ｒはプリン塩基（即ち、Ａ又はＧ）、ＫはＧ又はＴ、（ncr）は非コード領域、括弧内のアルファベット（例えば（Ｗ））は１文字アミノ酸記号、(och)はオーカー（ochre）、(amb)はアンバー（amber）、（Ｗ／Ｒ）はトリプトファン（Ｗ）又はアルギニン（Ｒ）、及び(del)は欠失をそれぞれ意味する。
【００５０】
表２に、表１に記載の変異から、親岡株−弱毒岡株の２株間において変異が検出された遺伝子番号、塩基番号、塩基の変異、及びその変異に伴うアミノ酸変異をそれぞれ抽出して列記した。尚、この表において、Ｘ／Ｙは、Ｘ又はＹを意味し、塩基の隣の（ ）にその塩基がコードするアミノ酸を３文字記号で記載した（尚、塩基が非コード領域のものの場合にはncrと記載した）。表中のその他の略語については、表１と同じである。
【００５１】
表３は、表１及び表２に記載した塩基変異を変異型に基づいてまとめた表であり、変異型とその件数、及び上記変異の内訳（即ち、ncr変異、終止コドン(och/amb)変異、アミノ酸の同義置換及び非同義置換、並びに欠失（あるいは付加））とそれぞれの件数を示す。
【００５２】
以下に表１〜３に基づく知見について説明する。
弱毒岡株の全長ゲノムＤＮＡ配列において、親岡株の全長ＤＮＡ配列との比較によって検出された主な塩基とアミノ酸の変異のうち、次の（ａ）〜（ｆ）に記載のものが弱毒生水痘ワクチンの品質管理に有用かつ重要であるとことが判明した。
【００５３】
（ａ）主な塩基変異の型は、ＸＸＹ型が１８例、ＸＸ（Ｘ／Ｙ）型が４０例の合計５８例であった。
（ｂ）上記５８例のうち、コード領域における変異は４９例、非コード領域における変異は８例、そして、終止コドンの変異が１例であった。
（ｃ）コード領域における前記変異４９例の内訳は、アミノ酸の非同義置換を伴う変異が２９例、同義置換を伴う変異が２０例であった。
（ｄ）ＸＸＹ型変異１８例のうち、アミノ酸の非同義置換を伴う変異が９例、同義置換を伴う変異が８例、及び非コード領域の変異が１例であった。
【００５４】
（ｅ）ＸＸＹ型変異の上記非同義置換を伴う変異９例、即ち、gene 6の第5,745塩基Ｇ、gene 62の第105,356番塩基Ｃ、第105,544番塩基Ｇ、第106,262番塩基Ｃ、及び第107,252番塩基Ｃ、並びにgene 71の第122,645番塩基Ｇ、第123,635番塩基Ｇ、第124,353番塩基Ｃ、及び第124,541番塩基Ｇが、生ワクチンの有効成分としてのウイルス株の弱毒性あるいは安全性の指標となり、従ってワクチンの品質管理に有用かつ重要であることが判明した。尚、gene 62とgene 71は互いに倒置反復配列の関係にある（図１参照）。
【００５５】
（ｆ）ＸＸ(Ｘ/Ｙ)型変異、即ち、ワクチン株におけるＸ又はＹの混在型変異は４０例であった。この変異は、第106,710番塩基を除き、弱毒岡株ウイルスを実験的に連続継代（５代、１０代、１７代等）したところ、その継代数の増加に伴いＹの検出頻度が高まり（Ｘ/ＹからＹへ移行し）、ＸＸＹ型に収束するという傾向が見られた。換言すれば、ウイルス継代に伴い、ＸとＹの混在量比（ｘ/ｙ）が減少するので、上記現象は、ｘ/ｙの定量からシードロットシステムにおけるシードウイルスの継代数の推定が可能であると考えられる。尚、これ等の変異のうち２０例は、アミノ酸の非同義置換を伴う変異へ収束する変異であった。残りの変異は、同義置換を伴う変異が１２例、終止コドンの変異（具体的には、オーカー/アンバー混在型から継代によるアンバー変異への収束）が１例、非コード領域の変異が７例であった。
【００５６】
【表１】
【００５７】
【表２】
【００５８】
【表３】
【００５９】
表４は、Dumas株−親岡株−弱毒岡株の３株間における、センス鎖のori領域の塩基配列の相違を示す。尚、この表において、“−”は欠失を意味する。
弱毒岡株のori領域においては、配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第110,214〜110,227番塩基及びアンチセンス鎖では第119,670〜119,683番塩基に相当する領域であり、５’末端から３’末端方向にみてＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡである配列が欠失している。従って、親岡株の配列との相違を考慮すると、その３’末側の配列、ＡＴＡＴＡＴＡＴＡの欠失がワクチンの品質管理に有用であることが明らかとなった。
【００６０】
【表４】
【００６１】
表５は、Dumas株−親岡株−弱毒岡株の３株間のgene 11内の反復領域Ｒ１の５’末端から３’末端方向にみた配列の相違を示す。
【００６２】
表６は、Dumas株−親岡株−弱毒岡株の３株間のgene 22内の反復領域Ｒ３の５’末端から３’末端方向にみた配列の相違を示す。
【００６３】
表７は、Dumas株−親岡株−弱毒岡株の３株間の反復領域Ｒ４の５’末端から３’末端方向にみた配列の相違を示す。
【００６４】
表５から明らかなように、Ｒ１の全領域の反復配列は、弱毒岡株と親岡株及びDumas株の３株間でそれぞれ異なることが判明した。同様に、Ｒ４の全領域の反復配列も、弱毒岡株と親岡株及びDumas株の３株間でそれぞれ異なることが判明した。従って、Ｒ１領域の反復配列ａｂｂａｂｂａ’ｂｂｂ’ａｂａｂａｂｘ（但し、ａは塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡを表わし、ａ’は塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＴＧＡＣＧＡＣＧＡを表わし、ｂは塩基配列ＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡを表わし、ｂ’は塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡを表わし、ｘはＧＧＡを表わす。）及びＲ４領域の反復配列ａａａａａａａａａａａａｘ（但し、ａは塩基配列ＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＴＡを表わし、ｘは塩基配列ＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧを表わす。）は弱毒岡株に固有の配列であり、弱毒生水痘ワクチンの品質管理に有用である。
【００６５】
また、表６に記載したgene 22内の反復領域Ｒ３の配列については、弱毒岡株及び親岡株のクローンによって配列が異なり、弱毒岡株に固有の配列は見出されなかった。
【００６６】
【表５】
【００６７】
【表６】
【００６８】
【表７】
【００６９】
【実施例２】
実施例１と同様にして弱毒岡株、親岡株、及び河口株（水痘ウイルス野外株）の各ゲノムＤＮＡを調製した。次に表８に記載したプライマーのうち、01-N12（配列番号５）と01-R13（配列番号６）とを用いて、gene 6の一部に相当する領域（Dumas株の第5,372〜6,134番塩基に相当する領域）を増幅した。得られたＰＣＲ産物（763 bp）について、制限酵素Alu I処理によって得られる断片の相違をＲＦＬＰ法で解析した。具体的には、弱毒岡株、親岡株及び河口株の各ＰＣＲ産物を制限酵素Alu Iで消化し、得られたＤＮＡ断片を４．０％(w/v) アガロースゲル電気泳動に付してサイズを調べた。
【００７０】
弱毒岡株では170 bpと593 bpの２断片が検出された。他方、親岡株及び河口株では共に170 bp、205 bp及び388 bpの３断片が検出された。従って、弱毒岡株では、親岡株と野外株の有する、205 bpと388 bpの２断片の間にあるAlu Iサイトが欠失していることが判明した。従って、強毒株のgene 6に位置する第5,745塩基Ａが、弱毒岡株では変異していることが、Alu Iサイトの欠失によって確認できることが明らかとなった。
【００７１】
【実施例３】
水痘由来の流行株及び帯状疱疹由来の流行株からなる合計５４株について、実施例２と同様に制限酵素Alu I処理によって得られる断片の相違をＲＦＬＰ法で解析した。その結果、これらの流行株では全て170 bp、205 bp及び388 bpの３断片が検出され、実施例２に記載の親岡株と同一であった。
【００７２】
【実施例４】
表８に記載したプライマー（配列番号３〜６及び９〜１８）、及び表９に記載の制限酵素Nla III、Alu I、BstX I、SfaN I、Acc II、Sac II、Sma I、BssH II並びにNae I、又はBsr Iを用いて実施例２と同様にＲＦＬＰ法を行った。具体的には、実施例１と同様にして弱毒岡株、親岡株、及び河口株の各ゲノムＤＮＡを調製した。次に表８に記載したプライマーを、表９に記載した組み合わせで用いてゲノムＤＮＡの特定の領域を増幅し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動に付した。結果を図２に示す。更に、ＲＦＬＰ法に用いた制限酵素とその切断断片のサイズを表９にまとめた。
【００７３】
図２及び表９から明らかなように、いずれの条件で行ったＲＦＬＰ法においても、弱毒岡株と、親岡株及び河口株では制限酵素処理によって得られる断片の数及びサイズが異なることが判明した。従って、弱毒岡株の第560番目のＣ、第5,745番目のＧ、第94,167番目のＣ、第105,356番目のＣ（第124,541番目のＧ）、第105,544番目のＧ（第124,353番目のＣ）、第105,705番目のＣ（第124,192番目のＧ）、第106,262番目のＣ（第123,635番目のＧ）、第107,136番目のＣ（第122,761番目のＧ）、第107,252番目のＣ（第122,645番目のＧ）、及び第108,111番目のＣ（第121,786番目のＧ）については、ＲＦＬＰ法を行うことでゲノムの塩基配列を決定せずにこれらの塩基の変異を確認できることが明らかとなった。
【００７４】
【表８】
【００７５】
【表９】
【００７６】
【発明の効果】
本発明の品質管理方法は、弱毒生水痘ワクチンの安全性、有効性、及び均質性についての品質管理と品質保証を極めて高い精度で行うことを可能にする。更に本発明は、予防接種効果の追跡調査並びに水痘及び帯状疱疹の疫学研究における極めて正確かつ有用な技術を提供することができ、これ等を促進かつ発展させることができる。ひいては、水痘及び帯状疱疹への予防対策に的確な手段をもたらし、人類の保健に多大に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 水痘ウイルス岡株の遺伝子地図であり、各遺伝子の番号と向きを示す。また、弱毒岡株と親岡株との間の変異を以下のように表わす。
ゲノムの長さは２０ｋｂ毎に表示している。Ｒ１〜Ｒ４は反復配列を示す。Oriはori領域を示す。ＴＲＬはターミナル・リピート・ロング（Terminal Repeat Long）、ＵＬはユニーク・ロング（Unique Long）、ＩＲＬはインターナル・リピート・ロング（Internal Repeat Long）、ＩＲＳはインターナル・リピート・ショート（Internal Repeat Short）、ＵＳはユニーク・ショート（Unique Short）、及びＴＲＳはターミナル・リピート・ショート（Terminal Repeat Short）をそれぞれ意味する。尚、gene 62〜gene 64とgene 69〜gene 71の両塩基配列は対称性（倒置反復配列）を示す。
【図２】 実施例４におけるＲＦＬＰの結果を示す電気泳動写真であって、ＰＣＲ産物の処理に用いた制限酵素は以下のとおりである。図２（ａ）はNla III、図２（ｂ）はAlu I、図２（ｃ）はBstX I、図２（ｄ）はSfaN I、図２（ｅ）はAcc II、図２（ｆ）はSac II、図２（ｇ）はSma I、図２（ｈ）はBssH II及びNae I、図２（ｉ）はBsr Iである。Ｖは弱毒岡株、Ｐは親岡株、Ｋは河口株を示す。
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は弱毒生水痘ワクチンの品質管理方法に関する。更に詳細には、水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡを塩基配列の解析に付し、特定の塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認することを特徴とする弱毒生水痘ワクチンの品質管理方法に関する。本発明の品質管理方法を用いると、弱毒生水痘ワクチンの有効成分となる弱毒水痘ウイルスの生水痘ワクチンとしての適格性を極めて正確に検定し、ワクチンの品質を管理することが可能となる。
【０００２】
【従来の技術】
衆知の通り、現行の弱毒生水痘ワクチンは、弱毒水痘ウイルス岡株（日本国特公昭53-41202号又は米国特許第3,985,615号）に由来のウイルスをシードに用いて製造され、世界の諸国で広く実用に供されている（Requirements for Varicella Vaccine (Live) Adopted 1984; Revised 1993: WHO Technical Report Series, No. 848, pp. 22-38, 1994）。また、ワクチンの安全性と有効性とを確保するため、ワクチン製造工程での継代によるウイルスの遺伝的変異を考慮し、製造承認された水痘シードウイルスの継代数の制限、即ち、シード承認時の継代数を０代としてそこから総継代数１０代以内のウイルスをワクチンに用いるとするシードロットシステムが制定されている。換言すれば、従来の弱毒生水痘ワクチンの品質管理及び品質保証は、各ワクチン製造者によるシードロットシステムの遵守に依存しているため、当業者が追跡検定できる方法によるものではない。
【０００３】
一方、水痘ワクチンの効果の追跡や市販後調査(PMS: Post-Marketing Surveillance)、また、疫学の観点から、自然感染による水痘患者から分離した水痘ウイルス新鮮野外株と上記岡株に由来のワクチン株との間のウイルス学的相違の解析が必要となり、免疫学や遺伝子工学等を駆使した解析が、既に種々試みられている。例えば、水痘ウイルス株間での遺伝子構造やＤＮＡ塩基配列の違い(Journal of Virology, 59, 660-668, 1986; Journal of General Virology，67, 1759-1816, 1986)、制限酵素Pst Iサイトの有無(Japanese Journal of Experimental Medicine, 59, 233-237, 1989)、ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)を用いるＲＦＬＰ(Restriction Fragment Length Polymorphism)に基づく判定(Journal of Virology, 66, 1016-1020, 1992)、上記Pst Iサイトの有無とＲＦＬＰとの組合わせ(Journal of Clinical Microbiology, 33, 658-660, 1995)等による試行が報告されている。しかし、これらはいずれも、新鮮野外株と岡株に由来のワクチン株とを鑑別するための条件を提起しているに過ぎず、信頼性に欠け、確定的ではない。更に、水痘ウイルスのgene 14領域を用いる水痘ウイルス岡株の同定方法（米国特許第6,093,535号）や、gene 62領域を用いる弱毒生水痘ワクチン用ウイルス株の同定方法（国際公開番号WO 00/50603）等も知られているが、いずれの技術も、水痘ウイルス岡株（強毒親株）、これより派生したワクチン株（弱毒岡株）、及び岡株以外の水痘ウイルス株の三者間の相違の検定を可能にしたものの、弱毒生水痘ワクチンの品質管理及び品質保証のための製剤基準としては必ずしも十分ではない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
現在、弱毒生水痘ワクチンの有効成分として用いる弱毒水痘ウイルスは、前述の通り、各ワクチン製造者がシードロットシステムを遵守するという約束によって品質が管理されている。換言すれば、第３者が追跡検定し、ワクチンの品質を評価および確認するための方法、例えば、シードウイルスやワクチンウイルスのゲノムＤＮＡの直接的ないしは定量的な遺伝子解析による品質管理は行われていないので、生ワクチン用の弱毒株の品質管理及び品質保証の精度は算出不能であり曖昧である。従って、品質管理及び品質保証の精度を高めることは、弱毒生水痘ワクチンの有効性・安全性・均質性を確保し保証する上で極めて重要である。しかし、上述の通り、未だその方法は確立されておらず、解決すべき急務の課題として残されていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
このような状況下にあって、本発明者らは、弱毒生水痘ワクチンの品質管理を極めて正確且つ定量的に行うための新規な方法を開発すべく鋭意研究を行った。即ち、本発明者らは、弱毒水痘ウイルス岡株の１２万塩基を超える全ゲノム塩基配列を決定し、得られた塩基配列を強毒株及び親岡株（強毒株）の全ゲノム塩基配列と比較し、弱毒水痘ウイルス岡株の有する遺伝子変異を同定した。その結果、ある水痘ウイルス株のゲノムＤＮＡに後記する特定の塩基が保存されているか否かを評価決定することによって、特定の塩基が保存されているウイルスが弱毒水痘ワクチンウイルスとして許容されるウイルス株であることを正確に検定することができることを知見した。本発明はこの知見に基いて完成されたものである。
【０００６】
したがって、本発明の１つの目的は、弱毒生水痘ワクチンの品質管理を行うための新規な方法を提供することである。
【０００７】
本発明の他の１つの目的は、上記の品質管理方法によって品質管理されている弱毒生水痘ワクチンを提供することである。
【０００８】
本発明の更に他の１つの目的は、上記の品質管理方法に用いられる方法で同定される、弱毒水痘ワクチンウイルスとして許容されるウイルス株を提供することである。
【０００９】
本発明の上記及びその他の諸目的、諸特徴ならびに諸利益は、添付の配列表及び図面を参照しながら述べる次の詳細な説明及び請求の範囲の記載から明らかになる。
【００１０】
配列表のフリーテキスト
配列番号３と４は、水痘ワクチンウイルスの第560番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーであり；
配列番号５と６は、水痘ワクチンウイルスの第5,745番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーであり；
配列番号７と８は、水痘ワクチンウイルスの第26,125番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーであり；
配列番号９と１０は、水痘ワクチンウイルスの第94,167番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーであり；
配列番号１１と１２は、水痘ワクチンウイルスの第105,356番塩基、第105,544番塩基、第124,353番塩基及び第124,541番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーであり；
配列番号１３と１４は、水痘ワクチンウイルスの第105,705番塩基、第106,262番塩基、第123,635番塩基及び第124,192番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーであり；
配列番号１５と１６は、水痘ワクチンウイルスの第107,136番塩基、第107,252番塩基、第122,645番塩基及び第122,761番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーであり；そして
配列番号１７と１８は、水痘ワクチンウイルスの第108,111番塩基及び第121,786番塩基の変異を検出する際に用いるＰＣＲプライマーである。
【００１１】
先ず、本発明に関し、この明細書で用いる「用語」を次の（ａ）〜（ｇ）の通り定義する。
【００１２】
（ａ） ＶＺＶ： 水痘及び帯状疱疹の原因となるウイルスであり、屡々単に水痘ウイルスと呼ばれる水痘・帯状疱疹ウイルス(Varicella-Zoster Virus)の略語である。
【００１３】
（ｂ） 水痘ワクチンウイルス及び水痘ワクチン： 水痘ワクチンウイルスはワクチンの有効成分であり、弱毒化されている。水痘ワクチンはＶＺＶ感染又は該感染による発症の予防に有効なワクチン。
【００１４】
（ｃ） 弱毒岡株： 弱毒水痘ウイルス岡株（日本国特公昭53-41202号及び米国特許第3,985,615号参照)及びこの株に由来の弱毒水痘ウイルスを意味する。該弱毒岡株は、寄託番号ＶＲ−７９５として１９７５年３月１４日にＡＴＣＣに寄託されている。
【００１５】
（ｄ） 親岡株： 分離当初の野生（強毒）の水痘ウイルス岡株。
【００１６】
（ｅ） 品質管理： ワクチン等の有効性、安全性及び均質性を確保するために、原材料、製造工程途中の中間製品及び最終製品に対して各種試験あるいは検定を行い、ワクチン等としての適格性を確認かつ確保すること。弱毒生水痘ワクチンについては、現在、薬事法（昭和35年法律第145号）第42条第1項に基づく厚生省告示第217号「生物学的製剤基準」に定める「乾燥弱毒生水痘ワクチン」についての諸規定あるいは検定基準、また、ＷＨＯによる前述の“Requirements for Varicella Vaccine (Live)”に記載の規定に準拠して品質管理が行われている。
【００１７】
（ｆ）ＤＮＡ塩基配列の塩基番号： 本発明おいては、水痘ウイルスのＤＮＡ塩基配列の塩基番号は全て配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株の全長ゲノムＤＮＡの塩基配列（Journal of General Virology, 67, 1759-1816, 1986及び GenBank（National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894, USA）, Accession No. X04370）の塩基番号システムに従っている。尚、本発明においては、特に記載のない限り、塩基配列はセンス鎖の配列である。
【００１８】
（ｇ） ＤＮＡの変異： 弱毒岡株のゲノムＤＮＡの変異は、弱毒岡株と、Dumas株及び強毒親岡株との間で各ＤＮＡ塩基配列のホモロジー検索を行い、弱毒岡株において変異している塩基を同定した。例えば、「Dumas株の第5,745番塩基Ａ、及びこれに対応する親岡株塩基のＡが、弱毒岡株ではＧに変異している。この変異に伴い、アミノ酸がSerからProへ非同義置換している。」という形で表記している。
【００１９】
本発明によれば、弱毒生水痘ワクチンの正確な品質管理方法が提供される。
次に、本発明の理解を容易にするために、まず本発明の基本的特徴及び好ましい態様を列挙する。
１．水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡを塩基配列の解析に付し、以下の５塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認することを特徴とする弱毒生水痘ワクチンの品質管理方法。
第5,745番目のＧ、第105,356番目のＣ、第105,544番目のＧ、第106,262番目のＣ、及び第107,252番目のＣ（但し、塩基番号は配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡの塩基配列の塩基番号システムに従う）
【００２０】
２．以下のプライマーを用いるＲＦＬＰ法によって、該５塩基の保存を確認することを特徴とする前項１に記載の品質管理方法。
第5,745番目のＧの確認には配列番号５と６に記載のプライマーを１組として用い、第105,356番目のＣ及び第105,544番目のＧの確認には配列番号１１と１２に記載のプライマーを１組として用い、第106,262番目のＣの確認には配列番号１３と１４に記載のプライマーを１組として用い、第107,252番目のＣの確認には配列番号１５と１６に記載のプライマーを１組として用いる。
【００２１】
３．更に、以下の４塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認することを特徴とする前項１又は２に記載の品質管理方法。
第122,645番目のＧ、第123,635番目のＧ、第124,353番目のＣ、及び第124,541番目のＧ（但し、塩基番号は配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡの塩基配列の塩基番号システムに従う）。
【００２２】
４．以下のプライマーを用いるＲＦＬＰ法によって、該４塩基の保存を確認することを特徴とする前項３に記載の品質管理方法。
第124,353番目のＣ及び第124,541番目のＧの確認には配列番号１１と１２に記載のプライマーを１組として用い、第123,635番目のＧの確認には配列番号１３と１４に記載のプライマーを１組として用い、第122,645番目のＧの確認には配列番号１５と１６に記載のプライマーを１組として用いる。
【００２３】
５．更に、以下の４９塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認することを特徴とする前項１〜４のいずれかに記載の品質管理方法。
第560番目のＣ、第703番目のＹ、第763番目のＹ、第2,515番目のＹ、第10,900番目のＹ、第12,779番目Ｙ、第19,431番目のＹ、第26,125番目のＧ、第31,732番目のＹ、第38,036番目のＹ、第39,227番目のＫ、第58,595番目のＲ、第59,287番目のＲ、第64,067番目のＲ、第71,252番目のＹ、第82,225番目のＲ、第84,091番目のＲ、第87,280番目のＲ、第87,306番目のＹ、第89,734番目のＲ、第90,535番目のＲ、第94,167番目のＣ、第97,748番目のＲ、第97,796番目のＹ、第101,089番目のＲ、第105,169番目のＲ、第105,310番目のＲ、第105,705番目のＣ、第106,710番目のＲ、第107,136番目のＣ、第107,599番目のＲ、第107,797番目のＲ、第108,111番目のＣ、第108,838番目のＲ、第109,137番目のＲ、第109,200番目のＲ、第111,650番目のＲ、第118,247番目のＹ、第120,697番目のＹ、第120,760番目のＹ、第121,059番目のＹ、第121,786番目のＧ、第122,100番目のＹ、第122,298番目のＹ、第122,761番目のＧ、第123,187番目のＹ、第124,192番目のＧ、第124,587番目のＹ、及び第124,728番目のＹ（但し、塩基番号は配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡの塩基配列の塩基番号システムに従い、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、及びＫはＧ又はＴをそれぞれ意味する）。
【００２４】
６．以下のプライマーを用いるＲＦＬＰ法によって、該４９塩基のうち第560番目のＣ、第26,125番目のＧ、第94,167番目のＣ、第105,705番目のＣ、第107,136番目のＣ、第108,111番目のＣ、第121,786番目のＧ、第122,761番目のＧ及び第124,192番目のＧの保存を確認することを特徴とする前項５に記載の品質管理方法。
第560番目のＣの確認には配列番号３と４に記載のプライマーを１組として用い、第26,125番目のＧの確認には配列番号７と８に記載のプライマーを１組として用い、第94,167番目のＣの確認には配列番号９と１０に記載のプライマーを１組として用い、第105,705番目のＣ及び第124,192番目のＧの確認には配列番号１３と１４に記載のプライマーを１組として用い、第107,136番目のＣ及び第122,761番目のＧの確認には配列番号１５と１６に記載のプライマーを１組として用い、第108,111番目のＣ及び第121,786番目のＧの確認には配列番号１７と１８に記載のプライマーを１組として用いる。
【００２５】
７．更に、該水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡの下記に定義される２つのori領域中の欠失変異を確認することを特徴とする前項１〜６のいずれかに記載の品質管理方法。
該２つのori領域は、配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第110,087〜110,350番塩基及びアンチセンス鎖では第119,547〜119,810番塩基に対応する領域であり、該欠失変異は、該Dumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第110,219〜110,227番塩基の部分及びアンチセンス鎖では第119,670〜119,678番塩基の部分に起きており、各欠失変異は５’末端から３’末端方向にみてＡＴＡＴＡＴＡＴＡである部分の欠失である。
【００２６】
８．更に、該水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡの下記に定義されるＲ１の全領域の反復配列が５’末端から３’末端方向にみてａｂｂａｂｂａ’ｂｂｂ’ａｂａｂａｂｘ（但し、ａは塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡを表わし、ａ’は塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＴＧＡＣＧＡＣＧＡを表わし、ｂは塩基配列ＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡを表わし、ｂ’は塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡを表わし、ｘはＧＧＡを表わす。）であることを確認することを特徴とする前項１〜７のいずれかに記載の品質管理方法。
該Ｒ１の全領域は、配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡにおいて、第13,937〜14,242番塩基に対応する領域である。
【００２７】
９．更に、該水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡの下記に定義される２つのＲ４のそれぞれの全領域の各々の反復配列が、５’末端から３’末端方向にみてａａａａａａａａａａａａｘ（但し、ａは塩基配列ＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＴＡを表わし、ｘは塩基配列ＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧを表わす。）であることを確認することを特徴とする前項１〜８のいずれかに記載の品質管理方法。
該２つのＲ４のそれぞれの全領域は、配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第109,762〜109,907番塩基及びアンチセンス鎖では第119,990〜120,135番塩基に対応する領域である。
【００２８】
１０．前項１〜９のいずれかに記載の品質管理方法によって品質管理されている弱毒生水痘ワクチン。
【００２９】
１１．前項１〜９のいずれかに記載の品質管理方法に用いられる方法で同定される、弱毒水痘ワクチンウイルスとして許容されるウイルス株。
【００３０】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明者らは、本発明の品質管理方法を完成させる経緯において、配列番号２に示す弱毒岡株（寄託番号ＶＲ−７９５として１９７５年３月１４日にＡＴＣＣ（American Type Culture Collection; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA）に寄託されている。）のゲノムＤＮＡの全長塩基配列を初めて決定した。更に、得られた弱毒岡株ゲノムＤＮＡ塩基配列を用い、Dumas株、親岡株及び弱毒岡株の３株間相互のゲノムＤＮＡ全長塩基配列に関するホモロジー検索を行った。その結果、表１に示した弱毒岡株の有する塩基変異（Dumas株及び/又は親岡株と異なる塩基）を解明し、更に塩基変異を解析して同義置換（コードするアミノ酸が不変）及び非同義置換（コードするアミノ酸が置換される）、非コード領域（noncoding region）の変異（ncr変異）、終止コドン変異（オーカー/アンバー変異）、反復配列の反復数や配列サイズ並びにその配列順序の相違、及びori領域（倒置反復配列、図１参照）における変異を見出した。以下に詳細に説明するように、本発明者らの見出した弱毒岡株の有する変異は弱毒岡株を他の水痘ウイルス株、特に強毒株と区別する際に有用であり、従って弱毒水痘生ワクチンの品質管理に用いることができる。
【００３１】
表１に示した弱毒岡株の有する塩基変異の中で重要な変異はＸＸＹ型とＸＸ（Ｘ／Ｙ）型の変異である。ＸＸＹ型変異とは、Dumas株の塩基と対応する親岡株の塩基が同じである（即ち、共に“Ｘ”である）が、対応する弱毒岡株の塩基は変異している（即ち、“Ｙ”に変異している）変異、即ち、弱毒株に固有の変異である。ＸＸ（Ｘ／Ｙ）型変異とは、Dumas株と親岡株では塩基が同じである（即ち、共に“Ｘ”である）が、弱毒岡株では変異しているものと変異していないものの両方が混在している。（即ち、変異していない“Ｘ”又は変異した“Ｙ”である）。弱毒岡株のゲノムには、ＸＸＹ型の変異が１８塩基、ＸＸ（Ｘ／Ｙ）型の変異が４０塩基存在した。この合計５８塩基の変異のうち、コード領域における変異は４９塩基、非コード領域における変異は８塩基、そして、終止コドンの変異が１塩基であった。更にコード領域における変異のうちアミノ酸の非同義置換を伴う変異が２９塩基存在し、同義置換を伴う変異が２０塩基であった。更に詳細に検討すると、ＸＸＹ型変異である１８塩基のうち、アミノ酸の非同義置換を伴う変異は９塩基であり、同義置換を伴う変異は８塩基であり、非コード領域の変異が１塩基であった。
【００３２】
ＸＸＹ型であり、且つアミノ酸の非同義置換を伴う弱毒岡株に固有の変異は、gene 6の第5,745番塩基のＧ；gene 62の第105,356番塩基のＣ、第105,544番塩基のＧ、第106,262番塩基のＣと第107,252番塩基のＣ；及びgene 71の第122,645番塩基のＧ、第123,635番塩基のＧ、第124,353番塩基のＣと第124,541番塩基のＧである。これらの弱毒岡株に固有の変異は水痘ウイルスの弱毒化や安全性に深くかかわる塩基だと考えられるため、非常に重要である。上記した９塩基のうち４塩基はgene 62に存在し、４塩基はgene 71に存在するが、gene 62とgene 71は互いに倒置反復配列の関係にあるため（図１参照）、本発明においては、水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡを塩基配列の解析に付し、上記のgene 6の１塩基及びgene 62の４塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認することによって弱毒生水痘ワクチンの品質管理を行う。又、品質管理の精度を向上させるためには、更に、上記のgene 71の４塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認することが好ましい。
【００３３】
更に本発明においては、水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡにおいて弱毒岡株に固有の５８塩基すべてが変異することなく保存されていることを確認することが好ましい。具体的には、上記のＸＸＹ型であり、且つアミノ酸の非同義置換を伴う弱毒岡株に固有の９塩基の他に、以下の４９塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認する：
第560番目のＣ、第703番目のＹ、第763番目のＹ、第2,515番目のＹ、第10,900番目のＹ、第12,779番目Ｙ、第19,431番目のＹ、第26,125番目のＧ、第31,732番目のＹ、第38,036番目のＹ、第39,227番目のＫ、第58,595番目のＲ、第59,287番目のＲ、第64,067番目のＲ、第71,252番目のＹ、第82,225番目のＲ、第84,091番目のＲ、第87,280番目のＲ、第87,306番目のＹ、第89,734番目のＲ、第90,535番目のＲ、第94,167番目のＣ、第97,748番目のＲ、第97,796番目のＹ、第101,089番目のＲ、第105,169番目のＲ、第105,310番目のＲ、第105,705番目のＣ、第106,710番目のＲ、第107,136番目のＣ、第107,599番目のＲ、第107,797番目のＲ、第108,111番目のＣ、第108,838番目のＲ、第109,137番目のＲ、第109,200番目のＲ、第111,650番目のＲ、第118,247番目のＹ、第120,697番目のＹ、第120,760番目のＹ、第121,059番目のＹ、第121,786番目のＧ、第122,100番目のＹ、第122,298番目のＹ、第122,761番目のＧ、第123,187番目のＹ、第124,192番目のＧ、第124,587番目のＹ、及び第124,728番目のＹ（但し、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、及びＫはＧ又はＴをそれぞれ意味する）。
【００３４】
本発明者らの行ったDumas株、親岡株及び弱毒岡株の３株間相互のゲノムＤＮＡ全長塩基配列に関するホモロジー検索によって、弱毒岡株に固有の変異として、上記した５８塩基の変異の他にも、ori領域内の欠失変異、gene 11内の反復領域Ｒ１の変異、及び非コード領域内の反復領域Ｒ４の変異が確認された。
【００３５】
水痘ウイルスゲノムにおいては、倒置反復配列の関係にある２つのori領域が存在する（図１参照）。これらのori領域は、Dumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第110,087〜110,350番塩基及びアンチセンス鎖では第119,547〜119,810番塩基に対応する領域である。表４にセンス鎖の塩基配列を示した。表４からも明らかなように、弱毒岡株の有するori領域の欠失変異は、Dumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第110,214〜110,227番塩基の部分及びアンチセンス鎖では第119,670〜119,683番塩基の部分に起きており、各欠失変異は５’末端から３’末端方向にみて塩基配列ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡである部分の欠失である。本発明においては、この変異の存在を更に確認することが好ましい。具体的には、センス鎖では第110,219〜110,227番塩基及びアンチセンス鎖では第119,670〜119,678番塩基に相当するＡＴＡＴＡＴＡＴＡである部分の欠失の有無によって確認することができる。
【００３６】
gene 11内の反復領域Ｒ１は、Dumas株のゲノムＤＮＡの第13,937〜14,242番塩基に対応する領域であり、表５にその塩基配列を示した。表５から明らかなように、弱毒岡株のＲ１領域の反復配列はDumas株の反復配列とも、親岡株の反復配列とも異なる。従って、品質管理を行う際に、更に、水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡのＲ１領域の塩基配列が弱毒岡株のＲ１領域の塩基配列と同じであることを確認することが好ましい。具体的には、水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡのＲ１の全領域の反復配列が５’末端から３’末端方向にみてａｂｂａｂｂａ’ｂｂｂ’ａｂａｂａｂｘ（但し、ａは塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡを表わし、ａ’は塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＴＧＡＣＧＡＣＧＡを表わし、ｂは塩基配列ＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡを表わし、ｂ’は塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡを表わし、ｘはＧＧＡを表わす。）であることを確認する。
【００３７】
水痘ウイルスゲノムにおいては、非コード領域内に、倒置反復配列の関係にある２つの反復領域Ｒ４が存在する（図１参照）。これらのＲ４領域は、Dumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第109,762〜109,907番塩基及びアンチセンス鎖では第119,990〜120,135番塩基に対応する領域である。表７にＲ４領域の５’末端から３’末端方向にみた塩基配列を示した。表７からも明らかなように、弱毒岡株のＲ４領域の反復配列はDumas株の反復配列とも、親岡株の反復配列とも異なる。従って、品質管理を行う際に、更に、水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡのＲ４領域の塩基配列が弱毒岡株のＲ４領域の塩基配列と同じであることを確認することが好ましい。具体的には、水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡのＲ４の全領域の反復配列が５’末端から３’末端方向にみてａａａａａａａａａａａａｘ（但し、ａは塩基配列ＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＴＡを表わし、ｘは塩基配列ＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧを表わす。）であることを確認する。
【００３８】
又、gene 22内の反復領域Ｒ３においても、表６に示したような変異が確認された。しかし、表６から明らかなように、弱毒岡株及び親岡株のＲ３領域の反復配列には多様なばらつきが存在することが判明した。
【００３９】
本発明の方法は、上記した弱毒岡株に固有の塩基変異に基づいて完成されたものである。従って、本発明の品質管理方法に用いられる方法は、弱毒生水痘ワクチンの品質管理（即ち、ワクチン用シードウイルス、ワクチンの原料となる弱毒水痘ウイルスや生ワクチンが変異しているか否かの検出）のみならず、弱毒生水痘ワクチン（水痘ワクチンの有効成分となるウイルス）として許容されるウイルス株の同定や、強毒株（親岡株や自然野外株）等の解析にも用いることができる。更に、本発明の方法は、予防接種効果の追跡調査並びに水痘及び帯状疱疹の疫学についての研究における極めて正確かつ有用な技術を提供し、水痘及び帯状疱疹への予防対策に的確な手段を与えることができる。
【００４０】
以下、本発明の品質管理方法を実施するための具体的な方法について説明する。
水痘ウイルスサンプルのゲノムＤＮＡの調製： 本発明の品質管理方法を実施する際に用いる水痘ウイルスサンプルとしては、弱毒生水痘ワクチンの有効成分として用いるウイルス浮遊液やワクチン原液、任意のＶＺＶを培養したウイルス浮遊液、自然感染した水痘患者の水疱液等を用いることができる。ゲノムＤＮＡを得るためには、上記ウイルスサンプルから直接常法により抽出・精製することができる。又、ウイルスサンプルとして用いるＶＺＶを細胞に接種し、ＶＺＶを培養した感染細胞から常法により抽出・精製することもできる（ＤＮＡの抽出・精製方法については、”Current Protocol in Molecular Biology”, Volume 1, Chapter 2, 2.0.1-2.6.12, John Wiley & Sons, Inc., 1987-2000（加除式）に詳述されている）。尚、ＶＺＶの培養には、例えば、ＷＩ−３８細胞やＭＲＣ−５細胞等を用いることができる。また、新鮮野外株や流行株ウイルスを分離・増幅・調製するための材料としては、自然感染し、発症後３日以内の水痘患者から採取した水疱液の使用が望ましい。
【００４１】
ＰＣＲプライマーの調製： 任意のＶＺＶゲノムＤＮＡの塩基配列の増幅は、ＰＣＲ法によって行うことができる。初めに、増幅しようとする目的領域のセンス鎖及びアンチセンス鎖の各５’末端側の連続した約１５〜３０塩基からなるポリヌクレオチドをそれぞれＤＮＡ合成装置で合成し、１組のＰＣＲプライマーとする。プライマーをデザインするにあたっては、配列番号２に記載した弱毒水痘ウイルス岡株の全長ゲノムＤＮＡ配列や「従来技術」の項で前述した特許公報（米国特許第6,093,535号や国際公開公報WO 00/50603）などを参照することができる。
【００４２】
ＰＣＲ産物の塩基配列の決定： 実験操作の省力化を図るには、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製することなく、ＰＣＲ産物のダイレクトＤＮＡシークエンス法を用いることが好ましい（この方法は、“Current Protocol in Molecular Biology”, Volume 3, Chapter 15, 15.2.1-15.2.11，同前に詳述されている）。尚、その際の塩基配列の決定は、常法、例えば、Dideoxy法や、Cycle Sequence Kit（日本国、宝酒造社製）、DNA Sequencing Kit（米国、Perkin Elmer Applied Biosystems社製）等を用いて行うことができる。
【００４３】
ＤＮＡ塩基配列のホモロジー検索： ＤＮＡ塩基配列のホモロジー検索は市販の遺伝情報処理ソフトウェアを用いて行うことができる。例えば、GENETYX-WIN（ver. 3.1）（日本国、ソフトウェア開発（株）製）、DNASIS（ver. 3.7）（日本国、日立ソフトウェア（株）製）、FASTA（http://www.ddjb.nig.ac.jp/）、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を用いることができる。ホモロジー検索によって水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡに本明細書に開示した弱毒岡株に固有の塩基配列が存在するか否かを確認することができる。
【００４４】
ＲＦＬＰ法による塩基変異の確認： 上記のようにウイルスサンプルのゲノムＤＮＡ（全長又は部分）の塩基配列を決定してホモロジー検索を行う他に、弱毒岡株に固有の塩基が変異を受けることなく保存されていることをＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法で確認することもできる。具体的には、変異を確認したい領域のセンス鎖及びアンチセンス鎖の各５’末端側の連続した約１５〜３０塩基からなるポリヌクレオチドをそれぞれＤＮＡ合成装置により合成して１組のＰＣＲプライマーとする。この１組を同時に使用して目的の領域を増幅し、得られたサンプルＤＮＡを制限酵素で消化した後、アガロースゲル電気泳動にかけ、検出されるＤＮＡ断片のサイズの違いに基づいて変異を判定することができる。本発明の品質管理方法を実施する際には、ホモロジー検索よりも簡便なＲＦＬＰ法を行うことが好ましい。尚、ＸＸＹ型であり、且つアミノ酸の非同義置換を伴う弱毒岡株に固有の９塩基（第5,745番目のＧ、第105,356番目のＣ、第105,544番目のＧ、第106,262番目のＣ、第107,252番目のＣ、第122,645番目のＧ、第123,635番目のＧ、第124,353番目のＣ及び第124,541番目のＧ）及びその他の変異である４９塩基のうち、第560番目のＣ、第26,125番目のＧ、第94,167番目のＣ、第105,705番目のＣ、第107,136番目のＣ、第108,111番目のＣ、第121,786番目のＧ、第122,761番目のＧ及び第124,192番目のＧについては、表８に記載の８組のプライマー（配列番号３〜１８の塩基配列）を用いるＲＦＬＰ法によって変異の有無を確認することができる。表８のプライマーを用いて得られるＰＣＲ産物の制限酵素サイトとその各断片について、表９にまとめた。例えば、gene 6の変異（弱毒岡株のgene 6の第5,745塩基のＧ）は、制限酵素Alu Iサイトの有無で検出することができる。具体的には、表８に示すプライマー01-N12と01-R13とをペアで用いるＰＣＲで水痘ワクチンウイルスサンプルゲノムＤＮＡの第5,372〜6,134番塩基である763 bpのＤＮＡ断片を増幅し、Alu Iで消化した後、アガロースゲル電気泳動にかける。強毒株のＰＣＲ産物の場合には、Alu Iで170 bp、205 bp及び388 bpの３断片に開裂するのに対し、弱毒岡株のそれは170 bpと593 bpの２断片に開裂するので、水痘ワクチンウイルスサンプルから増幅したＤＮＡ断片の開裂パターンから水痘ワクチンウイルスサンプルがワクチン株として許容されうるウイルスであるか否かを判断することができる。
【００４５】
本発明の品質管理方法を実施する際には、ＸＸＹ型であり、且つアミノ酸の非同義置換を伴う弱毒岡株に固有の９塩基について、以下のプライマーを用いるＲＦＬＰ法によって確認することが好ましい。第5,745番目のＧの確認には配列番号５と６に記載のプライマーを１組として用い、第105,356番目のＣ、第105,544番目のＧ、第124,353番目のＣ及び第124,541番目のＧの確認には配列番号１１と１２に記載のプライマーを１組として用い、第106,262番目のＣ及び第123,635番目のＧの確認には配列番号１３と１４に記載のプライマーを１組として用い、並びに第107,252番目のＣ及び第122,645番目のＧの確認には配列番号１５と１６に記載のプライマーを１組として用いる。尚、gene 62とgene 71は互いに倒置反復配列の関係にあるため（図１参照）、上記９塩基のうち少なくとも５塩基（gene 6の１塩基、及びgene 62の４塩基）についてＲＦＬＰ法によって確認することにより品質管理を行うことができる。
【００４６】
上記したように、弱毒岡株の全長ゲノムＤＮＡ配列（配列番号２）及び弱毒岡株に固有の塩基変異は本発明者らの研究によって初めて明らかになったものである。弱毒岡株に固有の塩基変異は、水痘ウイルスの弱毒化に重要な変異であると考えられることから、ＶＺＶ野生株や流行株などの強毒株のゲノムＤＮＡに塩基置換を導入したり、強毒株にアミノ酸変異を誘導することによって弱毒株を作製することができる。このような塩基及びアミノ酸変異の誘導に関する遺伝子工学については、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90(15), 7376-7380, 1998に記載の方法を採用することができる。具体的には、上記した弱毒岡株に固有の５８塩基の変異を指標として強毒株などに変異を導入することが可能であり、特にアミノ酸の非同義置換を伴う９塩基の置換が有用である。また、gene 62とgene 71が互いに倒置反復配列の関係にあることを考慮すると（図１参照）、上記置換のうち少なくともgene 6の変異とgene 62又はgene 71の変異からなる５塩基の置換が特に重要であると考えられる。
【００４７】
【発明の実施の形態】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００４８】
【実施例１】
弱毒岡株（弱毒ワクチン株）及びその親株（親岡株；弱毒化していないので強毒）をそれぞれＭＲＣ−５細胞に接種して培養した感染細胞を得た。得られた感染細胞から、各水痘ウイルスゲノムＤＮＡをフェノール及びクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、更にエタノール沈殿により精製し、ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡを鋳型とし、合計８８種（４４組）の合成プライマーを用いて各ウイルス株の全長ゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物を調製した。次に各ＰＣＲ産物の塩基配列を５２０種の合成プライマーを用いたダイレクトＤＮＡシークエンス法により決定した。尚、これにはDNA Sequencing Kit（米国、Perkin Elmer Applied Biosystems社製）を用いた。得られた弱毒岡株及び親岡株の各全長ゲノムＤＮＡ配列につき、配列番号１に記載のDumas株（強毒）の全長ゲノムＤＮＡ配列を基準としてホモロジー検索を行った。ホモロジー検索にはDNASIS（version 3.7）（日本国、日立ソフトウェア（株）製）を用いた。ホモロジー検索によって明らかとなった結果を表１〜７にまとめた。
【００４９】
表１に、Dumas株−親岡株−弱毒岡株の３株間において互いに塩基の変異が検出された塩基番号、遺伝子番号、塩基の変異、及びその変異に伴うアミノ酸変異をそれぞれ列記した。尚、この表において、Ｙはピリミジン塩基（即ち、Ｃ又はＴ）、Ｒはプリン塩基（即ち、Ａ又はＧ）、ＫはＧ又はＴ、（ncr）は非コード領域、括弧内のアルファベット（例えば（Ｗ））は１文字アミノ酸記号、(och)はオーカー（ochre）、(amb)はアンバー（amber）、（Ｗ／Ｒ）はトリプトファン（Ｗ）又はアルギニン（Ｒ）、及び(del)は欠失をそれぞれ意味する。
【００５０】
表２に、表１に記載の変異から、親岡株−弱毒岡株の２株間において変異が検出された遺伝子番号、塩基番号、塩基の変異、及びその変異に伴うアミノ酸変異をそれぞれ抽出して列記した。尚、この表において、Ｘ／Ｙは、Ｘ又はＹを意味し、塩基の隣の（ ）にその塩基がコードするアミノ酸を３文字記号で記載した（尚、塩基が非コード領域のものの場合にはncrと記載した）。表中のその他の略語については、表１と同じである。
【００５１】
表３は、表１及び表２に記載した塩基変異を変異型に基づいてまとめた表であり、変異型とその件数、及び上記変異の内訳（即ち、ncr変異、終止コドン(och/amb)変異、アミノ酸の同義置換及び非同義置換、並びに欠失（あるいは付加））とそれぞれの件数を示す。
【００５２】
以下に表１〜３に基づく知見について説明する。
弱毒岡株の全長ゲノムＤＮＡ配列において、親岡株の全長ＤＮＡ配列との比較によって検出された主な塩基とアミノ酸の変異のうち、次の（ａ）〜（ｆ）に記載のものが弱毒生水痘ワクチンの品質管理に有用かつ重要であるとことが判明した。
【００５３】
（ａ）主な塩基変異の型は、ＸＸＹ型が１８例、ＸＸ（Ｘ／Ｙ）型が４０例の合計５８例であった。
（ｂ）上記５８例のうち、コード領域における変異は４９例、非コード領域における変異は８例、そして、終止コドンの変異が１例であった。
（ｃ）コード領域における前記変異４９例の内訳は、アミノ酸の非同義置換を伴う変異が２９例、同義置換を伴う変異が２０例であった。
（ｄ）ＸＸＹ型変異１８例のうち、アミノ酸の非同義置換を伴う変異が９例、同義置換を伴う変異が８例、及び非コード領域の変異が１例であった。
【００５４】
（ｅ）ＸＸＹ型変異の上記非同義置換を伴う変異９例、即ち、gene 6の第5,745塩基Ｇ、gene 62の第105,356番塩基Ｃ、第105,544番塩基Ｇ、第106,262番塩基Ｃ、及び第107,252番塩基Ｃ、並びにgene 71の第122,645番塩基Ｇ、第123,635番塩基Ｇ、第124,353番塩基Ｃ、及び第124,541番塩基Ｇが、生ワクチンの有効成分としてのウイルス株の弱毒性あるいは安全性の指標となり、従ってワクチンの品質管理に有用かつ重要であることが判明した。尚、gene 62とgene 71は互いに倒置反復配列の関係にある（図１参照）。
【００５５】
（ｆ）ＸＸ(Ｘ/Ｙ)型変異、即ち、ワクチン株におけるＸ又はＹの混在型変異は４０例であった。この変異は、第106,710番塩基を除き、弱毒岡株ウイルスを実験的に連続継代（５代、１０代、１７代等）したところ、その継代数の増加に伴いＹの検出頻度が高まり（Ｘ/ＹからＹへ移行し）、ＸＸＹ型に収束するという傾向が見られた。換言すれば、ウイルス継代に伴い、ＸとＹの混在量比（ｘ/ｙ）が減少するので、上記現象は、ｘ/ｙの定量からシードロットシステムにおけるシードウイルスの継代数の推定が可能であると考えられる。尚、これ等の変異のうち２０例は、アミノ酸の非同義置換を伴う変異へ収束する変異であった。残りの変異は、同義置換を伴う変異が１２例、終止コドンの変異（具体的には、オーカー/アンバー混在型から継代によるアンバー変異への収束）が１例、非コード領域の変異が７例であった。
【００５６】
【表１】
【表２】
【表３】
表４は、Dumas株−親岡株−弱毒岡株の３株間における、センス鎖のori領域の塩基配列の相違を示す。尚、この表において、“−”は欠失を意味する。
弱毒岡株のori領域においては、配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第110,214〜110,227番塩基及びアンチセンス鎖では第119,670〜119,683番塩基に相当する領域であり、５’末端から３’末端方向にみてＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡである配列が欠失している。従って、親岡株の配列との相違を考慮すると、その３’末側の配列、ＡＴＡＴＡＴＡＴＡの欠失がワクチンの品質管理に有用であることが明らかとなった。
【００６０】
【表４】
表５は、Dumas株−親岡株−弱毒岡株の３株間のgene 11内の反復領域Ｒ１の５’末端から３’末端方向にみた配列の相違を示す。
【００６２】
表６は、Dumas株−親岡株−弱毒岡株の３株間のgene 22内の反復領域Ｒ３の５’末端から３’末端方向にみた配列の相違を示す。
【００６３】
表７は、Dumas株−親岡株−弱毒岡株の３株間の反復領域Ｒ４の５’末端から３’末端方向にみた配列の相違を示す。
【００６４】
表５から明らかなように、Ｒ１の全領域の反復配列は、弱毒岡株と親岡株及びDumas株の３株間でそれぞれ異なることが判明した。同様に、Ｒ４の全領域の反復配列も、弱毒岡株と親岡株及びDumas株の３株間でそれぞれ異なることが判明した。従って、Ｒ１領域の反復配列ａｂｂａｂｂａ’ｂｂｂ’ａｂａｂａｂｘ（但し、ａは塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡを表わし、ａ’は塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＴＧＡＣＧＡＣＧＡを表わし、ｂは塩基配列ＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡを表わし、ｂ’は塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡを表わし、ｘはＧＧＡを表わす。）及びＲ４領域の反復配列ａａａａａａａａａａａａｘ（但し、ａは塩基配列ＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＴＡを表わし、ｘは塩基配列ＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧを表わす。）は弱毒岡株に固有の配列であり、弱毒生水痘ワクチンの品質管理に有用である。
【００６５】
また、表６に記載したgene 22内の反復領域Ｒ３の配列については、弱毒岡株及び親岡株のクローンによって配列が異なり、弱毒岡株に固有の配列は見出されなかった。
【００６６】
【表５】
【表６】
【表７】
【実施例２】
実施例１と同様にして弱毒岡株、親岡株、及び河口株（水痘ウイルス野外株）の各ゲノムＤＮＡを調製した。次に表８に記載したプライマーのうち、01-N12（配列番号５）と01-R13（配列番号６）とを用いて、gene 6の一部に相当する領域（Dumas株の第5,372〜6,134番塩基に相当する領域）を増幅した。得られたＰＣＲ産物（763 bp）について、制限酵素Alu I処理によって得られる断片の相違をＲＦＬＰ法で解析した。具体的には、弱毒岡株、親岡株及び河口株の各ＰＣＲ産物を制限酵素Alu Iで消化し、得られたＤＮＡ断片を４．０％(w/v) アガロースゲル電気泳動に付してサイズを調べた。
【００７０】
弱毒岡株では170 bpと593 bpの２断片が検出された。他方、親岡株及び河口株では共に170 bp、205 bp及び388 bpの３断片が検出された。従って、弱毒岡株では、親岡株と野外株の有する、205 bpと388 bpの２断片の間にあるAlu Iサイトが欠失していることが判明した。従って、強毒株のgene 6に位置する第5,745塩基Ａが、弱毒岡株では変異していることが、Alu Iサイトの欠失によって確認できることが明らかとなった。
【００７１】
【実施例３】
水痘由来の流行株及び帯状疱疹由来の流行株からなる合計５４株について、実施例２と同様に制限酵素Alu I処理によって得られる断片の相違をＲＦＬＰ法で解析した。その結果、これらの流行株では全て170 bp、205 bp及び388 bpの３断片が検出され、実施例２に記載の親岡株と同一であった。
【００７２】
【実施例４】
表８に記載したプライマー（配列番号３〜６及び９〜１８）、及び表９に記載の制限酵素Nla III、Alu I、BstX I、SfaN I、Acc II、Sac II、Sma I、BssH II並びにNae I、又はBsr Iを用いて実施例２と同様にＲＦＬＰ法を行った。具体的には、実施例１と同様にして弱毒岡株、親岡株、及び河口株の各ゲノムＤＮＡを調製した。次に表８に記載したプライマーを、表９に記載した組み合わせで用いてゲノムＤＮＡの特定の領域を増幅し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動に付した。結果を図２に示す。更に、ＲＦＬＰ法に用いた制限酵素とその切断断片のサイズを表９にまとめた。
【００７３】
図２及び表９から明らかなように、いずれの条件で行ったＲＦＬＰ法においても、弱毒岡株と、親岡株及び河口株では制限酵素処理によって得られる断片の数及びサイズが異なることが判明した。従って、弱毒岡株の第560番目のＣ、第5,745番目のＧ、第94,167番目のＣ、第105,356番目のＣ（第124,541番目のＧ）、第105,544番目のＧ（第124,353番目のＣ）、第105,705番目のＣ（第124,192番目のＧ）、第106,262番目のＣ（第123,635番目のＧ）、第107,136番目のＣ（第122,761番目のＧ）、第107,252番目のＣ（第122,645番目のＧ）、及び第108,111番目のＣ（第121,786番目のＧ）については、ＲＦＬＰ法を行うことでゲノムの塩基配列を決定せずにこれらの塩基の変異を確認できることが明らかとなった。
【００７４】
【表８】
【表９】
【発明の効果】
本発明の品質管理方法は、弱毒生水痘ワクチンの安全性、有効性、及び均質性についての品質管理と品質保証を極めて高い精度で行うことを可能にする。更に本発明は、予防接種効果の追跡調査並びに水痘及び帯状疱疹の疫学研究における極めて正確かつ有用な技術を提供することができ、これ等を促進かつ発展させることができる。ひいては、水痘及び帯状疱疹への予防対策に的確な手段をもたらし、人類の保健に多大に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 水痘ウイルス岡株の遺伝子地図であり、各遺伝子の番号と向きを示す。また、弱毒岡株と親岡株との間の変異を以下のように表わす。
【図２】 実施例４におけるＲＦＬＰの結果を示す電気泳動写真であって、ＰＣＲ産物の処理に用いた制限酵素は以下のとおりである。図２（ａ）はNla III、図２（ｂ）はAlu I、図２（ｃ）はBstX I、図２（ｄ）はSfaN I、図２（ｅ）はAcc II、図２（ｆ）はSac II、図２（ｇ）はSma I、図２（ｈ）はBssH II及びNae I、図２（ｉ）はBsr Iである。Ｖは弱毒岡株、Ｐは親岡株、Ｋは河口株を示す。
【配列表】
Claims (9)
- 水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡを塩基配列の解析に付し、以下の５塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認することを特徴とする弱毒生水痘ワクチンの品質管理方法。
第5,745番目のＧ、第105,356番目のＣ、第105,544番目のＧ、第106,262番目のＣ、及び第107,252番目のＣ（但し、塩基番号は配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡの塩基配列の塩基番号システムに従う） - 以下のプライマーを用いるＲＦＬＰ法によって、該５塩基の保存を確認することを特徴とする請求項１に記載の品質管理方法。
第5,745番目のＧの確認には配列番号５と６に記載のプライマーを１組として用い、第105,356番目のＣ及び第105,544番目のＧの確認には配列番号１１と１２に記載のプライマーを１組として用い、第106,262番目のＣの確認には配列番号１３と１４に記載のプライマーを１組として用い、第107,252番目のＣの確認には配列番号１５と１６に記載のプライマーを１組として用いる。 - 更に、以下の４塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認することを特徴とする請求項１又は２に記載の品質管理方法。
第122,645番目のＧ、第123,635番目のＧ、第124,353番目のＣ、及び第124,541番目のＧ（但し、塩基番号は配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡの塩基配列の塩基番号システムに従う）。 - 以下のプライマーを用いるＲＦＬＰ法によって、該４塩基の保存を確認することを特徴とする請求項３に記載の品質管理方法。
第124,353番目のＣ及び第124,541番目のＧの確認には配列番号１１と１２に記載のプライマーを１組として用い、第123,635番目のＧの確認には配列番号１３と１４に記載のプライマーを１組として用い、第122,645番目のＧの確認には配列番号１５と１６に記載のプライマーを１組として用いる。 - 更に、以下の４９塩基が変異を受けることなく保存されていることを確認することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の品質管理方法。
第560番目のＣ、第703番目のＹ、第763番目のＹ、第2,515番目のＹ、第10,900番目のＹ、第12,779番目Ｙ、第19,431番目のＹ、第26,125番目のＧ、第31,732番目のＹ、第38,036番目のＹ、第39,227番目のＫ、第58,595番目のＲ、第59,287番目のＲ、第64,067番目のＲ、第71,252番目のＹ、第82,225番目のＲ、第84,091番目のＲ、第87,280番目のＲ、第87,306番目のＹ、第89,734番目のＲ、第90,535番目のＲ、第94,167番目のＣ、第97,748番目のＲ、第97,796番目のＹ、第101,089番目のＲ、第105,169番目のＲ、第105,310番目のＲ、第105,705番目のＣ、第106,710番目のＲ、第107,136番目のＣ、第107,599番目のＲ、第107,797番目のＲ、第108,111番目のＣ、第108,838番目のＲ、第109,137番目のＲ、第109,200番目のＲ、第111,650番目のＲ、第118,247番目のＹ、第120,697番目のＹ、第120,760番目のＹ、第121,059番目のＹ、第121,786番目のＧ、第122,100番目のＹ、第122,298番目のＹ、第122,761番目のＧ、第123,187番目のＹ、第124,192番目のＧ、第124,587番目のＹ、及び第124,728番目のＹ（但し、塩基番号は配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡの塩基配列の塩基番号システムに従い、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、及びＫはＧ又はＴをそれぞれ意味する）。 - 以下のプライマーを用いるＲＦＬＰ法によって、該４９塩基のうち第560番目のＣ、第26,125番目のＧ、第94,167番目のＣ、第105,705番目のＣ、第107,136番目のＣ、第108,111番目のＣ、第121,786番目のＧ、第122,761番目のＧ及び第124,192番目のＧの保存を確認することを特徴とする請求項５に記載の品質管理方法。
第560番目のＣの確認には配列番号３と４に記載のプライマーを１組として用い、第26,125番目のＧの確認には配列番号７と８に記載のプライマーを１組として用い、第94,167番目のＣの確認には配列番号９と１０に記載のプライマーを１組として用い、第105,705番目のＣ及び第124,192番目のＧの確認には配列番号１３と１４に記載のプライマーを１組として用い、第107,136番目のＣ及び第122,761番目のＧの確認には配列番号１５と１６に記載のプライマーを１組として用い、第108,111番目のＣ及び第121,786番目のＧの確認には配列番号１７と１８に記載のプライマーを１組として用いる。 - 更に、該水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡの下記に定義される２つのori領域中の欠失変異を確認することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の品質管理方法。
該２つのori領域は、配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第110,087〜110,350番塩基及びアンチセンス鎖では第119,547〜119,810番塩基に対応する領域であり、該欠失変異は、該Dumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第110,219〜110,227番塩基の部分及びアンチセンス鎖では第119,670〜119,678番塩基の部分に起きており、各欠失変異は５’末端から３’末端方向にみてＡＴＡＴＡＴＡＴＡである部分の欠失である。 - 更に、該水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡの下記に定義されるＲ１の全領域の反復配列が５'末端から３'末端方向にみてａｂｂａｂｂａ’ｂｂｂ’ａｂａｂａｂｘ（但し、ａは塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡを表わし、ａ'は塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＴＧＡＣＧＡＣＧＡを表わし、ｂは塩基配列ＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡを表わし、ｂ’は塩基配列ＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡを表わし、ｘはＧＧＡを表わす。）であることを確認することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の品質管理方法。
該Ｒ１の全領域は、配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡにおいて、第13,937〜14,242番塩基に対応する領域である。 - 更に、該水痘ワクチンウイルスサンプルのゲノムＤＮＡの下記に定義される２つのＲ４のそれぞれの全領域の各々の反復配列が、５’末端から３’末端方向にみてａａａａａａａａａａａａｘ（但し、ａは塩基配列ＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＴＡを表わし、ｘは塩基配列ＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧを表わす。）であることを確認することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の品質管理方法。
該２つのＲ４のそれぞれの全領域は、配列番号１に記載の水痘ウイルスDumas株のゲノムＤＮＡにおいて、センス鎖では第109,762〜109,907番塩基及びアンチセンス鎖では第119,990〜120,135番塩基に対応する領域である。
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