CN104726469A - 一种重组鸭瘟病毒转移载体及重组鸭瘟病毒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组鸭瘟病毒转移载体及应用该载体构建的重组鸭瘟病毒，所述的重组载体携带有用于重组到鸭瘟病毒TK基因上的核苷酸片段，所述核苷酸片段是在TK基因同源臂之间插入鸭坦布苏病毒E基因和筛选标记基因；且筛选标记基因的两侧有loxP核苷酸序列。本发明通过同源重组的方法获得的重组鸭瘟病毒在神经细胞等非分裂细胞中的复制能力降低，使得潜伏于神经组织的病毒难以激活，大大降低鸭瘟病毒疫苗株的神经毒力，从而保证该重组鸭瘟病毒作为疫苗具有更优的安全性。本发明还涉及该重组鸭瘟病毒疫苗株用于制备预防鸭瘟及鸭坦布苏的疫苗的应用。

Description

一种重组鸭瘟病毒转移载体及重组鸭瘟病毒

技术领域

本发明属于重组病毒疫苗技术领域，具体涉及一种重组鸭瘟病毒转移载体及重组鸭瘟病毒。

背景技术

鸭瘟病毒(Duck Plague Virus,DPV)，又名鸭病毒性肠炎(Duck Enteritis Virus,DEV)为疱疹病毒科(Herpesvirales)、α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)马立克病毒属(Mardivirus)成员，能够引起鸭、鹅及其他雁形目禽类发生急性、热性、败血性为特征的烈性传染病。在自然条件下鸭瘟病毒引起鸭大批发病和死亡，主要见于成年鸭，尤其是母鸭；不同年龄、性别的鸭均易感，但不同品种鸭的易感性不同。鸭瘟病毒感染后鸭只的典型病理变化以血管损伤、组织出血、消化道粘膜糜烂为主。目前对鸭瘟病毒的研究相对于其他疱疹病毒较少。

当前市场上的鸭瘟病毒疫苗多是通过人工致弱疫苗株来制备，但通过传代致弱的疫苗株是非克隆变异株的混合物，易回复突变，同时具有一定的神经毒力，易存在潜伏感染。因此，有必要提供一种更稳定的鸭瘟病毒疫苗株。

目前以不同种类病毒作为载体，表达不同病原的外源基因，已成功的应用于人及动物疾病的预防。研究表明，疱疹病毒基因组较大，能够提供多个外源基因的插入位点，或者替换基非必须区基因，如猪伪狂犬病毒(PRV)成功的表达猪瘟病毒E2等外源基因，取得良好的免疫效果。因此，疱疹病毒被认为是一种良好的活病毒载体。鸭瘟病毒作为疱疹病毒科成员之一，不仅具有基因工程疫苗载体的特点，以其为载体开发的基因工程疫苗在控制鸭、鹅等水禽疾病具良好的应用前景。

发明内容

本发明目的是提供一种重组鸭瘟病毒转移载体及应用该载体构建的重组鸭瘟病毒，使构建的重组鸭瘟病毒制备的疫苗能够同时预防鸭瘟及鸭坦布苏，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种用于重组到鸭瘟病毒TK基因上的核苷酸片段，所述核苷酸片段是在TK基因同源臂之间插入鸭坦布苏病毒E基因和筛选标记基因；且筛选标记基因的两侧为loxP核苷酸序列；

作为实施例的优选，上述的筛选标记基因为筛选标记基因lacZ；

上述的核苷酸片段，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:1；

本发明另一个方面提供一种重组鸭瘟病毒转移载体，该重组表达载体为插入有上述用于重组到鸭瘟病毒TK基因上的核苷酸片段的表达载体；

作为实施例的优选，该表达载体为pUC57载体。

本发明的重组表达载体用于制备重组鸭瘟病毒；是将该重组表达载体以同源重组方式将所携带的核苷酸片段插入到鸭瘟病毒基因组内的TK基因内，构建能够表达鸭坦布苏病毒E基因的重组鸭瘟病毒。

上述制备的重组鸭瘟病毒用于制备疫苗。

本发明通过同源重组的方法获得的重组鸭瘟病毒在神经细胞等非分裂细胞中的复制能力降低，使得潜伏于神经组织的病毒难以激活，大大降低鸭瘟病毒疫苗株的神经毒力，从而保证该重组鸭瘟病毒作为疫苗具有更优的安全性。而且，本发明所提供的重组鸭瘟病毒转移载体利用BrdU及X-gal蓝斑筛选方法，减少重组病毒筛选工作。而且，本发明将免疫原性基因E引入到鸭瘟病毒内，从而达到同时预防鸭瘟及鸭坦布苏的目的。

附图说明

图1：鸭瘟病毒转移载体pDTK-E/lacZ模式图；

图2：是本发明的鸭瘟病毒转移载体pDTK-E/lacZ质粒图谱。

图3：是本发明的鸭瘟病毒转移载体pDTK-E/lacZ酶切鉴定结果。

图4：是本发明的重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ构建流程。

图5：是本发明的重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ PCR鉴定电泳图谱。

图6：是本发明的重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ的Westernblot及IFA鉴定。

具体实施方式

本发明利用分子克隆及同源重组技术，提供一种鸭瘟病毒转移载体的构建方法及应用，利用该载体通过与鸭瘟病毒发生同源重组，将包含鸭坦布苏病毒E基因、CMV启动子序列及BGH polyA序列的基因片段CMV-DTMUV-E-polyA替换鸭瘟病毒(Duck Plague Virus,DPV)TK基因内第248-250位核苷酸，从而构建获得在TK基因内部插入CMV-DTMUV-E-polyA表达框的鸭瘟病毒基因工程毒株。利用该基因工程毒株可制备鸭瘟-鸭坦布苏的双价基因工程疫苗，应用于鸭瘟及鸭坦布苏的防制。此外该基因工程病毒基因组内插入lacZ基因，它不仅可作为一个筛选标记，还可被其他外源基因替换以构建预防多种疫病的多价基因工程疫苗。另外，在该基因工程毒株的lacZ基因表达盒两侧设计有loxP位点，可通过Cre-LoxP重组系统去除lacZ基因，获得不含有筛选标记基因的重组病毒。

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

实施例1.鸭瘟病毒核酸的制备

(1)鸡胚成纤维(CEF)细胞的制备：取9-10日龄鸡胚，置于蛋槽中，气室向上，用碘酒和酒精棉球由中央向四周涂抹蛋壳除菌消毒；用镊子敲开气室并轻轻去除蛋壳，用弯头镊子从鸡胚脖子处轻轻挑出鸡胚并放入已经灭菌的细胞培养皿中。依次将头、四肢及内脏全部取出，用灭菌的PBS冲洗三次，直至胚体发白，然后用眼科剪均匀剪成大约1mm³的组织块。加入0.25％胰酶约5mL置于37℃水浴中消化10-20min，期间每5min摇动一次，当组织块变得疏松时，中止消化，1000rpm离心10min，取上清，用灭菌的4-6层纱布过滤，在过滤液加入细胞培养基DMEM后混匀，制成10⁶-10⁷细胞/mL，分装到细胞瓶或六孔细胞培养板中，放入CO2培养箱内培养24-48h。

(2)鸭瘟病毒接种：在长成致密单层的CEF细胞中，按常规方法接种鸭瘟病毒疫苗株(CVCC AV1222，中国兽医微生物菌种保藏管理中心，目录编号AV1222，购自中国兽医药品监察所)，注意观察，待细胞出现80-90％病变时收获细胞，并反复冻融三次，将细胞混悬液分装到1.5mL Eppendorf管中，-20℃保存备用。

(3)鸭瘟病毒核酸制备：

采用天根生物的TIANamp Virus DNA/RNA Kit，根据说明书进行具体操作。

实施例2.鸭瘟病毒转移载体的构建

(1)所构建的鸭瘟病毒转移载体pDTK-E/lacZ模式图如图1所示，分别在pUC57载体的Nde I与Hind III酶切位点之间，依次有TK基因同源臂A元件、鸭坦布苏病毒E基因表达框C元件、筛选标记基因lacZ表达框D元件及TK基因同源臂B元件。另外在D元件的两侧设有loxP序列E元件，图1。

具体构建方法如下：

(2)质粒pUC-LS的构建

设计含有loxP位点的基因序列，在该序列两端分别设计Nde I与Hind III酶切位点，含两个同向的34bp的loxp序列(斜线部分)：

CATATGAGATCTGAATTCTCGCGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGATCCGAGCTCGCTAGCGGTACCTCTAGATATCGTCGACATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTCGAGCTGCA GAAGCTT。将上述合成序列连接到pUC57的Nde I与Hind III位点构建质粒并命名为pUC-LS。

(3)鸭瘟病毒TK基因扩增

根据鸭瘟病毒VAC株基因组(GenBank:EU082088.2)序列，设计扩增TK基因及其上下游片段的引物：

TK-F:5′-AACCCCATAGTCGCAATAGTCGTA-3′

TK-R:5′-TCCCCGGCCATGGTAAAAGATAG-3′

以提取鸭瘟病毒疫苗株AV1222的DNA为模板扩增含TK基因及其上下游序列的1982bp片段，连接于pMD18-T载体中，命名为pMD-TK，并进行测序鉴定。

(4)鸭瘟病毒通用转移载体pDTK-lacZ的构建

应用Hind III与Xho I双酶切质粒pMD-TK得到的片段连接到pUC-LS载体相应的酶切位点内，命名为pLS-TK-L。

设计以下引物：

SV40-F:5′-GAAGATCTAAGAACCAGCTGGGGCTCTA-3′

SV40-R:5′-CCGCTCGAGCGACGGTATACAGACATGAT-3′

以pCDNA3.1(+)为模板扩增含SV40启动子及SV40polyA的Neo基因表达框，琼脂糖凝胶回收后应用Bgl II与Xho I双酶切连接到载体pLS-TK-L内BamHI与Sal I位点内，构建载体pDTK-L-Neo。

设计扩增lacZ基因ORF引物：

lacZ-F:5′-GCCCGGGATGATAGATCCCGTCGTTT-3′

lacZ-R:5′-GCTTCGAATTATTTCTGACACCAGACC-3′

以质粒pLenti6/V5-GW/lacZ为模板扩增lacZ基因，回收片段应用Sma I与BstP104双酶切后连接到载体pDTK-L-Neo相应的酶切位点，替换Neo基因，命名为pDTK-L-lacZ。

设计扩增同源臂TK-R引物：

TK-RF:5′-GAAGATCTTCCCCGGCCATGGTAAAAGATAG-3′

TK-RR:5′-CGGGATCCACATAGCAACAACTGACGCAAAAG-3′

以质粒pMD-TK为模板扩增TK-R片段，回收后经Bgl II与BamH I双酶切后连接到载体pcDNA3.1(+)内的Bgl II位点，鉴定连接产物正反向后，选择正向连接的质粒并命名为pcDNA-TK-R。

设计扩增TK-R及CMV启动子、多克隆位点MCS及BGH polyA引物：

TK-RF:5′-GAAGATCTTCCCCGGCCATGGTAAAAGATAG-3′

BGHpA-R:5′-TCCCCCGGGTCAGAAGCCATAGAGCCCACCGCAT-3′

以上述构建的质粒pcDNA-TK-R为模板进行扩增，回收片段以Bgl II和SmaI双酶切后连接到已构建的pDTK-L-lacZ内Bgl II与Nru I位点内并命名为pDTK-lacZ(SEQ ID NO:3)。

(5)鸭瘟病毒转移载体pDTK-E/lacZ构建

设计扩增鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因ORF的引物：

DTMUV-F:5′-CTAGCTAGCATGTTCAGCTGTCTGGGGATG-3′

DTMUV-R:5′-GTTGTTGCGGCCGCTTAGGCATTGACATTTACTG-3′

本单位从浙江一养鸭厂突发产蛋下降的蛋鸡体内分离到一株鸭坦布苏病毒，命名为“ZJ“，提取该病毒的核酸经反转录cDNA后，以此为模板应用上述引物扩增E基因ORF(SEQ ID NO:2)，经Nhe I与Not I双酶切后连接到步骤(4)构建的鸭瘟病毒通用载体pDTK-lacZ内相应的酶切位点，命名为pDTK-E/lacZ，图2。对该质粒进行酶切及测序鉴定，酶切结果见图3。

图中3：鸭瘟病毒通用转移载体pDTK-lacZ；2：含DTMUV E基因的鸭瘟病毒转移载体pDTK-E/lacZ；3：Bgl II酶切结果，产生863bp、1.84kp及8.6kp大小的目的条带；4：EcoR V酶切结果，产生4.8kp及6.4kp大小的目的条带；5：DNA marker(DL 2000)。所有酶切结果与预期相符，说明已经成功构建含有鸭坦布苏病毒E基因的重组鸭瘟病毒转移载体pDTK-E/lacZ。

实施例4.重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ的构建与纯化

(1)按常规方法制备原代鸡胚成纤维(CEF)细胞，在六孔细胞培养板中培养至80－90％致密单层，接种鸭瘟病毒株，37℃作用2h。在病毒孵育过程中，按照每孔加入150uL无血清OPTI-MEM和8uL Lipofectamine 2000的比例配制溶液1，温柔混匀，再按照每孔加入150uL无血清OPTI-MEM和10uL含5ugpDTK-E/lacZ鸭瘟病毒转移载体配制溶液2，然后将溶液2逐滴加入溶液1中，温柔混匀，室温放置20min。在此期间，将孵育鸭瘟病毒的六孔板内细胞用无血清DMEM轻轻洗两次，每孔加入1.5mL无血清OPTI-MEM，再逐滴加入孵育后的脂质体-DNA混合液，温柔混匀，并留一孔作为对照。37℃5％CO2培养箱培养4-6h，吸弃转染液，加入细胞维持液，37℃5％CO2培养箱培养72-96h，注意每天观察细胞病变情况，收集转染毒。

(2)重组鸭瘟病毒rDPV/E/lacZ的筛选与纯化

收集转染的鸭瘟病毒细胞液，反复冻融三次后按10MOI接种CEF细胞中，在接种病毒前24小时用含40ug/mL BrdU(5-溴2′-脱氧尿嘧啶)的DMEM营养液培养，于37℃5％CO2培养箱培养48-72h，待出现细胞病变后，收获病毒液。连接接种于含40ug/mL BrdU的DMEM营养液培养三代，收集病毒液。

收集的病毒液按一定的稀释倍数接种到六孔板内已长满单层的鸡胚成纤维(CEF)细胞，37℃5％CO2培养箱培养36-48h。待出现细胞病变，形成细胞感染蚀斑后，吸去细胞培养液，在六孔板中同样加入2mL含150-200ug/mL X-gal的营养琼脂：2×细胞维持液与1.2％低溶点琼脂糖等体积混合。置于37℃5％CO2培养箱培养12-24h，显微镜下标记并将呈现蓝色的病毒感染蚀斑挑取出来，放入到1mL无血清无抗生素的DMEM培养基中，反复冻融三次。重复该步骤直至所有的病变细胞均呈现蓝色，见附图4，其中图A：鸭瘟病毒感染CEF细胞后所形成的细胞蚀斑；图B：转染产物在X-gal条件下挑取的蓝斑细胞毒；图C：在X-gal条件下蓝斑细胞毒经多次纯化后感染CEF细胞。

实施例5.重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ的PCR鉴定

分别设计鉴别lacZ基因及DTMUV E基因的引物：

lacZID-F:5′-CCGCGCTGTACTGGAGGCTGAAG-3′

lacZID-R:5′-CATACTGCACCGGGCGGGAAGGAT-3′

DTMUVE-F:5′-TGGGGATGCAGAACCGAGACTTT-3′

DTMUVE-F:5′-CAGCGGTGTAGACGGGACTTTTG-3′

分别提取重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ、鸭瘟病毒及CEF细胞的基因组核酸，以此为模板应用上述引物进行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳分析所扩增的条带(图5)。

图A为筛选的四株重组鸭瘟病毒及亲本株DPV、CEF细胞的lacZ基因PCR鉴定。1－4：分别为筛选的四株重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ；5：鸭瘟病毒DPV；6：CEF细胞；M：DL2000marker。在筛选的1、3与4号重组鸭瘟病毒中均可以扩增出752bp大小的目的条带，在亲本株鸭瘟病毒及CEF细胞均未扩增出相应大小的条带，这说明该三株鸭瘟病毒可能发生了重组，含有lacZ基因。

图B为经上述lacZ基因PCR鉴定的三株重组鸭瘟病毒及亲本株DPV、CEF细胞的DTMUV E基因PCR鉴定。1－3：分别为lacZ基因PCR鉴定的三株重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ；4：鸭瘟病毒DPV；5：CEF细胞；M：DL2000marker。在2、3号重组鸭瘟病毒中均可以扩增出523bp大小的目的条带，在亲本株鸭瘟病毒及CEF细胞均未扩增出相应大小的条带。在2、3号重组鸭瘟病毒扩增出的目的条带经琼脂糖凝胶回收后测序，结果与DTMUV E基因序列完全一致，这说明该二株鸭瘟病毒发生了重组，含有lacZ及DTMUV E基因。

实施例6.重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ的E蛋白印迹(Westernblot)及间接免疫荧光(IFA)鉴定

将上述经PCR鉴定正确的重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ和亲本病毒株DPVAV1222应用Western blot与IFA检测DTMUV E基因的表达情况。

Westernblot：分别接种rDPV-E/lacZ和亲本病毒株DPV于CEF细胞，待细胞出现80-90％病变时，弃上清收取细胞，用冷PBS洗三次，进行Westernblot。SDS-PAGE胶浓度为10％，硝酸纤维素膜电转印后，用5％脱脂奶粉进行4℃封闭过夜，加入用5％脱脂奶粉按1︰1000比例稀释的鼠抗DTMUV E蛋白抗体(由本发明人所在的实验室按常规方法制备并保存)作为一抗，室温孵育1小时。用PBST洗膜三次，每次10分钟。加入用5％脱脂奶粉按1︰5000比例稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗，室温孵育1小时。用PBST洗膜三次，每次10分钟，最后用增敏二氨基联苯胺(DAB)显色并照相。

由图6(A)所示，纯化的二株重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ-1(1)、rDPV-E/lacZ-2(2)感染的细胞样品与DPV(3)感染的细胞样品及鸡胚成纤维(CEF)细胞(4)相比，在大约51kD处有一条特异性条带，与预期蛋白大小相一致，为DTMUV E蛋白，说明外源蛋白在DPV中获得表达。

间接免疫荧光：分别接种rDPV-E/lacZ和亲本病毒株DPV于CEF细胞，待细胞出现80-90％病变时，用4％多聚甲醛固定细胞30分钟，PBS洗三次，每次5分钟。0.1％的TritonX-100透化细胞，室温孵育5分钟，PBS洗三次，每次5分钟。用1％山羊血清封闭过夜，再用PBS洗三次，每次5分钟。用1％山羊血清配制按1︰50比例稀释的鼠抗DTMUV E蛋白单克隆抗体(由本发明人所在的实验室按常规方法制备并保存)作为一抗，室温孵育1小时。用PBS洗三次，每次5分钟。最后用1％山羊血清配制按1︰50比例稀释的FITC标记的山羊抗鼠IgG为二抗，室温孵育1小时。用PBS洗三次，每次5分钟。置荧光显微镜下观察。

由图6(B、C)所示，由重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ感染的CEF细胞(B)中能够明显看到荧光出现，而在亲本株鸭瘟病毒感染的CEF细胞(C)中并未呈现有荧光出现，这说明DTMUV E蛋白在DPV中得到了表达。

实施例7.重组鸭瘟病毒的免疫学试验

将表达DTMUV E基因的重组鸭瘟rDPV-E/lacZ和亲本株DPV分别按10⁶TCID₅₀感染4周龄的雏鸭6只。每周采血，分离血清，测其中和抗体。

步骤如下：采集血清灭活后，于96孔板培养板中倍比稀释血清，稀释后的样品与20TCID₅₀DTMUV病毒液37℃混合感作1h，传代BHK-21细胞到96孔板内培养6d，观察CPE，应用Reed-Muench法计算中和抗体，每一样品独立重复二次。结果如下：

结果说明，在免疫后1周时能够检测到抗DTMUV中和性抗体，且呈持续性升高趋势，而在对照组DPV(WT)中不能产生任何抗DTMUV的中和性抗体，所构建的表达鸭坦布苏病毒E基因的重组鸭瘟病毒能够在机体内诱导中和抗体产生。

实施例8.动物攻毒保护实验

将重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ和亲本株DPV分别按10⁶TCID₅₀感染4周龄的鸭只10只，PBS组作为阴性对照，3周后分别用100倍DLD₅₀的DPV强毒(CVCCAV1221，购自中国兽医药品监察所)和鸭坦布苏病毒进行攻毒，隔离饲养，连续观察15d，记录各组鸭只的发病死亡情况，以观察期结束鸭健康存活判定为保护。结果不论是针对鸭瘟不是针对鸭坦布苏病，用重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ免疫的鸭子得到100％的保护。结果如下：

本发明的重组病毒在体外能够良好的表达E基因。用其对鸭进行免疫后能够得到良好的表达，诱导产生良好的中和抗体，并能够抵抗鸭坦布苏病毒的攻击。本发明研制的表达鸭坦布苏病毒E基因的重组鸭瘟病毒，不但能够给免疫鸭提供良好的对DPV的免疫效果，还能提供良好的对鸭坦布苏病的免疫效果。因此，本发明研制的表达鸭坦布苏病毒E基因的重组鸭瘟病毒不但具有重要的理论及实践意义，也具有非常重要的经济和公共卫生意义。

应该理解，尽管参考其示例性实施方案，对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (9)

1.一种用于重组到鸭瘟病毒TK基因上的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段是在TK基因同源臂之间插入鸭坦布苏病毒E基因和筛选标记基因；且在筛选标记基因两侧有loxP核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的筛选标记基因为lacZ。

3.如权利要求1所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:1。

4.一种重组鸭瘟病毒转移载体，其特征在于，所述的重组表达载体为插入有权利要求1所述的核苷酸片段的表达载体。

5.如权利要求4所述的重组鸭瘟病毒转移载体，其特征在于，所述的表达载体以pUC57载体为骨架。

6.权利要求4所述的重组鸭瘟病毒转移载体用于制备重组鸭瘟病毒。

7.一种制备重组鸭瘟病毒的方法，其特征在于，所述的方法是将该权利要求4所述的重组鸭瘟病毒转移载体以同源重组方式将所携带的核苷酸片段插入到鸭瘟病毒基因组内的TK基因内，构建表达鸭坦布苏病毒E基因的重组鸭瘟病毒。

8.一种重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述的重组鸭瘟病毒是用权利要求7所述的方法制备的。

9.权利要求8所述的重组鸭瘟病毒用于制备疫苗。