CN111041003A

CN111041003A - 一种重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN111041003A
Application number: CN201911327241.6A
Authority: CN
Inventors: 周远成; 邝声耀; 阴文奇
Original assignee: Livestock Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Livestock Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2020-04-21

Abstract

本发明公开了一种重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用。该重组鸭瘟病毒的基因组中插入有鸭坦布苏病毒E蛋白基因和绿头鸭CD154基因；鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；绿头鸭CD154基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过在鸭瘟病毒基因中插入修饰后的鸭坦布苏病毒E蛋白基因和修饰后的绿头鸭CD154基因构建得到重组鸭瘟病毒，其具有免疫原性，可用于制备动物疫苗。

Description

一种重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用。

背景技术

鸭瘟病毒(DEV)是一种α疱疹病毒，能引起鸭、鹅、天鹅等雁形目水禽产生一种急性、热性、败血性、接触性传染病。鸭坦布苏病毒病是自2010年以来在我国蛋鸭和种鸭主产区爆发的一种以传播迅速、产蛋量骤降为主要特点的新传染病。

2010年4月以来，我国鸭主产区的蛋鸭和种鸭爆发一种新的传染病，该病以传播迅速、产蛋量骤降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征。通过病原分离鉴定和全序列测定，明确该病原属于黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)、蚊媒病毒类(Mosquito-borne)、Ntaya病毒群，与该群Tembusu 病毒(TMUV)具有最近的遗传进化关系，可以认为是TMUV的一个新成员，暂定名为鸭坦布苏病毒。该病可危害不同品种的种鸭和蛋鸭，发病率高低不一，群内发病率高达100％，死淘率5％～15％，继发感染时死淘率可达30％。临床上主要表现为发病后2～5d内，鸭群的产蛋量骤然下降，从产蛋高峰迅速下降至30％～10％，严重的甚至停产。研究发现，该病毒主要危害除番鸭外的所有品种产蛋鸭、肉种鸭及野鸭等，最近也有产蛋鸡、鹅自然感染发病的报道。该病的流行给养殖业造成了巨大的损失，而目前尚没有有效的疫苗及药物控制该病的发生。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用，通过在鸭瘟病毒基因中插入修饰后的鸭坦布苏病毒E蛋白基因和修饰后的绿头鸭CD154基因构建得到该组鸭瘟病毒，其具备免疫原性，可用于制备动物疫苗。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种重组鸭瘟病毒，重组鸭瘟病毒的基因组中插入有鸭坦布苏病毒E蛋白基因和绿头鸭CD154基因；鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；绿头鸭CD154基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，鸭坦布苏病毒E蛋白基因的N端添加有自裂解肽。

进一步地，自裂解肽为T2A自裂解肽。

进一步地，绿头鸭CD154基因为进行密码子优化后的核苷酸序列，并在其 N端加入柔性肽。

进一步地，柔性肽的氨基酸序列为：GSAGSAGGG(SEQ ID NO.7)。

上述重组鸭瘟病毒的构建方法，包括以下步骤：

(1)选取鸭瘟病毒TK基因编码区上游和下游序列作为同源臂，分别将其克隆至pEGFP-C1载体中，构建得到载体pDEV-Dtk；

(2)对鸭坦布苏病毒E蛋白基因进行密码子优化，并在其N端添加T2A 自裂解肽，然后将其克隆至pDEV-Dtk载体中，构建得到载体pDEV-TK-DTVE；

(3)对绿头鸭CD154基因进行密码子优化，并在其N端加入柔性肽，然后将其克隆至pDEV-TK-DTVE载体中，构建得到载体pDEV-TK-DTVEF154；

(4)将pDEV-TK-DTVEF154质粒、基因编辑载体和鸭瘟病毒DNA共转染细胞，筛选纯化后获得所述重组鸭瘟病毒。

进一步地，上游和下游的同源臂分别克隆至pEGFP-C1载体的AseI和MluI 酶切位点处。

进一步地，鸭坦布苏病毒E蛋白基因克隆至pDEV-Dtk载体的EcoRI和 BamHI酶切位点处。

进一步地，绿头鸭CD154基因克隆至pDEV-TK-DTVE载体的BamHI酶切位点处。

上述重组鸭瘟病毒在制备疫苗中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明通过在鸭瘟病毒基因中插入修饰后的鸭坦布苏病毒E蛋白基因和修饰后的绿头鸭CD154基因构建得到重组鸭瘟病毒，其具有免疫原性，可用于制备动物疫苗。

附图说明

图1为重组质粒pDEV-TK-DTVE和pDEV-TK-DTVEF154的酶切鉴定结果；

图2为重组鸭瘟病毒接种细胞后形成的绿色荧光嗜斑检测图；

图3为重组鸭瘟病毒的一步生长曲线检测结果图；

图4为重组鸭瘟病毒免疫原性检测结果图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

1、病毒株、质粒和细胞

鸭瘟病毒疫苗株AV1222购自中国兽医药品监察所；HEK293T传代细胞系由畜禽生物制品四川省重点实验室传代保存；鸭坦布苏病毒病活疫苗(WF100 株)购于齐鲁动物保健品有限公司；SPF鸡胚山东济南斯帕法斯家禽科技有限公司，鸭胚购于四川省什邡市某养殖场。CEF细胞根据常规方法制备。pEGFP-C1 载体、pLentiCRISPR v2载体由畜禽生物制品四川省重点实验室保存提供。

2、主要试剂

Lipofectamine 3000转染试剂、DEME培养液、胰酶、胎牛血清、BsmBⅠ内切酶等购于Thermo Fisher Scientific公司。质粒提取试剂盒、病毒核酸提取试剂盒、细胞培养皿、细胞培养板、血清移液管、细胞培养瓶等购于康宁生命科学 (吴江)有限公司。

3、主要仪器

DMIL LED倒置荧光显微镜购于徕卡公司产品；Heraeus multifuge XIR冷冻离心机、Steri-cycle 371培养箱、超低温冰箱、Nanodrop 2000超微量生物检测仪等购于ThermoFisher Scientific公司；BIO-RAD C1000 PCR扩增仪、凝胶成像仪、蛋白电泳仪为美国伯乐公司产品。

实施例1重组质粒的构建

1、根据鸭瘟病毒基因组序列(NC_013036)，选取TK基因编码区上游和下游序列作为上下游同源臂(上游同源臂序列如SEQ ID NO.3所示，下游同源臂序列如SEQ ID NO.4所示)。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成上下游同源臂，分别将上游同源臂克隆至pEGFP-C1载体的AseI和MluI酶切位点处，将构建好的载体命名为pDEV-dTK。

2、根据鸭坦布苏病毒基因组序列(JX273153)中E蛋白编码序列进行密码子优化，在E蛋白N端添加T2A切割肽，然后进行人工合成，将合成好的基因序列定向克隆至pDEV-dTK质粒的EcoRI和BamHI酶切位点处。将构建的质粒命名为pDEV-TK-DTVE。

3、根据绿头鸭CD154基因序列(DQ267671.2)进行密码子优化，将优化后的基因进行人工合成，并将合成的CD154基因定向克隆至pDEV-TK-DTVE 中，使用BamHI酶切位点，在CD154基因序列N端加入柔性肽，其氨基酸序列为：Gly-Ser-Ala-Gly-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO.7)。将构建好的基因命名为pDEV-TK-DTVEF154。上述基因均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成制备。

实施例2重组质粒的鉴定

将pDEV-TK-DTVE载体经BamH1酶切，pDEV-TK-DTVEF154使用EcoR1 和Not1酶切进行鉴定。将鉴定正确的质粒按照Lipofectamine 3000试剂说明书转染HEK293T细胞，转染后48小时观察是否出现特异性绿色荧光。其结果见图1，其中泳道1、2分别为pDEV-TK-DTVE质粒和该质粒经BamH1酶切后的电泳条带，泳道3、4分别为pDEV-TK-DTVEF154质粒和该质粒经EcoR1和Not1 酶切后的电泳条带。

如图1所示，将pDEV-TK-DTVE载体经BamH1酶切，pDEV-TK-DTVEF154 使用EcoR1和Not1酶切后电泳目的条带与预期一致。将pDEV-TK-DTVE、 pDEV-TK-DTVEF154转染HEK293T细胞，转染后48小时能够观察到特异性的绿色荧光，表明质粒构建成功了。

实施例3TK基因编辑载体的构建

以鸭瘟病毒基因组序列(NC_013036)中TK编码序列为靶序列，使用在线 CRISPRsgRNA设计软件(https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html)针对2 条特异性识别切割TK基因的sgRNA。将设计好的sgRNA1： 5'-TATACGCGGACGAGGCATAA-3'(SEQ IDNO.5)和sgRNA2： 5'-TATGAGCCTTAGTACTCTAT-3'(SEQ ID NO.6)按照pLentiCRISPR v2质粒说明书克隆至pLentiCRISPR v2载体中，将测序验证正确的质粒分别命名为pLentiCRISPR-TK1和pLentiCRISPR-TK2。

实施例4重组病毒的构建

按照常规方法提取鸭瘟病毒核酸以及pLentiCRISPR-TK1、 pLentiCRISPR-TK2和pDEV-TK-DTVEF154质粒并传代HEK293T细胞，待细胞汇合度达到70％左右时，按照Lipofectamine 3000试剂说明书将鸭瘟病毒核酸、 pLentiCRISPR-TK1、pLentiCRISPR-TK2和pDEV-TK-DTVEF154转染至 HKE293T细胞。转染后6小时换液。转染后每天观察，每隔2天换液收获上清，将收获的上清接种长满鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)单层的96孔板，挑选含有绿色荧光的嗜斑的孔进行梯度稀释后按照原方法接种长满CEF单层细胞的96 孔板。连续筛选至少3轮后筛选单个嗜斑孔病毒上清接种长满单层CEF的T25 瓶子，待细胞病变达到80％以上时收获病毒上清分装后-80℃保存。

经过3轮纯化成功获得能够表达鸭坦布苏病毒E蛋白和鸭154融合蛋白的重组病毒(rDEV-dTE154)。图2中a为对照组的CEF细胞，b为rDEV-dTE154 接种的CEF细胞。

实施例5重组病毒的遗传稳定性研究

将rDEV-dTE154毒株在CEF中连续传代，每个代次接种后每天观察是否有无EGPF的CPE出现，选择F5、F10、F15、F20代收获病毒液进行PFU测定，培养96小时后在倒置荧光显微镜下观察是否有无荧光嗜斑出现，每个病毒观察至少200个嗜斑。

将rDEV-dTE154毒株在CEF中连续传代，传代过程中均能观察到绿色荧光蛋白的表达。选择F5、F10、F15、F20代收获病毒液进行PFU测定，病毒含量均高于10⁷PFU/mL，F5、F10、F15、F20代病毒培养96小时后在倒置荧光显微镜下至少200个嗜斑，未观察到无荧光嗜斑的出现。

实施例6重组病毒一步生长曲线测定

分别使用DEV亲本毒株和rDEV-dTE154毒株感染CEF细胞，感染后12小时开始每隔12小时收获上清，测定上清中的病毒含量，绘制病毒生长曲线。其结果见图3。

如图3所示，经测定结果发现亲本毒株与两个重组毒株感染后复制动力学基本一致。

实施例7重组病毒免疫原性检测

分别使用DEV亲本病毒株、重组病毒株rDEV-dTE154免疫2周龄鸭瘟和鸭坦布苏病毒抗体阴性雏鸭，免疫剂量为10⁵TCID/羽，免疫前、免疫后2周、4 周采集血清测定鸭瘟和鸭坦布苏病毒中和抗体。免疫后观察并记录是否出现异常反应，其结果见图4，图4中每组柱形图从左到右分别为DEV亲本病毒株、重组病毒株rDEV-dTE154。

DEV亲本病毒株、重组病毒株rDEV-dTE154免疫2周龄鸭瘟和鸭坦布苏病毒抗体阴性雏鸭，免疫后各组采食正常，无异常反应。免疫前、免疫后2周、4 周采集血清测定鸭瘟和鸭坦布苏病毒中和抗体，测定结果如图4所示。中和抗体测定结果显示在免疫鸭中均能检测到鸭瘟病毒抗体，组间差异不显著；免疫重组病毒rDEV-dTE154的鸭中能检测到鸭坦布苏病毒中和抗体。

序列表

<110> 畜科生物工程有限公司

<120> 一种重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1525

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctaccggtc gccaccatgg tgttcagctg tctggggatg cagaaccgag actttgttga 60

gggagtgaat ggtgttgagt ggatcgatgt cgttttggaa ggaggctcat gcgtgactat 120

cacggcaaaa gacaggccga ccatagacgt caagatgatg aacatggagg ccacggaatt 180

agcggttgtg agatcttact gctatgagcc gaaagtgtca gacgtgacga cagaatccag 240

atgcccaacc atgggagagg ctcataatcc caaagcaact tatgctgaat acatatgcaa 300

aaaagatttt gtggacaggg gttggggcaa tggctgtggc ttgtttggaa aggggagcat 360

acagacatgt gccaagtttg actgcgcaaa gaaagcagaa ggcaggatcg tgcagaagga 420

aaacgtccag tttgaagttg cagttttcat acatggttcc acagaagcga gcacctacca 480

caattactca gcccagcagt cgctgaaaca tgccgctaga ttcgttataa cgcccaaaag 540

tcccgtctac accgctgaga tggaggatta tggtaccgtc acactcgaat gtgaaccccg 600

atctggggtt gacatggggc aattctatgt ctttaccatg aacacaaaaa gctggcttgt 660

taacagagac tggtttcatg atctcaattt accatggaca gggtcatcag cgggtacgtg 720

gcaaaacaaa gagtcattga tagaattcga ggaggcccac gccaccaaac aatcagtggt 780

ggctttggca tcacaagaag gagccctcca tgcagcattg gcgggagcta ttccagtgaa 840

gtactctgga agcaaattgg aaatgacctc aggtcatctt aaatgcaggg ttaaaatgca 900

gggcttgaag ctgaaaggaa tgacctaccc gatgtgtagc aatacatttt ccctagtgaa 960

gaatcctacc gacactgggc atggcactgt cgtggtggaa ttgtcttatg cgggtaccga 1020

tgggccctgc agagttccca tatccatgtc ggcagatctg aatgacatga caccagttgg 1080

acgcttgata acagtcaacc catacgtgtc gacttcctcc acgggtgcca agataatggt 1140

ggaagtggaa cctccattcg gggattcatt catcttagtg ggaagtggaa agggacagat 1200

caggtaccag tggcatagaa gtgggagcac aattggaaaa gcttttacat cgacgctcaa 1260

aggagcacaa aggatggttg ctttgggtga cactgcatgg gattttggct cagttggggg 1320

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atttggagga atgtcatgga ttactcaagg catgctgggg gcactgctat tgtggatggg 1440

gctgaatgca agggatagat ccatttctat gacttttcta gccgtaggag gaattttagt 1500

cttcctggca gtaaatgtca atgcc 1525

<210> 2

<211> 672

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagatggaag aggcgttgag cttaaatgaa gactacatct tcctgaggaa agtacagaaa 60

tgccaaacag cagaagttca gaagtcgaca ttgttggact gtgaaaaaat tttaaaaggc 120

ttcaaggacc tccagggcaa gtttcaggat ggggcagcca acaaggaggg gccaaagttt 180

gaaatgcaaa gaggtcatga gcacccccac tcgaagagca ggaatgagac atctgtggca 240

gctgagaaga ggcagccgat tgcaacccac atggcaggac tgaagagcaa caaggcggtg 300

ccagtgctag agtggaacaa gacgagctac gccccaatga acagcttgat atcctaccac 360

aaagggaagc tgaaggtgga gaaggcaggg ctctactaca tctatgcaca agtcagcttc 420

tgcaccaagg cagcggcttc ggcaccgttt accctctata tttatttgta cctccccatg 480

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gtcaacgtga cagactcaac gatagtgaac tacagccatg gcagcaccta ctttggcatc 660

ttcaagctgt ag 672

<210> 3

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgtaatata cgtaatttct gtatcgctgt ttcttcttca tggcgatttg cctgcgattt 60

tgtccagtag tgcgctggcc aattcggtgt tataaaattc ctagaatctg atatgtagcc 120

cgcggagcta tgttctttgc acatatcaag tggggagaaa aagaatcttt ccattgttga 180

ttatacaagc cgatagtttt aagaaatcca atacacttct aatcgacaga ccctcgcaca 240

gctagtaaca aaaaccgttg tcaaacaatt ctttttaaac actcgcgacc agaactcccg 300

cccataataa tcaacactgc cagacaatag gatggtaata tgcgtttctg taataatgca 360

ctagtgttta gttggtctga atatggatgc tacaaatcgc aatactccac cgcctatttg 420

tgtctctgta tcgctacaat taatatcact gtctgatgcg acgccatgct tgccatcata 480

accgtattct ccattaatac catctatatt cgttttgggt tcttcagtat tgtttagtcc 540

tgtatttgtc tgtggtgtaa ccaactgccc ataaccccat agtcgcaata gtcgtacgct 600

atggatccca gttgcattgc cgtgtggtat gttctcgcct gccgcagaac tcgtcccgac 660

gcctgg 666

<210> 4

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taaatatatt tgttttaaat aaagctctga tgggcggttc tgaaactatg acgcatatgt 60

gtgtttattg cctgccacat ttgtaaatgc acgccttcgc tactccctat ttgttttact 120

gtttggagac agttagtata tgttcacgcg agaatataat gcgccattcc gccgagagga 180

cctaggcgag ctttctggga cctcaccgcg gagctagttt tctctacgcg gccgcggttc 240

tgtcccaggt aaagctaacc ggccaacttt agaatgtcgc agcttacggt gctaatatat 300

acagtcatag tttttgaggt tgtaagtgcg gcgtggatag gtgtcgggga agaagatatg 360

agtttaaact ttactcatca cgttatatcg ccagatgttc ttcgccatgc ctttacagga 420

atagtaacgg acagtggacc aactgggcgt agcacatcta caattcatgt atcgtcggtt 480

ctcggcgcgc cgtacggaat aaattccacc gatctgagta atctaaaatg gatacatgca 540

accacaatat tcttcttcgt taccaacccc aaaggaacga agtttacagg tactttgcta 600

ttcgtaccta gagaagcggg cataaaattc agatcaattg actatcctga cagcgttatg 660

cttgcg 666

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatacgcgga cgaggcataa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tatgagcctt agtactctat 20

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Gly Gly

1 5

Claims

1.一种重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述重组鸭瘟病毒的基因组中插入有鸭坦布苏病毒E蛋白基因和绿头鸭CD154基因；所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述绿头鸭CD154基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因的N端添加有自裂解肽。

3.根据权利要求2所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述自裂解肽为T2A自裂解肽。

4.根据权利要求1所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述绿头鸭CD154基因为进行密码子优化后的核苷酸序列，并在其N端加入有氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的柔性肽。

5.权利要求1～4任一项所述的重组鸭瘟病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)对鸭坦布苏病毒E蛋白基因进行密码子优化，并在其N端添加T2A自裂解肽，然后将其克隆至pDEV-Dtk载体中，构建得到载体pDEV-TK-DTVE；

6.根据权利要求5所述的重组鸭瘟病毒的构建方法，其特征在于，所述基因编辑载体为pLentiCRISPR-TK1质粒和pLentiCRISPR-TK2质粒；其构建方法为：

以鸭瘟病毒基因组序列中TK编码序列为靶序列，将SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列分别克隆至pLentiCRISPR v2载体中，即可构建得到pLentiCRISPR-TK1质粒和pLentiCRISPR-TK2质粒。

7.权利要求1～4任一项所述的重组鸭瘟病毒在制备疫苗中的应用。