CN105039268A - 表达鸭坦布苏病毒e蛋白的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用，该重组鸭瘟病毒的基因组中插入有鸭坦布苏病毒E蛋白基因，所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.9所示。所述构建方法包括：(1)将pDEV-vac中gfp基因的CMV启动子替换成EF1启动子，获得pDEV-EF1；(2)将Pcmv-E-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1，获得pDEV-E；(3)将pDEV-E转染鸡胚成纤维细胞，拯救获得所述重组鸭瘟病毒。所述重组鸭瘟病毒与亲本毒株相比，其病毒蚀斑大小不具有显著差异，说明鸭坦布苏病毒E蛋白基因的插入不影响鸭瘟病毒在鸡胚成纤维细胞上的扩散。所述重组鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞后成功表达E蛋白，为鸭瘟病毒-鸭坦布苏病毒二联疫苗的研制奠定了基础。

Description

表达鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种表达鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用。

背景技术

2010年4月以来,我国鸭主产区的蛋鸭和种鸭爆发一种新的传染病，该病以传播迅速、产蛋量骤降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征。通过病原分离鉴定和全序列测定，明确该病原属于黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)、蚊媒病毒类(Mosquito-borne)、Ntaya病毒群,与该群Tembusu病毒(TMUV)具有最近的遗传进化关系，可以认为是TMUV的一个新成员，暂定名为鸭坦布苏病毒(DuckTembusuvirus，DTMUV)(SuJ,LiS,HuX,etal.Duckegg-dropsyndromecausedbyBYDvirus,anewTembusu-relatedflavivirus[J].PLoSOne,2011,6(3):e18106)。该病可危害不同品种的种鸭和蛋鸭，发病率高低不一，群内发病率高达100％，死淘率5％～15％，继发感染时死淘率可达30％(曹贞贞,张存,黄瑜,等.鸭出血性卵巢炎的初步研究[J].中国兽医杂志，2010，46(12)：3-6.)(CaoZ,ZhangC,LiuY,etal.Tembusuvirusinducks,china[J].EmergingInfectiousDiseases,2011,17(10):1873-1875.)。临床上主要表现为发病后2～5d内，鸭群的产蛋量骤然下降，从产蛋高峰迅速下降至30％～10％，严重的甚至停产。研究发现，该病毒主要危害除番鸭外的所有品种产蛋鸭、肉种鸭及野鸭等，最近也有产蛋鸡(陈仕龙,陈少莺,王劭,等.一种引起蛋鸡产蛋下降的新型黄病毒的分离与初步鉴定[J].福建农业学报,2011,26(2):170-174.)、鹅自然感染发病的报道(赵冬敏,黄欣梅,刘宇卓,等.新型黄病毒在种鹅中垂直传播的研究[J].南方农业学报,2012,43(1):99-102.)。该病的流行给养殖业造成了巨大的损失，而目前尚没有有效的疫苗及药物控制该病的发生。

随着病原学研究的深入和病毒基因组的破译，发现该病毒对鸡红细胞无血凝活性，病毒直径约45nm，有囊膜。病毒基因组为不分节段的单股正链RNA，由10990个核苷酸组成，具有典型的黄病毒基因组结构特点。病毒基因组编码一个大多聚蛋白，由3426个氨基酸构成，该多聚蛋白前体经过病毒自身和宿主细胞的蛋白酶，被切割成至少十种成熟的蛋白，其中包括3个结构蛋白(核衣壳蛋白C、膜蛋白prM、囊膜蛋白E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b与NS5)(YunT,YeW,NiZ,etal.IdentificationandmolecularcharacterizationofanovelflavivirusisolatedfromPekinducklingsinChina[J].VeterinaryMicrobiology,2012,157(3-4):311-319.)。E蛋白全长501个氨基酸，位于成熟病毒颗粒表面，构成病毒颗粒的突起。E蛋白是黄病毒的主要结构蛋白，在病毒感染靶细胞的受体结合、膜融合和侵入过程中起着关键作用；同时，E蛋白具有较好的免疫原性和反应原性，是宿主抗感染免疫的主要保护性抗原，也是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原(GublerDJ,KunoG,MarkoffL.Flaviviruses.InFieldsVirology.KnipeDM,andHowleyPM(eds).Philadelphia:LippincottWilliamsandWilkins,2007:1153-1252.)。

发明内容

本发明提供了一种表达鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭瘟病毒，具有制备双联疫苗的潜质。

一种重组鸭瘟病毒，所述重组鸭瘟病毒的基因组中插入有鸭坦布苏病毒E蛋白基因，所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。

优选的，所述基因组插入有Pcmv-E-BGH-pA表达框；其中E表示鸭坦布苏病毒E蛋白基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾；所述基因组中gfp基因的CMV启动子替换为EF1启动子。

优选的，所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因插入在所述基因组的US7基因和US8基因之间。

优选的，所述的以鸭瘟病毒的疫苗株作为活载体。鸭瘟病毒作为病毒活载体具有疫苗生产、储存和免疫技术成熟，且安全性良好的优势。

本发明还提供了一种重组鸭瘟病毒的构建方法，包括以下步骤：

(1)将pDEV-vac中gfp基因的CMV启动子替换成EF1启动子，获得pDEV-EF1；

(2)将Pcmv-E-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1，获得pDEV-E；

(3)将pDEV-E转染鸡胚成纤维细胞，拯救获得所述重组鸭瘟病毒；

其中pDEV-vac为携带鸭瘟病毒疫苗株全基因组的感染性细菌人工染色体，E表示鸭坦布苏病毒E蛋白基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾；一般情况下p起始表示质粒，r起始表示病毒；

所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。

所述CMV启动子替换成EF1启动子的方法为：

(1)以pEP-EF1-in为模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物，扩增获得目标片段；

(2)将所述目标片段转入pDEV-vac/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得pDEV-kanEF1；

(3)敲除pDEV-kanEF1中的kan抗性基因，获得pDEV-EF1；

所述的pEP-EF1-in质粒图谱如图6所示；

所述的pDEV-vac/GS1783为携带pDEV-vac的大肠杆菌GS1783。

所述Pcmv-E-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1的方法为：

(1)人工合成所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因，插入pEP-BGH-end，获得pEP-BGH-E；

(2)以pEP-BGH-E为模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物，扩增获得目标片段；

(3)将所述目标片段转入pDEV-EF1/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得pDEV-kanE；

(4)敲除pDEV-kanE中的kan抗性基因，获得pDEV-E；

所述的pEP-BGH-end质粒图谱如图7所示。

本发明在鸭瘟病毒疫苗株的基础上，结合RedE/T重组技术将pDEV-vac上gfp基因的CMV启动子替换为EF1启动子，以便于E基因准确插入到pDEV-EF1的预期位置，同时有利于启动E基因的表达。该技术不需要特定的限制性酶切位点，只需较短的同源序列，即可在生物体内完成重组过程，省去了体外DNA酶切、连接等步骤。

本发明又提供了所述的重组鸭瘟病毒在制备动物疫苗中的应用。

本发明得到的重组鸭瘟病毒与亲本毒株相比，其病毒蚀斑大小不具有显著差异，说明鸭坦布苏病毒E蛋白基因的插入不影响鸭瘟病毒在鸡胚成纤维细胞上的扩散。

本发明得到的重组鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞后成功表达E蛋白，为鸭瘟病毒-鸭坦布苏病毒二联疫苗的研制奠定了基础。

附图说明

图1为重组克隆pDEV-EF1的XbaⅠ酶切鉴定图，其中1：pDEV-EF1；2：pDEV-kanEF1；3：pDEV-vac。

图2为重组克隆pDEV-E的BamHⅠ和XbaⅠ酶切鉴定图，其中a为以参考序列GenBank(EU082088.2)进行预测的结果，b为电泳图谱；1：pDEV-vac；2：pDEV-EF1；3：pDEV-E。

图3为荧光显微镜下(100×)重组病毒出现的荧光噬斑图，其中a：rDEV-BAC；b：rDEV-EF1；c：rDEV-E。

图4为rDEV-BAC、rDEV-EF1和rDEV-E在CEFs上的蚀斑面积测定及比较图。

图5为Westernblotting方法检测rDEV-E病毒感染细胞中E蛋白的表达图，其中1：rDEV-EF1；2：rDEV-E。

图6为pEP-EF1-in载体质粒图谱。

图7为pEP-BGH-end载体质粒图谱。

具体实施方式

下列实施中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.赛德曼等主编，马学军，舒跃龙译，北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

1、序列优化、引物设计及合成

鸭坦布苏病毒E基因序列参考GenBank(JF270480.1)，由GenScript公司以鸡为宿主进行优化合成；引物分别参考序列GenBank(EU082088.2)、鸭坦布苏病毒E基因优化序列设计，由上海生工合成；

引物EF1-ep1和EF1-ep2用于以EF1启动子替换pDEV-vac中gfp基因的启动子Pcmv，构建pDEV-EF1。下划线部分与pEP-EF1-in质粒序列同源，斜体序列分别和pDEV-vac序列中gfp基因的启动子Pcmv上、下游序列同源；

引物pDEVvac-in-s和pDEVvac-in-as用于将表达框Pcmv-E-BGH-pA插入到DEV基因组的US7基因和US8基因之间。下划线部分与pEP-BGH-E同源，粗体部分分别与位于US7和US8基因间插入位点上、下游的序列同源；

引物EF1-JD-F和EF1-JD-R用于EF1启动子替换是否成功的鉴定；

引物Rec-JD-F和Rec-JD-R用于外源基因插入BAC基因组中的验证。

表1

2、pDEV-vac的CMV启动子替换成EF1启动子

本发明所用的携带有鸭瘟病毒疫苗株全基因组感染性细菌人工染色体(BAC)克隆的pDEV-vac/GS1783菌株是由浙江省农业科学院畜牧研究所构建并保存(ChenL,YuB,HuaJ,etal.Constructionofafull-lengthinfectiousbacterialartificialchromosomecloneofduckenteritisvirusvaccinestrain[J].VirolJ,2013,10:328.)。将pDEV-vac/GS1783菌株接种于氯霉素(CAM)抗性的LB培养基中，32℃220r/min培养至OD₆₀₀为0.5～0.7，42℃水浴摇床摇15min以诱导Red重组酶表达，按常规方法制备电转化感受态细胞。

本发明所用的pEP-EF1-in质粒由浙江省农科院畜牧兽医研究所保存(由德国柏林自由大学马光刚博士赠送)，所述质粒图谱如图6所示。以pEP-EF1-in质粒为模板，用引物对EF1-ep1和EF1-ep2扩增，得到2358bp的片段。胶回收纯化片段，取200ng电转化至pDEV-vac/GS1783感受态细胞中，涂布于CAM/卡那霉素(Kan)双抗性平板上，于32℃培养36h；挑取阳性克隆提取质粒，XbaⅠ酶切筛选正确重组的克隆(pDEV-kanEF1)进行第二次重组。

第二步Red重组将pDEV-kanEF1质粒中的Kan抗性基因删除，具体方法为:接种pDEV-kanEF1菌落于液体培养基，于32℃220r/min培养过夜，次日转接于2mLCAM-LB中，振荡培养2～4h，加入等量2％L-阿拉伯糖，继续培养1h诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶，然后再转入42℃水浴摇床培养30min进行Red重组，最后32℃培养1h；将细菌悬液作10^-3～10^-5稀释后涂布于CAM平板，32℃孵育24～48h，挑取菌落同时点种于CAM和Kan平板；XbaⅠ酶切分析Cam阳性和Kan阴性的菌落，以筛选正确重组的克隆pDEV-EF1。

以pDEV-EF1为模板，用引物对EF1-JD-F和EF1-JD-R进行PCR扩增，胶回收后克隆至pMD18-TVector，选取阳性克隆送至Invitrogen公司测序，测序结果与预期一致。

分别提取pDEV-kanEF1、pDEV-EF1和pDEV-vacDNA，经XbaⅠ酶切、电泳，电泳图谱(图1)显示pDEV-kanEF1比pDEV-vac多一条约10000bp左右的条带(如图1箭头所示)，而pDEV-EF1较pDEV-kanEF1少一条约10000bp左右的条带，与预期结果一致。

3、pEP-BGH-E质粒的构建

本发明所用的鸭坦布苏病毒E基因序列参考GenBank(JF270480.1)，由GenScript公司以鸡为宿主进行优化合成；所用的pEP-BGH-end质粒均由浙江省农科院畜牧兽医研究所保存(由南京农业大学孙学强博士赠送)，质粒图谱如图7所示。以鸡为宿主进行优化合成的DTMUVE基因在合成时在其5’和3’端分别引入了KpnⅠ和NotⅠ酶切位点，将片段用KpnⅠ和NotⅠ进行双酶切之后插入到pEP-BGH-end相应的酶切位点中；通过PCR和酶切鉴定筛选获得阳性克隆，送Invitrogen生物公司测序，测序结果与预期一致。

4、重组pDEV-E突变体的构建

将pDEV-EF1/GS1783菌株接种于氯霉素(CAM)抗性的LB培养基中，32℃220r/min培养至OD₆₀₀为0.5～0.7，42℃水浴摇床摇15min以诱导Red重组酶表达，按常规方法制备电转化感受态细胞。

以pEP-BGH-E质粒为模板，用引物pDEVvac-in-s和pDEVvac-in-as(序列见表1)扩增长度约为3653的片段，胶回收纯化片段，取200ng电转化至pDEV-EF1/GS1783感受态细胞中，涂布于CAM/Kan双抗性平板上，于32℃培养36h。挑取阳性克隆提取质粒，酶切筛选正确重组的克隆pDEV-kanE进行第二次重组。

第二步Red重组将pDEV-kanE质粒中的Kan抗性基因删除。具体方法为:接种pDEV-kanE菌落于液体培养基，于32℃220r/min培养过夜，次日转接于2mLCAM-LB中,振荡培养2～4h，加入等量2％L-阿拉伯糖，继续培养1h诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶,然后再转入42℃水浴摇床培养30min进行Red重组，最后32℃培养1h。将细菌悬液作10^-3～10^-5稀释后涂布于CAM平板，32℃孵育24～48h，挑取菌落同时点种于CAM和Kan平板。酶切分析Cam阳性和Kan阴性的菌落，以筛选正确重组的克隆pDEV-E。

以pDEV-E为模板，用引物Rec-JD-F和Rec-JD-R(序列见表1)扩增，获得大小约3104bp的片段，胶回收后克隆至pMD18-T载体，选取阳性克隆送至Invitrogen公司测序。测序结果与预期一致。

分别提取pDEV-vac、pDEV-EF1和pDEV-EDNA，经过BamHⅠ和XbaⅠ酶切鉴定，电泳图谱(图2b)与以参考序列GenBank(EU082088.2)进行预测的结果(图2a)基本一致，说明外源基因按照预期结果插入。

5、重组病毒rDEV-E的拯救

本发明所用的9-11日龄SPF鸡胚购自浙江荐量生物技术公司。用碱裂解法提取pDEV-vac、pDEV-EF1和pDEV-E，根据Promega磷酸钙转染试剂盒说明书分别转染CEFs，于37℃5％CO₂继续培养，48h后荧光显微镜下观察发现均出现荧光噬斑，待细胞80％以上出现荧光时收获病变细胞培养物，即获得拯救病毒，分别命名为rDEV-BAC、rDEV-EF1和rDEV-E(图3a-c)。

6、重组病毒蚀斑大小的测定

将rDEV-BAC、rDEV-EF1和rDEV-E病毒冻存液用不同稀释度进行稀释，接种于12孔板中的单层CEFs上，2h后，换上含有1.5％甲基纤维素的DMEM培养基，放于37℃CO₂培养箱培养48h，在荧光显微镜下每种病毒各拍100张蚀斑照片，用ImageJ软件来测量不同病毒的蚀斑面积，计算各病毒的平均值，将rDEV-EF1蚀斑面积设成100％，其他病毒蚀斑面积以之为标准换算成百分比。将rDEV-E的蚀斑面积与rDEV-BAC进行比较，发现rDEV-E蚀斑面积较rDEV-BAC减少了8.3％(P＝0.120)。与亲本毒株rDEV-EF1进行比较，发现rDEV-E蚀斑面积较rDEV-EF1减少了18.4％(P＝0.002)(图4)。

7、蛋白表达分析

分别接种rDEV-E和对照毒株rDEV-BAC于96孔板的CEFs细胞中，培养72h，PBS(pH7.0)洗涤三次，收获细胞。细胞样品于SDS-PAGE电泳完毕，采用半干转移法将蛋白转移至PVDF膜上，取出PVDF膜，放入封闭液中4℃封闭过夜。以小鼠抗TUMVE蛋白DIII结构域多克隆抗体(1：500稀释)作为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1：5000稀释)作为二抗于37℃孵育1h，最后用ECL方法进行显色。结果显示rDEV-E感染的细胞样品较rDEV-EF1感染的细胞样品在约52～55kDa处多出特异性条带(图5)，说明E蛋白获得了表达。

Claims (8)

1.一种重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述重组鸭瘟病毒的基因组中插入有鸭坦布苏病毒E蛋白基因，所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。

2.如权利要求1所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述基因组插入有Pcmv-E-BGH-pA表达框；其中E表示鸭坦布苏病毒E蛋白基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾；所述基因组中gfp基因的CMV启动子替换为EF1启动子。

3.如权利要求1所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因插入在所述基因组的US7基因和US8基因之间。

4.如权利要求1所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，以鸭瘟病毒的疫苗株作为活载体。

5.一种重组鸭瘟病毒的构建方法，包括以下步骤：

(1)将pDEV-vac中gfp基因的CMV启动子替换成EF1启动子，获得pDEV-EF1；

(2)将Pcmv-E-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1，获得pDEV-E；

(3)将pDEV-E转染鸡胚成纤维细胞，拯救获得所述重组鸭瘟病毒；

其中pDEV-vac为携带鸭瘟病毒疫苗株全基因组的感染性细菌人工染色体克隆，E表示鸭坦布苏病毒E蛋白基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾；

所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。

6.如权利5所述的构建方法，其特征在于，所述CMV启动子替换成EF1启动子的方法为：

(1)以pEP-EF1-in为模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物，扩增获得目标片段；

(2)将所述目标片段转入pDEV-vac/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得pDEV-kanEF1；

(3)敲除pDEV-kanEF1中的kan抗性基因，获得pDEV-EF1；

所述的pDEV-vac/GS1783为携带pDEV-vac的大肠杆菌GS1783。

7.如权利5所述的构建方法，其特征在于，所述Pcmv-E-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1的方法为：

(1)人工合成所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因，插入pEP-BGH-end，获得pEP-BGH-E；

(2)以pEP-BGH-E为模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的引物，扩增获得目标片段；

(3)将所述目标片段转入pDEV-EF1/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得pDEV-kanE；

(4)敲除pDEV-kanE中的kan抗性基因，获得pDEV-E。

8.如权利要求1-4任一所述的重组鸭瘟病毒在制备动物疫苗中的应用。