CN104651322A - 一种重组狂犬病病毒的构建及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组狂犬病病毒株，是在对狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列进行反向遗传操作而获得的狂犬病病毒基因组中插入2个狂犬病病毒G基因，得到具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。由本发明构建的重组病毒株具有更好的安全性和免疫原性，适用于制备狂犬病灭活疫苗。

Description

一种重组狂犬病病毒的构建及培养方法

技术领域

本发明涉属于重组疫苗领域。尤其涉及一种表达3G基因重组狂犬病病毒的构建。

背景技术

狂犬病是一种很重要的人畜共患病，每年约造成60000人死亡。在很多辅助中构建，狗仍是造成人感染狂犬病的主要原因，而在发达国家，狂犬病病毒主要存在于野生动物宿主。实践证明，对动物如狗进行免疫能显著降低人狂犬病的发病率，因此对动物实施免疫对控制狂犬病及为重要。

狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病毒属，基因组是不分节段的单股负链RNA，全长约12Kb，编码5种病毒蛋白：核蛋白N、磷蛋白P、基质蛋白M、糖蛋白G和RNA聚合酶L。位于囊膜上的糖蛋白G是主要的致病因子，同时也是诱导保护性免疫反应的主要抗原。

目前，狂犬病病毒SAD Bern(Sanafox)株在欧洲一直作为野生动物狂犬病免疫的活疫苗，其具有较高的保护性和安全性。鉴于弱毒活疫苗在使用过程中存在较大的安全隐患，我国农业部规定狂犬病的预防必须使用灭活疫苗。

为获得高效的、免疫原性更佳的狂犬病毒毒株，本研究利用反向遗传技术构建了一个含有3个同源G基因的狂犬病病毒。我们鉴定了该重组病毒株的生物学特性，并将其与亲本毒株SAD Bern(Sanafox)进行了比较。结果表明重组病毒RV-r3G与rSAD Bern(Sanafox)相比具有更好的安全性和免疫原性，适用于狂犬病毒灭活疫苗的开发。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种狂犬病毒毒株的构建及培养方法，该毒株的免疫原性更佳。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种重组狂犬病病毒株，它是在对狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列进行反向遗传操作而获得的狂犬病病毒基因组中插入2个狂犬病病毒G基因，得到具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，即RV-r3G狂犬病病毒。

其中，所述的对狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列进行反向遗传操作而获得狂犬病病毒基因组包括：根据狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列，得到8个互补DNA片段F1～F8；将所述的8个互补DNA片段F1～F8进行人工合成，得到所述的狂犬病病毒基因组。

优选地，所述狂犬病病毒基因组F1段的5’端引入PmeI酶切位点和锤头状核酶(HamRz)、在F8的3’端引入NotI酶切位点和丁肝病毒核酶。

其中，所述2个狂犬病病毒G蛋白根据狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列获得，具体包括：根据狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列，得到G基因；通过对G基因进行扩增，得到所述的2个狂犬病病毒G基因；通过PCR重叠技术，将所述的2个狂犬病病毒G基因串联在一起，得到2G基因。

为实现本发明的目的，本发明另一方面提供一种重组狂犬病病毒株的构建及培养方法，包括以下步骤：

对狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列进行反向遗传操作，获得狂犬病病毒基因组；

根据SAD Bern全基因组序列，得到2个G基因；

将所得到的2个G基因插入到所述狂犬病病毒基因组中，得到具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列的重组狂犬病病毒。

其中，所述的对狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列进行反向遗传操作，获得狂犬病病毒基因组包括：根据狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列，得到8个互补DNA片段F1～F8；对所述的8个互补DNA片段F1～F8进行人工合成，得到所述的狂犬病病毒基因组。

特别是，在所述狂犬病病毒基因组F1段的5’端引入PmeI酶切位点和锤头状核酶(HamRz)、在F8的3’端引入NotI酶切位点和丁肝病毒核酶。

其中，所述的根据SAD Bern全基因组序列得到2个G基因包括：根据狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列，得到N基因、P基因、L基因和G基因；通过对所述G基因进行扩增，得到所述的2个狂犬病病毒G基因；通过PCR重叠技术，将所述的2个狂犬病病毒G基因串联在一起，得到2G基因。

其中，将2个G基因插入到所述狂犬病病毒基因组中包括：利用限制性内切酶与连接酶，将所述狂犬病病毒基因组及N基因、P基因、L基因、G基因分别连接到质粒pcDNA中，分别得到SAD Bern(Sanafox)基因组全长cDNA克隆质粒pcDNA-SAD和辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L、pcDNA-G。将所述2G基因在所述克隆质粒pcDNA-SAD中的G基因与L基因之间进行插入，获得含有3G基因的重组全长质粒pcDNA-SAD3-3G。

特别是，在所述克隆质粒pcDNA-SAD的在G基因和L基因之间引入BsiWI和Nhe I酶切位点，便于连接2G基因。

特别是，所述重组狂犬病病毒株的构建及培养方法还包括：将所述辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L、pcDNA-G和质粒pcDNA-SAD-3G进行混合，并加入转染试剂，共同转染宿主细胞，得到重组病毒；对重组病毒进行RT-PCR鉴定、序列测定及纯化，获得重组病毒株。

特别是，随所述质粒pcDNA-SAD-3G和质粒pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L、pcDNA-G进行混合的混合比例为30-50:8-12:3-7:1-5:0.5-1.5。

特别是，所述共同转染宿主细胞，还包括：进行所述共同感染前，对宿主细胞用含有10％牛血清的MEM培养基培养，并在转染前一天，将BSR细胞以4×10⁵个细胞/孔的细胞密度接种到6孔板中，使培养细胞生长至80％～90％单层。

其中，所述宿主细胞选自BSR细胞、mNA细胞或BHK-21细胞中的一种。

特别是，所述共同转染宿主细胞还包括：对转染后的宿主细胞进行冻融处理，对冻融后的宿主细胞进行盲代培养后，与抗体进行反应，得到具有感染性的重组病毒株。

特别是，所述冻融处理为2～3次，以便释放细胞中的病毒。

特别是，所述盲代培养为2～3代。

其中，将所述制得具有感染性的重组狂犬病病毒置于-70～-79℃的温度条件下保存。

本发明的有益效果体现在以下方面：

1、本发明的重组狂犬病病毒株，在对狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列进行反向遗传操作而获得的狂犬病病毒基因组中插入2个狂犬病病毒G基因后，具有优良的免疫原性，灭活的重组病毒可诱导比野生型更高的中和抗体水平，可以作为人和动物的狂犬病灭活疫苗种毒株。

2、本发明的重组狂犬病病毒株的构建及培养方法简单，拯救效率高，适用性广。

附图说明

图1是本发明所述的3G基因的SAD Bern基因组的构建过程；

其中：a是本发明所述的狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列F1～F8,以及是构建全长需要的酶切位点示意图；b是本发明所述的将2G基因插入到狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列F1～F8中构建重组狂犬病毒的基因组示意图。

图2是实施例1的中间接免疫荧光检测结果；

其中，A为SAD B感染BSR细胞的间接免疫荧光检测结果；B为RV-r3G感染BSR细胞间接免疫荧光检测结果；C为BSR细胞阴性对照间接免疫荧光检测结果。

图3是实施例1的RT-PCR检测3G重组病毒；的检测结果

其中，Line1和line 2为RV-r3G重组病毒；3.DNA Marker；

图4是实施例1的SAD Bern和RV-r3G(重组狂犬病毒)在mNA(A)和BSR(B)上的生长动力学曲线；

图5是实施例4的中和抗体滴度试验结果。

具体实施方式

材料：pCAGGS购自拓飞生物科技有限公司；pcDNA3.1购自life technology；BSR细胞(ATCC CCL-10)、mNA(CCL-131)购自ATCC；培养基分别为含10％胎牛血清的DMEM(GIBCO)和MEM(GIBCO)。

试剂：Trizol Reagent、Pfx DNAPolymerase、Zero Blunt PCR Cloning Kit、转染试剂LipofectamineTM2000Reagent均购自Life Technology公司；T4DNA连接酶和限制性内切酶均购置NEB；Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture、随机引物、DL15000Marker均购自TaKaRa公司；M-MLV反转录酶、RNase抑制剂均购自Promega；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自AxyGen公司；狂犬病抗原ELISA检测试剂盒购自武汉生物制品所；大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞由实验室保存；DMEM购自Gibco公司；鼠抗狂犬病病毒高免血清由中国兽医药品监察所制备；FITC标记的羊抗鼠荧光二抗购自Sigma公司，

仪器：普通显微镜和荧光显微镜购自leica公司；PCR仪购自AppliedBiosystem公司。P2级生物安全柜购自苏州公司；-70℃超低温冰箱购自NBS公司；普通冰箱冰柜购自海尔公司；全自动净水机购自BIOCEL公司；各种规格细胞瓶及细胞培养板均购自CORNING公司。

实施例1

1、构建前的准备

1A)cDNA的构建

根据Gene Bank公布的SAD Bern(Sanafox)全基因组序列，将SAD Bern(Sanafox)株基因组序列分为8个独立的基因组片段(如图1所示)，以上述8个独立的基因片段的碱基序列为模板，利用逆转录酶进行生工合成(南京钟鼎生物科技有限公司)，得到与8个独立的基因组片段相同的互补DNA(cDNA)片段F1～F8，并在F1的5’端引入PmeI酶切位点和锤头状核酶(HamRz)、在F8的3’端引入NotI酶切位点和丁肝病毒核酶，从而获得含有锤头状核酶的F1基因片段，和含有丁肝病毒核酶的F8基因片段。再将合成制备的F1～F8的基因片段分别克隆到pCR-Blunt载体质粒中，得到8个分别含有F1～F8基因序列的载体质粒(克隆的具体方法见《分子克隆试验指南》，J.萨达姆鲁克编，2008年第三版，科学出版社译。)

1B)辅助质粒的构建

以SAD Bern(Sanafox)株的N、P、L、G基因序列为模板，分别进行N、P、L、G基因的基因合成，并在每段基因片段引入多克隆酶切位点，通过酶切位点分别将N、P、L、G基因构建到含有相应酶切位点序列的多个pcDNA3.1的表达载体中，得到表达N基因的辅助质粒pcDNA-N、含有P基因的辅助质粒pcDNA-P、含有L基因的辅助质粒pcDNA-L、含有G基因的辅助质粒pcDNA-G。

1C)2G基因的获得

通过重叠PCR方法扩增获得含有2个G基因的表达单位，其上含有转录起始序列、转录终止序列及两端的酶切位点BsrG I和Nhe I。

2、含有SAD Bern(Sanafox)基因组的全长cDNA的构建

2A)组装基因组片段

将上述构建好的F1～F8基因cDNA片段，利用基因组片段相邻重叠部分的限制性酶切位点发生连接，获得同时含有F1～F8基因并依次连接的基因组，利用pcDNA3.1上的PmeI和NotI酶切位点将F1～F8基因片段连接到pcDNA3.1载体上，获得SAD Bern(Sanafox)基因组全长cDNA克隆质粒pcDNA-SAD。

该克隆在pcDNA3.1载体上游的CMV启动子之下，两个核酶之间的全长cDNA可以在真核细胞RNA聚合酶的作用下得到转录，并且由于核酶的自身催化功能，可以保证转录产物的3’末端与病毒基因组精确一致。

2B)含有3G基因的基因组全长CDNA的构建

在病毒基因组转录质粒pcDNA-SAD的基础上，利用重叠PCR方法在G和L之间引入BsiW I和Nhe I酶切位点，进行克隆，获得含有BsiW I和Nhe I酶切位点的全长cDNA，再将2个串联的SAD Bern(Sanafox)株的G基因(序列信息见序列表SEQID NO：1)通过酶切和T4DNA连接酶将两个串联的G基因连接到pcDNA-SAD内，获得重组全长质粒pcDNA-SAD-3G(如图1所示)。

3、病毒拯救

3A)BSR细胞的扩增

用含有10％牛血清的MEM培养BSR细胞，转染前一天，将BSR细胞以4×10⁵个细胞/孔的细胞密度接种到6孔板中，培养细胞生长至80％～90％单层。

为了使病毒能够健康的传染到BSR细胞中，在BSR细胞在容器中生长到80％～90％时，进行传染。此时的细胞生长力强，病毒可以正常的在细胞中成长。

3B)质粒的转染

采用脂质体介导法将质粒pcDNA-SAD-3G和质粒pcDNA-N、质粒pcDNA-P、质粒pcDNA-L、质粒pcDNA-G以40:10:5:3:1的比例混合(同样的，将质粒pcDNA-SAD-3G和质粒pcDNA-N、质粒pcDNA-P、质粒pcDNA-L、质粒pcDNA-G以30-50:8-12:3-7:1-5:0.5-1.5的比例混合适用于本发明)，并加入转染试剂LipofectamineTM2000Reagent，得到质粒-转染试剂的混合液，再将该混合液置于温度为37℃、CO₂含量为5％的温箱内共同转染BSR细胞，4-6天后对转染后的BSR细胞进行2次冻融处理，即将转染后的BSR细胞置于0～-120℃的冰箱中冷冻30～80min，使细胞中的水分子形成冰晶，破坏细胞的结构，再将冷冻的细胞置于0～37℃的温箱中融化，将细胞中的病毒从细胞中释放出来，获得病毒第一冻融液，为了使细胞中的病毒完全释放出来，对融化的细胞再进行一次冻融处理，收获病毒第二冻融液。取病毒溶液的悬浮液300μL继续接种于BSR细胞单层，进行盲传2代后，每传代一次对细胞进行冻融处理一次，并将第3代的冻融液做10^-1～10^-5稀释，并接种于生长在96孔板的BSR细胞上。继续培养2天后，将PBS鼠抗狂犬病毒高免血清以1:50的稀释倍数进行稀释，并将稀释后的鼠抗狂犬病毒高免血清标为一抗，以荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(Sigma)为二抗，以1:50倍稀释小鼠阴性血清，并将稀释后的小鼠阴性血清标为对照，将一抗、二抗及对照分别与BSR细胞发生反应，并置于荧光显微镜下观察显色情况，检测结果呈阳性，且病毒滴度达到3.27×10^7.5FFU/ml，根据拯救病毒滴度，将病毒进行1：10稀释传代，制得具有感染性的重组狂犬病病毒，命名为RV-r3G(以下简称RV-r3G)，并将制备好的RV-r3G保存于-70℃。

4、RT-PCR鉴定及序列测定

取500μL制备好的RV-r3G，用Trizol提取病毒RNA，用上游引物5‘ATGGTTCCTCAGGTTCTTTTG’3和下游引物5‘TCACAGTCTGGTCTCGCCTCC’3对制备好的RV-r3G进行RT-PCR方法扩增含有3个G基因的片段，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳筛选和分离，纯化RV-r3G的基因序列，获得拯救成功的RV-r3G重组病毒株。

5、种毒的制备及滴定

将上述拯救的RV-r3G重组病毒株置于培养在6％牛血清的MEM培养基的BSR细胞上进行扩增，在37℃的条件下培养3天后，收获病毒后并测定病毒滴度，即将病毒用无血清MEM培养基连续10倍稀释至10^-8，每个稀释度做8个重复孔接种培养于96孔板的单层BSR细胞。培养48h后，进行直接免疫荧光检测(DFA检测)病毒(检测结果如图2所示)，病毒滴度用病灶形成单位(Focusforming unit)FFU表示。

6、多步生长曲线的测定

为验证RV-r3G重组病毒在G-L区引入两个G基因后是否影响病毒的生长性质，以野生病毒SAD Bern(Sanafox)为对照，将RV-r3G重组病毒和野生病毒SADBern(Sanafox)分别以0.01的感染指数(MOI)感染BSR细胞(同样的，mNA细胞也适用于本发明)，感作1h后添加含有2％胎牛血清的MEM培养基于37℃的条件下进行培养，分别于接种后24h、48h、72h、96h和120h时收获病毒，确定狂犬病毒的体外嗜神经指数，即病毒在mNA细胞相对于BSR细胞上感染性比例(计算结果如表1所示)，并绘制出分别感染BSR细胞和mNA细胞时，RV-r3G重组病毒和SAD Bern(Sanafox)病毒的生长曲线(如图4所示)，数据表明，RV-r3G在两种细胞上的生长性能与野生型SAD Bern(Sanafox)没有显著差异，这表明从基因组全长cDNA拯救出来的RV-r3G的生长特性与野生型SAD Bern(Sanafox)是一致的，说明在G-L区之间引入两个G基因没有影响病毒的复制。

7、检测G基因的表达

将重组病毒RV-r3G进行10倍倍比稀释，将10^-3、10^-4、10^-5稀释度的重组病毒液作为被检样品，应用酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)法检测G基因的表达。检测方法见狂犬病抗原ELISA检测试剂盒说明书，检测病毒液中G蛋白的含量(检测结果如表2所示)。

试验例1

重组病毒对小鼠的致病性试验

将救获的病毒和野生病毒SAD Bern(Sanafox)用灭菌PBS作10倍倍比稀释至10^-7，将10^-4～10^-7各稀释度分别取30μL，对5只5～6周龄的Balb/c雌性小鼠进行脑内接种，接种后，连续观察21天，每天记录小鼠的死亡数量，并利用Reed-Muench法计算小鼠半数致死量(LD₅₀)(统计结果如表3所示)。

将10⁷FFU的rSAD和RV-r3G分别于小鼠后腿肌肉注射4只5～6周龄的Balb/c雌性小鼠。连续观察21天，每天记录小鼠的平均体重变化和死亡数量(统计结果如表3所示)。

试验例2

效力试验

将重组3G狂犬病灭活抗原与法国206佐剂按49:51比例混合配制成灭活疫苗，以重组3G狂犬病的灭活疫苗免疫小鼠，以常规狂犬病灭活疫苗作对照病毒免疫小鼠。试验动物采用15-20g的SPF小白鼠，不同重组狂犬病疫苗接种试验各分成4组，每组16只，分别肌肉注射1/25、1/125、1/625、1/3125头份的疫苗；14天后攻击狂犬病毒，记录小鼠死亡和存活数，按照Spearman-Karber法计算疫苗的半数保护量(PD₅₀)(统计结果如表3所示)。

试验例3

对小鼠的致病性试验

为了确定RV-r3G和野生型SAD Bern(Sanafox)对小鼠的致病性，每只小鼠脑内接种病毒10⁵FFU/30μl，所有的老鼠在11天内全部死亡。此外，我们测定了野生型SAD Bern(Sanafox)和RV-r3G的LD₅₀，分别为3.4个FFU和8.8个FFU。可见，rSAD Bern(Sanafox)对小鼠仍有致病性。10⁷的SAD Bern外周感染小鼠可引起小鼠发病并致死，可见SAD Bern(Sanafox)还残留一定的神经侵害能力，而rSAD Bern(Sanafox)株相同滴度外周感染小鼠引起小鼠体重下降及个别后肢麻痹但并不引起小鼠死亡，表明rSAD Bern(Sanafox)的安全性较SAD Bern(Sanafox)高。

试验例4

重组病毒对比格犬的免疫试验

为了评价重组病毒对狗的免疫效果，将8*10⁷FFU/ml的野生SAD Bern(Sanafox)和重组RV-r3G分别用1：6000β-丙内脂处理2h进行灭活，再将灭活后的野生SAD Bern(Sanafox)和RV-r3G分别与法国206佐剂(购自郑州博轩化工产品有限公司)3：1混合摇匀后，通过肌肉注射途径免疫3月龄比格犬(购自沈阳康平实验动物中心)各6条，将肌肉注射1ml PBS的6条3月龄比格犬作为对照，免疫后21天采集3月龄比格犬的血液，分离出血清后进行中和抗体滴度测定(测定结果如图5所示)。

根据OIE标准测定灭活的重组病毒RV-r3G和野生型wtSAD Bern(Sanafox)诱导比格犬中和抗体水平实验结果显示：灭活RV-r3G免疫比格犬诱导产生的中和抗体达14+/-4IU/ml，灭活wtSAD Bern(Sanafox)免疫比格犬诱导产生的中和抗体滴度为6+/-2.3IU/ml，两组数据差异显著(P<0.05)。可见，灭活的重组病毒RV-r3G可诱导比野生型更高的中和抗体水平，更适用于狂犬病病毒灭活疫苗的开发。

表1 野生型SAD Bern(Sanafox)和RV-r3G的体外嗜神经性(实施例1)

wt SAD Bern(Sanafox)为标准狂犬病毒疫苗毒株，RV-r3G为本发明的重组病毒。

a同一种病毒在mNA细胞和BSR细胞上的滴度

b体外嗜神经指数＝Log(mNA上的滴度)-Log(BSR上的滴度)

表2 ELISA检测重组病毒G基因表达结果(实施例1)

wt SAD Bern(Sanafox)为标准狂犬病毒疫苗毒株，RV-r3G为本发明的重组病毒。

如表2所示，ELISA检测重组病毒G基因表达结果，表明，本发明的重组病毒(RV-r3G)的OD450显著高于标准狂犬病毒疫苗毒株(wt SAD Bern)

表3 重组3G狂犬病灭活疫苗的效力检验结果

如表3所示，试验例2的测定结果表示，与商品化狂犬病灭活疫苗相比，重组3G狂犬病疫苗的相对效价为1.02IU/mL，不低于1IU/mL，符合OIE关于兽用狂犬病灭活疫苗的要求。

本发明通过反向遗传操作技术成功拯救重组狂犬病病毒RV-r3G株，该重组病毒是在亲本弱毒疫苗株SAD Bern(Sanafox)株反向遗传操作系统基础上，进行插入2个同源狂犬病毒的G基因的构建，构建了含有3个相同G基因的病毒全长cDNA克隆并拯救获得。SAD Bern(Sanafox)具有优良的免疫原性，被广泛作为人和动物的狂犬病灭活疫苗种毒株。

RV-r3G在神经细胞mNA细胞和非神经细胞BSR细胞上的生长动力学曲线与亲本SAD Bern(Sanafox)十分相似(图4)，然而，RV-r3G在BSR细胞中G蛋白的表达量显著高于亲本株SAD Bern(Sanafox)(表2所示)。

如图5所示，试验例4证明额外增加2个G基因同样不影响病毒的生长性能，且在感染细胞中G蛋白的表达量显著提高。对比格犬的免疫试验还表明，灭活的重组病毒RV-r3G可诱导比野生型更高的中和抗体水平，更适用于狂犬病病毒灭活疫苗的开发。

如图4及表3所示，囊膜糖蛋白G蛋白是狂犬病病毒最主要的致病因子。SAD Bern(Sanafox)株小鼠脑内接种时仍感染并致死，额外增加2个G蛋白是否会增强其致病能力。通过实施例1测定LD₅₀并观察小鼠状态，我们发现RV-r3G株的LD₅₀与其亲本株SAD Bern(Sanafox)没有显著差异，这表明RV-r3G株的毒力与亲本株SAD Bern(Sanafox)几乎是一样的。SAD Bern(Sanafox)高滴度外周感染小鼠可引起小鼠发病并致死，可见SAD Bern(Sanafox)还残留一定的神经侵害能力，RV-r3G株高滴度外周感染小鼠，引起小鼠体重下降，及个别后肢麻痹，但并不引起小鼠死亡。增加G蛋白含量的重组病毒诱导细胞凋亡能力增强，外周感染时对小鼠的致病力下降，与之相应的是细胞的中和抗体滴度显著上升，

如图4所示，狂犬病病毒的RNA基因组以RNP复合物形式存在，RNA基因组模板及其转录子均被N蛋白紧密包裹起来，使其不受RNA酶的降解，维持高活性。插入外源片段后的重组RV RNA高遗传稳定性是其作为载体使用的优势之一。RV-r3G株在BSR细胞上连续多次传代后仍保有额外的G基因并维持病毒的高滴度和G蛋白高表达，表明在培养细胞中RV-r3G的遗传稳定性。

尽管上述对本发明做了详细说明，但不限于此，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种重组狂犬病病毒株，其特征在于，在对狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列进行反向遗传操作而获得的狂犬病病毒基因组中插入2个狂犬病病毒G基因，得到具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的重组狂犬病病毒株，其特征在于，所述的对狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列进行反向遗传操作而获得狂犬病病毒基因组包括：

根据狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列，得到8个互补DNA片段F1～F8；

将所述的8个互补DNA片段F1～F8进行人工合成，得到所述的狂犬病病毒基因组。

3.如权利要求1或2所述的重组狂犬病病毒株，其特征在于，所述2个狂犬病病毒G蛋白根据狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列获得，具体包括：

根据狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列，得到G基因；

通过对G基因进行扩增，得到所述的2个狂犬病病毒G基因；

通过PCR重叠技术，将所述的2个狂犬病病毒G基因串联在一起，得到2G基因。

4.一种重组狂犬病病毒株的构建及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

对狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列进行反向遗传操作，获得狂犬病病毒基因组；

根据SAD Bern全基因组序列，得到2个G基因；将所得到的2个G基因插入到所述狂犬病病毒基因组中，得到具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的重组狂犬病病毒。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的对狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列进行反向遗传操作，获得狂犬病病毒基因组包括：

根据狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列，得到8个互补DNA片段F1～F8；

对所述的8个互补DNA片段F1～F8进行人工合成，得到所述的狂犬病病毒基因组。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的根据SAD Bern全基因组序列得到2个G基因包括：

根据狂犬病病毒SAD Bern全基因组序列，得到N基因、P基因、L基因和G基因；

通过对所述G基因进行扩增，得到所述的2个狂犬病病毒G基因；

通过PCR重叠技术，将所述的2个狂犬病病毒G基因串联在一起，得到2G基因。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将2个G基因插入到所述狂犬病病毒基因组中包括：

利用限制性内切酶与连接酶，将所述狂犬病病毒基因组及N基因、P基因、L基因、G基因分别连接到质粒pcDNA中，分别得到SAD Bern(Sanafox)基因组全长cDNA克隆质粒pcDNA-SAD和辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L、pcDNA-G；

将所述2G基因在所述克隆质粒pcDNA-SAD中的G基因与L基因之间进行插入，获得含有3G基因的重组全长质粒pcDNA-SAD-3G。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括：

将所述辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L、pcDNA-G和质粒pcDNA-SAD-3G进行混合，并加入转染试剂，共同转染宿主细胞，得到重组病毒；

对重组病毒进行RT-PCR鉴定、序列测定及纯化，获得重组病毒株。

9.如权利要求8所述的重组狂犬病病毒的构建及培养方法，其特征在于，所述宿主细胞选自BSR细胞、mNA细胞或BHK-21细胞中的一种。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述制得具有感染性的重组狂犬病病毒置于-70～-79℃的温度条件下保存。