CN102796753A - 新型狂犬病病毒疫苗ctn181株反向遗传系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统，首先采用基因定点突变技术分别对狂犬病病毒CTN 株G蛋白194位和333位氨基酸进行定点突变，将突变后的G蛋白基因替换原有反向遗传系统中的G蛋白基因，同时对突变后的G蛋白基因进行拷贝，构建含有两个和三个改造后G蛋白基因的全长感染性克隆，并将其分别与辅助质粒共转染BSR细胞，拯救出了分别含有一个、两个和三个突变后G 蛋白基因的重组狂犬病病毒，为研制安全、稳定、高效的新型狂犬病病毒疫苗奠定了基础。

Description

新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统

技术领域

本发明通过对原有狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统进行改造，构建新型的反向遗传系统，为研制安全、稳定、高效的新型狂犬病病毒疫苗奠定基础。 

背景技术

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus）引起的一种急性、动物源性人兽共患传染病，病毒感染人或动物后，病死率几乎达100％，是迄今为止人类病死率最高的急性传染病。据世界卫生组织(WHO)报告显示，全世界每年因狂犬病死亡人数达55000人，其中99%发生于亚洲和非洲，仅亚洲每年大约死亡35000～40000人。目前，狂犬病尚无有效的治疗手段，接种疫苗仍是预防狂犬病唯一有效的方法。因此，在我国需要对犬进行大规模的免疫接种及加强对人暴露前和暴露后预防免疫，这是降低我国狂犬病的发病率的一项有效措施[参见：俞永新. 中国预防控制狂犬病降低发病率的思考[J].中国计划免疫, 2007, 13 (4):391-397.]。 

目前，狂犬疫苗主要以细胞培养疫苗和减毒活疫苗为主。由于人用狂犬疫苗价格和产量的原因，狂犬病的预防免疫需要的费用较高，而且往往需要多次接种，一般家庭难以承受。对于兽用疫苗，普遍应用的为减毒活疫苗，数量严重不足而且质量往往的不到保证，注射后还存在发生狂犬病的潜在危险，WHO狂犬病专家并不主张用减毒活疫苗注射免疫动物(参见：WHO. Expert Committee on Rabies[M].1st report, Geneva: WHO.2005.931.)。因此，非常有必要研发一种安全、稳定、高效和廉价的新型狂犬疫苗。 

CTN 株狂犬病病毒的亲代病毒为1956 年在山东省淄博市一个感染狂犬病的病人脑组织中分离得到，经鼠脑和人二倍体细胞连续多次传代得到的减毒疫苗株，并于1983年和2005被世界卫生组织（WHO）批准作为中国狂犬病疫苗生产用毒株。基因序列分析表明，CTN株与我国各病毒株的核苷酸同源性为82％~93％，大于其他疫苗株与街毒代表株间的同源性，表明该疫苗能有效预防我国目前流行的狂犬病[参加：盂胜利, 徐葛林, 明平刚, 等. 狂犬病毒疫苗株CTN-1八代次N和G基因序列测定及分析[J].中国人兽共患病学报,2007,23(4):327-332.]。 

RNA病毒反向遗传技术的核心是构建RNA病毒的全长cDNA分子，在DNA水平上可对该cDNA可进行各种修饰或改造，通过体外转录过程可再次得到病毒RNA，将这些经改造的RNA转染细胞，即可获得改造后的新病毒。这项新技术为RNA病毒分子生物学研究开辟了新途径，也为新型疫苗的研发提供了有力的工具。近年来，狂犬病病毒的反向遗传学研究进展迅速，相继有六株狂犬病病毒株：SAD B19，RC-HL，HEP-Flury，SHBRV，HN10和CTN 的感染性克隆构建成功，狂犬病病毒反向遗传体系构建策略不断完善，为研发新型的狂犬病减毒活疫苗奠定了基础。 

研究表明：G蛋白是狂犬病病毒颗粒的表面膜蛋白，是诱发中和抗体的唯一抗原，对狂犬病病毒致病性和免疫原性起关键作用。G蛋白上的333位精氨酸或赖氨酸是狂犬病病毒致病决定因子，这个残基被选为产生减毒株的靶位点(参见：Tuffereau C, Leblois H, Benejean J, et al. Arginine or lysine in position 333 of ERA and CVS glygoprotein is necessary for rabies virulence in adult mice [J].Virology,1989, 172(1):206-212.)；而G蛋白中194位的天冬氨酸替换为丝氨酸可以增加狂犬病病毒的遗传稳定性(参见：Faber M, Faber M L., Papaneri A, et al. A single amino acid change in rabies virus glycoprotein increases virus spread and enhances virus pathogenicity[J]. J. Virol. 2005, 79:14141–14148.)。 

发明内容

本发明的任务是提供一种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统。本专利申请在已有的狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统（以下简称CTN181反向遗传系统）的基础上(参见：Huang Y, Tang Q, Susan A, et al. Development of a reverse genetics system for a human rabies virus vaccine strain employed in China[J] . VirusRes , 2010,149 :28-35.)，首先应用基因定点突变技术，分别对CTN反向遗传系统中G蛋白第194位和第333位氨基酸进行突变（194位天冬酰胺→丝氨酸；333位谷氨酰胺→谷氨酸），将突变后的G蛋白基因替换CTN181反向遗传系统中的G蛋白基因；并对突变后的G蛋白基因进行拷贝将其插入到CTN181反向遗传系统中G-L基因间的非编码区，分别构建含有两个和三个突变后G蛋白基因的全长感染性克隆（构建示意图见图7），随后将其与辅助质粒一起转染BSR细胞，拯救出经改造的新型狂犬病病毒疫苗株。 

实现本发明的技术方案是：本发明提供的这种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统，是对狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统中G蛋白第194位和第333位氨基酸位点实施定点突变，使G蛋白第194位氨基酸由原来的天冬酰胺突变为丝氨酸，第333位氨基酸由原来的谷氨酰胺突变为谷氨酸。本发明提供的这种新型狂犬病病毒疫 苗CTN181株反向遗传系统含有一个、两个或／和三个突变后G蛋白基因的全长感染性克隆。利用本发明提供的这种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统，可拯救出经改造的新型狂犬病病毒疫苗株。 

本发明的另一个任务是提供一种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统的构建方法。 

本发明提供的新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统的构建方法，包括以下步骤： 

步骤一：应用基因定点突变技术对狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统中的G蛋白基因进行突变，使G蛋白第194位氨基酸由原来的天冬酰胺突变为丝氨酸，第333位氨基酸由原来的谷氨酰胺突变为谷氨酸，具体方法是：将要突变的G蛋白基因扩增后克隆到pGEM-T载体，利用以下引物： 

m-F1：5’-TGTGATATTTTCACCAGCAGCAGAGGGAAGAGA-3’ 

m-R1：5’-TCTCTTCCCTCTGCTGCTGGTGAAAATATCACA-3’ 

m-F2：5’-TCACTACAAATCGGTCGAAACTTGGGATGAGAT-3’ 

m-R2：5’- ATCTCATCCCAAGTTTCGACCGATTTGTAGTGA -3’ 

对G蛋白基因中194位和333位的氨基酸位点进行定点突变，将突变后的G蛋白基因命名为GAS基因，将得到的突变后的重组质粒命名为pGEM-GAS； 

步骤二：利用以下引物分别扩增GAS基因： 

G-F1：5’-GAATTCTAGAACATGTCAACTATGG-3’与G-R3：5’-GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’； 

G-F4：5’-GCGCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3’与G-R35’- GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’； 

G-F2：5’-GCGATCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC-3’G-R25’-GGCGCGCCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’； 

G-F3：5’-GGCGCGCCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3’与G-R3：5’- GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’； 

将PCR产物切胶回收后与pGEM-T载体进行连接，构建成重组质粒pGEM-GAS₁、pGEM-GAS₂、pGEM-GAS₃、pGEM-GAS₄； 

步骤三：人工合成含有BssHⅡ、AsiSⅠ、AscⅠ、AscⅠ酶切位点的linker并与pMD18-T载体连接，得到中间载体pMD-MCS； 

步骤四：利用内切酶BsiWⅠ、NheⅠ分别对pCTN-GFP和 pGEM-GAS₁进行双酶切，酶切产物切胶回收后进行连接构建成重组质粒pCTN-GAS。 

步骤五：利用内切酶BsiWⅠ、BssHⅡ分别对pCTN-GFP和 pGEM-GAS进行双酶切后连接构建pCTN-GAS-GFP；随后，利用内切酶BssHⅡ、NheⅠ分别对pCTN-GAS-GFP和 pGEM-GAS₂进行双酶切后连接构建成重组质粒pCTN-GASGAS。 

步骤六：利用内切酶AscⅠ、NheⅠ分别对pMD-MCS和 pGEM-GAS₄进行双酶切后连接构建重组质粒pMD-GAS₄；随后，利用内切酶AsiSⅠ、AscⅠ双酶切pMD-GAS₄和 pGEM-GAS₃后连接构建pMD-GAS₃GAS₄；将pMD-GAS₃GAS₄ 利用内切酶AscⅠ单酶切后切胶回收，再利用S1核酸酶处理去掉突出的碱基，经T4 DNA 连接酶连接以去除AscⅠ酶切位点，处理后的pMD-GAS₃GAS₄ 与pCTN-GAS-GFP经BssHⅡ、NheⅠ双酶切后连接构建成重组质粒pCTN-GASGASGAS。 

实验资料 

1 材料与方法 

1.1细胞与质粒   

BSR细胞与MNA细胞购于ATCC；pVAX-1 购于Invitrogen 公司； 

pCTN-GFP为含有狂犬病病毒CTN181株全基因组的重组质粒，是将狂犬病病毒CTN181株全基因组按顺序分四段克隆在pVAX-1之中，同时将绿色荧光蛋白（GFP ）基因插入到CTN181株G-L 间隔区； 

辅助质粒pVAX-N、pVAX-P、pVAX-L是分别将CTN181株N、P和L基因插入到pVAX-1之中(具体方法参见：Huang Y, Tang Q, Susan A, et al. Development of a reverse genetics system for a human rabies virus vaccine strain employed in China[J] . VirusRes , 2010,149 :28-35.)。 

pGEM-T 购于Promega 公司； 

pMD18-T 购于Takara公司。 

1.2其它试剂    

GoTaq Green Master Mix购于Promega 公司； 

DH5α 感受态细胞、DL15000 DNA Marker 、DL2000 DNA Marker 、反转录酶MMLV、dNTP mixture购于Takara公司； 

Easy-A High Fidelity cloning enzyme 、QuikChange Site-Direted Mutagenesis Kit为Stratagene 公司产品； 

各种限制性内切酶和T4 DNA 连接酶购于NEB 公司； 

质粒小量与大量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购于Qiagen 公司； 

Lipofectamine 2000 Reagent、TRIzol LS 购自Invitrogen 公司； 

FITC标记的抗狂犬病病毒N蛋白抗体购自Millipore公司。 

1.3 实验方法 

1.3.1 引物设计 实验中所用到引物序列及含有的酶切位点见表 l。 

表 l  引物序列和所含有的酶切位点 

1.3.2 G蛋白基因的定点突变  分析含有狂犬病病毒CTN181株全基因组pCTN-GFP质粒的序列，考虑到在全长质粒基础上进行定点突变，序列太长，突变难度大而且效率。所以，首先设计引物将要突变的G蛋白基因扩增后克隆到pGEM-T载体。按照QuikChange Site-Direted Mutagenesis Kit的操作说明，利用引物m-F1、m-R1和m-F2、m-R2对G蛋白基因中194位和333位的氨基酸进行定点突变，将突变后的G蛋白基因命名为GAS基因，突变后的重组质粒命名为pGEM-GAS。 

1.3.3 中间载体pMD-MCS的构建与鉴定  在构建含有多个GAS基因的过程中需要用到中间载体pMD18-T，并在中间载体中插入含有多个酶切位点的人工接头。首先人工合成含有BssHⅡ、AsiSⅠ、AscⅠ、AscⅠ酶切位点的linker，按照一定比例与pMD18-T载体连接。将连接产物转化感受态细胞DH5α后，通过测序的方法鉴定重组质粒。 

1.3.4 连接T载体  利用引物G-F1与G-R3、G-F4与G-R3、G-F2与G-R2、G-F3与G-R3 分别扩增GAS基因，将PCR产物切胶回收后与pGEM-T载体按照一定比例进行连接，构建重组质粒pGEM-GAS₁、pGEM-GAS₂、pGEM-GAS₃、pGEM-GAS₄，并通过PCR、双酶切和测序的方法对重组质粒进行鉴定。 

1.3.5 重组质粒的构建与鉴定  

（1）利用内切酶BsiWⅠ、NheⅠ分别对pCTN-GFP和 pGEM-GAS₁进行双酶切，酶切产物切胶回收后按照一定比例进行连接构建重组质粒pCTN-GAS； 

（2）先利用内切酶BsiWⅠ、BssHⅡ分别对pCTN-GFP和 pGEM-GAS进行双酶切后连接构建pCTN-GAS-GFP。随后，利用内切酶BssHⅡ、NheⅠ分别对pCTN-GAS-GFP和 pGEM-GAS₂进行双酶切后连接构建重组质粒pCTN-GASGAS； 

（3）先利用内切酶AscⅠ、NheⅠ分别对pMD-MCS和 pGEM-GAS₄进行双酶切后连接构建重组质粒pMD-GAS₄。随后，利用内切酶AsiSⅠ、AscⅠ双酶切pMD-GAS₄和 pGEM-GAS₃后连接构建pMD-GAS₃GAS₄。 

实验中，发现AscⅠ识别位点中含有BssHⅡ酶切位点，会对后续酶切产生影响。故先将pMD-GAS₃GAS₄ 利用内切酶AscⅠ单酶切后切胶回收，再利用S1核酸酶处理去掉突出的碱基，经T4 DNA 连接酶连接以去除AscⅠ酶切位点。处理后的pMD-GAS₃GAS₄ 与pCTN-GAS-GFP经BssHⅡ、NheⅠ双酶切后连接构建重组质粒pCTN-GASGASGAS。各重组质粒都通过PCR、双酶切和测序的方法对进行鉴定，具体构建示意图见图7。 

1.3.6 病毒的拯救  将BSR细胞在6孔板中培养过夜，待其长成单层，细胞密度约为80%～90% (约4～6×10⁵个细胞/孔)时用于转染。分别将1.5μg pCTN-GAS，pCTN-GASGAS，pCTN-GASGASGAS 与0.75μg pVAX-N，0.375μg pVAX-P，0.375μg pVAX-L与适量的Lipofectamine 2000 Reagent混合后加入6孔板，置于37℃ 5% CO2 培养箱培养6h后，更换新鲜配制的含10% FBS 的DMEM 培养液继续培养3天。将转染细胞及上清混合物反复冻融3次收获重组病毒。 

1.3.7  DFA鉴定重组病毒 在96孔细胞培养板中加入100μl新鲜制备的BSR细胞悬液，然后加入50μl收获的重组病毒混合均匀，37℃ 5% CO2 培养箱培养24h。去除细胞上清液，用PBS洗涤1 次，加预冷的80% 丙酮4℃固定30min。弃去丙酮，加入1：50稀释的FITC标记的抗狂犬病病毒N蛋白抗体和1:2000稀释的伊文思蓝，37 % 孵育30min，PBS洗涤3次，加入60%甘油避光存放，在荧光显微镜下观察。 

1.3.8  RT-PCR鉴定重组病毒 取250μl 感染重组病毒上清液加入750μl TRIzol LS提取病毒RNA，以G-F1引物为反转录引物合成cDNA，由G-F1和G-R1扩增病毒基因组中G蛋白的序列。同时，为了提高检测的准确性和灵敏度，再以nest-F和nest-R进行巢氏PCR 扩增G蛋白中的部分序列。 

体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具，也是我们改造/优化基因常用的手段。本研究中，我们利用体外定点突变技术对狂犬病病毒G蛋白上的两个关键位点进行改造。其中，333位的氨基酸是狂犬病病毒致病决定因子，这个残基被选为产生减毒株的靶位点；而将194位的天冬氨酸替换为丝氨酸，可以增加狂犬病病毒的遗传稳定性。研究中，我们选用的是Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit，它通过设计一对包含突变位点的引物（正、反向）和模板质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，延伸产物形成带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，通过筛选、测序鉴定我们得到了突变质粒的克隆。 

研究表明：[参见：Milosz F, Rojjanaporn P, Suchita S H, et a1.Overexpression of the Rabies Virus Glycoprotein Results in Enhancement of Apoptosis and Antiviral Immune Response[J]. J. Virol. 2002, 76(7):3374-3381.]提高狂犬病病毒G 蛋白的表达量可以促进感染细胞的凋亡及增强机体的抗病毒免疫。因此，为了增加G蛋白在感染细胞中的表达水平和增强减毒活疫苗毒株的免疫原性，我们在反向遗传系统全长质粒病毒基因组中利用特定的酶切位点，将突变后的GAS基因替换原有的GFP基因，以构建含有两个GAS的全长质粒。同时，为了构建含有三个GAS基因的全长质粒，我们利用添加了含有合适酶切位点Linker的中间载体，将两个GAS基因串联到Linker中后再酶切下来插入原有质粒从而构建含有三个GAS基因的全长质粒。 

在拯救实验中，本研究将改造后分别含有一个、两个和三个GAS基因全长感染性克隆和辅助质粒一起转染BSR细胞，采用DFA和RT-PCR的方法筛选重组病毒。我们在6孔细胞培养板中进行转染拯救重组病毒，经DFA检测中在部分细胞中可见发现散在绿色荧光，通过巢氏PCR检测可以扩增出预期的DNA片段，表明重组病毒拯救成功。 

总之，我们对狂犬病病毒疫苗株CTN181反向遗传系统进行了改造，拯救出了新型的重组病毒，为研制安全、稳定和高效的新型狂犬病病毒减毒活疫苗提供合格的疫苗候选株。 

附图说明

图1 : 突变体pGEM-GAS 的鉴定。G蛋白基因定点突变结果： 突变后的质粒经测序发现，G蛋白基因成功的发生定点突变，638位碱基由A突变为G，1054位碱基由C 突变为G，表明G蛋白基因已突变成功。 

图2：重组质粒pCTN-GAS 的鉴定。重组质粒pCTN-GAS鉴定结果： 重组质粒pCTN-GAS通过PCR和酶切鉴定可见1132bp条带，结果与预期一致，表明重组质粒pCTN-GAS构建成功。 

图3：重组质粒pCTN-GASGAS 的鉴定。重组质粒pCTN-GASGAS鉴定结果： 重组质粒pCTN-GAS-GFP通过PCR和酶切鉴定可见1132bp条带，结果与预期一致。重组质粒pCTN-GASGAS经酶切鉴定可见1657bp条带，结果与预期一致，表明重组质粒pCTN-GASGAS构建成功。 

图4：重组质粒pCTN-GASGASGAS的鉴定 。重组质粒pCTN-GASGASGAS鉴定结果：重组质粒pMD-GAS₄通过PCR、经双酶切鉴定可见1659bp条带。重组质粒pMD-GAS₃GAS₄经双酶切鉴定可见3320bp条带。重组质粒pCTN-GASGASGAS经双酶切鉴定，可见3320bp条带，结果与预期一致，表明重组质粒pCTN-GASGASGAS构建成功。 

图5：重组病毒的DFA鉴定。重组病毒DFA鉴定结果： 拯救病毒感染BSR 细胞后，经丙酮固定，荧光素标记抗狂犬病病毒N蛋白抗体染色, 在荧光显微镜下均可见部分细胞胞浆内有散在荧光点而正常的BSR细胞不显示荧光，表明已拯救出重组病毒。 

图6：重组病毒的RT-PCR鉴定。重组病毒的RT-PCR鉴定结果：提取重组病毒RNA，以G-F1为反转录引物合成cDNA。由G-F1和G-R1进行扩增，再以其PCR产物为模板，以nest-F和nest-R为引物进行巢氏PCR扩增出约500bp的条带，表明已拯救出重组病毒。 

图7：含有突变后G蛋白基因的全长感染性克隆的构建示意图。 

具体实施方式

实施例1 

1 材料与方法 

1.1 细胞与质粒  BSR细胞与MNA细胞购于ATCC；pVAX-1 购于Invitrogen 公司；pCTN-GFP为含有狂犬病病毒CTN181株全基因组的重组质粒，是将狂犬病病毒CTN181株全基因组按顺序分四段克隆在pVAX-1之中，同时将绿色荧光蛋白（GFP ）基因插入到CTN181株G-L 间隔区；辅助质粒pVAX-N、pVAX-P、pVAX-L是分别将CTN181株N、P和L基因插入到pVAX-1之中(具体方法参见：Huang Y, Tang Q, Susan A, et al. Development of a reverse genetics system for a human rabies virus vaccine strain employed in China[J] . VirusRes , 2010,149 :28-35.)；pGEM-T 购于Promega 公司；pMD18-T 购于Takara公司。 

1.2 其它试剂   GoTaq Green Master Mix购于Promega 公司；DH5α 感受态细胞、DL15000 DNA Marker 、DL2000 DNA Marker 、反转录酶MMLV、dNTP mixture购于Takara公司；Easy-A High Fidelity cloning enzyme 、QuikChange Site-Direted Mutagenesis Kit为Stratagene 公司产品；各种限制性内切酶和T4 DNA 连接酶购于NEB 公司；质粒小量与大量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购于Qiagen 公司；Lipofectamine 2000 Reagent、TRIzol LS 购自Invitrogen 公司；FITC标记的抗狂犬病病毒N蛋白抗体购自Millipore公司。 

1.3 实验方法 

1.3.1 引物设计 实验中所用到引物序列及含有的酶切位点见表 l。 

表 l  引物序列和所含有的酶切位点 

1.3.2 G蛋白基因的定点突变  分析含有狂犬病病毒CTN181株全基因组pCTN-GFP质粒的序列，考虑到在全长质粒基础上进行定点突变，序列太长，突变难度大而且效率。所以，首先设计引物将要突变的G蛋白基因扩增后克隆到pGEM-T载体。按照QuikChange Site-Direted Mutagenesis Kit的操作说明，利用引物m-F1、m-R1和m-F2、m-R2对G蛋白基因中194位和333位的氨基酸进行定点突变，将突变后的G蛋白基因命名为GAS基因，突变后的重组质粒命名为pGEM-GAS。 

1.3.3 中间载体pMD-MCS的构建与鉴定  在构建含有多个GAS基因的过程中需要用到中间载体pMD18-T，并在中间载体中插入含有多个酶切位点的人工接头。首先人工 合成含有BssHⅡ、AsiSⅠ、AscⅠ、AscⅠ酶切位点的linker，按照一定比例与pMD18-T载体连接。将连接产物转化感受态细胞DH5α后，通过测序的方法鉴定重组质粒。 

1.3.4 连接T载体  利用引物G-F1与G-R3、G-F4与G-R3、G-F2与G-R2、G-F3与G-R3分别扩增GAS基因，将PCR产物切胶回收后与pGEM-T载体按照一定比例进行连接，构建重组质粒pGEM-GAS₁、pGEM-GAS₂、pGEM-GAS₃、pGEM-GAS₄，并通过PCR、双酶切和测序的方法对重组质粒进行鉴定。 

1.3.5 重组质粒的构建与鉴定 （1）利用内切酶BsiWⅠ、NheⅠ分别对pCTN-GFP和 pGEM-GAS₁进行双酶切，酶切产物切胶回收后按照一定比例进行连接构建重组质粒pCTN-GAS。（2）先利用内切酶BsiWⅠ、BssHⅡ分别对pCTN-GFP和 pGEM-GAS进行双酶切后连接构建pCTN-GAS-GFP。随后，利用内切酶BssHⅡ、NheⅠ分别对pCTN-GAS-GFP和 pGEM-GAS₂进行双酶切后连接构建重组质粒pCTN-GASGAS。（3）先利用内切酶AscⅠ、NheⅠ分别对pMD-MCS和 pGEM-GAS₄进行双酶切后连接构建重组质粒pMD-GAS₄。随后，利用内切酶AsiSⅠ、AscⅠ双酶切pMD-GAS ₄和 pGEM-GAS₃后连接构建pMD-GAS₃GAS₄。实验中，发现AscⅠ识别位点中含有BssHⅡ酶切位点，会对后续酶切产生影响。故先将pMD-GAS₃GAS₄ 利用内切酶AscⅠ单酶切后切胶回收，再利用S1核酸酶处理去掉突出的碱基，经T4 DNA 连接酶连接以去除AscⅠ酶切位点。处理后的pMD-GAS₃GAS₄ 与pCTN-GAS-GFP经BssHⅡ、NheⅠ双酶切后连接构建重组质粒pCTN-GASGASGAS。各重组质粒都通过PCR、双酶切和测序的方法对进行鉴定。具体构建示意图见图7；突变体pGEM-GAS 的鉴定结果见图1；重组质粒pCTN-GAS 的鉴定结果见图2；重组质粒pCTN-GASGAS 的鉴定结果见图3；重组质粒pCTN-GASGASGAS的鉴定结果见图4。 

1.3.6 病毒的拯救  将BSR细胞在6孔板中培养过夜，待其长成单层，细胞密度约为80%～90% (约4～6×10⁵个细胞/孔)时用于转染。分别将1.5μg pCTN-GAS，pCTN-GASGAS，pCTN-GASGASGAS 与0.75μg pVAX-N，0.375μg pVAX-P，0.375μg pVAX-L与适量的Lipofectamine 2000 Reagent混合后加入6孔板，置于37℃ 5% CO2 培养箱培养6h后，更换新鲜配制的含10% FBS 的DMEM 培养液继续培养3天。将转染细胞及上清混合物反复冻融3次收获重组病毒。 

1.3.7  DFA鉴定重组病毒 在96孔细胞培养板中加入100μl新鲜制备的BSR细胞悬液，然后加入50μl收获的重组病毒混合均匀，37℃ 5% CO2 培养箱培养24h。去除细胞上清液，用PBS洗涤1 次，加预冷的80% 丙酮4℃固定30min。弃去丙酮，加入1：50稀释的FITC标记的抗狂犬病病毒N蛋白抗体和1:2000稀释的伊文思蓝，37 % 孵育 30min。PBS洗涤3次，加入60%甘油避光存放，在荧光显微镜下观察，重组病毒的DFA鉴定结果见图5。 

1.3.8  RT-PCR鉴定重组病毒 取250μl 感染重组病毒上清液加入750μl TRIzol LS提取病毒RNA，以G-F1引物为反转录引物合成cDNA，由G-F1和G-R1扩增病毒基因组中G蛋白的序列。同时，为了提高检测的准确性和灵敏度，再以nest-F和nest-R进行巢氏PCR扩增G蛋白中的部分序列。重组病毒的RT-PCR鉴定结果见图6。 

Claims (4)

1.一种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统，其特征在于，该反向遗传系统是对狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统中G蛋白第194位和第333位氨基酸位点实施了定点突变，使G蛋白第194位氨基酸由原来的天冬酰胺突变为丝氨酸，第333位氨基酸由原来的谷氨酰胺突变为谷氨酸。

2.根据权利要求1所述的新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统，其特征在于，含有一个、两个或／和三个突变后G蛋白基因的全长感染性克隆。

3.权利要求1或2所述的新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统在拯救狂犬病病毒疫苗株中的应用。

4.一种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统的构建方法，包括以下步骤：

步骤一：应用基因定点突变技术对狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统中的G蛋白基因进行突变，使G蛋白第194位氨基酸由原来的天冬酰胺突变为丝氨酸，第333位氨基酸由原来的谷氨酰胺突变为谷氨酸，具体方法是：将要突变的G蛋白基因扩增后克隆到pGEM-T载体，利用以下引物：

m-F1：5’-TGTGATATTTTCACCAGCAGCAGAGGGAAGAGA-3’

m-R1：5’-TCTCTTCCCTCTGCTGCTGGTGAAAATATCACA-3’

m-F2：5’-TCACTACAAATCGGTCGAAACTTGGGATGAGAT-3’

m-R2：5’- ATCTCATCCCAAGTTTCGACCGATTTGTAGTGA -3’

对G蛋白基因中194位和333位的氨基酸位点进行定点突变，将突变后的G蛋白基因命名为GAS基因，将得到的突变后的重组质粒命名为pGEM-GAS；

步骤二：利用以下引物分别扩增GAS基因：

G-F1：5’-GAATTCTAGAACATGTCAACTATGG-3’与G-R3：5’-GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’；

G-F4：5’-GCGCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3’与G-R35’- GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’；

G-F2：5’-GCGATCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC-3’G-R25’-GGCGCGCCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’；

G-F3：5’-GGCGCGCCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3’与G-R3：5’-GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’；

将PCR产物切胶回收后与pGEM-T载体进行连接，构建成重组质粒pGEM-GAS₁、pGEM-GAS₂、pGEM-GAS₃、pGEM-GAS₄；

步骤三：人工合成含有BssHⅡ、AsiSⅠ、AscⅠ、AscⅠ酶切位点的linker并与pMD18-T载体连接，得到中间载体pMD-MCS；

步骤四：利用内切酶BsiWⅠ、NheⅠ分别对pCTN-GFP和 pGEM-GAS₁进行双酶切，酶切产物切胶回收后进行连接构建成重组质粒pCTN-GAS。

步骤五：利用内切酶BsiWⅠ、BssHⅡ分别对pCTN-GFP和 pGEM-GAS进行双酶切后连接构建pCTN-GAS-GFP；随后，利用内切酶BssHⅡ、NheⅠ分别对pCTN-GAS-GFP和 pGEM-GAS₂进行双酶切后连接构建成重组质粒pCTN-GASGAS。

步骤六：利用内切酶AscⅠ、NheⅠ分别对pMD-MCS和 pGEM-GAS₄进行双酶切后连接构建重组质粒pMD-GAS₄；随后，利用内切酶AsiSⅠ、AscⅠ双酶切pMD-GAS₄和 pGEM-GAS₃后连接构建pMD-GAS₃GAS₄；将pMD-GAS₃GAS₄ 利用内切酶AscⅠ单酶切后切胶回收，再利用S1核酸酶处理去掉突出的碱基，经T4 DNA 连接酶连接以去除AscⅠ酶切位点，处理后的pMD-GAS₃GAS₄ 与pCTN-GAS-GFP经BssHⅡ、NheⅠ双酶切后连接构建成重组质粒pCTN-GASGASGAS。

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