CN110904153A - 表达非洲猪瘟病毒p12或p17蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种表达非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）p12蛋白或者p17蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）重组质粒的构建方法，以及根据该重组质粒构建的基因工程疫苗及构建方法。对rPRRSV‑p12和rPRRSV‑p17感染孔进行间接免疫荧光，发现视野下出现了抗PRRSV N蛋白的特异性荧光及抗ASFV p12蛋白或p17蛋白的特异性荧光。说明该表达非洲猪瘟病毒p12蛋白或p17蛋白的重组PRRSV可以保证外源蛋白ASFV的p12或p17蛋白得到良好的高效的稳定的表达。而有研究表明p12和p17都是重要的抗原蛋白，能够用于ASF的疫苗研制。

Description

表达非洲猪瘟病毒p12或p17蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征 病毒的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种病毒的重组质粒和基因工程疫苗，更具体地说，涉及一种能够表达非洲猪瘟病毒 (ASFV) p12或p17蛋白的PRRS病毒重组质粒和基因工程疫苗。
背景技术
ASFV是ASFV感染家猪或者野猪引起的一种急性、烈性、出血性，高度接触性传染病。病程短，发病率和死亡率高。严重威胁全球养猪业。目前尚没有有效的疫苗和治疗方法。ASF于1921年首发于非洲肯尼亚并蔓延至非洲多个地区；1957年传到欧洲的葡萄牙；1971年由西欧传入南美洲的古巴，随后南美洲国家陆续暴发疫情；2007年传入欧亚接壤的高加索地区，2017年传播至俄罗斯远东地区。2018年8月，我国辽宁省沈阳市发现首例ASF疫情，随后迅速蔓延至全国二十多个省份，给中国的养猪业造成了迄今最为惨重的经济损失。一年时间内，我国32个省、市、自治区均发生ASF疫情。ASF疫情使我国生猪存栏量和出栏量下降20%-50%，许多猪场因ASF疫情完全覆没，严重削弱了我国猪肉的有效供给，导致我国生猪和猪肉价格均出现翻番。从ASF在中国流行的总体情况来看，ASF疫情防控效果不容乐观，疫情仍然处于持续扩散的状态。因此疫苗研发刻不容缓。过去几十年大量的研究表明，灭活疫苗虽能诱导抗体反应，但对强毒攻击不能提供有效保护；基于单个或多个保护性抗原的亚单位疫苗，包括重组蛋白、DNA疫苗和病毒活载体疫苗等，能对免疫动物提供部分保护；而弱毒活疫苗，包括天然弱毒株、传代培养致弱毒株和基因缺失弱毒株等，能诱导体液免疫应答和细胞免疫应答，为接种动物提供高水平的保护，被认为是最有希望研制成功的疫苗。目前，虽然有基因缺失毒株被构建，并被用作评价其作为疫苗的可能性，但是其安全性却堪忧。其安全性的问题主要体现在以下三个方面：一是副反应问题、二是弱毒株接种存在散在风险，三是毒力返强。而ASFV病毒活载体疫苗表现出较好的安全性，只需要对其免疫效率进行提高。对ASFV的防控将有重要作用。已有研究表明：单纯依赖一种或几种病毒的抗原蛋白很难达到免疫预防效果。而多种保护性抗原协同免疫（“鸡尾酒”式混合免疫）可以提高疫苗的免疫保护水平。因此表达ASFV抗原蛋白的活病毒载体疫苗的研发将是今后的一个重要的研究方向，以期在ASFV防控的安全性和免疫效力上都达到令人免疫的效果。
ASF的病原ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，为大型双链DNA病毒，也是目前已知的唯一的DNA虫媒病毒。猪单核细胞-巨噬细胞为ASFV主要的靶细胞。ASFV的基因组约170-193kb，含有150-167个ORF，编码150-200种蛋白质。其中约50多种是病毒的结构蛋白。同时ASFV基因组还编码DNA复制、基因转录和RNA修饰酶类，以及调节宿主细胞功能和参与病毒免疫逃逸的相关蛋白。然而，目前仍有约一半以上的ASFV基因编码的蛋白功能尚不清楚。ASFV粒子直径约为200nm，呈20面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是类核 （Nucleoid）、核壳（Core shell）、内囊膜（Inner envelope）、衣壳（Capsid）和外囊膜（External envelope）。
ASFV的p12蛋白是ASFV感染晚期表达的膜蛋白，由O61R基因编码，共186nt，其分子量大小约为6.7kD。其C-末端区域富含半胱氨酸的结构域，参与病毒的吸附。有学者通过免疫电子显微镜发现，该蛋白位于病毒粒子层，细胞表面的膜蛋白是ASFV的受体。在病毒侵染细胞时，可吸附细胞膜，使病毒进入细胞内。在机体外，p12蛋白的抗体可阻断ASFV侵入宿主细胞。另外，利用HEK293细胞表达p12蛋白，纯化后免疫猪能产生针对p12的特异性抗体，表明p12具有一定的免疫原性。另一方面，ASFV的P17蛋白是ASFV表达的晚期膜蛋白，由D117L基因编码，核苷酸序列共354nt，编码蛋白大小为13.1kD。位于病毒内膜的跨膜蛋白。与早期膜蛋白p54一样，p17对于病毒活力至关重要，能促进ASFV病毒的二十面体颗粒形成。若缺失p17，组装后的病毒将变得不稳定，失去感染作用。p17蛋白还同时具有抑制蛋白水解的作用，使多聚蛋白pp220和pp62不能进一步水解。
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是一种严重影响养猪业的接触性传染病，给世界各国造成的经济损失巨大。其病原PRRS病毒 (PRRSV)一直处于不断的变异及进化过程中。在中国，2006年爆发了高致病性PRRS（Highly-pathogenic PRRSV, HP-PRRSV），这就是PRRS的病毒变异株引起的急性高致死性的疫病。目前，反向遗传操作被广泛应用于研究PRRSV的生物学特性、致病机理、毒力决定因子以及不断变异的分子机制，而其基因组作为外源基因表达载体的研究也被广泛开展。PRRSV的基因组中除ORF1和ORF2以及ORF4和ORF5外，其结构蛋白编码框架之间有少则几个多则逾百的碱基重叠（overlap）。相关研究表明：ORF重叠区的影响会导致嵌合病毒失去感染性，因此可选择非重叠区或者将重叠区拉开作为外源基因的插入位点。需要注意的是外源基因的插入原则应以能在最小程度上改变病毒基因组为基础。但即便如此，插入外源基因也会在传代过程中逐渐丢失编码序列以致无法发挥其功能，呈现遗传不稳定性。Dr.Dongwan Yoo 2009年报道了其在ORF1b和ORF2之间通过插入两个额外的酶切位点之后插入了GFP基因，如果在其3’ 端下游插入一个二级结构简单的 (由其自身核心序列及周围序列形成) 转录调控序列6 (TRS6) 的拷贝，让外源基因的表达被一个独立的转录子所引导。所构建的突变体克隆能够在至少37代次的传达过程中保持遗传稳定。
众所周知，非洲猪瘟 (ASF)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征 (HP-PRRS) 都是临床上非常重要的猪传染病，严重制约着全球养猪业，给养猪业造成的经济损失巨大。本发明旨在高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的全长感染性克隆骨架上，插入ASFV的p12的编码基因O61R或p17的编码基因D117L的核苷酸序列，获得能够稳定表达ASFV p12蛋白或p17蛋白的重组PRRS病毒，对其进行一系列病毒特性分析及遗传稳定性检测；并在病毒复制、转录、翻译水平对其与亲本病毒进行比较分析。这是对非洲猪瘟病毒疫苗研发的一种全新的尝试。该疫苗的成功研制将会对非洲猪瘟的防控起到积极重要的作用。并且此重组病毒的骨架为高致病性PRRSV弱毒疫苗株，该疫苗已经在市场上使用多年。因此可以起到“一针防两病”的效果。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种表达非洲猪瘟病毒 (ASFV) p12蛋白或者p17蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒的构建方法。
本发明的构建表达ASFV p12蛋白或p17蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合重组质粒的方法，为根据ASFV p12蛋白的编码基因O61R的核苷酸序列、p17蛋白的编码基因D117L的序列以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因序列设计SOE PCR引物，在HuN4-F112基因组的ORF1b和ORF2之前分别插入ASFV p12蛋白的编码基因O61R和p17蛋白的编码基因D117L序列，并在外源基因3’端下游插入此病毒的转录调控序列6（TRS6）。将扩增出的两个嵌合片段通过Asc I和EcoR V双酶切，然后回收PCR产物分别连接到HuN4-F112的Asc I和EcoR V双酶切载体上，从而获得了嵌合重组质粒pA-ASFV-p12和pA-ASFV-p17（SEQ ID NO.11和12）。
本发明的嵌合ASFV p12或p17蛋白的重组PRRSV是能够稳定表达ASFV p12或p17蛋白的高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112重组病毒。
本发明的ASFV p12或p17蛋白的重组PRRSV的构建方法包括以下步骤：首先通过SOE PCR的方法扩增出含有ASFV p12蛋白或者p17蛋白编码基因的PRRSV突变片段，然后将扩增出的PCR片段和高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112进行Asc I和EcoR V酶切，最后将酶切后的突变PCR片段和HuN4-F112的双酶切片段进行连接，并转化TOP10感受态细胞，然后通过筛选获得重组全长感染性克隆质粒pA-ASFV-p12和pA-ASFV-p17，从而提供了相应的构建方法。
使用本发明所构建的两个重组质粒pA-ASFV-p12和pA-ASFV-p12，转染MARC-145细胞后所拯救出来的病毒具有和亲本病毒vHuN4-F112相似的病毒生物学特性。并且在至少连续20代次的细胞传代过程中能够保持遗传稳定性。同时，基于上述重组质粒，转染MARC-145细胞后拯救出的一株重组PRRS病毒：rPRRSV-p12和rPRRSV-p17。能与p12或p17的鼠源多抗以及PRRSV的N蛋白的单抗发生抗原抗体反应，出现特异性的免疫荧光。说明该重组病毒rPRRSV-p12、rPRRSV-p17能够稳定高效的表达ASFV的p12或p17蛋白。表达ASFV p12蛋白或p17蛋白的的重组PRRSVrPRRSV-p12和rPRRSV-p17有望今后作为新型的基因工程活载体疫苗用于非洲猪瘟的免疫保护。
附图说明
图1是ASFV p12或p17嵌合PRRSV重组质粒构建示意图
图2是SOE PCR引物扩增我国流行的II型ASFV基因组p12或p17编码基因的不同PCR片段的电泳检测结果，其中，图2a中1,2泳道为由pHuN4-F112为模板，引物HF11559和ASFV-p12-R1获得的长度约为450bp的PCR产物p12-SOE-1；3,4泳道是以II型ASFV基因组p12编码基因O61R全长的质粒为模板，ASFV-p12-F2和ASFV-p12-R2/R3为上下游引物所获得的259bp的PCR产物p12-SOE-2；7,8泳道是以pHuN4-F112为模板，引物ASFV-p12-F4和HR13090获得的长度约为1182bp的PCR片段p12-SOE-4；5,6泳道是以p12-SOE-1和p12-SOE-2回收产物为模板，引物HF11559和ASFV-p12-R2/R3为引物扩增出的679bp长度的PCR产物p12-SOE-3；9,10泳道为由p12-SOE-3和p12-SOE-4的回收产物为模板，引物HF11559和HR13090扩增出的1759bp长度的PCR产物p12-SOE-5，图中的Marker是DL5,000。图2b中1,2泳道为由pHuN4-F112为模板，引物HF11559和ASFV-p17-R1获得的长度约为450bp的PCR产物p17-SOE-1；3,4泳道是以II型ASFV基因组p17编码基因D117L全长的质粒为模板，ASFV-p17-F2和ASFV-p17-R2/R3为上下游引物所获得的427bp的PCR产物p17-SOE-2；7,8泳道是以pHuN4-F112为模板，引物ASFV-p17-F4和HR13090获得的长度约为1182bp的PCR片段p17-SOE-4；5,6泳道是以p17-SOE-1和p17-SOE-2回收产物为模板，引物HF11559和ASFV-p17-R2/R3为引物扩增出的847bp长度的PCR产物p17-SOE-3；9,10泳道为由p17-SOE-3和p17-SOE-4的回收产物为模板，引物HF11559和HR13090扩增出的约2000bp长度的PCR产物p17-SOE-5，图中的Marker是DL5,000。
图3中a-1是嵌合重组质粒pA-ASFV-12与亲本质粒pHuN4-F112的全长鉴定电泳结果；其中泳道1是亲本质粒pHuN4-F112，泳道2,3是嵌合重组质粒pA-ASFV-p12。图a-2构建好的嵌合重组质粒pA-ASFV-p12以及亲本质粒pHuN4-F112的EcoR V和Asc I双酶切鉴定结果，其中泳道1是Marker 5,000，泳道2是pA-ASFV-p12的EcoR V和Asc I双酶切鉴定结果，泳道3是pHuN4-F112的EcoR V和Asc I双酶切鉴定结果。图a-3是Hind III-HF酶切嵌合重组质粒pA-ASFV-p12和亲本质粒的电泳结果，其中，泳道1是Marker DL15,000，泳道2-4是Hind III-HF酶切的pA-ASFV-p12，泳道5是Hind III-HF酶切的亲本质粒pHuN4-F112。 图3中b-1是嵌合重组质粒pA-ASFV-p17与亲本质粒pHuN4-F112的全长鉴定电泳结果；其中泳道1是亲本质粒pHuN4-F112，泳道2,3是嵌合重组质粒pA-ASFV-p17。图b-2构建好的嵌合重组质粒pA-ASFV-p17以及亲本质粒pHuN4-F112的EcoR V和Asc I双酶切鉴定结果，其中泳道1是Marker 5,000，泳道2是pA-ASFV-p17的EcoR V和Asc I双酶切鉴定结果，泳道3是pHuN4-F112的EcoR V和Asc I双酶切鉴定结果。图b-3是Hind III-HF酶切嵌合重组质粒pA-ASFV-p17和亲本质粒的电泳结果，其中，泳道1是Marker DL15,000，泳道2-4是Hind III-HF酶切的pA-ASFV-p17，泳道5是Hind III-HF酶切的亲本质粒pHuN4-F112。
图4中a-1是对嵌合重组质粒pA-ASFV-p12的Swa I线性化模板的电泳结果，a-2是对pA-ASFV-p12的线性化模板的体外转录RNA的电泳鉴定结果。b-1是对嵌合重组质粒pA-ASFV-p17的Swa I线性化模板的电泳结果。b-2是pA-ASFV-p17的线性化模板的体外转录RNA的电泳鉴定。
图5是用两株嵌合重组质粒pA-ASFV-p12和pA-ASFV-p17转染细胞后出现的细胞病变结果。
图6是拯救病毒rPRRSV-p12、rPRRSV-p17以及亲本病毒vHuN4-F112的N蛋白抗体、ASFV p12蛋白抗体，ASFV p17蛋白抗体的免疫荧光照片。 同时设置阴性对照Mock细胞孔。
图7是对拯救病毒株rPRRSV-p12、rPRRSV-p17与亲本病毒vHuN4-F112的滴度比较结果，生长曲线的描绘。
具体实施方式
在本发明中，所述嵌合重组质粒指的是，利用反向遗传操作技术，将我国流行的II型ASFV基因组p12蛋白编码基因O61R和p17蛋白编码基因D117L的核苷酸序列分别插入HuN4-F112基因组骨架中所获得的pA-ASFV-p12和pA-ASFV-p17。
在本发明中，所述嵌合重组病毒指的是，利用基因嵌合技术获得的全长重组质粒pA-ASFV-p12和pA-ASFV-p17转染MARC-145细胞后分别拯救出的活病毒rPRRSV-p12和rPRRSV-p17。
在本发明中，所述的反向遗传操作指的是：相对于经典遗传学而言的，是在获得的高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的感染性克隆骨架上，通过SOE PCR的方法或者定点突变的方法对病毒基因进行必要的加工和修饰，进行外源基因的插入，再按组成顺序构建全长病毒基因组，让其装配出具有生物活性的病毒粒子，研究突变病毒与亲本病毒在病毒生物学特性上的变化，以及外源基因插入可能对病毒的表型、性状有何种影响等方面的内容。
在本发明中，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4的Genbank 登录号是EF635006。
在本发明中，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株的感染性克隆HuN4-F112指的是，参考文献Shanru Zhang, Yanjun Zhou, Yifeng Jiang, Guoxin Li,Liping Yan, Hai Yu, Guangzhi Tong. Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive andrespiratory syndrome virus的方法所构建的感染性克隆。
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。
在本发明的实施例中，使用的病毒和细胞：MARC-145细胞（非洲绿猴肾细胞系）。
在本发明的实施例中，使用的质粒与菌株：pBlueScript II SK(+)载体购自Invitrogen公司，pBS-T载体、TOP10感受态细胞购自TIANGENE公司。
在本发明的实施例中，使用的其他试剂：QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGENE公司，pfu II DNA Polymerase购自Strategene公司，T7 mMESSAGE High YieldCapped RNA Transcription Kit购自Ambion公司，胶回收试剂盒和Quant ReverseTranscriptase购自TIANGENE公司，rTaq DNA聚合酶，dNTP和限制性内切酶购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，DMRIE-C转染试剂购自Invitrogen公司，Opti-MEM购自Invitrogen公司。
在本发明的实施例中，MARC-145单层细胞采用以下方法制备：
MARC-145细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍后加入0.01MOI的病毒500微升吸附1小时后，弃吸附液，PBS洗两遍后加入维持液（含有2％FBS的DMEM）培养基，37℃5％CO2培养箱中培养。
实施例1表达ASFV p12或p17蛋白的重组PRRSV质粒的构建
根据GenBank登录号为EF635006和MH766894的核苷酸序列，设计出6条引物，用来进行SOE PCR扩增，过程如图2所示，然后分别通过细胞转染实验，验证了获得的嵌合重组质粒的感染性，具体过程如下：
1.1引物设计
根据GenBank上的HuN4的碱基序列和我国流行的II型ASFV基因组的碱基序列，设计两组SOE PCR引物，第一组SOE PCR引物命名为：HF11559、HR13090、ASFV-p12-F2、ASFV-p12-R1、ASFV-p12-F4、ASFV-p12-R2/R3，其序列分别如下所示：
HF11559: 5’-TCATACATCCGAGTTCCTGTT-3’（SEQ ID NO.1）
HR13090: 5’-GAAATATTGTCATGGCGAGGC-3’（SEQ ID NO.2）
ASFV-p12-F2: 5’-TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAatggcacttgatggttcaagtgg -3’（SEQ ID NO.3）
ASFV-p12-R1：5’-gagcctccaccacttgaaccatcaagtgccatTTCAATTCAGGCCTAAAGTT -3’（SEQ ID NO.4）
ASFV-p12-F4：5’-taataacggaagctgttccctaaaaacaagttaaGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGAGT-3’（SEQ ID NO.5）
ASFV-p12-R2/R3：5’-CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACttaacttgtttttagggaacagcttcc -3’（SEQ ID NO.6）
ASFV-p17-F2: 5’-TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAatggacactgaaacgtctccactg -3’（SEQ ID NO.7）
ASFV-p17-R1：5’-atgagaaagcagtggagacgtttcagtgtccatTTCAATTCAGGCCTAAAGTT -3’（SEQ ID NO.8）
ASFV-p17-F4：5’-cgacgaacaattagctgaacttgcgcattcataaGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGAGT-3’（SEQ ID NO.9）
ASFV-p17-R2/R3：5’-CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACttatgaatgcgcaagttcagctaattgttc -3’（SEQ ID NO.10）
具体构建步骤如下：
1.1.1扩增p12-SOE-1和p17-SOE-2的PCR产物
以pHuN4-F112作为模板，引物HF11559和ASFV-p12-R1/ASFV-p12-R1分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增突变片段p12-SOE-1和p17-SOE-2，具体如下：
PCR反应体系为：pHuN4-F112质粒模板1μL，上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfuBuffer 5μL，2.5mM dNTP 4μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5 units，加水至50μL。
PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸15s，共进行35个循环，然后72℃延伸3min。
取PCR反应产物，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2a所示，根据检测结果，获得的两个目的片段p12-SOE-1和p12-SOE-2大小均为450bp。
1.1.2扩增p12-SOE-2和p17-SOE-2的PCR产物
分别以含有我国流行的II型ASFV的p12编码基因O61R的质粒pUC-p12f和p17编码基因D117L的质粒pUC-p17f为模板，引物 ASFV-p12-F2和ASFV-p12-R2/R3，ASFV-p17-F2和ASFV-p17-R2/R3分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增p12-SOE-2和p17-SOE-2，具体如下：
PCR反应体系为：分别以含有我国流行的II型ASFV的p12编码基因O61R的质粒pUC-p12f或p17编码基因D117L的质粒pUC-p17f为模板（1:1000稀释）1μL，各自上下游引物对（10μM）各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。
PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸20s，进行35个循环，再72℃延伸3min。
取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2b所示，根据检测结果，获得的目的片段p12-SOE-2和p17-SOE-2，大小分别为259bp和427bp。
1.1.3扩增p12-SOE-4和p17-SOE-4的PCR产物
PCR反应体系为：以pHuN4-F112作为模板，以ASFV-p12-F4/ASFV-p17-F4和HR13090上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。
PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸20s，进行35个循环，再72℃延伸3min。
取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，根据检测结果，获得的目的片段p12-SOE-4和p17-SOE-4的大小均为1182bp。
1.1.4扩增p12-SOE-3和p17-SOE-3的PCR产物
PCR反应体系为：以p12-SOE-1和p12-SOE-2 PCR回收产物作为模板，以HF11559和ASFV-p12-R2/R3上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu IITurbo DNA聚合酶5units，加水至50μL；以p17-SOE-1和p17-SOE-2 PCR回收产物作为模板，以HF11559和ASFV-p17-R2/R3上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mMdNTP 2μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。
PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s，进行35个循环，再72℃延伸3min。
取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，根据检测结果，获得的目的片段p12-SOE-3和p17-SOE-3的大小分别为679bp和847bp。
1.1.5 扩增p12-SOE-5和p17-SOE-5的PCR产物
PCR反应体系为：以p12-SOE-3和p12-SOE-4 PCR回收产物作为模板，以HF11559和HR13090上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu II TurboDNA聚合酶5units，加水至50μL。以p17-SOE-3和p17-SOE-4 PCR回收产物作为模板，以HF11559和HR13090上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfuII Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。
PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸45s，进行35个循环，再72℃延伸3min。
取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2b所示，根据检测结果，获得的目的片段p12-SOE-5和p17-SOE-5的大小约为1800bp和2000bp。
2.2表达ASFV p12蛋白或p17蛋白的重组PRRSV质粒的构建
将上述p12-SOE-5 和p17-SOE-5的PCR产物使用Asc I/EcoR V进行双酶切，再分别与经过Asc I和EcoR V双酶切的亲本病毒全长质粒pHuN4-F112的大片段通过T4 DNA连接酶连接，经测序鉴定后筛选出阳性克隆，获得pA-ASFV-p12和pA-ASFV-p17，构建策略如图3所示。
具体步骤如下：
于37℃水浴中，用Asc I/EcoR V分别对p12-SOE-5 的PCR产物和亲本病毒全长质粒pHuN4-F112进行双酶切，反应体系为p12-SOE-5/p17-SOE-5嵌合片段41μL，Asc I 2μL，EcoRV 2μL，10×NEB Buffer4 5μL；pHuN4-F112 15μL，Asc I 2μL，EcoR V 2μL，10×NEBBuffer4 5μL，ddH2O 26μL。
将p12-SOE-5或p17-SOE-5的PCR产物和相应的载体的Asc I/EcoR V双酶切片段以摩尔比3∶1的比例，以T4 DNA连接酶连接，转化TOP10，挑取独立的菌落进行纯培养，提取质粒DNA，1％凝胶电泳，挑取大小为18kb的质粒进行测序，筛选阳性克隆。
对所获得的待鉴定质粒进行全长质粒电泳鉴定，与亲本全长感染性克隆进行电泳图谱比较鉴定，结果见图3a-1和3b-1所示；对全长突变质粒和亲本质粒进行Asc I/EcoR V双酶切电泳图谱比较，结果如图3a-2和3b-2所示。
对嵌合重组质粒pA-ASFV-p12/pA-ASFV-p18和亲本质粒pHuN4-F112进行HindIII-HF酶切检测是否有大片段的缺失，酶切体系为：突变质粒20μL，Hind III-HF 2.5μL，ddH2O 22.5μL，10×Cutsmart Buffer 5μL)，37℃水浴酶切过夜。对酶切产物进行电泳鉴定，结果见图3a-3和3b-3所示，
1.3病毒RNA的制备
1.3.1质粒的Swa I线性化
于37℃水浴中，用Swa I分别对嵌合重组质粒pA-ASFV-p12、pA-ASFV-p17和亲本质粒pHuN4-F112进行线性化酶切(反应体系为：突变质粒41.5μL，Swa I 3μL，ddH2O 0μL，100×BSA 0.5μL，10×NEB Buffer3 5μL)，酶切过夜。参考说明书的方法，用QIAquick PCRPurification Kit纯化酶切产物，分别获得纯化的线性化质粒，见图4a。
1.3.2、体外转录
参考说明书的方法，使用T7 mMESSAGE High Yield Capped RNA Transcription Kit（购自Ambion公司）体外转录纯化后的线性化质粒，并采用RNA电泳鉴定，根据鉴定结果，见图4b，获得了pA-ASFV-p12和pA-ASFV-p17的体外转录RNA。
1.4表达ASFV p12或p17蛋白的PRRSV重组病毒rPRRSV-p12和rPRRSV-p17的检测
1.4.1 RNA的转染
接种MARC-145细胞（非洲绿猴肾细胞系，购自美国ATCC）于六孔板中培养，待细胞密度为80-90％时，向每孔中分别加入pA-ASFV-p12或pA-ASFV-p17的in vitro RNA和2μLDMRIE-C转染试剂，在1mL的Opti-MEM中振荡混匀，然后根据转染试剂说明书的方法，转染MARC-145细胞，并且逐日观察细胞病变。
待出现如图5所示的细胞病变（CPE）后，收取上清并传代，上清收取及传代过程具体如下：
MARC-145细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍，吸取转染过后五天的上清液，将其与维持液（含2％FBS的DMEM）按照1∶10的比例接种上清液200μL，置37℃继续培养并采用上述方法继续传代，并收取第五代的病毒上清，然后按照QIAGEN公司RNA提取试剂盒中的操作方法提取上清病毒RNA，获得病毒rPRRSV-p12和rPRRSV-p17。
根据上述结果，获得的重组质粒pA-ASFV-p12和pA-ASFV-p17具有感染性，能够从单一的基因组序列成功转变为具有活性的病毒粒子并具有相应的病毒感染性。
1.4.2 间接免疫荧光检测
按照实施例1.4.1中的RNA转染步骤，分别以纯化后1000倍稀释的病毒rPRRSV-p12和rPRRSV-p17，感染单层MARC-145细胞，然后于感染36h后弃去培养基，用冰甲醇固定10min，1％BSA室温封闭30min，分别用PRRSV核衣壳蛋白的特异性单抗（1∶800稀释）和ASFV p12、p17的特异性多抗（鼠源，1:1000倍稀释）室温孵育2h，再加入FITC标记的羊抗鼠的二抗室温孵育1h，PBS洗五遍后，在荧光显微镜下观察，结果如图6所示。
根据图5的结果：pA-ASFV-p12和pA-ASFV-p17于转染后第5天出现了明显的CPE，以无限稀释法传代纯化嵌合重组病毒rPRRSV-p12和rPRRSV-p17，并且以间接免疫荧光分别检测感染嵌合病毒rPRRSV-p12和rPRRSV-p17 36h后的MARC-145细胞，结果出现了特异性荧光。
同时，利用RT-PCR技术检测原代（P0）和子代 （P5、P10、P15、P20）病毒，结果显示，ASFV p12和ASFV p17的编码基因能够稳定存在于PRRSV基因组中。
上述结果说明：利用反向遗传操作系统获得了和亲本毒vHuN4-F112具有相似生长特性的表达ASFV p12蛋白或p17蛋白的嵌合重组PRRSV：rPRRSV-p12和rPRRSV-p17，同时证明外源基因ASFV p12蛋白基因O61R或p17蛋白基因D117L的插入不影响整个病毒的生长，是可行的。
1.4.3病毒细胞半数感染量(TCID50)测定
参照Pizzi，M.，Sampling variation of the fifty percent end-point，determinedby the Reed-Muench (Behrens) method，Hum Biol，1950. 22(3)：p151-90.中的方法，用96孔组织培养板方法进行感染性滴度的测定。将上述感染细胞后收取的病毒上清用维持液（含有2％FBS的DMEM）作10倍系列稀释后，将10-1-10-9连续稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的MARC-145单层细胞，每稀释度接种8孔，每孔0.1mL，再设2列对照(即用维持液代替病毒液)，置37℃ 5％的二氧化碳培养箱中培养，6-7天后观察感染细胞，记录出现细胞病变的孔数，并按Reed-Muench法计算TCID50。
1.4.4 病毒多步生长曲线的绘制
分别以低剂量（0.01MOI）病毒（rPRRSV-p12、rPRRSV-p17和vHuN4-F112）感染MARC-145细胞，分别在感染后不同的时间段（2h、10h、18h、26h、40h、56h、80h、96h）收取细胞培养上清，并进行病毒滴度的测定，收取的每个时间点病毒用TCID50计算滴度，并根据不同时间点病毒的滴度，绘制病毒多步生长曲线，结果如图7所示，根据该图，在感染10h后病毒形成第一个复制高峰期，随后在第50h出现第二个复制高峰期；亲本病毒vHuN4-F112与两株嵌合重组病毒rPRRSV-p12和rPRRSV-p17之间的差异不显著。结果说明利用反向遗传操作技术，获得的表达我国流行的II型ASFV的p12蛋白编码基因O61R的全长重组质粒以及p17蛋白编码基因D117L的全长重组质粒拯救出来的重组病毒rPRRSV-p12/rPRRSV-p17和亲本毒株在病毒的增殖各个时间点的病毒滴度，指数增长期，平台期等生长曲线方面具有相似的生物学活性，只是病毒滴度在感染初期略低于亲本病毒vHuN4-F112。达到峰值之后，平台期等时间点两种重组病毒的病毒滴度与亲本病毒的病毒滴度无明显差异。见图7。
本发明在高致病性PRRSV弱毒疫苗株的全长感染性克隆pHuN4-F112的骨架上，利用SOE PCR的方法，分别在ORF1b和ORF2之间插入我国流行的II型ASFV p12蛋白编码基因O61R的核苷酸序列以及 p17蛋白编码基因D117L的核苷酸序列，获得了重组的全长感染性克隆质粒pA-ASFV-p12和pA-ASFV-p17，经病毒拯救，获得了活病毒rPRRSV-p12和rPRRSV-p17，经RT-PCR鉴定，两株嵌合重组病毒rPRRSV-p12和rPRRSV-p17能够稳定传代20次而不发生缺失及其他的突变，ASFV的p12和p17蛋白都是ASFV重要的抗原蛋白。表达ASFV p12蛋白或者p17蛋白的这两株重组猪繁殖与呼吸综合征病毒rPRRSV-p12和rPRRSV-p17能够作为新型ASFV的PRRSV活载体疫苗“鸡尾酒疗法”的重要组分。再加上HP-PRRSV弱毒疫苗株的载体，有望同时防治ASFV和HP-PRRSV。
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Claims (10)

1.一种表达非洲猪瘟病毒p12或p17蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法，所述方法为根据ASFV p12蛋白的编码基因O61R或p17蛋白的编码基因D117L的核苷酸序列以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因序列设计SOE PCR引物，在HuN4-F112的ORF1b和ORF2之前插入ASFV p12的编码基因O61R的核苷酸序列或者p17蛋白的编码基因D117L的核苷酸序列，并在外源基因3’端下游插入此病毒的转录调控序列6（TRS6）；将扩增出的嵌合p12蛋白或p17蛋白的编码基因片段通过Asc I和EcoR V双酶切，然后回收PCR产物连接到HuN4-F112的Asc I和EcoR V双酶切载体上，从而获得了嵌合重组质粒pA-ASFV-p12或pA-ASFV-p17。
2. 如权利要求1所述的一种表达非洲猪瘟病毒p12或p17蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法，所述嵌合重组质粒pA-ASFV-p12、pA-ASFV-p17是能够分别稳定表达ASFV p12及p17蛋白的两株高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112重组病毒。
3.如权利要求1所述的一种表达非洲猪瘟病毒p12蛋白或p17蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法，所述两个嵌合重组质粒pA-ASFV-p12的全长序列如SEQ ID NO.11所示、pA-ASFV-p17的全长序列如SEQ ID NO.12所示。
4.一种利用权利要求1-3之一所述的一种表达非洲猪瘟病毒p12蛋白或p17蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法获得的嵌合重组质粒。
5.一种权利要求4所述的嵌合重组质粒的应用，所述应用为作为一种新型的基因工程活载体疫苗用于非洲猪瘟的免疫保护。
6.一种包含非洲猪瘟病毒p12或者p17蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒或其免疫原性衍生物的疫苗组合物，其中所述表达非洲猪瘟病毒p12或p17蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的嵌合重组质粒pA-ASFV-p12的全长序列如SEQ ID NO.11所示、pA-ASFV-p17的全长序列如SEQ ID NO.12所示。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述组合物还包含佐剂。
8.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂及其组合。
9.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。
10.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述组合物还包含至少一种额外的抗原。
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