CN115894718A - 一种非洲猪瘟病毒的抗原表位肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种猪瘟抗原表位肽，所述猪瘟抗原表位肽包括非洲猪瘟病毒蛋白p12和p17中的多个抗原表位，而且通过生物信息学分析，对其中个别氨基酸进行了替代或者改变，同时考虑到高级空间结构，个别抗原表位之间通过柔性linker和刚性linker加以连接，充分将其抗原表位进行暴露。经试验验证，所述猪瘟抗原表位肽可诱发实验动物针对非洲猪瘟病毒的免疫反应。

Description

一种非洲猪瘟病毒的抗原表位肽及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种非洲猪瘟病毒的抗原表位肽及其应用，更具体的，所述抗原表位肽为非洲猪瘟病毒的多种抗原表位肽串联形式。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒科的唯一成员非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、发热、传染性很高的疾病。家猪和欧洲野猪普遍易感，呈现复杂的临床症状，引起消化系统和呼吸系统充血、出血以及功能紊乱，在家猪中是一种高度接触性传播疾病，发病过程短，潜伏期5-15天，有很高的发病率和死亡率，死亡率甚至可高达100％。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。ASF给中国的养猪业造成了迄今最为惨重的经济损失。一年时间内，我国32个省、市、自治区均发生ASF疫情。ASF疫情使我国生栏量和出栏量下降20％-50％，许多猪场因ASF疫情完全覆没，严重削弱了我国猪肉的有效供给，导致我国生猪和猪肉价格均出现翻番。从ASF在中国流行的总体情况来看，ASF疫情防控效果不容乐观，疫情仍然处于持续扩散的状态。

ASF的病原ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，为大型双链DNA病毒，也是目前已知的唯一的DNA虫媒病毒。猪单核细胞-巨噬细胞为ASFV主要的靶细胞。ASFV的基因组约170-193kb，含有150-167个ORF，编码150-200种蛋白质。其中约50多种是病毒的结构蛋白。同时ASFV基因组还编码DNA复制、基因转录和RNA修饰酶类，以及调节宿主细胞功能和参与病毒免疫逃逸的相关蛋白。然而，目前仍有约一半以上的ASFV基因编码的蛋白功能尚不清楚。ASFV粒子直径约为200nm，呈20面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是类核(Nucleoid)、核壳(Core shell)、内囊膜(Inner envelope)、衣壳(Capsid)和外囊膜(External envelope)。现有技术的研究中发现，ASFV的p12蛋白是ASFV感染晚期表达的膜蛋白，由O61R基因编码，共186nt，其分子量大小约为6.7kD。其C-末端区域富含半胱氨酸的结构域，参与病毒的吸附。有学者通过免疫电子显微镜发现，该蛋白位于病毒粒子层，细胞表面的膜蛋白是ASFV的受体。在病毒侵染细胞时，可吸附细胞膜，使病毒进入细胞内。在机体外，p12蛋白的抗体可阻断ASFV侵入宿主细胞。另外，利用HEK293细胞表达p12蛋白，纯化后免疫猪能产生针对p12的特异性抗体，表明p12具有一定的免疫原性。另一方面，ASFV的P17蛋白是ASFV表达的晚期膜蛋白，由D117L基因编码，核苷酸序列共354nt，编码蛋白大小为13.1kD。位于病毒内膜的跨膜蛋白。与早期膜蛋白p54一样，p17对于病毒活力至关重要，能促进ASFV病毒的二十面体颗粒形成。若缺失p17，组装后的病毒将变得不稳定，失去感染作用。p17蛋白还同时具有抑制蛋白水解的作用，使多聚蛋白pp220和pp62不能进一步水解。

灭活疫苗虽能诱导抗体反应，但对强毒攻击不能提供有效保护；而弱毒活疫苗，包括天然弱毒株、传代培养致弱毒株和基因缺失弱毒株等，能诱导体液免疫应答和细胞免疫应答，为接种动物提供高水平的保护，但是其安全性却堪忧；基于单个或多个保护性抗原的亚单位疫苗，包括重组蛋白、DNA疫苗和病毒活载体疫苗等，能对免疫动物提供部分保护，是今后的一个重要的研究方向，以期在ASFV防控的安全性和免疫效力上都达到令人免疫的效果。现阶段，研究人员提出了利用基因工程制备含有ASFV病毒的抗原性蛋白载体蛋白结合的融合蛋白用于ASFV疫苗。但是现有技术中的融合蛋白为包涵体，单体形式存在，抗原表位丰度低，免疫效果较低，且通过变复性方法获得，蛋白质构象折叠准确性低，同时纯化方法复杂。而且选择的蛋白和抗原表位的不同，也会造成免疫效果的差异，尤其是在后期的疫苗、抗体的制备过程中更是差异显著。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的非洲猪瘟病毒的抗原表位肽，所述抗原表位肽中串联了猪瘟病毒p12和p17蛋白的多个抗原表位，并对其进行了个别氨基酸的替换和改造，实现了抗原表位丰度高、免疫效果好的技术效果。

进一步的，所述抗原表位肽的具体序列为SEQ ID NO.1-3所示；

进一步的，本发明提供一种重组抗原，含有所述的一种猪瘟抗原表位肽与其他第二种病毒抗原；

优选的，所述二种病毒抗原包括但不限于非洲猪瘟病毒其他蛋白抗原(例如：p30蛋白、p54蛋白、KP177R蛋白、E199L蛋白,E184L蛋白,B475蛋白，E120R蛋白、A104R蛋白、A137R蛋白、K145R蛋白、CP312R蛋白等)、猪圆环病毒结构蛋白Cap、乙肝病毒核心抗原蛋白、PRRSV N蛋白抗原等；

进一步的，本发明提供如下产品：

(a)一种特异性识别所述的抗原表位肽的抗体；(b)一种编码所述抗体的核苷酸序列；(c)一种表达载体，包括所述的核苷酸序列；(d)一种宿主，包括所述的表达载体；(e)一种组合物，包括所述的(a)-(d)中的一种或者多种；优选的，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步的，本发明提供一种上述(a)-(e)产品的应用，所述应用为非疾病的诊断和治疗目的的检测，可以用于生物样品、水样、猪场环境等的检测。

进一步的，本发明提供如下产品：

(a’)一种抗所述的抗原表位肽的抗体；(b’)一种编码所述抗体的核苷酸序列；(c’)一种表达载体，包括所述的核苷酸序列；(d’)一种宿主，包括所述的表达载体；(e’)一种组合物，包括所述的(a’)-(d’)中的一种或者多种；优选的，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步的，本发明提供一种上述(a’)-(e’)产品的应用，所述应用为制备疫苗的应用。所述疫苗为预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染。

有益效果

本发明提供的一种猪瘟抗原表位肽，所述猪瘟抗原表位肽包括非洲猪瘟病毒蛋白p12和p17中的多个抗原表位，而且通过生物信息学分析，对其中个别氨基酸进行了替代或者改变，同时考虑到高级空间结构，个别抗原表位之间通过柔性linker和刚性linker加以连接，充分将其抗原表位进行暴露。经试验验证，所述猪瘟抗原表位肽可诱发实验动物针对非洲猪瘟病毒的免疫反应。

本发明提供的猪瘟抗原表位肽，抗原表位丰度高，免疫效果优良，且所述重组抗原为可溶性表达，蛋白构象折叠准确率高，纯化方法简单，同时相比非洲猪瘟减毒活疫苗，不具有病毒核酸，没有感染性，安全性极高，且所有重组抗原均采用大肠杆菌表达系统，具有周期短，成本低廉等优点。

本发明提供的猪瘟抗原表位肽与其他的常见猪类病毒抗原之间具有较好的协同作用，可以实现一针多价，一针多苗，节省成本，可以起到“一针防两病”，甚至“一针防多病”的效果。而且诱导出的抗体具有较好的特异性，可以为后续的检测抗体、疫苗的进一步研究提供坚实的基础。

附图说明

图1，经纯化后非洲猪瘟病毒p12p17融合抗原表位肽1-3的SDS-PAGE电泳图；

图2，非洲猪瘟病毒p12p17融合抗原表位肽1-3检测免疫小鼠的450nm吸收值。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

在本发明的实施例中，使用的病毒和细胞：MARC-145细胞(非洲绿猴肾细胞系)。

在本发明的实施例中，使用的质粒与菌株：pBlueScript II SK(+)载体购自Invitrogen公司，pBS-T载体、TOP10感受态细胞购自TIANGENE公司。

在本发明的实施例中，使用的其他试剂：QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGENE公司，pfu II DNA Polymerase购自Strategene公司，T7 mMESSAGE HighYieldCapped RNA Transcription Kit购自Ambion公司，胶回收试剂盒和QuantReverseTranscriptase购自TIANGENE公司，rTaq DNA聚合酶，dNTP和限制性内切酶购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，DMRIE-C转染试剂购自Invitrogen公司，Opti-MEM购自Invitrogen公司。

实施例1非洲猪瘟病毒蛋白p12和p17抗原表位分析

本试验采用生物信息学方法对GenBank公布的Pig/HU/2018毒株序列(MK333180.1)、我国流行的ASFV基因II型SY18株(GenBank:MH766894)，利用ProtScale、TMHMM和SignalP分析蛋白的疏水性、跨膜区和信号肽，利用ABCpred预测蛋白的抗原表位，并利用DNAStar分析病毒蛋白抗原性，结合已有文献分析设计，得到的非洲猪瘟病毒p12和p7的潜在抗原表位。

进一步的，结合大肠杆菌表达外源基因的特点，大病毒蛋白选择抗原性强、亲水性高的区段进行表达，膜蛋白选择去掉信号肽的胞外区表达，小蛋白进行融合表达。根据大肠杆菌密码子偏嗜性，对上述潜在抗原表位进行优化。筛选出的抗原表位列表如下所示。

再综合非洲猪瘟病毒的生物学特性，利用DNAStar及ANTHEPROT软件对融合蛋白中各个表位之间的亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Garnier-Robson的二级结构进行分析，暴露尽可能多的细胞免疫表位。同时考虑到在表位串联时，容易出现两个表位连接处形成新的表位，从而掩盖了原有表位的免疫应答的情况，因此在串联表位时利用KK\GSGG\GPGGGP对其中个别表位进行串联，最终获得非洲猪瘟病毒p12p17融合抗原表位肽的候选序列，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.1-3。

其中，

p12p17-1为：MKCSKAEECTCGSGGGPGGGPPLLSHNLSTRKKNVETLLIVEGIKQSTQGLLAHTIGPGGGPPLLS HNLSTRAELAHSIMLYALDGSSGG(SEQ ID NO.1)；

p12p17-2为：NVETLLIVGSGGKRKNSVVIMAIMLGPGGGPKCSKAEECTCKKALDGSSGGAELAHSSLLAEPPS YYVQQPENRTIDCKSSIPGSGGKCSKAEECTC(SEQ ID NO.2)；

p12p17-3为：KCSKAEECTCGPGGGPAELAHSALDGSSGGVVIMAIMLAIVYYNRGSGGIMLYEGIKQSTQGLLA HTIGSGGNRTIDCKSSIPCSLKTGPGGGPKRKNS(SEQ ID NO.3)

实施例2非洲猪瘟病毒p12p17融合抗原表位肽的构建

根据所获得的p12p17融合抗原表位肽的具体氨基酸序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成并将获得的重组基因序列插入pET-28a载体BamHI和XhoI之间，获得重组表达载体，分别命名为pET-28a-p12p17-1，pET-28a-p12p17-2，pET-28a-p12p17-3。

将上述3株pET-28a-p12p17重组表达载体转化大肠杆菌BL21DE3感受态细胞，获得相应的表达菌株，利用大肠杆菌表达系统表达ASFVp12p17融合蛋白，表达方法是：挑取单一菌落，接种于5ml的LB液体培养基(含卡那霉素50μg/ml)中于37℃、200rpm的摇床中过夜培养。第二天将菌液接种入1L的LB培养基(含卡那霉素50ug/ml)中扩大培养，待培养至OD600＝0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，16℃，220r/min诱导表达16～20h，将培养后的菌液3800rpm、4℃离心30min，倒掉上清，将得到的菌体按照1g/ml重悬于0.01mol/L PBS缓冲液中，用均质机进行菌体破碎，离心收集上清，经Ni柱纯化蛋白，将纯化后的蛋白经分子筛进行纯化并除去咪唑，获得3种p12p17抗原表位嵌合蛋白候选株，并作为免疫抗原和包被抗原，SDS-PAGE电泳图如图1所示，-20℃保存备用。

实施例3非洲猪瘟病毒p12p17融合抗原表位肽的ELISA效果鉴定

使用灭活非洲猪瘟病毒免疫小鼠，分离血清用于对抗原的ELISA检测，Balb/c小鼠(六周龄)为未免疫小鼠血清对照，具体步骤如下：

将100μl的稀释至2μg/ml的待检测抗原(三种ASFVp12p17融合蛋白)分别加入到ELISA孔中，于37℃包被过夜；第二天用PBST溶液洗板三次后，加入0.2％BSA按照200μl/孔室温(25℃)封闭1h；封闭结束用PBST溶液洗板三次；加入按照血清：PBS缓冲液＝1:1000(体积比)稀释的小鼠血清，100ul/孔室温反应1h；加入PBST溶液洗板3次；加入按照HRP-山羊抗小鼠二抗：PBS缓冲液＝1:10000(体积比)稀释的HRP-山羊抗小鼠二抗100μl/孔，室温反应1h；加入PBST溶液洗板5次；加入TMB显色液100μl/孔显色，显色后加入2M硫酸100μl/孔终止反应；读取450nm吸收值，各自做重复三次。同时，ASFVp12蛋白和ASFVp17蛋白作为对照进行同批次试验。

结果如图2所示，三株ASFVp12p17融合蛋白都可与血清发生免疫反应，且免疫效果显著，而且都明显的好于ASFVp12蛋白和ASFVp17蛋白，说明本发明所述猪瘟抗原表位肽抗原表位丰度高，免疫效果优良。其中pET-28a-p12p17-3的效果在一定程度上要好于其他候选株，可以作为后续研究的重点。

实施例4非洲猪瘟病毒p12p17融合抗原表位肽的ELISA检测体系的建立根据本领域常规操作制备相应的ELISA检测试剂盒，其中包括：

(1)分别包被有非洲猪瘟病毒p12p17融合抗原、ASFVp12蛋白和ASFVp17蛋白的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板(每孔150ng蛋白)；2×96孔。

(2)阳性对照血清：是以非洲猪瘟病毒主要抗原p30、p54和p72重组蛋白免疫制备的高免血清经样品稀释液稀释后，作为试剂盒的阳性对照血清(1管，1.5ml/管)。

(3)阴性对照血清：是无特定病原体(SPF)猪血清，作为试剂盒的阴性对照血清(1管，1.5ml/管)。

(4)酶标二抗：是以辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG(购自sigma公司，货号A5670)作为原液进行1:30000稀释后制得，2瓶(12ml/瓶)。

(5)样品稀释液：为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，1瓶(24ml/瓶)。

(6)底物液A：为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1瓶，12ml/瓶)

(7)底物液B：为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液(1瓶，12ml/瓶)。

(8)终止液：2mol/L的硫酸溶液(1瓶，12ml/瓶)。

(9)20倍浓缩洗涤液：为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(50ml/瓶，2瓶)。

敏感性试验

利用上述制备的ELISA检测试剂盒对猪场采集的经PCR检测验证阳性的25份待检猪血清进行检测，同时用OIE推荐ELISA(抗原由英国Pirbright研究所提供)、西班牙Ingenasa公司ELISA试剂盒(INGEZIM PPA COMPAC)、法国ID-Vet公司ELISA试剂盒(IDScreen African Swine Fever Indirect ELISA kit)进行平行检测。检测方法简述为：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：20的比例稀释。各孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本，尽量同时加入，避免操作引起的误差，同时设定2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。震荡混匀，置37℃温箱中，孵育反应30min。反应后弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，冲洗浸泡，甩干，重复2-4次。各孔加100μl辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。置37℃温箱，温育30min。弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，冲洗浸泡，甩干，重复2-4次。每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。测定每孔的OD450nm值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值)。

检测结果的判定：

1、阴性对照OD450nm平均值应该≤0.15，否则无效。

2、阳性对照每个检测值应该在1.0～2.5之间，否则无效。

3、临界值的计算：临界值＝0.154×阳性对照OD450nm值平均值。

待检血清测定OD450nm值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450nm值<临界值者判为阴性。

检测结果如表1所示，结果显示：使用本申请所设计的p12p17融合抗原表位的ELISA试剂盒具有良好的敏感性，完全可以作为国外进口品牌的替代品，而且p1217-3的表现极其优异，效果要明显高于其他方法。

表1各种ELISA试剂盒的敏感性试验

ELISA试剂盒	检出率	敏感性
			P12	15/25	60％
P17	12/25	48％
			P1217-1	19/25	76％
P1217-2	21/25	84％
			P1217-3	24/25	96％
OIE-ELISA	18/25	72％
			Ingenasa	19/25	76％
ID-Vet	13/25	52％

特异性试验

使用上述8种试剂盒对本实验室保存的15份健康猪血清、5份猪瘟阳性血清(CSF)、5份猪口蹄疫病毒O型(FMD-O)阳性血清、10份猪蓝耳病(PRRSV)阳性血清、5份猪圆环病毒(PCV)阳性血清，分别进行检测。

试剂盒的特异性检测结果如表2所示，对15份健康猪血清的检测结果显示，本申请所涉及到的试剂盒的特异性均为100.0％。对5份猪瘟阳性血清(CSF)、5份猪口蹄疫病毒O型(FMD-O)阳性血清、10份猪蓝耳病(PRRSV)阳性血清、5份猪圆环病毒(PCV)阳性血清的检测结果均显示为阴性，因此本申请所涉及到的试剂盒的特异性均为100％。以上结果说明本申请的技术方案具有良好的市场前景。

表2各种ELISA试剂盒的特异性试验

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种新的非洲猪瘟病毒的抗原表位肽，其特征在于所述抗原表位肽中串联了猪瘟病毒p12和p17蛋白的多个抗原表位，并对其进行了个别氨基酸的替换和改造，实现了抗原表位丰度高、免疫效果好的技术效果。

2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒的抗原表位肽，所述抗原表位肽的具体序列为SEQID NO.1-3之一所示。

3.如权利要求1或2所述的非洲猪瘟病毒的抗原表位肽的应用，所述应用为制备检测、治疗、预防非洲猪瘟病毒的药物中的用途。

4.一种含有权利要求1或2所述非洲猪瘟病毒的抗原表位肽的ELISA检测试剂盒，其中包括：

(1)制备包被有权利要求1或2所述非洲猪瘟病毒的抗原表位肽的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板(每孔150ng蛋白)；2×96孔。

(2)阳性对照血清：是以非洲猪瘟病毒主要抗原p30、p54和p72重组蛋白免疫制备的高免血清经样品稀释液稀释后，作为试剂盒的阳性对照血清(1管，1.5ml/管)。

(3)阴性对照血清：是无特定病原体(SPF)猪血清，作为试剂盒的阴性对照血清(1管，1.5ml/管)。

(4)酶标二抗：是以辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG(购自sigma公司，货号A5670)作为原液进行1:30000稀释后制得，2瓶(12ml/瓶)。

(5)样品稀释液：为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，1瓶(24ml/瓶)。

(6)底物液A：为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1瓶，12ml/瓶)

(7)底物液B：为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液(1瓶，12ml/瓶)。

(8)终止液：2mol/L的硫酸溶液(1瓶，12ml/瓶)。

(9)20倍浓缩洗涤液：为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(50ml/瓶，2瓶)。

5.如权利要求4所述的ELISA检测试剂盒在非疾病的诊断目的中的应用，所述应用为针对环境样品、饲料、猪产品中的非洲猪瘟病毒的检测。

6.一种产品，其特征在于所述产品具体为：(a)一种特异性识别如权利要求1或2所述的抗原表位肽的抗体；(b)一种编码所述抗体的核苷酸序列；(c)一种表达载体，包括所述的核苷酸序列；(d)一种宿主，包括所述的表达载体；(e)一种组合物，包括所述的(a)-(d)中的一种或者多种；优选的，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

7.一种权利要求6所述的产品的应用，所述应用为非疾病的诊断和治疗目的的检测，可以用于生物样品、水样、猪场环境等的检测。

8.一种产品，其特征在于所述产品具体为：(a’)一种抗所述的抗原表位肽的抗体；(b’)一种编码所述抗体的核苷酸序列；(c’)一种表达载体，包括所述的核苷酸序列；(d’)一种宿主，包括所述的表达载体；(e’)一种组合物，包括所述的(a’)-(d’)中的一种或者多种；优选的，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

9.一种权利要求8所述的产品的应用，所述应用为制备疫苗的应用。所述疫苗为预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染。

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