CN102174091B - 截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents
截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及动物医学及生物技术领域，尤其涉及截短的鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白，所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白DNA序列如SEQIDNo.1所示，具有如SEQIDNo.2所示的多肽序列；其制备方法为截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的基因的获取，截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的重组原核表达载体的制备，其蛋白的制备；所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白在制备鸭瘟病毒抗原或疫苗中的应用，特别在制备DPV的ELISA抗体检测试剂盒中的应用；本重组囊膜gI蛋白纯度高，本制备方法操作简单，用所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白对血清中DPV抗体进行ELISA检测具有简便、高效、准确的特点。
Description
技术领域
本发明涉及动物医学及生物技术领域，尤其涉及截短的鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白及其制备与应用。
背景技术
鸭瘟（Duck plague,DP）又称为鸭病毒性肠炎(Duck Viral Enteritis,DVE)，是由鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）引起的鸭、鹅及多种雁行目禽类的一种急性、热性、败血性传染病，是危害世界水禽养殖的主要传染病之一。目前用于鸭瘟预防的疫苗有灭活苗和弱毒苗两大类，其中弱毒苗较之灭活苗免疫效力更好，而对DPV特异性抗体水平的检测是评价DPV免疫效果及制定合理的免疫程序的关键。目前，用于检测DPV抗体的主要方法包括中和试验(neutralization test，NT)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、琼脂凝胶扩散试验、Dot-ELISA测定法和被动血凝试验。其中经典的方法是血清中和试验，但因其实验周期长，操作繁琐，敏感性差，不适于大批量血清样品检测。EL ISA用于DPV抗体检测具有简便、敏感、特异等优点, 结合半自动化检测设备，适宜于大批鸭群抗体水平的监测和基层单位检疫需要；但是以往建立的ELISA方法使用全病毒作为包被抗原，由于受病毒培养和纯化等方面的技术限制，全病毒抗原纯度有限，稳定性差，难以标准化，从而影响ELISA检测结果的准确性，限制了包被全病毒的ELISA方法（DPV-ELISA）的大规模应用。因而，建立特异敏感的诊断方法对预防控制该疾病显得十分必要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供截短鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白，该蛋白是经切除信号肽与跨膜位点，并保留大部分抗原位点，即gI基因的88bp-813bp区域，在宿主细胞中表达而得，其表达效率高。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
1、截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白，所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列及如SEQ ID No.1所示的DNA序列。
2、根据1所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白，所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白由插入了如SEQ ID No.1所示的DNA序列的重组原核表达载体转化入宿主细胞所得的转化体诱导表达而得。
3、根据2所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白，重组原核表达载体为pET-32a(+)插入了如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列而得。
4、根据2所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)Plysis。
本发明的目的之二在于提供截短鸭瘟病毒gI蛋白的制备方法，该方法工艺简单、成本低，适合于大规模生产。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
5、1-4任一项所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：
A、截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的基因的获得
以鸭瘟病毒的核酸为模板，前引物如SEQ ID No.3，后引物如SEQ ID No.4所示，通过聚合酶链式反应获得截短的gI核酸序列，如SEQ ID No.1所示；
B、截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的重组原核表达载体的获得：
将步骤A所得如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列插入原核表达载体pET-32a(+), 获得截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的重组原核表达载体, 命名为pET-32a(+)-gI726；
C、截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的获得
将步骤B所得pET-32a(+)-gI726转化入宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)Plysis，得转化体，将所述转化体用异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，得截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白。
6、根据5所述的截短鸭瘟病毒Ig蛋白抗原的制备方法，其特征在于：将步骤B所得pET-32a(+)-gI726转化入宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)Plysis并用异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，Ni-NTA Argarose纯化，得截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白。
本发明的目的之三在于提供截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的应用，该应用是基于其具有良好的抗原反应原性而产生的，其特异性好，敏感性高。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
7、1所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白在制备鸭瘟病毒抗原 中的应用。
本发明的另一目的在于提供截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的另一应用，该运用为其抗体的检测提供了新手段。
8、1所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白在制备检测鸭瘟病毒抗体的ELISA试剂盒中的应用。
本发明的目的之五在于提供鸭瘟病毒抗体的检测方法，该方法操作简单，适用于大规模检测。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
9、鸭瘟病毒抗体的ELISA检测方法，具体包括以下步骤：
a 固相抗原的制备：将所述截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白包被酶标反应板，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；
b 一抗结合：将待检血清作2倍的稀释，得稀释血清，通过保温反应使所述稀释血清与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；
c 二抗结合：将辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG酶标二抗作3000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原—抗体—二抗复合物；
d 显色：在步骤c所得抗原—抗体—二抗复合物加入显色液TMB，避光显色10-20分钟，加入终止液终止反应得显色样品液；
e 检测并判定：将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD450nm值, OD450nm值在约等于1且P/N比值＞2.0时，判定为阳性。
本发明的有益效果在于：截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白为切除gI基因信号肽及两端跨膜预测位点，保留gI基因的88bp-813bp部分（包含主要抗原预测位点），以DPV核酸为模板，通过PCR方法扩增获得截短的DPV gI核酸序列，并克隆于大肠杆菌原核表达载体pET-32a(+), 将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)Plysis宿主细胞后用IPTG诱导表达，经Ni-NTA Argarose纯化，获得截短的gI重组蛋白，其纯度高，截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白主要抗原域在88bp-813bp序列区域，经过DPV阳性血清验证，截短表达的DPV gI蛋白具有良好的抗原反应原性，可作为诊断抗原用于酶联免疫吸附试验等检测DPV感染后的抗体。此外，该截短表达的DPV gI蛋白还可以用于制备单克隆抗体或多克隆抗体以检测DPV抗原的存在以及配以适当免疫佐剂制备基因工程亚单位疫苗；用所述截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白对血清中DPV抗体进行ELISA检测具有简便、高效、准确的特点，能够弥补琼扩试验、中和试验等传统实验方法的不足。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为截短鸭瘟病毒gI基因原核表达载体pET-32a(+)-gI726结构示意图,gI726表示插入载体pET-32a(+)的截短gI片段；
图2为重组质粒pET-32a(+)-gI726的PCR和双酶切鉴定图，M1为核酸标准分子量（2000、1000、750、500、250、100bp）；M2为核酸标准分子量（15000，10000，7500，5000，2500，1000，250bp）；1为 pET-32a(+)-gI726 PCR产物；2为pET-32a(+)-gI726的BamHI/XhoI双酶切产物；3. pET-32a(+)-gI726的BamHI单酶切产物；
图3为重组蛋白的SDS-PAGE分析图，M为蛋白标准分子量（116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4 kDa）；1为pET-32a(+)未诱导；2为pET-32a(+)诱导；3为pET-32a(+)-gI726未诱导；4为pET-32a(+)-gI726诱导菌液上清；5为pET-32a(+)-gI726诱导菌包涵体；6为pET-32a(+)-gI726诱导蛋白纯化后；箭头所指为47kDa；
图4为重组蛋白的Western-blotting(免疫印迹)分析图：M蛋白标准分子量（120、86、47、34、26、20 kDa）；1为兔抗DPV阳性血清组；2为兔阴性血清对照组；箭头所指为47kDa。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白及其制备方法与应用
一、DNA的提取
1. DPV的增殖培养
将DPV CHv种毒接种于刚刚长成的致密单层鸭胚成纤维细胞（DEF），37℃吸附60分钟后弃病毒液，然后加含体积分数为2％的小牛血清和100IU/mL双抗的MEM 维持营养液，之后37℃培养24~48小时。
2. DNA提取
1)选取用DPV种毒感染后细胞病变（CPE）达70％的DEF（100mL细胞瓶）；
2)倾去细胞培养液，加入500μL的细胞裂解液，同时加蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200μg/mL，轻轻混匀后，37℃孵育10分钟；
3)将细胞悬浮液倒入EP离心管中，并用500μL的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物，倒入离心管中；
4)用饱和酚：氯仿及氯仿抽提2次，再用水饱和乙醚处理2次；
5)加1/10倍体积3mol/L NaAC，混匀后，加入2倍体积冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟；
6)13000转/分钟离心20分钟，沉淀用预冷的体积分数为70%乙醇洗涤两次；
7)真空抽干后，溶于适量TE缓冲液中，加入1μL RNA酶，37℃作用30分钟，-20℃保存备用。
二、DPV CHv株截短gI基因的PCR扩增
1、 引物设计
应用Oligo软件设计引物，为了便于基因的克隆及构建表达载体，同时参照pMD18-T 载体、原核表达载体pET -32a(+)的多克隆位点序列，分析gI基因序列内的酶切位点，设计一对引物(下划线标注为酶切位点)，详见SEQ ID No.3和SEQ ID No.4：
P1：5’-ggatccgtaagcttatatctacaggaacc-3’，
P2：5’- ctcgagaagtccactattggtatcattatg-3’；
P1、P2分别为上游引物和下游引物，P1、P2的5’端分别引入与质粒载体相同的BamHⅠ（ggatcc）和XhoⅠ（ctcgag）酶切位点，经Primer软件检测，所设计的引物不含有自身互补序列，不形成发夹结构，两引物间不形成引物二聚体。P1、P2引物的跨幅为726bp，涵盖了Us7基因（即gI基因）从第88bp到第813bp的基因片段。引物由宝生物生物技术有限公司合成。合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20 mmol/L，-20℃保存备用。
2、 PCR反应
PCR反应体系（20ml体系）：
| 2×傻瓜PCR Mixtrue | 10μL |
| DPV 基因组DNA | 1.0μL |
| P1(20pmol／μL) | 0.6μL |
| P2（20pmol／μL) | 0.6μL |
| 超纯水 | 7.8μL |
| 总体系 | 20μL /Sample |
PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃ 60s,59℃ 60s,72℃ 60s,进行30个循环，72℃延伸10min结束，得如SEQ ID No.1所示的序列。
三、pET-32a(+)-gI726 表达载体的构建
PCR产物纯化试剂盒回收目的片段，利用T-A克隆直接连接于pMD-18T载体，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取单克隆，PCR和双酶切鉴定正确的阳性克隆进行测序鉴定。抽提含有正确的截短gI基因的T克隆质粒，经BamHI/XhoI双酶切，回收目的片段克隆于表达质粒pET-32a(+)的BamHI/XhoI酶切位点之间,构建重组表达质粒pET-32a(+)-gI726，详见图1。连接体系如下：
| 回收目的截短gI片段 | 6.0μL |
| pET-32a(+)双酶切回收片段 | 1.5μL |
| 2×DNA连接酶Mixtrue | 7.5μL |
| 超纯水补足至 | 15μL |
将连接产物转化感受态宿主菌BL21(DE3)Plysis，在Amp平板上挑取阳性克隆进行LB液体扩大培养，抽取重组质粒进行PCR、双酶切、单酶切和测序鉴定。酶切体系如下：
| BamHI | BamHI / XhoⅠ | |
| pET-32a(+)-gI726质粒 | 8.0μL | 16.0μL |
| BamHI | - | 1.0μL |
| XhoⅠ | 1.0μL | 1.0μL |
| 10×K Buffer | 1.0μL | 2.0μL |
| 超纯水补足至 | 10μL | 20μL |
重组质粒pET-32a(+)-gI726的PCR、单酶切和双酶切鉴定见图2，测序结果见SEQ ID No.1所示
四、DPV 截短gI蛋白抗原基因的诱导表达
将鉴定正确的重组质粒转化BL21(DE3)Plysis宿主菌，挑取单克隆接种到含有50μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜，按照体积比为1：100的比例将培养物接种于含有Amp的液体LB培养基中，150转/分钟振荡培养2小时左右，当OD600≈0.5时，按终浓度0.2mM加入异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达5小时，离心收集菌体。沉淀中加入80μL超纯水和20μL 5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性5～10分钟，进行12%SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，观察表达结果。结果重组质粒经诱导后表达了约47kDa的融合蛋白，对照组没有相应条带，详见图3。
五、重组蛋白的鉴定
Western-blotting分析：表达蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转移至硝酸纤维素膜（NC）上，用含有5%(w/v)脱脂奶粉的PBST 37℃缓慢摇动温育1.5小时封闭NC膜；然后加入含5%(w/v)脱脂奶粉的PBST稀释的兔抗DPV血清，同时设兔阴性血清对照组，37℃缓慢摇动温育1小时；PBST洗涤膜3次，每次10分钟；再加入含质量分数为5%的脱脂奶粉的HRP标记的羊抗兔IgG二抗，37℃缓慢摇动温育1小时；PBST洗涤膜3次，每次10分钟后，加入DAB显色液进行显色，结果能观察到特异性的反应条带，详见图4。
六、重组蛋白的纯化
1、包涵体的洗涤
1）诱导表达200mL菌液，4℃、10000转/分钟离心10离心，沉淀（菌体）用40mL浓度为20mM 的Tris-Cl（pH8.0）悬浮；
2）冰浴超声波破碎菌体，150瓦破菌1分钟，间歇进行3次；
3）将破碎后的菌体于4℃、10000转/分钟离心10分钟，沉淀用40mL的浓度为20mM Tris-Cl（pH8.0）悬浮；
4）重复步骤2）；
5）4℃、10000转/分钟 离心10分钟，用40mL 浓度为20mM Tris-Cl（pH8.0）悬浮；加入新鲜配制的溶菌酶至终浓度为1mg/ml，置冰浴上30min，不断搅拌；
6）再次超声波破碎，离心，沉淀加入40ml含8M尿素的缓冲液；
7）将制备的溶液用0.45μm孔径的滤膜进行过滤。
2、镍NTA琼脂糖凝胶FF过柱纯化截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白
样品经过超声波破碎，溶菌酶裂解等一系列处理，初步纯化包涵体后利用融合蛋白的6×His标签对镍离子特殊的亲和作用，使带有标签的经过洗涤的初步提纯的重组蛋白能够结合于镍胶上，然后将其洗脱，而达到进一步纯化的目的。具体操作步骤为：
1) 镍琼脂糖凝胶 FF装柱，柱床体积为40mL；
2) 用缓冲液平衡2～5个床体积，流速为1mL/分钟；
3) 将滤膜过滤后的细胞破碎液上样，流速为0.5 mL /分钟；
4) 用缓冲液再洗2～5个床体积，流速为1 mL /分钟；
5) 用浓度分别为50、300、500mM咪唑的缓冲液进行阶段洗脱，流速为
1mL/分钟，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；
6) 用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为1mL/分钟，柱子置于4～8℃环境中保存。
纯化后的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白经SDS-PAGE分析，详见图3。
七、截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白在制备鸭瘟病毒抗原或免疫原中的应用
截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白用0.05M pH9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释，包被酶标反应板，37℃孵育1小时，转入4℃过夜。次日用洗涤液PBST加满孔进行摇床振荡洗涤3～5次，每次3～5分钟。用含有5%脱脂奶粉的PBST37℃下封闭2小时，洗涤。将待检测的DPV阳性血清和鸭阴性血清分别用PBST作2倍的倍比连续稀释后加入孔中，37℃孵育1小时，同上洗涤。加入3000倍体积比稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG二抗，37℃孵育1小时，洗涤。加入缓冲液稀释的显色液TMB，避光显色10～20分钟，最后加终止液2M H2SO4，每孔50mL，终止反应。酶标检测仪在450nm波长下读取各孔的OD值，OD450值约1且P/N比值＞2.0，判定为阳性。
结果：截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白与待检测的阳性血清发生反应，达到阳性标准，但与阴性血清不反应。本项发明可取代DPV全病毒用于检测DPV感染以及DPV疫苗免疫所产生的DPV抗体水平，也可用于鸭瘟的流行病学调查。
八. 截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白 。
疱疹病毒是一类体积较大、结构较复杂的病毒，其基因组约含70个基因，编码70-100种蛋白，其中约有30多种为病毒结构蛋白，分别凝聚形成核蛋白、囊膜糖蛋白、间质蛋白和衣壳蛋白。在疱疹病毒的蛋白中，糖蛋白的研究最为重要，这是由于它涉及病毒的识别、吸附、侵入宿主细胞并导致感染、免疫原性以及基因工程疫苗的研制等，对其深入研究，不仅有利于阐明病毒感染的作用机制，且对研究安全、高效的新型基因工程疫苗或诊断试剂具有十分重要意义。目前疱疹病毒已有11种糖蛋白被鉴定，分别命名为 gB、gC、gD、gE 、gH、gI、gK、gL、gM、gN和 gJ。其中gI作为囊膜糖蛋白是病毒颗粒表面的抗原决定簇，也具有免疫原性。Ghiasi 等【① Ghiasi H, Kaiwar R, Nesburn A B, et al. Expression of seven herpes simplex virus type 1 glycoproteins (gB, gC, gD, gE, gG, gH, and gI): comparative protection against lethal challenge in mice[J]. J Virol, 1994, 68(4): 2118-2126；② Ghiasi H, Nesburn A B, Wechsler S L. Vaccination with a cocktail of seven recombinantly expressed HSV-1 glycoproteins protects against ocular HSV-1 challenge more efficiently than vaccination with any individual glycoprotein[J]. Vaccine, 1996, 14(2): 107-112.】比较了HSV-1 gB、gD、gC、gE、gG、gH、gI 7种囊膜糖蛋白在小鼠眼部感染中的免疫保护作用，杆状病毒表达系统表达的HSV-1 gI可产生 52kDa和56kDa两种大小的蛋白，分布在感染细胞膜上，接种重组 gI蛋白的小鼠在体内产生高滴度中和 HSV-1抗体，具有明显免疫保护作用；进一步把7种囊膜糖蛋白混合起来，进行免疫比较发现，7种混合囊膜糖蛋白的免疫保护效果要好于单独免疫时效果最好的gD，因此，gI对HSV-1亚单位疫苗的开展具有应用价值，与其他囊膜糖蛋白混合成多价免疫苗可提高免疫保护效率。牛疱疹病毒5型（Bovine herpesvirus 5，BHV-5）【Hubner S O, Oliveira A P, Franco A C, et al. Experimental infection of calves with a gI, gE, US9 negative bovine herpesvirus type 5[J]. Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2005, 28(3): 187-196.】、马疱疹病毒1型（Equine herpesvirus 1, EHV-1）【Matsumura T, Kondo T, Sugita S, et al. An equine herpesvirus type 1 recombinant with a deletion in the gE and gI genes is avirulent in young horses[J]. Virology, 1998, 242(1): 68-79.】在gI缺失突变情况下，毒力几乎完全消失，免疫原性降低，说明gI在相应病毒中具有较好免疫原性。我国研究者【① 陈志琳，崔治中，秦爱建, 等. 表达马立克氏病病毒gI基因重组鸡痘病毒的免疫原性[J]. 扬州大学学报(农业与生命科学版), 2002, 23(2): 10-12；② 韩凌霞，陈 雷，丁家波, 等. 马立克氏病病毒囊膜糖蛋白I原核表达产物单克隆抗体的制备[J]. 江苏农业研究, 2001, 22(2): 54-57；③ 丁家波,崔治中,韦平等.马立克氏病病毒广西株G2囊膜糖蛋白gI基因的克隆和表达[J].中国兽医学报.2001,21(2):7～10；④ 丁家波,崔治中.pGEX载体表达马立克氏病病毒囊膜糖蛋白gI基因的最佳条件[J]. 微生物学报,2001,41(5):567～672.】研究发现马立克病毒(Marek's disease virus, MDV) gI蛋白具有较好的免疫原性，在大肠杆菌中表达的G2株MDV gI基因的融合蛋白保留了天然蛋白的部分抗原性，pGEX载体表达的融合蛋白也保留了天然蛋白的部分抗原，在保护鼠眼粘膜免受单纯疱疹病毒V型(HSV—V)侵害的预防接种试验中，发现gI与其他糖蛋白有协同保护作用。因此，截短表达鸭瘟病毒的重组囊膜gI蛋白也可能存在免疫原性，可以进一步将其制备成疫苗应用。
[0034] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
<110> 四川农业大学
<120> 截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白及其制备方法与应用
<160> 4
<210> 1
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鸭瘟病毒CHv株截短gI DNA
<400> 1
gcagtagtcc ccccggatga taacgcttat gaaaaggtaa cagaacggcc acccgtcggc 480
gaagatttcg gagttgtagc ggatgtaggt tccatatgcc atcactatga cttctattct 540
ggagttcctc tcgactatca tctcatgggc atttctggac cattggagga tgacaagcat 600
ttgaaagaag aggtatctac agaaggcttc tcgaccatga agcctgtgac cgttcctacg 660
actaacaatt acacaacatt atctgatgat atgcagccta cgcataatga taccaatagt 720
ggactt 726
<210> 2
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短表达鸭瘟病毒CHv株重组囊膜gI蛋白
Ala Ser Leu Tyr Leu Gln Glu Pro Ala Ser Ala Ser Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Glu Asp Arg His Ala Ala Tyr Gly Lys Leu Leu Phe Leu Gly
20 25 30
Ser Gln Ala Glu Leu Pro Pro Ala Tyr Asn Gly Thr Ala Glu Leu
35 40 45
leu Ala Tyr Asn Ile Ser Arg His Cys Tyr Ser Ala Ala Tyr Ala
50 55 60
Ala Ile Tyr Asp Asp Cys Pro Arg Leu Gly Ala Thr Ala Phe Lys
65 70 75
Ala Cys Arg His Ala Thr Arg Tyr Phe Asp Pro Ala Arg Pro His
80 85 90
leu lys Asp Ala Leu Ser Ser Thr Ala Leu Phe Ala leu Asp Ser
95 100 105
Pro Ser Ile His Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Ile Arg Ala Ser Ala
110 115 120
Asn Asp Ala Ala Ala Pro Asp Ala Phe Lys Thr Thr Ala Ile Ile
125 130 135
Thr Asp Lys Ile Asn Ala Ala Ala Pro Pro Asp Asp Asn Ala Tyr
140 145 150
Glu Lys Ala Thr Glu Arg Pro Pro Ala Gly Glu Asp Phe Gly Ala
155 160 165
Ala Ala asp Ala Gly Ser Ile Cys His His Tyr Asp Phe Tyr Ser
170 175 180
Gly Ala Pro Leu Asp Tyr His Leu Met Gly Ile Ser Gly Pro Leu
185 190 195
Glu Asp Asp Lys His leu lys Glu Glu Ala Ser Thr Glu Gly Phe
200 205 210
Ser Thr Met Lys Pro Ala Thr Ala Pro Thr Thr Asn Asn Tyr Thr
215 220 225
Thr Leu Ser Asp Asp Met Gln Pro Thr His Asn Asp Thr Asn Ser
230 235 240
Gly Leu
242
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短鸭瘟病毒CHv株gI基因引物F
<400> 3
ggatccgtaa gcttatatct acaggaacc 29
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短鸭瘟病毒CHv株gI基因引物R
<400> 4
ctcgagaagt ccactattgg tatcattatg 30
Claims (9)
1.截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白，其特征在于：所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码DNA序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白，其特征在于：所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白由插入了如SEQ ID No.1所示的DNA序列的重组原核表达载体转化入宿主细胞所得的转化体诱导表达而得。
3.根据权利要求2所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白，其特征在于：重组原核表达载体为pET-32a(+)插入了如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列而得。
4.根据权利要求2所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白，其特征在于：宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)Plysis。
5.权利要求1-4任一项所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
A、截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的基因的获得
以鸭瘟病毒 CHv株的核酸为模板，前引物如SEQ ID No.3，后引物如SEQ ID No.4所示，通过聚合酶链式反应获得截短的gI核酸序列，如SEQ ID No.1所示；
B、截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的重组原核表达载体的获得：
将步骤A所得如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列插入原核表达载体pET-32a(+)，获得截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的重组原核表达载体, 命名为pET-32a(+)-gI726；
C、截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的获得
将步骤B所得pET-32a(+)-gI726转化入宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)Plysis，得转化体，将所述转化体用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，得截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白。
6.根据权利要求5所述的截短鸭瘟病毒Ig蛋白抗原的制备方法，其特征在于：将步骤B所得pET-32a(+)-gI726转化入宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)Plysis并用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，Ni-NTA Argarose纯化，得截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白。
7.权利要求1所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白在制备鸭瘟病毒抗原中的应用。
8.权利要求1所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白在制备检测鸭瘟病毒抗体的ELISA试剂盒中的应用。
9.鸭瘟病毒抗体的ELISA检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
a 固相抗原的制备：将权利要求1所述的截短表达鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白包被酶标反应板，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；
b 一抗结合：将待检血清作2倍的稀释，得稀释血清，通过保温反应使所述稀释血清与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；
c 二抗结合：将辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG酶标二抗作3000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原—抗体—二抗复合物；
d 显色：在步骤c所得抗原—抗体—二抗复合物加入显色液TMB，避光显色10-20分钟，加入终止液终止反应得显色样品液；
e 检测并判定：将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD450nm值, OD450nm值在约等于1且P/N比值＞2.0时，判定为阳性。
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