CN101104851A - 抗病毒蛋白cv-n的制备 - Google Patents

Abstract

一种抗病毒蛋白CV－N的制备，属于生物技术领域。本发明的目的是通过对现有的CV－N进行基因突变重组抗病毒蛋白CV－N的制备。本发明主要是将现有CV－N的30位天冬酰胺——N，AAC突变为丙氨酸——A，GCA，去除了糖基化位点，同时将51位脯氨酸——P，CCG突变为甘氨酸——G，GGA，将合成的CV－N基因序列构建到原核表达载体pET－28a中。具有广谱的抗病毒活性，可与一切具有高甘露糖寡糖链结构或类似结构的病毒特异性结合，起到中和病毒、阻断感染、抑制传播的作用，有望研发成为一种新型的抗病毒制剂，从而为艾滋病(AIDS)、禽流感(AI)、艾博拉(EV)等具有糖蛋白结构病毒引起的疾病的预防与治疗提供新的思路和途径。

Description

抗病毒蛋白CV-N的制备

技术领域：

本发明属于生物技术领域，特别是涉及制备抗病毒蛋白CV-N。

背景技术：

艾滋病(AIDS，Acquired Immunodeficiency Syndrome)、非典(SARS，Severe Acute Respiratory Syndrome)、禽流感(AI，AvianInfluenza)等病的暴发与流行，不断地向人们敲响警钟，人类与传染病的斗争是一个长期和持续的过程。为此，各国政界、业界、学界和科界人士都通过不同的思路、途径、策略等来研究和探讨对付这些传染病的方法。其中，从陆地生物、海洋生物以及经过选择的微生物资源中提取或筛选具有抗病毒活性或抗癌活性的物质成为当前研究的一个热点。

CV-N是美国国家癌病研究院(NCI，the U.S.National CancerInstitute)新近在蓝细菌中发现的第一个具有抗病毒活性的蛋白质。通过常规方法测得该蛋白的氨基酸序列，并推导出其DNA编码序列，化学合成后，在大肠杆菌体系中进行表达，对表达产物的研究表明，天然的和重组的CV-N在化学组成和生物学活性上没有差别。

CV-N可以特异地与一切具有高甘露糖寡糖链结构或类似结构的病毒非可逆的结合，起到中和病毒、阻断感染、抑制传播的作用，从而成为一种新型的、具有潜在应用价值的抗病毒制剂，可用于艾滋病(AIDS)、禽流感(AI)、艾博拉(EV)等病毒的预防和治疗。

发明内容：

本发明的目的是通过对现有的CV-N进行基因突变重组抗病毒蛋白CV-N的制备。

本发明的工艺过程是：

a、首先综合去除大肠杆菌、酵母及人稀有密码子，按照高表达基因要求密码子与反密码子的匹配能力适中原则，进行了密码子配对的优化；

b、分别对2个氨基酸序列进行了点突变：①将30位天冬酰胺--N，AAC突变为丙氨酸--A，GCA，去除了糖基化位点，②将51位脯氨酸--P，CCG突变为甘氨酸--G，GGA；

c、将合成的CV-N基因序列构建到原核表达载体pET-28a中，获得了大量重组蛋白。

由上述方法所获得的抗病毒蛋白CV-N SEQ ID NO：1。

本发明的优点是：

1、本发明成功获得了具有生物活性的CV-N抗病毒蛋白，为进一步抗病毒活性实验及体内临床试验提供了前提。

2、本发明获得的CV-N基因序列，通过密码子优化和点突变，可以在原核及其他非原核表达系统中高效表达，从而有利于该蛋白的大量制备。

3、本发明所获得的CV-N蛋白，具有稳定、特异、高效及广谱的抗病毒活性，为AIDS、AI等疾病的诊断、预防、治疗开辟了新的思路和途径。

4、本发明所获得的CV-N蛋白，除上述所叙的抗病毒活性外，还可以作为导向载体，连接自杀分子、细胞因子等，构建融合蛋白，特异、靶向地杀伤病毒感染细胞或进行机体免疫重建；可以用作模板，进行抗病毒小分子预防或治疗性药物的模拟、筛选、合成；还可制备AIDS疫苗，体外、局部或体内用药，预防HIV感染；可以清除污染，通过开发成为可溶CVN或基质锚定的CVN或其他基于CVN的技术，能使传染性的HIV或类似结构病毒从医学设备、供应品或血液、血制品的组织或细胞中除去或失活；还可用作诊断检测，通过特异性结合，来检测目的病毒的存在。

附图说明：

附图是本发明pET-CVN的构建流程图。

具体实施方式：

CV-N是从蓝细菌念珠属的天然代谢物中分离筛选获得的第一个具有独特抗病毒生物活性的蛋白质，化学合成后全长303bp，编码101个氨基酸，天然的和重组的CVN在化学组成和生物学活性上没有什么区别。

本发明通过搜索GenBank，查找获得CV-N蛋白的基因序列；对CV-N基因进行全序列扫描后，在不改变开放阅读框架(ORF)的前提下，对该序列进行密码子优化和定点突变：

a、首先综合去除大肠杆菌、酵母及人稀有密码子，按照高表达基因要求密码子与反密码子的匹配能力适中原则，进行了密码子配对的优化；

b、分别对2个氨基酸序列进行了点突变：①将30位天冬酰胺--N，AAC突变为丙氨酸--A，GCA，去除了糖基化位点，②将51位脯氨酸--P，CCG突变为甘氨酸--G，GGA；从而消除了脯氨酸介导的错误折叠或构象异质化，避免了表达产物的不均一性，使表达的蛋白更为稳定。

c、将合成的CV-N基因序列构建到原核表达载体pET-28a(+)中，通过IPTG诱导，参数优化，表达获得了大量重组蛋白，SDS-PAGE及Westem Blot表明，该蛋白具有生物活性。

由由上述方法所获得的抗病毒蛋白CV-N SEQ ID NO：1。

特性：①具有很强的稳定性，其与病毒形成的复合物不易解离，甚至用强烈的变性剂也不能导致CV-V释放；②具有高效的杀病毒活性，在低nmol浓度下可以不可逆地使所有实验室中涉及到的病毒失活；③具有多重广谱抗病毒活性，能够与一切具有高甘露糖寡糖链结构或类似结构的病毒特异性结合；④具有低细胞毒性，对没有感染病毒的宿主细胞毒性很低。

用途：①直接抗病毒；②可作为导向载体，连接自杀分子、细胞因子等，构建融合蛋白，特异、靶向地杀伤病毒感染细胞或进行机体免疫重建；③可用作模板，进行抗病毒小分子预防或治疗性药物的模拟、筛选、合成；④可制备AIDS疫苗，体外、局部或体内用药，预防HIV感染；⑤可清除污染，通过开发成为可溶CVN或基质锚定的CVN或其他基于CVN的技术，能使传染性的HIV或类似结构病毒从医学设备、供应品或血液、血制品的组织或细胞中除去或失活；⑥可用作诊断检测，通过特异性结合，来检测目的病毒的存在。

下面叙述本发明的具体实施方法：

1、分子生物学常规的实验操作

大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒的提取及限制性内切酶消化、DNA片段的回收、线性DNA片段的连接、重组质粒的筛选与鉴定、PCR扩增反应等均参照《分子克隆实验指南》(黄培堂等译，第三版，科学出版社，2002)相关章节进行。

2、目的基因的获得

2.1目的基因的序列优化

搜索GenBank，查找获得CV-N基因的全序列，对该序列进行全基因扫描后，考虑二级结构因素，在不改变开放阅读框架(ORF)的情况下，对该序列进行密码子优化和定点突变：①综合去除大肠杆菌、酵母及人稀有密码子；②按照高表达基因要求密码子与反密码子的匹配能力适中原则，进行了密码子配对的优化；③将30位天冬酰胺(N，AAC)突变为丙氨酸(A，GCA)，去除了糖基化位点；④将51位脯氨酸(P，CCG)突变为甘氨酸(G，GGA)，从而消除了脯氨酸介导的错误折叠或构象异质化，避免了表达产物的不均一性。

2.2  目的基因的同源建模分析

通过生物信息学软件Insight II的Homology Module模块对优化修饰后的氨基酸序列进行了同源建模分析。

2.3目的基因的化学合成

将设计好的基因送宝生物(大连)公司进行人工化学合成，克隆到载体pSK上得pSK-CVN。

3、原核表达载体pET-CVN的构建

3.1双酶切反应用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化质粒pSK-CVN，获得基因片段CVN；用同样的酶消化原核表达载体pET-28a(+)，获得线性化的载体片段。具体步骤如下：

将1.0μg的质粒DNA与适量水混匀，使其总体积为17μl，各加入两种限制性内切酶2～3U及2μl相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置最适反应温度水浴2～3h，取5μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳检查。完全酶切后，回收片段备用。

3.2连接反应将获得CVN基因片段定向插入到pET-28a(+)载体中，获得pET-CVN重组质粒。具体步骤如下：

取0.5μg回收的载体DNA，加2-10倍摩尔量的外源DNA片段，2μl10×连接缓冲液加水定容至20ul，最后加入适量的T₄ DNA连接酶(1weiss单位)，混匀并瞬间离心以使液滴聚集管底，置16℃水浴过夜或25℃连接1-4h，取5μl连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。最后挑取单个菌落，进行质粒提取。

3.3重组质粒的鉴定  将提取的质粒分别用PCR及双酶切(EcoRI+XhoI)反应进行鉴定，获得正确的原核重组质粒pET-CVN。

4、目的蛋白的诱导表达

用表达载体pET28作对照，与重组质粒同步转化表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取3～5个转化菌落，接种于2ml LB培养基中，37℃振摇培养至OD600＝0.6～1.0(约2～3h)，置4℃冰箱14～16h。4℃5000r/min离心5min收集菌体，用2ml LB培养基重悬沉淀，取0.1ml混悬液接种10ml LB培养基(200μg/ml Kan)，37℃200r/min振荡培养OD600＝0.6～1.0(约2～3h)，加IPTG进行诱导表达，同时设置不同的温度、诱导时间、IPTG浓度，而后4℃5000r/min离心5min收集菌体。用1/10培养基体积10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)重悬菌体，分别取适量诱导表达菌体及其对照菌体，加等量2×SDS加样缓冲液(100mmol/L Tris·Cl pH6.8、4％SDS、0.2％溴酚蓝、20％甘油、5％巯基乙醇)，100℃水浴3min后，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察表达量。

5、表达条件的优化

通过设置不同的表达参数，对表达条件进行了优化。

5.1温度梯度试验

固定IPTG诱导浓度为1mmol/L，诱导时间为3.5h，设温度梯度为25℃、37℃、42℃。

5.2IPTG浓度梯度实验

固定温度为37℃，诱导时间为3.5h，设IPTG浓度梯度为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L。

5.3诱导时间梯度实验

固定温度为37℃，诱导浓度为1.2mmol/L，设诱导时间梯度为3.5h、4.5h、6h、8h、10h、12h、16h。

6、目的蛋白的鉴定

6.1SDS-PAGE凝胶电泳

诱导结束后，4℃5000r/min离心5min收集菌体。用1/10培养基体积的10mmol/L Tis.Cl(PH8.0)重悬菌体，以含质粒pET28的对照菌体和标准蛋白作对照，分别取适量样品加等量2×上样溶液，用微量移液器加入加样槽，以8v/cm电压电泳，当溴酚蓝前沿进入分离胶后，以12v/cm电压电泳，溴酚蓝电泳至分离胶底部后，取出凝胶，进行考马斯亮蓝染色或蛋白印迹。

6.2Western blot检测

SDS-PAGE电泳结束后，切出含待转移蛋白的凝胶，剪6张同样大小的Whatman 3mm滤纸和1张硝酸纤维素膜(Millipore HAWP)，用软铅笔在纤维膜一角做好标记。将它们漂浮于ddH₂O水平面上，润湿后浸于水中5min，驱除膜上的气泡，再浸泡于转移缓冲液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris，0.037％SDS，20％甲醇)中。在塑料支架上依次叠放浸湿的海绵、3层滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层滤纸和海绵，使滤纸、凝胶和硝酸纤维素膜对齐，且各层之间无气泡存在；将塑料支架夹紧插入电转移槽中；硝酸纤维素膜一侧接阳极，凝胶一侧接阴极，加转移液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris·Cl，0.037％SDS，20％甲醇)稍超过凝胶，以30V～35V电压，4℃转移14～16h。转移完毕，将硝酸纤维素膜浸于封闭液(5％脱脂奶粉或3％BSA，150mmol/L NaCl，0.02％Tween-20)中约室温2h，以封闭无关蛋白结合位点，同时对凝胶进行染色，检查蛋白转移是否完全。封闭后，用洗涤液(10mmol/L Tris·Cl pH 7.5，0.15mol/L NaCl，0.05％Tween-20)洗膜3次，每次5min；将一抗(抗His-Tag单克隆抗体)用抗体稀释液(0.01mol/L TBS，1％BSA，0.05％Tween-20)适当稀释，滴在保鲜膜上，然后将硝酸纤维素膜正面(吸附抗原面)向下覆盖在加抗体的保鲜膜上，室温反应2h；用洗涤液洗膜3次，每次5min；同样方法加酶标二抗(碱性磷酸酶标记的马抗鼠IgG)，室温反应2h；用洗涤液洗膜3次，每次5min；膜稍干，加酶底物反应液进行反应。

酶底物反应液配制：

(1)NBT(氮兰四唑)在10ml 70％的二甲基酰胺中溶解0.5gNBT；

(2)BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)在10ml 100％二甲基酰胺中溶解0.5g BCIP；

(3)碱性磷酸酶缓冲液：100mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl₂，100mmol/L Tris·Cl pH 9.5。取66μl NBT与10ml碱性磷酸酶缓冲液混匀，加入33μl BCIP，该溶液在30min内使用；

将洗涤过的膜移入浅托盘中，按0.1ml/cm²加入底物反应液，于室温平缓摇动进行温育显色。显色5～20min后将硝酸纤维素膜移至蒸馏水中，终止显色，观察结果。

检测结果：

结果一：模建结构与原始天然结构基本相符，在突变下多了两个α螺旋，结构比原来更为稳定，见图1；本发明所设计的基因其氨基酸序列的合理性比原始序列更为稳定，表明可行，见图2，分值较原来(-0.18)有所提高(-0.095)；

结果二：通过原核表达，SDS-PAGE表明，获得了重组目的蛋白，见样孔2，如图4。

结果三：Western Blot分析表明，所获得的目的蛋白具有生物活性。

序列表

<110>金宁一

<120>抗病毒蛋白CV-N的制备

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>303

<212>DNA

<213>synthetic construct

<221>CDS

<222>(1)..(303)

<400>1

ctt ggt aaa ttc tcc cag acc tgc tac aac tcc gct atc cag ggt tcc     48

1               5                     10                   15

gtt ctg acc tcc acc tgc gaa cgt acc aac ggt ggt tac gca acc tcc     96

            20                     25                 30

tcc atc gac ctg aac tcc gtt atc gaa aac gtt gac ggt tcc ctg aag    144

        35                    40                  45

tgg cag gga tcc aac ttc atc gaa acc tgc cgt aac acc cag ctg gct    192

    50                    55                  60

ggt tcc tcc gaa ctg gct gct gaa tgc aaa acc cgt gct cag cag ttc    240

65                    70                  75                 80

gtt tcc acc aag atc aac ctg gac gac cac atc gct aac atc gac ggt    288

                85                    90                  95

acc ctg aag tac gaa                                                303

            100

Claims (2)

1.一种抗病毒蛋白CV-N的制备，其特征在于：

a、首先综合去除大肠杆菌、酵母及人稀有密码子，按照高表达基因要求密码子与反密码子的匹配能力适中原则，进行了密码子配对的优化；

b、分别对2个氨基酸序列进行了点突变：①将30位天冬酰胺——N，AAC突变为丙氨酸——A，GCA，去除了糖基化位点，②将51位脯氨酸——P，CCG突变为甘氨酸——G，GGA；

c、将合成的CV-N基因序列构建到原核表达载体pET-28a中，获得了大量重组蛋白。

2.由权利要求1的方法所获得的抗病毒蛋白CV-N SEQ IDNO：1。

Images