CN101705241B - 重组蓝藻抗病毒蛋白的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含重组蓝藻抗病毒蛋白N核苷酸序列的表达载体和包含该表达载体的寄主细胞，并在此基础上提供了一种制备重组蓝藻抗病毒蛋白的方法，获得了重组蓝藻抗病毒蛋白，并进一步证明了所述表达载体和/或所述寄主细胞和/或所述重组蓝藻抗病毒蛋白能够应用于制备抗病毒药物。本发明的方法克服了现有技术产量低，易形成包涵体，纯化困难等缺点。利用本发明制备的重组CVN蛋白的肽质量指纹谱与理论肽质量指纹谱完全一致，并通过抗病毒实验证明了所得重组蛋白具有良好的抗病毒活性。

Description

重组蓝藻抗病毒蛋白的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组蓝藻抗病毒蛋白的制备方法，以及此方法中涉及的表达载体和寄主细胞，本发明还涉及所述表达载体和/或寄主细胞和/或所述方法得到的重组蓝藻抗病毒蛋白在制备抗病毒药物中的应用。

背景技术

蓝藻抗病毒蛋白N(CVN)是一种从蓝藻，又名蓝细菌Cyanobacteria(Nostocettipsosporum)中分离得到的一种水溶性糖蛋白，其独特的抗病毒活性最初是在一项抗人类免疫缺陷病毒(human immunodefiiciency virus，HIV)天然药物筛选计划中发现的[Boyd MR，Gustafson KR，McMahon JB，et al.Discovery of cyanovirin-N，a novel humanimmunodefiiciency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120：potential applications to microbicide development[J].Antimicrob.Agents Chemother，1997，41(7)：1521—1530.]。后来的研究表明其具有广泛的抗病毒作用。天然CVN相对分子质量为11kD，一级结构含有101个氨基酸残基，无翻译后的修饰，带有两个内部二硫键。CVN能特异地、高亲合性地结合在人免疫缺陷病毒HIV-1的衣壳蛋白gp120上有效降低HIV-1病毒对细胞的感染[Bewley CA，Gustafson KR，Boyd MR，et al.Solution structure of cyanovirin—N，a potent HIV—inactivating protein[J].Nat Struct Biol，1998，5(7)：571.]。此外CVN对流感病毒、埃博拉病毒、疱疹病毒和黄热病病毒、副流感病毒、丙型肝炎病毒[O’Keefe BR，SmeeDF，Turpin JA，et al.Potent anti-inflluenza activity of cyanovirin-N and interactions with viralhemagglutinin[J].Antimicrob Agents Chemother，2003，47(8)：2518.，Barrientos LG，O’Keefe BR，Bray M，et al.Cyanovirin-N binds to the viral surface glycoprotein gp1，2andinhibits infectivity ofthe Ebola virus[J].Antiviral Research，2002，58(1)：47256.]等都有诘抗作用。早在CVN发现之初，CVN的重组表达研究就已经开始，目前已在大肠杆菌，酵母菌和植物细胞中表达成功，但这些重组表达方法存在表达产量低，易形成包涵体且复性困难，易形成无活性的二聚体形式，融合表达出现氨基酸缺失，纯化方法复杂等缺点[Mori T，Gustafson KR，Pannell LK，et al.Recombinant production of cyanovirin-N，a potent humanimmunodefiiciency virus-inactivating protein derived from a cultured cyanobacterium[J].ProteinExpr Purif，1998，12(2)：151.，Mori T，Barrientos LG，Han Z，et al.Functional homologsof cyanovirin-N amenable to mass production in prokaryotic and eukaryotic hosts[J].Protein ExprPurif，2002，26(1)：42.，Colleluori DM，Tien D，Kang F，et al.Expression，purifiication，and characterization of recombinant cyanovi-rin-N for vaginal anti-HIV microbicidedevelopment[J].Protein Expr Purif，2005，39(2)：229.，Sexton A，Drake PM，MahmoodN，et al.Transgenic plant production of Cyanovirin-N，an HIV microbicide[J].FASEB J，2006，20(2)：356.]。

小分子泛素样修饰蛋白(Small ubiquitin-like modifiier，SUMO)，和泛素具有类似生物学功能，广泛存在于真核细胞中。发挥着调节蛋白质之间的相互的作用(SUMO化和去SUMO化)，调节蛋白在核质间的运输，帮助蛋白质在细胞内正确的定位，调节蛋白质的转录活性以及抗泛素化等作用[Zhou，F.F.Xue，Y.and Lu，H.L.et al.A genome-wide analysis ofsumoylation-related biological processes and functions in human nucleus[J]FEBS Lett，2005，579：3369.，Johnson，E.S.Protein modifiication by SUMO[J]Annu.Rev.Biochem，2004，73：355.]。SUMO蛋白融合表达系统是一种有效地表达小分子量蛋白的表达方法，具有抗蛋白酶解，增加重组蛋白表达量，促进蛋白正确折叠，能准确无误地切除融合标签，纯化工艺简单等优点。

发明内容

为克服上述现有技术中存在的问题及不足，本发明的目的首先在于提供一种高效表达活性重组蓝藻抗病毒蛋白N(CVN)的表达载体。

本发明的另一目的是提供携带或整合了上述表达载体的寄主细胞。

本发明的再一目的是提供一种利用上述寄主细胞高效表达重组CVN的方法。

本发明的再一目的是提供一种具有抗病毒活性的重组CVN。

本发明的最后目的是将上述表达载体和/或寄主细胞和/或上述重组CVN用于制备抗病毒的药物。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先基于SUMO蛋白融合表达系统，构建了包含编码蓝藻抗病毒蛋白N的核苷酸序列的表达载体，所述核苷酸序列编码的蛋白包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

本发明进一步提供了包含该表达载体的寄主细胞，同过培养该细胞，并结合现有的分子生物学技术对目标蛋白进行了分离纯化，得到了高纯度的重组CVN。

本发明进一步用实验证明了纯化后的重组CVN的抗病毒活性，充分证明上述表达载体和/或寄主细胞和/或得到的重组蛋白能够应用于制备抗病毒的药物。

作为优选方案，我们的表达载体选择包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列，选择的载体骨架是pET3c并优选大肠杆菌作为表达载体的宿主。具体步骤是：根据大肠杆菌密码子偏好性对CVN原始核苷酸序列进行优化，通过多次PCR合成SUMO-CVN的全长序列，构建pET3c-SUMO-CVN重组表达质粒，转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达SUMO-CVN融合蛋白，然后用特异性的SUMO蛋白酶对融合蛋白进行酶切，并再次通过Ni柱纯化除去含6×His标签的SUMO，SUMO融合蛋白和SUMO蛋白酶，得到纯化的重组CVN蛋白。

本发明的有益效果如下：

(1)提高了CVN在宿主菌中的表达水平。将CVN与分子伴侣蛋白SUMO融合，促进CVN在大肠杆菌中的表达，最终获得表达量40％的工程寄主菌株；

(2)改变了CVN高表达的表达形式，不再形成包涵体；

(3)通过His标签的巧妙应用，简化了下游纯化路线，并且不需要His标签特异性蛋白酶就可最终制备不带标签的CVN，得到的纯化后的重组CVN在最大程度上保留了天然CVN的结构特征，表现为重组CVN蛋白的肽质量指纹谱与理论肽质量指纹谱完全一致。

附图说明

图1是PCR合成SUMO-CVN全长序列方案。

图2是PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳的结果。

其中，M：DL2000DNA marker，1：F1-CVN、R1-CVNPCR产物；2：F2-CVN、R2-CVNPCR产物；3：F3-CVN、R3-CVNPCR产物4：F4-CVN、R4-CVNPCR产物5：F4-CVN、R5-CVNPCR产物；6：F-SUMO、R-SUMO PCR产物；7：SUMO-CVN全长序列。

图3是PET3c-SUMO-CVN质粒的图谱。

图4是重组质粒pET3c-SUMO-CVN的双酶切鉴定结果。

其中：M：DL2000DNAmarker；1：双酶切鉴定；2：PCR鉴定。

图5是SUMO-CVN融合蛋白表达条件的优化。

其中：M：low molecular protein marker；1，2，3分别是0.5mM IPTG在37℃、30℃、20℃诱导4h；4是0.5mM IPTG20℃诱导24h；5，6，7分别是1mM IPTG在37℃、30℃、20℃诱导4h；8：1mM IPTG20℃诱导24h。

图6是重组CVN蛋白纯化结果的SDS-PAGE鉴定图谱。

其中：M是low molecular protein marker；1：上清；2：穿透峰；3：40mM咪唑洗脱峰；4：200mM咪唑洗脱峰；5：酶切；6：酶切后200mM咪唑洗脱峰；7：CVN。

图7是重组CV-N蛋白的肽质量指纹谱(PMF)，“↓”表示于理论肽谱相符的肽质量。

图8是MALDI-TOF测定重组CV-N蛋白分子量。

其中(A)包含T1和T7肽段；(B)包含T2，T3，T4，T5，T7和T8肽段。

图9是MTT法测定CVN，SUMO—CVN蛋白抗HSV-I活性。

图10是MTT法测定CVN，SUMO—CVN蛋白对Vero细胞毒性。

图11是CVN对HIV-1/IIIB致细胞病变效应的抑制活性。

图12是CVN对宿主细胞生长的抑制活性(毒性)。

图13是CVN抗HIV-1/IIIB活性测定过程中的宿主细胞形态。

具体实施方式

本发明实施例涉及的主要材料如下：宿主菌BL21(DE3)、质粒pET3c由本室保存；质粒pET3c-SUMO和SUMO蛋白酶由暨南大学医药生物技术研究开发中心黄亚东博士惠赠，Taq酶、T4连接酶限制性内切酶Nde I、BamhI购自大连宝生物公司，IPTG、小相对分子质量标准蛋白、引物购自上海生工生物公司；Ni SepharoseTM6 Fast Flow购自Amersham公司，四甲基偶氮唑(MTT)，美国SIGMA公司；单纯疱疹病毒1型(HSV-1)F，武汉大学病毒研究所；Vero细胞，美国ATCC公司。其它试剂均为分析纯试剂。NTA-10buffer(20mmol/LTris-HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，10mmol/L咪唑)，NTA-40buffer(20mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.5mol/LNaCl，40mmol/L咪唑)，NTA-200buffer(20mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.5mol/LNaCl，200mmol/L咪唑)，酶切缓冲液(20mmol/LTris-HCl，pH8.0，2％Igepal，1.5mol/LNaCl，10mmol/L DTT)。

实施例1 达质粒pET3c-SUMO-CVN的构建及序列分析

1、引物序列的设计

根据大肠杆菌密码子偏好性，对CVN原始序列进行优化，合成十一条引物，通过多次PCR合成SUMO-CVN的全序列，合成策略如图1所示。

所设计的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列见表1。

表1 用于合成SUMO-CVN全长序列的引物

2、PCR合成SUMO-CVN全序列

合成分两步进行，首先通过多次PCR合成CVN基因，第一次PCR引物是F1-CVN、R1-CVN。反应体系为引物各1μl，8μl无菌ddH2O，10μl Taq PCR MasterMix，反应混合物94℃变性1min，退火至55℃，保持1min，72℃延伸1min，进行29个循环。反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并做胶回收，作为下一轮PCR的模板，经过5次PCR反应合成全长的CVN序列。SUMO全长序列通过PCR方法从PET3c-SUMO中合成。利用SUMO序列末端与CVN序列前端的20bp重叠互补序列进行PCR：以SUMO序列和CVN序列为延伸模板，F1-SUMO，R5-CVN为上下游引物，在常规的PCR条件下进行反应，反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(图2)，并做胶回收，得到SUMO-CVN全长序列。

3、表达质粒构建及序列分析

如图3所示，将质粒pET3c和SUMO-CVN全长序列分别用Nde I与BamH I进行双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物，用T₄DNA连接酶把这两个酶切产物连接起来，构建成重组质粒pET3c-SUMO-CVN。重组质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，提取质粒进行PCR及Nde I与BamH I双酶切鉴定(图4)，并送往英骏公司测序。

实施例2重组蛋白的表达、纯化及鉴定

1、表达菌株的筛选及诱导表达

挑取经测序正确的单克隆，抽提质粒转化到表达宿主BL21(DE3)中，用含氨苄青霉素的平板筛选出阳性转化子，挑取单克隆到3ml含氨苄的LB培养基中，37℃，180rpm培养至OD₆₀₀＝0.6～1.0。取1ml作未诱导对照，其余加IPTG至终浓度1mmol/L，在37℃下诱导4h，离心收集菌体，菌体沉淀重悬于100μl ddH₂O中，并加入1μl溶菌酶，室温孵育30min。4℃，20000×g离心15min，分别取上清和沉淀，进行12％的SDS-PAGE分析。选择有表达产物的单克隆进行菌种保存。

2、SUMO-CVN融合蛋白表达条件分析

将保存的菌种按1％接种于3ml LB培养基，37℃、180rpm振荡培养过夜，1％的接种量接种到50ml含氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基中，至OD₆₀₀到0.6时，把培养基分成4瓶，3瓶分别在37℃、30℃、20℃0.5mM IPTG诱导表达4h；另外1瓶在20℃、0.5mMIPTG诱导表达24h。用同样的方法，在1.0mM IPTG条件下诱导表达。4℃、6000×g、10min离心收集菌体。菌体沉淀溶解在5ml NTA-10buffer(20mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.5mol/LNaCl，10mmol/L咪唑)中，冻融3次，超声破碎3次。破碎产物4℃、25000×g、30min离心，收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳分析，并进行灰度扫描，确定各表达条件下可溶性目的蛋白表达量，确定最佳表达条件。

结果如下：SDS-PAGE电泳分析(图5)可见重组菌体会表达大小约为29kDa的融合蛋白，且融合蛋白多数位于上清中，为可溶性表达(图5，lane1)。可溶性融合蛋白表达情况如(表2)所示。由表2可知最佳表达条件是IPTG终浓度为0.5mmol/L，20℃，诱导表达24h。

表2 不同表达条件下可溶性蛋白含量

3、SUMO-CVN融合蛋白摇瓶发酵及纯化

选取高表达菌株接种到1L含氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基中，按前述最佳表达条件进行摇瓶发酵并诱导。4℃、6000×g、10min离心收集菌体，冻融一次，然后将菌体沉淀以1：10比例重新悬浮于NTA-10buffer，超声破碎(工作时间5s、间歇时间5s，99次，重复3遍)，4℃、25000×g、30min离心收集上清。

上清液上样至柱床体积为20ml的Ni-NTA亲和层析柱中，流速0.6ml/min，NTA-10buffer洗回基线，流速为1ml/min，NTA-40buffer洗杂蛋白，NTA-200buffer，洗脱目的蛋白。纯化后的目的蛋白经Sephadex G-25分子筛脱咪唑后进行SUMO蛋白酶酶切，除去SUMO融合蛋白。

结果如下：1L的发酵培养基摇床发酵后收集得到6±0.5g菌体，菌体破碎产物用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，不含6xHis标签的杂蛋白40mmol/L咪唑的NTA-40缓冲液洗脱，SUMO-CVN目的蛋白用含200mmol/L咪唑的NTA-200缓冲液洗脱。1L发酵产物约可以纯化得到44.6±1mg融合蛋白，占菌体总蛋白的20.2％。纯化产物经SDS-PAGE电泳后进行灰度扫描，结果显示纯度达90％(图6)。

4、SUMO-CVN融合蛋白酶切、CVN蛋白纯化及鉴定

纯化后的目的蛋白调整浓度至1mg/ml，加入1U SUMO蛋白酶/mg融合蛋白，在酶切缓冲液中，30℃酶切1h。因SUMO、SUMO蛋白酶均含有6×His标签，酶切后的样品按前述的纯化方法除去SUMO、未酶切的SUMO-CVN和SUMO蛋白酶后得到目的蛋白CVN。纯化后的CVN蛋白用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行肽质量指纹谱(peptide mass fiingerprinting，PMF)鉴定并测定分子量。

结果如下：纯化后的目的蛋白经Sephadex G-25分子筛脱咪唑后进行SUMO蛋白酶酶切，除去SUMO融合蛋白。酶切产物的SDS-PAGE电泳分析(图6)表明，30℃，1h条件下80％的融合蛋白可以被酶切开。酶产物再次用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化得到目的蛋白CVN，SDS-PAGE电泳分析(图6)表明纯化的CVN蛋白纯度可达95％。1L的发酵产物最终可纯化得到11±0.3mg的CVN蛋白。

CVN蛋白一级结构的完整对其发挥抗病毒活性是至关重要的，研究发现N端和C端缺失能够造成CVN活性的下降，下降比例随着缺失残基的增加而提高[O’Keefe BR，Smee DF，Turpin JA，et al.Potent anti-inflluenza activity of cyanovirin-N and interactions with viralhemagglutinin[J].Antimicrob Agents Chemother，2003，47(8)：2518.]。为鉴定重组蛋白是否是CVN蛋白、有无氨基酸缺失，纯化后的重组蛋白脱盐后用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行肽质量指纹谱(peptide mass fiingerprinting，PMF)鉴定并测定分子量，结果如图7、图8所示。其中从图7(A)上可以找到T1和T7肽段，从图7(B)上可以找到T2，T3，T4，T5，T7，T8肽段，测定结果与胰蛋白酶酶切后理论肽谱相符(表3)。重组蛋白分子量测定结果为11019.87Da(图8)，与天然CVN蛋白理论分子量11013.16Da相差0.005KD，在误差范围内，说明所获得的重组蛋白为完整的CVN蛋白，无末端氨基酸缺失。

表3：胰蛋白酶切后理论肽谱

 

NO.	cleavagesite	Resulting peptide sequence	length	M，[Da]
					T1	3	LGK	3	316.401
T2	24	FSQTCYNSAIQGSVLTSTCER	21	2295.524
					T3	48	TNGGYNTSSIDLNSVIENVDGSLK	24	2497.655
T4	59	WQPSNFIETCR	11	1380.541
					T5	74	NTQLAGSSELAAECK	15	1521.662
T6	76	TR	2	275.308
					T7	84	AQQFVSTK	8	908.022
T8	99	INLDDHIANIDGTLK	15	1651.837
					T9	101	YE	2	310.307

实施例3重组CVN蛋白抗疱疹病毒活性测定

细胞毒性测定：MTT法[徐叔云，卞如濂，陈修，主编.药理实验方法学[M].第2版.北京：人民卫生出版社，1992.]测定。单层Vero细胞中，加入不同浓度样品稀释液，5％CO2培养48h，每孔加入5mg/ml MTT 10μl，5％CO2继续培养4h，弃上清液，每孔加入200μl DMSO，室温避光放置30min，振摇培养板10min左右，酶标读数仪比色(波长570nm，参比波长630nm)，测定吸光度并计算样品的半数毒性浓度(50％cytotoxic concentration，TC50)。

抗HSV-1活性测定：单层Vero细胞中，加入不同稀释度样品和100TCID50的HSV-1病毒液各50μl，同时设正常细胞对照及病毒对照组。5％CO₂培养48h，MTT法测定吸光度并计算样品半数有效浓度(50％inhibiting concentration，IC₅₀)。

结果如下：

单纯疱疹病毒I型(HSV-I)是一种在人群中引起广泛感染的DNA病毒，人类是其唯一的宿主，健康成人中约有90％感染HSV-I[李智，董彦亮，纪玉兰.胎膜早破与人类单纯疱疹病毒感染[J].江苏医药，1997，23(5)：330.]。HSV-I可引起唇疱疹、疱疹性角膜结膜炎、新生儿脑炎等多种疾病，由于HSV-I可在神经节内潜伏感染，故症状易复发[赵高年，李勇，谢鹏.LAT和HSV-1的潜伏感染与再激活[J].中国临床神经科学，2003，11(4)：425.]。本实验用MTT法测定重组CVN蛋白的抗病毒活性，结果图9、图10及表4所示。结果显示本方法制得的重组蛋白具有良好的抗单纯疱疹病毒I型活性，其半数有效浓度IC₅₀为0.31μg/ml。未酶切过的SUMO-CVN同样具有抗单纯疱疹病毒I型活性，但其半数有效浓度要高于CVN蛋白，推测可能是由于多余的肽段影响了CVN蛋白的活性位点。

表4.MTT法测定样品抗HSV-1活性结果

实施例4CVN抗HIV活性测定

1、材料

MT-4细胞，来自美国国立健康研究院(NIH)，第15代。病毒株HIV-1/IIIB H9，实验室保存。培养基RPMI-1640，购自Sigma-Aldrich(Lot No.：067K2399)，10％胎牛血清(FBS)购自JRH Bioscience(Lot No.：6D0974)

2、方法

WST-1法

(1)抑制率测定在P3生物安全柜中，重组CVN用含10％FBS的RPMI1640培养液稀释至50μg/mL(4.53μmol/L)、10μg/mL(0.91μmol/L)、2μg/mL(180nmol/L)和0.4μg/mL(36nmol/L)，共4个浓度梯度；收集培养至对数生长期的MT-4细胞，计数细胞总数和活细胞数，用含10％FBS的RPMI1640培养液调整细胞浓度至1×10⁵cell/mL；取100μL细胞悬液至96孔板中，加入100TCID50的HIV-1/IIIB病毒(50μL/孔)，再加入预先稀释好的不同浓度CVN样品(50μL/孔)，每个样品平行设置4个复孔，同时设空白对照、细胞对照、病毒对照和阳性对照(AZT，63nmol/L)各4个复孔；37℃，5％CO₂培养箱中培养96h后，加入10μL/孔WST-1(5mmol/L)溶液，37℃孵育4h，450nm测定吸光值。

(2)毒性测定 与抑制率测定方法相同，但各培养板孔中只加细胞和待测样品，不加病毒。

(3)计算公式 抑制率(IR)＝(As-Av)/(Ac-Av)

            As：样品吸光值均值；

            Av：病毒对照组吸光值均值；

            Ac：细胞对照组吸光值均值；

3、结果

如图11-13所示，CVN具有明显的抑制HIV-1/IIIB活性，在浓度为10μg/mL(0.91μmol/L)时，抑制率为73％，细胞密度为无病毒细胞对照组的95％，与阳性药物AZT的抑制率和毒性相当(74％，101％)，为高效低毒抗病毒物质。

综上所述，本发明构建了pET3c-SUMO-CVN重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达成功。SUMO-CVN融合蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后，用Sephadex G-25分子筛脱去咪唑，以特异性的SUMO蛋白酶酶切即可除去融合标签。因SUMO-CVN融合蛋白N端，SUMO蛋白酶N端均含有6x His标签，因此可以用Ni-NTA亲和层析柱方便地除去酶切后混合物中的杂蛋白，得到纯度达95％的重组CV-N蛋白，纯化后的重组蛋白脱盐后经肽质量指纹谱(PMF)鉴定和分子量测定表明其与野生型蛋白完全相同。抗病毒活性测定的结果表明：重组蛋白CVN具有良好的抗HSV-I型病毒活性，未酶切过的SUMO-CVN融合蛋白同样具有较好的抗HSV-I型病毒活性；重组蛋白CVN也具有明显的抑制HIV-1/IIIB活性，为高效低毒抗病毒物质。

实验结果表明SUMO融合表达适合表达全长序列的，无融合标签的重组CVN蛋白。该表达方法克服了其它表达方法产量低，易形成包涵体，纯化困难等缺点。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>暨南大学

<120>重组蓝藻抗病毒蛋白的制备方法及应用

<130>5

<160>21

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>105

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>101

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

<210>3

<211>624

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(624)

<223>根据大肠杆菌密码子偏好性，对CVN原始序列进行优化，通过多次PCR合成S

UMO-CVN的全序列

<400>3

<210>4

<211>207

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

<210>5

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(39)

<223>多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的上游引物之一F4-CVN

<400>5

<210>6

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(49)

<223>多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的上游引物之一F3-CVN

<400>6

<210>7

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(54)

<223>多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的上游引物之一F2-CVN

<400>7

<210>8

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(59)

<223>多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的上游引物之一F1-CVN

<400>8

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的上游引物之一F-SUMO

<400>9

<210>10

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(59)

<223>多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的下游引物之一R1-CVN

<400>10

<210>11

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(57)

<223>多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的下游引物之一R2-CVN

<400>11

<210>12

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(57)

<223>多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的下游引物之一R3-CVN

<400>12

<210>13

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(57)

<223>多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的下游引物之一R4-CVN

<400>13

<210>14

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(57)

<223>多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的下游引物之一R5-CVN

<400>14

<210>15

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(37)

<223>多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的下游引物之一R-SUMO

<400>15

<210>16

<211>21

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(21)

<223>肽指纹图谱T2肽段

<400>16

<210>17

<211>24

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(24)

<223>肽指纹图谱T3肽段

<400>17

<210>18

<211>11

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(11)

<223>肽指纹图谱T4肽段

<400>18

<210>19

<211>15

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(15)

<223>肽指纹图谱T5肽段

<400>19

<210>20

<211>8

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(8)

<223>肽指纹图谱T7肽段

<400>20

<210>21

<211>15

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(15)

<223>肽指纹图谱T8肽段

<400>21

Claims (6)

1.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体包含编码蓝藻抗病毒蛋白N的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码的蛋白包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

3.一种包含权利要求1或2所述表达载体的寄主细胞。

4.根据权利要求3所述的寄主细胞，其特征在于：所述细胞为原核细胞。

5.根据权利要求4所述的寄主细胞，其特征在于：所述细胞为大肠杆菌。

6.一种重组蓝藻抗病毒蛋白N的制备方法，其特征在于：培养权利要求4或5所述寄主细胞，分离并纯化所需的重组蓝藻抗病毒蛋白N。

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