CN111494604B

CN111494604B - 蓝藻抗病毒蛋白n在制备抗炎药物中的应用

Info

Publication number: CN111494604B
Application number: CN202010391561.4A
Authority: CN
Inventors: 欧瑜; 彭雯
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2020-05-11
Filing date: 2020-05-11
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2040-05-11
Also published as: CN111494604A

Abstract

本发明涉及蓝藻抗病毒蛋白N（CV‑N）在制备抗炎药物中的应用，属于CV‑N新用途技术领域。蓝藻抗病毒蛋白N在制备抗炎药物中的应用，其特征在于所述的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。本发明首次发现，CV‑N在体外实验中能显著抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7细胞iNOS的表达和NO的分泌。在体内实验中，CV‑N能显著抑制LPS诱导的小鼠全身炎症，抑制肺、肝、脾等器官炎性细胞浸润及病理损伤。这些结果表明，CV‑N能显著抑制炎症的发展，具有开发为抗炎药物的前景。

Description

蓝藻抗病毒蛋白N在制备抗炎药物中的应用

技术领域：

本发明涉及蓝藻抗病毒蛋白N(CV-N)在制备抗炎药物中的应用，属于CV-N新用途技术领域。

背景技术：

蓝藻抗病毒蛋白N(Cyanovirin-N，CV-N)是一种从蓝藻Nostoc ellipsosporum中分离纯化得到的抗病毒蛋白，由101个氨基酸组成，以致密单体或二聚体的形式存在于溶液中，而所有晶体结构均显示为三维域交换的二聚体，晶体堆积似乎在热力学上倾向于二聚体形式。研究发现从蓝藻中分离纯化或根据其基因序列克隆表达的CV-N对多种病毒都有抑制作用，它可以与病毒包膜糖蛋白寡糖链结合，抑制病毒的入侵，也有报道CV-N对病毒的生理周期也存在影响。CV-N的高稳定性和低毒性是其优势所在。但目前尚未见关于CV-N其它活性的报道。

炎症反应是由损伤、感染和刺激引起的，在正常情况保护宿主免受全身感染，帮助恢复组织内平衡，但如果炎症反应过度或持续地发生，则会使机体产生一系列异常的应激反应，炎症产生的诱生型促炎因子会不断对自身健康组织细胞进行攻击，从而引起多种疾病，严重时甚至威胁到生命安全。巨噬细胞是免疫细胞中的重要成员，也是调节炎症相关疾病的一个靶细胞。炎症过程中巨噬细胞的过度活化会分泌大量的炎性介质，是造成炎症反应的主要原因。一氧化氮合酶(NOS)是还原型辅酶Ⅱ(NADPH)依赖性的氧化酶，能催化左旋精氨酸(L-Arg)形成一氧化氮(NO)和肌氨酸。一氧化氮合酶有三种同功酶，即在正常状态下表达的神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)以及在损伤后诱导表达的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。其中iNOS主要分布在巨噬细胞、中性粒细胞、肝细胞、平滑肌细胞和胰岛细胞。正常生理情况下，iNOS不或很少存在于哺乳动物细胞内，但致炎物质如LPS、TNF、IFN-γ等刺激下，可诱导产生iNOS，引起长时间且大量释放炎性介质NO，进一步诱导炎症细胞因子的产生。所以iNOS是一种能够反映出炎症严重程度的标志酶，当巨噬细胞过度激活，iNOS表达增加，催化产生大量的NO，非选择性地造成细胞和组织损伤，引发炎症。因此可以针对活化的巨噬细胞诱导表达iNOS来寻找安全有效的抗炎药物。

发明内容：

本发明目的在于提供一种蓝藻抗病毒蛋白N在抗炎方面的应用，为炎症疾病患者提供一种低毒有效的新药物。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明的技术方案如下：

蓝藻抗病毒蛋白N(CV-N)在制备抗炎药物中的应用，其特征在于所述的氨基酸序列为LGKFSQTCYNSAIQGSVLTSTCERTNGGYNTSSIDLNSVIENVDGSLKWQPSNFIETCRNTQLAGSSELAAECKTRAQQFVSTKINLDDHIANIDGTLKYE(见SEQ ID NO.1)。

所述CV-N可以来源于蓝藻，或cv-n基因在原核或真核细胞的表达。

所述CV-N能显著抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7细胞iNOS的表达和NO的分泌。

所述CV-N能显著抑制LPS诱导的全身炎症，抑制肺、肝、脾等器官炎症的发展。

含有CV-N的组合物在制备抗炎药物中的应用。

所述组合物是以CV-N作为活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的药物。

本发明所述药学上可接受的辅料，是指制备不同剂型时加入所需的各种常规辅料。

本发明所述CV-N在用于抗炎药物时，可以单独使用，也可以和其它药物配合同时使用，或与其它药物制成复方制剂使用。

本发明的应用范围包括巨噬细胞释放过量炎性介质一氧化氮所导致的各类炎症。

有益效果：本发明首次发现，CV-N在体外实验中能显著抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7细胞iNOS的表达和NO的分泌。在体内实验中，CV-N能显著抑制LPS诱导的小鼠全身炎症，抑制肺、肝、脾等器官炎性细胞浸润及病理损伤，显著降低肺部iNOS表达。这些结果表明，CV-N能显著抑制炎症的发展，具有开发为抗炎药物的前景。

附图说明：

图1 CV-N对RAW264.7细胞增殖率的影响。

图2 LPS与CV-N合用对RAW264.7细胞增殖率的影响。

图3 CV-N对LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型NO释放量的影响。***P<0.0001，与空白组相比；###P<0.0001，与LPS模型组相比。

图4 CV-N对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型iNOS表达的影响。

图5 CV-N对LPS诱导的全身炎症模型Balb/c小鼠肺部组织损伤的影响。

图6 CV-N对LPS诱导的全身炎症模型Balb/c小鼠肝部组织损伤的影响。

图7 CV-N对LPS诱导的全身炎症模型Balb/c小鼠脾部组织损伤的影响。

图8 CV-N对LPS诱导的全身炎症模型Balb/c小鼠肺部iNOS表达的影响。

具体实施方式

以下将通过具体的实施例对本发明进行描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1重组蓝藻抗病毒蛋白N制备

按照专利“一种蓝藻抗病毒蛋白N的制备方法及应用，申请号201911177607.6”方法进行。携带有重组质粒pGEX-4T-1-cv-n的OrigamiB(DE3)菌株在37℃下活化过夜。1:100转接扩大培养，当菌体OD₆₀₀值达到约0.6时，加入IPTG使其终浓度达到1mM，30℃诱导表达3小时。收集菌体,超声裂解菌体，收集上清。通过谷胱甘肽凝胶，纯化带有GST标签的蛋白。用凝血酶37℃，8小时切割标签。再一次通过谷胱甘肽凝胶纯化，所得的产物使用超滤管浓缩，并用PBS置换缓冲溶液，使蓝藻抗病毒蛋白N的终浓度达到1.5mg/ml。

实施例2 CV-N对RAW264.7细胞存活率的影响

取对数生长期RAW264.7细胞，培养48小时以后传代，待细胞密度达到50％时铺板。铺板24小时以后，直接加入CV-N，使其终浓度为0μg/ml,1μg/ml,10μg/ml,30μg/ml,100μg/ml和300μg/ml。培养24小时后每孔加10μL MTT(浓度为5mg/ml)溶液，继续培养4小时，终止培养。小心吸弃孔内MTT溶液，每孔加入150μL的二甲基亚枫(DMSO)，震荡摇匀10min，在波长490nm测各孔吸光度。细胞存活率＝(CV-N处理组吸光值/空白对照组平均吸光值)*100％。利用Graphpad对其显著性进行检测。从图1可以看出，高达300μg/ml的CV-N对细胞无毒性，表明CV-N的低毒性和安全性好。

实施例3 LPS与CV-N合用对RAW264.7细胞存活率的影响

取对数生长期RAW264.7细胞,培养48小时以后传代，待细胞密度达到50％时铺板。铺板24小时以后，分别加入LPS(10μg/ml),LPS(10μg/ml)+CV-N(1μg/ml),LPS(10μg/ml)+CV-N(10μg/ml)，LPS(10μg/ml)+CV-N(100μg/ml)。培养24小时后每孔加10μL MTT(浓度为5mg/ml)溶液，继续培养4小时，终止培养。小心吸弃孔内MTT溶液，每孔加入150μL的二甲基亚枫(DMSO)，震荡摇匀10min，在波长490nm测各孔吸光度。细胞存活率＝(处理组吸光值/空白对照组平均吸光值)*100％。利用Graphpad对其显著性进行检测。从图2可以看出，CV-N与LPS联合使用对RAW264.7细胞的存活率无显著影响。

实施例4 CV-N对LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型NO分泌的影响

取对数生长期RAW264.7细胞，培养48小时以后传代，待细胞密度达到50％时铺板。分别加入LPS(10μg/ml)，LPS(10μg/ml)+CV-N(1μg/ml)，LPS(10μg/ml)+CV-N(10μg/ml)，LPS(10μg/ml)+CV-N(100μg/ml)。培养24小时后利用Griess法测定培养基上清NO含量。由图3可知，RAW 264.7细胞在LPS刺激下NO分泌显著增加，给予CV-N后显著抑制了NO的分泌。因此，CV-N具有抑制巨噬细胞释放NO的活性，进而说明它具有显著的抗炎活性。

实施例5

CV-N对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型iNOS表达的影响

取对数生长期RAW264.7细胞，培养48小时以后传代，待细胞密度达到50％时铺板，分别加入LPS(10μg/ml)，LPS(10μg/ml)+CV-N(1μg/ml)，LPS(10μg/ml)+CV-N(10μg/ml)，LPS(10μg/ml)+CV-N(100μg/ml)。培养24小时后，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白含量。SDS-PAGE电泳分离蛋白样品后转膜，5％脱脂奶粉室温下封闭2小时后，4℃下孵育一抗iNOS(1:500)，β-actin(1:1000)过夜，室温下二抗(1:10000)孵育1小时，ECL检测目的蛋白条带。由图4可知，LPS显著增加细胞iNOS的表达水平，而不同浓度的CV-N干预后，iNOS水平显著下调。说明CV-N通过抑制LPS诱导的iNOS的表达，进而抑制炎性介质NO的产生，从而发挥抗炎作用。

实施例6 CV-N显著抑制LPS诱导的Balb/c小鼠全身性炎症

6周龄20-25g的Balb/c小鼠，在实验前适应培养一周。小鼠随机分为PBS组，LPS组(4mg/kg)，低剂量组(CV-N 1mg/kg)，中剂量组(CV-N 3mg/kg)，高剂量组(CV-N 9mg/kg)，阳性药组(地塞米松(DXM)1mg/kg)，除PBS组以外其余各组腹腔注射LPS(4mg/kg)PBS组注射等体积PBS。注射结束后一小时分别按照高剂量、中剂量和低剂量在颈背部皮下注射给药。阳性药为腹腔注射。给药后观察小鼠的行为活动、精神状态、食欲、皮毛、呼吸、大小便及死亡情况等，并称取体重。24小时后二次给药，48小时时摘眼球取血，并脊椎离断处死。取右肺置于标记好的EP管中，液氮冻存备用。取左肺部用4％的甲醛灌注，气管和一侧肺叶结扎。再用穿刺针插入气管上端，灌注方法与肺泡灌洗类似。放于组织固定液固定，常规方法制备石蜡切片并HE染色，然后对其进行打分。肺损伤进行评分是通过考虑以下四个因素确定的：(1)中性粒细胞分布及数量，(2)肺泡结构破坏程度，(3)蛋白质碎片在间隙的分布，和(4)肺泡间隔厚度。每个因素的严重程度以3分制评分，范围为0-2，即每个字段的得分。取脾脏，放于组织固定液中，常规方法制备石蜡切片并HE染色，根据脾脏动脉周围淋巴鞘、淋巴滤泡、边缘区、红髓中淋巴细胞密度和统计生发中心的总数目，对脾脏进行炎症评估。取肝脏放于组织固定液中，常规方法制备石蜡切片并进行HE染色，观察对照组，造模组与阳性药组，肝部空泡管增殖和炎性细胞浸润情况。

正常组小鼠精神状态良好，皮毛顺滑，饮食饮水正常。模型组造模以后精神状态较差，浑身颤栗，饮食较少，毛发无光泽。而给药组和地塞米松组的饮食和精神状态比模型组都有提高。正常组小鼠体重呈现增加趋势，而模型组小鼠体重持续降低，给药组小鼠在给药后第二天体重相对于模型组体重降低减少，地塞米松组小鼠体重降低程度相比模型组也大大减少。

由图5可知肺部组织：正常组肺泡结构完整，无炎性浸润，肺泡壁间隔无增厚；模型组肺泡结构破坏严重，炎性浸润严重，多见红细胞且肺泡壁间隔增厚；地塞米松组，有肺泡结构破坏，肺泡壁增厚，炎性浸润，症状较模型组有所改善；低剂量组肺泡结构破坏严重，炎性浸润严重，肺泡壁间隔增厚，较模型组无显著改善；中剂量组肺泡结构破坏，肺泡壁增厚，偶见炎性浸润，症状较模型组很大改善；高剂量组，少见肺泡结构破坏，肺泡壁增厚，炎性浸润，症状较模型组大大减轻。肺部具体评分结果见表1。由图6可知肝部组织：正常组肝部组织窦状间隙清晰，无空泡结构出现；模型组肝细胞高度肿胀，窦状间隙消失；低剂量组少见空泡结构，中剂量组、高剂量组与阳性药组无空泡结构。由图7可知脾组织：正常组无红细胞炎性浸润，模型组炎性浸润明显，给药组和阳性药组炎性浸润好转。

表1肺部损伤评价结果

综上所述，CV-N能显著改善LPS诱导的小鼠全身炎症，抑制肺、肝、脾等器官炎性细胞浸润及病理损伤。

取保存在液氮中的肺部组织，按比例加入提前加好蛋白酶抑制剂的动物组织裂解液，使用匀浆器充分裂解细胞，静置后离心取上清，使用BCA蛋白试剂盒检测总蛋白浓度，分装后-80℃保存，通过免疫印迹法测定iNOS蛋白表达量。模型组小鼠肺组织中iNOS表达上调，CV-N使iNOS水平明显降低(图8)，表明CV-N通过抑制LPS诱导的Balb/c小鼠肺部iNOS的表达起到抑制炎症的作用。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 蓝藻抗病毒蛋白N在制备抗炎药物中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Leu Gly Lys Phe Ser Gln Thr Cys Tyr Asn Ser Ala Ile Gln Gly Ser

1 5 10 15

Val Leu Thr Ser Thr Cys Glu Arg Thr Asn Gly Gly Tyr Asn Thr Ser

20 25 30

Ser Ile Asp Leu Asn Ser Val Ile Glu Asn Val Asp Gly Ser Leu Lys

35 40 45

Trp Gln Pro Ser Asn Phe Ile Glu Thr Cys Arg Asn Thr Gln Leu Ala

50 55 60

Gly Ser Ser Glu Leu Ala Ala Glu Cys Lys Thr Arg Ala Gln Gln Phe

65 70 75 80

Val Ser Thr Lys Ile Asn Leu Asp Asp His Ile Ala Asn Ile Asp Gly

85 90 95

Thr Leu Lys Tyr Glu

100

Claims

1.蓝藻抗病毒蛋白N在制备抗炎药物中的应用，其特征在于所述的氨基酸序列为SEQID NO. 1。