WO2019105060A1 - 锰型高稳定性超氧化物歧化酶的应用 - Google Patents

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    • C12Y115/01—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15) with NAD or NADP as acceptor (1.15.1)
    • C12Y115/01001—Superoxide dismutase (1.15.1.1)

Definitions

  • the invention belongs to the fields of biomedicine, functional food and the like, and particularly relates to the application of a superoxide dismutase.
  • the fatty liver is alcoholic fatty liver or nonalcoholic fatty liver.
  • the medicament is administered by the oral, injection or gavage route.
  • the injection is intravenous or intraperitoneal.
  • the pharmaceutical dosage form is a tablet, a capsule, a powder, an injection or an aerosol.
  • the manganese type high stability superoxide dismutase provided by the invention can effectively reduce the superoxide level, and is suitable for various types of fatty liver such as alcoholic fatty liver, nonalcoholic fatty liver, fatty liver accompanied by metabolic syndrome. Have a good therapeutic effect.
  • Figure 3A shows the weight comparison between the high fat diet group and the MS-SOD treatment group
  • Figure 4A shows plasma ethanol concentration
  • Figure 4B shows liver alcohol dehydrogenase (Adh1) and cytochrome P4502E1 (Cyp2e1) mRNA levels;
  • Figure 5D is a fatty liver score
  • FIG. 5G shows the results of a glucose tolerance test (GTT).
  • Figure 5K shows plasma endotoxin lipopolysaccharide levels.
  • High-fat+MS-SOD group (HFD+MS-SOD): fed with high-fat diet for 18 weeks, and starting from the 8th week, the mice were given MS-SOD for 3U/g body weight. Each 0.1ml, once a day, up to 18 weeks. MS-SOD was from the article of Example 1 above.
  • High fat feed component add lard based on low fat feed.
  • Mn-SOD manganese-type superoxide dismutase
  • CuZn-SOD copper-zinc superoxide dismutase
  • the test was carried out using the superoxide detection kit of Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. Kit principle: The superoxide can be detected by using superoxide to reduce the water-soluble tetrazolium-1 (WST-1) to produce soluble colored substances.
  • WST-1 water-soluble tetrazolium-1
  • MS-SOD gavage group the mice were intragastrically administered orally (oral) at a dose of 6 U/g body weight per day, and the amount of gavage was 0.1 ml per day, once a day for 7 days;
  • MS-SOD intraperitoneal injection group mice were intraperitoneally injected with 6 U/g body weight per day, the injection volume was 0.1 ml per time, 1 time/day, and continuous injection for 7 days.
  • mice Sixty-five-year-old male C57 mice (purchased from the Guangdong Experimental Animal Center) were housed in an SPF environment and divided into three groups:
  • Control group The Lieber-DeCarli alcohol-free liquid diet for 9 weeks;
  • Model control group (alcohol, Alc): The Lieber-DeCarli alcoholic liquid diet for 9 weeks;
  • MS-SOD treatment group (Alc+SOD): The Lieber-DeCarli alcoholic liquid diet for 9 weeks, while gavage MS-SOD (3 U/g body weight).
  • the MS-SOD treatment group was intragastrically administered with MS-SOD solution (3 U/g body weight), the amount of gastric perfusion was 0.1 ml per time, once per day, and the gavage period was 9 weeks.
  • the blank control group and the model control group were intragastrically administrated with sterile water, and the amount, frequency and cycle of gavage were the same as those in the treatment group.
  • fresh feces were collected every 9 am at 9 am and stored at -80 °C.
  • the plasma ALT/AST levels were monitored by eyelid blood collection.
  • the tissues were dissected and frozen at -80 °C.
  • mice were induced for eight weeks in the diet of liber DeCarli. Ethanol metabolism is not affected by MS-SOD, such as plasma ethanol levels and liver alcohol dehydrogenase, cytochrome p4502E1 expression ( Figures 4A, 4B).
  • MS-SOD such as plasma ethanol levels and liver alcohol dehydrogenase, cytochrome p4502E1 expression
  • the liver weight/body weight ratio was significantly higher in the alcohol group and slightly lower in the alcohol + SOD group (Fig. 4C).
  • plasma alanine aminotransferase levels were significantly reduced in the alcohol + SOD group (Fig. 4D).
  • hepatic lipid accumulation and liver ccl2 expression were significantly reduced in the MS-SOD group (Fig. 4E-H).
  • MS-SOD can improve the symptoms of intestinal flora imbalance, intestinal leakage and hepatic steatosis caused by alcohol feeding.
  • Example 6 MS-SOD alleviates the symptoms of fatty liver and metabolic syndrome in mouse genetically deleted leptin (ob/ob mice)
  • ITT Insulin tolerance test
  • MS-SOD treatment significantly changed the composition of the intestinal flora (Fig. 5I).
  • Fig. 5I By monitoring the levels of fecal albumin and plasma endotoxin lipopolysaccharide, it was found that MS-SOD significantly improved intestinal leakage and translocation of bacterial products (Fig. 5J, K).
  • MS-SOD relieves the symptoms of fatty liver and metabolic disorders in the OB/OB mouse model.

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Abstract

提供了锰型高稳定性超氧化物歧化酶（MS-SOD）在制备治疗脂肪肝药物中的应用，其中，所述锰型高稳定性超氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

Description

锰型高稳定性超氧化物歧化酶的应用 技术领域
本发明属于生物医药、功能食品等领域，具体涉及一种超氧化物歧化酶的应用。
背景技术
脂肪肝是一种广泛流行的慢性疾病，可以分为酒精性脂肪肝(Alcoholic fatty liver disease,ALD)与非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)。脂肪肝是导致肝病的主要原因，如肝硬化和肝癌等。非酒精性脂肪肝的特点是肝脏脂肪堆积和代谢的失调(如胰岛素抵抗)。长期的高脂饮食或编码瘦素(Leptin)肥胖基因的敲除所致的肝脏脂肪变性和代谢变化最终导致非酒精性脂肪肝的发生，出现肝纤维化，肝硬化和肝癌。酒精性脂肪肝是由于长期滥用酒精发生的，也可导致从单纯的脂肪变性到晚期的肝病。非酒精性脂肪肝与酒精性脂肪肝的发病机制非常复杂，但越来越多的证据表明，肠屏障的损伤会导致病原体相关分子模式(pamps)易位到肠道外组织中，并伴随着肠道菌群的改变以及NAFLD和ALD的发生。尽管已知肠屏障损伤是脂肪肝发展的一个重要驱动力，但却很少有通过修复肠屏障损伤进而治疗脂肪肝症状的有效方法。
自由基长期以来被认为参与了肠道屏障的破坏，但很少有人重视到肠道内容物的自由基。体外研究表明胞内和胞外超氧化物自由基可破坏Caco-2细胞的单层结构。目前，细胞外超氧化物被认为主要来自于包括巨噬细胞和单核细胞在内的炎症细胞。另一方面，宏基因组的分析显示，代谢性疾病患者的肠道菌群的氧化压力明显增高。值得注意的是，在大鼠模型中，粪肠球菌菌株产生胞外超氧化物，并产生羟基自由基。尽管缺乏直接证据表明肠道菌群产生超氧化物，但是肠道微生物可能是另一个细胞外超氧化物的产生源，并影响肠道内局部环境。最近的研究表明，高脂饮食喂养与肠道微生物活性氧(ROS)的升高密切相关，但是，肠道菌群的活性氧对脂肪肝发展的细节仍有待研究。
发明内容
本申请发明人对肠道细菌超氧化物对脂肪肝的潜在影响进行了探讨，提出了脂肪肝治疗的新途径。
具体地，本发明提供锰型高稳定性超氧化物歧化酶(MS-SOD)在制备治疗脂肪肝的药物中的应用，其中，所述锰型高稳定性超氧化物歧化酶的氨基酸 序列如SEQ ID NO:4所示。
在一种具体实施方式中，所述脂肪肝为酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝。
在一种具体实施方式中，所述脂肪肝为伴有代谢综合征的脂肪肝。
优选地，所述代谢综合征为高血糖或者胰岛素抵抗。
优选地，所述药物为口服、注射或灌胃途径给药。
进一步优选地，所述注射为静脉注射或腹腔注射。
优选地，所述药物剂型为片剂、胶囊剂、粉针、注射剂或气雾剂。
优选地，所述药物还包括一种或多种制药学上可接受的辅料，如稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、溶剂和/或缓冲剂等。这些辅料以本领域公知的方式与MS-SOD制备成药，其用量亦是本领域技术人员可知的。
本发明提供的锰型高稳定性超氧化物歧化酶能够有效降低超氧化物水平，对于各种类型的脂肪肝，如酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、伴有代谢综合征的脂肪肝都有很好的治疗效果。
附图说明
图1A显示氧化压力相关酶的基因丰度分析；
图1B显示小鼠肠道粪便中相对超氧化物水平(n＝8-14)；
图2A显示血浆总SOD活性(n＝8)；
图2B显示肠壁总SOD活性(n＝8)；
图2C显示盲肠内容物总SOD活性(n＝7-8)；
图3A显示高脂饮食组与MS-SOD治疗组体重对比；
图3B显示脂肪组织相对重量；
图3C为肝脏HE和油红O染色图(n＝6-9)；
图3D为脂肪肝评分(n＝6-9)；
图3E显示肝脏总甘油三酯含量(n＝7-11)；
图3F显示肝细胞因子和趋化因子相对mRNA表达水平(n＝10-15)；
图3G为葡萄糖耐量试验结果(GTT)(n＝10-20)；
图3H为胰岛素耐量试验结果(ITT)(n＝10-20)；
图3I显示空腹血糖水平(n＝10-20)；
图3J显示空腹胰岛素水平(n＝10-20)；
图3K显示稳态模型评估胰岛素抵抗指数HOMA-IR水平(n＝10-20)；
图4A显示血浆乙醇浓度；
图4B显示肝脏乙醇脱氢酶(Adh1)和细胞色素P4502E1(Cyp2e1)mRNA水平；
图4C显示肝脏体重比结果(n＝8-10)；
图4D显示血浆谷丙转氨酶水平(n＝8-10)；
图4E为肝脏HE和油红O染色结果(n＝6-10)；
图4F显示基于油红O染色(n＝6-10)的脂肪肝评分；
图4G显示肝脏总甘油三酯的含量(n＝7-10)；
图4H显示肝脏Ccl2 mRNA相对表达水平(n＝8-10)；
图4I显示肠道粪便中的相对超氧化物量(n＝6-8)；
图4J显示盲肠细菌的PCoA分析(n＝6-8)；
图4K显示粪便白蛋白水平(n＝8-11)；
图4L显示血浆内毒素水平(n＝8-11)；
图5A显示体重变化情况；
图5B显示脂肪组织相对重量；
图5C为肝脏HE和油红O染色结果；
图5D为脂肪肝评分；
图5E显示肝脏总甘油三酯含量；
图5F显示肝脏Ccl4 mRNA水平；
图5G显示葡萄糖耐量试验(GTT)结果；
图5H显示胰岛素耐量试验(ITT)结果；
图5I为菌群分类的变化图；
图5J显示粪便白蛋白水平；
图5K显示血浆内毒素脂多糖水平。
具体实施方式
以下实施例中，如无具体说明，检测、监测各项指标均以本领域已知的方法进行。
其中，血浆胰岛素、葡萄糖、总胆固醇和血乙醇测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。LPS测定试剂盒购自Bioswamp公司。
实施例中使用的小鼠均购自广东省实验动物中心。
葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐量试验(ITT)：参考“葡萄糖耐量试验的原理及临床应用”，Shanghai Med J.2009，第32卷，第5期，第440-443页。
实施例1：锰型高稳定性超氧化物歧化酶(MS-SOD)的制备
以嗜热菌HB27(购自美国ATCC细胞库，保藏编号为ATCC BAA-163) 的基因组为模板，以如下引物序列进行扩增得到目的基因：正向引物：5’-aagaattcatgccgtacccgttcaagct-3’(SEQ ID NO.1)反向引物：5’-ctgtcgactcaggctttgttgaagaac-3’(SEQ ID NO.2)；用回收试剂盒(购自生工生物工程上海(股份)有限公司)回收扩增产物，用酶EcoRI和Sal I双酶切，并连接到用同样酶双酶切的质粒载体pET28a(+)(购自生工生物工程上海(股份)有限公司)中，将重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)(购自生工生物工程上海(股份)有限公司)，通过测序筛选MS-SOD核苷酸序列正确的菌株，培养该菌株，得到MS-SOD蛋白。其中，MS-SOD编码基因的核苷酸序列为：
Figure PCTCN2018099148-appb-000001
MS-SOD的氨基酸序列为：
Figure PCTCN2018099148-appb-000002
实施例2：MS-SOD对高脂饮食诱导小鼠肠道菌群的作用
1.动物模型建立：
6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠(购自广东省实验动物中心)，分为3组：
(1)正常对照组(NC)：低脂饲料喂养(脂肪来源卡路里10％)18周；
(2)高脂饮食组(HFD)：高脂饲料喂养(脂肪来源卡路里60％)18周；
(3)高脂+MS-SOD组(HFD+MS-SOD)：高脂食物喂养18周，并从第8周开始同时对小鼠进行MS-SOD灌胃3U/g体重，灌胃量为每只0.1ml，每天1次，直至18周。MS-SOD来自上述实施例1的制品。
低脂饲料组分:玉米粉、豆粨、小麦粉、鱼、植物油等。
高脂饲料组分：低脂饲料基础上添加猪油。
2.实验内容：
(1)氧化压力相关酶的检测
委托生物公司，通过对NC组和HFD组小鼠肠道菌群进行宏基因组测序，得到锰型超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、铜锌型超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物还原酶的基因丰度。具体为：
a.分别取NC组和HFD组小鼠粪便，每只1g，混悬于5毫升50mM磷酸缓冲液(含0.5％吐温-20)，样品在-80℃和60℃环境下反复冻融3次，以破坏微生物细胞。
b.样品总RNA采用Invitrogen公司的Trizol法试剂盒进行提取，采用ABI 7500 rtPCR系统利用实时定量荧光PCR对样品进行检测。
c.酶基因相对表达量的测定：以18sRNA为内参基因，采用定量PCR的方法对目标基因和内参基因同时进行扩增，然后运用Ct比较法对目标基因的相对表达量进行分析。引物序列自NIH qPrimerdepot数据库中得到。
(2)超氧化物水平的检测：
采用上海碧云天生物技术有限公司的超氧化物检测试剂盒进行检测。试剂盒原理：利用超氧化物可以还原水溶性四氮唑-1(WST-1)产生可溶性有色物质为基础来检测超氧化物。
a.在酶标板检测孔中加入200微升超氧化物缓冲液，10微升WST-1液，2微升Catalase溶液；
b.在检测孔中加入处理好的待测样品；
c.37℃孵育3分钟；在450nm处测定吸光度。
3.实验结果
1)高脂饮食喂养提高了小鼠肠道微生物的超氧化物水平。
对小鼠活性氧代谢相关的基因，包括锰型超氧化物歧化酶、铜锌超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物还原酶的基因进行了研究，发现除铜锌型-SOD外，其他酶的基因丰度均有所下降(图1A)。而小鼠肠道菌群的超氧化物水平显著提高(图1B)。这些数据明确表明高脂饮食能够提高肠道微生物的超氧化物水平，降低活性氧代谢相关基因的丰度。
2)MS-SOD对高脂饮食诱导的肠道菌群超氧化物水平的失衡具有修复作用。
如上，为研究MS-SOD的作用，同时进行了对比实验。结果表明，与高 脂饮食组小鼠对比，MS-SOD灌胃组的超氧化物水平降低到了正常水平(图1B)，说明MS-SOD能够修复高脂饮食诱导的肠道菌群超氧化物水平的失衡。
实施例3：MS-SOD灌胃和注射对小鼠肠道SOD活力的影响
1.动物模型建立：
6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠(购自广东省实验动物中心)，分为3组：
(1)MS-SOD灌胃组：每天按6U/g体重对小鼠进行灌胃(口服)，灌胃量为每只0.1ml，1次/天，连续灌胃7天；
(2)磷酸盐缓冲液对照组：每天0.1ml的灌胃量对小鼠进行灌胃(口服)，1次/天，连续灌胃7天；
(3)MS-SOD腹腔注射组：每天按6U/g体重对小鼠进行腹腔注射，注射量为每只0.1ml，1次/天，连续注射7天。
2.实验内容：
7天后，取各组实验小鼠的血浆、空肠、回肠、结肠和盲肠内容物，采用邻苯三酚法(参考GB/T5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定》)进行SOD活力测定。
3.实验结果：
如图2A所示，注射MS-SOD可引起血浆总SOD活性升高；相比之下，灌胃(口服)MS-SOD，小鼠血浆总SOD没有显著变化，说明口服MS-SOD不会影响肠道外器官。如图2B所示，空肠、回肠、结肠中总SOD活性也没有明显改变；但如图2C所示，盲肠内容物中SOD的活性明显增强，说明MS-SOD可直接改变肠道细菌环境中的氧化还原电位。
实施例4：MS-SOD对高脂饮食小鼠肝脏脂质堆积和代谢综合征的影响
1.动物模型的建立：
同实施例2中动物模型的建立。
2.实验结果
(1)对小鼠的体重和脂肪组织含量进行检测。如图3A和3B所示，以MS-SOD进行灌胃没有改变小鼠的体重和脂肪组织的含量。然而，从肝脏切片可以看出，长期高脂饮食导致肝脏脂肪变性，灌胃MS-SOD后，脂肪肝症状明显减轻(图3C-D)，同时，肝脏甘油三酯的含量显著降低(图3E)。
(2)提取肝脏组织的mRNA，逆转录成cDNA，采用实时荧光定量PCR的方法对肝脏中的关键细胞因子表达的进行研究。结果显示：MS-SOD在高脂饮食喂养过程中能够显著降低肿瘤坏死因子tnf-α、趋化因子ccl4、ccl8、cxcl1、 cxcl2和cxcl10的mRNA水平(图3F)。
(3)高脂饮食喂养也会导致代谢紊乱，如葡萄糖耐受和胰岛素抵抗。葡萄糖耐量试验(GTT)显示，与高脂饮食喂养的小鼠相比，用MS-SOD灌胃的小鼠血液葡萄糖水平明显降低(图3G)。与此相一致的是，胰岛素耐量试验结果显示，相对单纯高脂饮食喂养的小鼠，采用MS-SOD灌胃的高脂饮食喂养的小鼠对胰岛素更加敏感(图3H)。与正常对照组相比，高脂饮食喂养会显著提高空腹血糖水平和HOMA-IR指数，这是胰岛素抵抗的标志。MS-SOD几乎可以使这些参数恢复正常(图3I-K)。MS-SOD能改善高脂饮食诱导的胰岛素敏感性受损。可见，MS-SOD能够显著降低高脂饮食导致的肝脏脂肪变性和代谢紊乱。
实施例5：MS-SOD减轻酒精性脂肪肝的症状
(一)实验方案
1.动物模型：
8周龄雄性C57小鼠(购自广东省实验动物中心)60只，饲养于SPF环境分为三个组：
空白对照组(control)：The Lieber-DeCarli无酒精流质饮食9周；
模型对照组：(alcohol,Alc)：The Lieber-DeCarli酒精流质饮食9周；
MS-SOD治疗组(Alc+SOD)：The Lieber-DeCarli酒精流质饮食9周，同时灌胃MS-SOD(3U/g体重)。
Lieber-DeCarli酒精液体饲料(TP4231C，热量包括脂肪40％,蛋白质18％,碳水化合物14％,酒精28％，购自南通南通特洛菲饲料科技有限公司Trophic Animal Feed High-Tech Co.,Ltd,China)。
2.实验方案：
MS-SOD治疗组以MS-SOD溶液灌胃(3U/g体重)，灌胃量为每只0.1ml，1次/天，灌胃期为9周。空白对照组和模型对照组以无菌水灌胃，灌胃量、频次和周期同治疗组。实验期每两周五上午9点收取新鲜粪便，并储存于-80℃条件。灌胃干预第4、6、8周分别通过眼眶采血监测小鼠血浆ALT/AST水平，实验最后一天，解剖小鼠取各组织于-80℃冻存。
3.实验结果：
小鼠在liber DeCarli的饮食中受到了八个星期的诱导。乙醇代谢不受MS-SOD的影响，如血浆乙醇水平和肝脏乙醇脱氢酶、细胞色素p4502E1表达(图4A、4B)。与酒精组的肝重/体重比显著升高，酒精+SOD组肝重/体重比较之略有下降(图4C)。同时酒精+SOD组血浆丙氨酸氨基转移酶水平显著 降低(图4D)。重要的是，MS-SOD组的肝脂堆积和肝脏ccl2的表达明显减少了(图4E-H)。慢性酒精滥用显示了一个明显的趋势，粪便中有较高的超氧化物含量，但MS-SOD可以显著降低酒精喂养过程中的超氧化物水平(图4I)。最后用MS-SOD灌胃显著降低了慢性酒精所致肠道通透性升高和微生物产物移位(图4J-L)。综上，MS-SOD可以改善酒精喂养导致的肠道菌群失衡、肠漏和肝脏脂肪变性等症状。
实施例6：MS-SOD减轻小鼠遗传缺失瘦素(ob/ob小鼠)脂肪肝和代谢综合征症状
(一)实验方案
1.动物模型：
小鼠遗传缺失瘦素(ob/ob小鼠)：6-8周龄雄鼠，购自广东省实验动物中心。
2.实验方案
(1)ob/ob小鼠从第8周开始直到第12周喂食MS-SOD(3U/g体重)。
(2)葡萄糖耐量试验(GTT)：小鼠禁食16小时后腹膜注射葡萄糖(1g/kg体重)。分别在0、30、60、90、120分钟测定血糖浓度。
(3)胰岛素耐量试验(ITT)：小鼠禁食6小时后腹膜注射胰岛素(0.35U/kg体重)。分别在0、30、60、90、120分钟测定血糖浓度。
3.实验结果
MS-SOD治疗缓解了小鼠遗传缺失瘦素(ob/ob老鼠)的脂肪肝和代谢综合征。MS-SOD没有明显改变ob/ob小鼠的体重(图5A、B)，但是脂肪组织指数有明显改善(图5C、D)，肝脏甘油三酯含量也明显降低(图5E)，肝脏Ccl4 mRNA水平也显著降低(图5F)。GTT和ITT实验证明了灌胃MS-SOD使小鼠的血糖得到了更好的控制，明显降低了血糖，对胰岛素的敏感性也更大(图5G、H)。重要的是,与高脂饮食喂养模型类似，MS-SOD治疗对肠道菌群成分有显著的改变(图5I)。通过监测粪便白蛋白和血浆内毒素脂多糖水平，可发现MS-SOD可明显改善肠道泄漏和细菌产物的易位(图5J、K)。总之，MS-SOD可缓解OB/OB小鼠模型的脂肪肝和代谢紊乱症状。

Claims (9)

  1. 锰型高稳定性超氧化物歧化酶在制备治疗脂肪肝的药物中的应用，其中，所述锰型高稳定性超氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
  2. 根据权利要求1所述的应用，其中，所述脂肪肝为酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝。
  3. 根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述脂肪肝为伴有代谢综合征的脂肪肝。
  4. 根据权利要求3所述的应用，其中，所述代谢综合征为高血糖或者胰岛素抵抗。
  5. 根据权利要求1-4任一项所述的应用，其中，所述药物为口服、注射或灌胃途径给药。
  6. 根据权利要求5所述的应用，其中，所述注射为静脉注射或腹腔注射。
  7. 根据权利要求1-4任一项所述的应用，其中，所述药物剂型为片剂、胶囊剂、粉针、注射剂或气雾剂。
  8. 根据权利要求1-4任一项所述的应用，其中，所述药物还包括一种或多种制药学上可接受的辅料。
  9. 根据权利要求8所述的应用，其中，所述辅料为稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、溶剂和/或缓冲剂。
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