CN109943622B - 亚硝基谷胱甘肽还原酶的医药用途 - Google Patents
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Abstract
亚硝基谷胱甘肽还原酶的医药用途，属于糖尿病防治技术领域，具体涉及调控亚硝基谷胱甘肽还原酶GSNOR在糖尿病血管内皮功能障碍防治中的应用。通过转染小干扰RNA，敲除GSNOR基因或注射抑制剂N6022，抑制GSNOR的表达或活性，可有效抑制糖尿病导致的血管内皮功能障碍。
Description
技术领域
本发明属于糖尿病防治技术领域，具体涉及调控亚硝基谷胱甘肽还原酶GSNOR在糖尿病血管内皮功能障碍防治中的应用。
背景技术
糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病，目前全球近4亿人患有糖尿病。糖尿病会导致多种靶器官发生损伤，引发一系列的并发症，比如糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病心肌病等等。这些糖尿病并发症严重危害着糖尿病患者的生命健康。同时，糖尿病长期存在的高血糖所引起的血管病变又是导致各种靶器官损伤的主要原因。血管病变主要表现为内皮细胞损伤、炎症细胞募集和平滑肌细胞增殖迁移，从而导致血管弹性丧失，内膜/中膜的增厚，通透性改变等，进而引发一系列的相关疾病。许多研究表明血管内皮细胞在血管病变中扮演着最重要的角色，正常血管内皮细胞功能的维持，是保证血管稳态的重要前提。血管内皮细胞为衬贴在血管腔的单层扁平细胞，是连接血液与血管组织的桥梁和屏障，一直暴露在体液因子、炎症介质和机械力（血流剪切力和压力）的环境中，成为诱发生物学应答并最终影响血管结构的效应细胞。 糖尿病使血管内皮细胞长期处于高胰岛素，高糖及各类细胞因子水平异常的应激环境中，从而影响内皮细胞的正常生物学功能，最终导致各种血管病变的发生。因此，明确糖尿病血管内皮功能障碍的调节机制，有助于寻找治疗糖尿病血管病变的新方案，对糖尿病并发症的预防和治疗具有十分重要的意义。
亚硝基谷胱甘肽还原酶（S-nitrosoglutathione reductase, GSNOR）作为醇脱氢酶家族中一个特殊的蛋白酶，其在细胞内的主要作用是调节亚硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione, GSNO）的代谢，进而影响着细胞内一氧化氮（Nitric oxide, NO）以及亚硝基硫醇基团（-SNO）的稳态调节。研究显示，使用GSNOR抑制剂N6022能通过增加NO从而有效改善小鼠的哮喘症状，并且该作用已进入早期临床试验阶段。此外，有研究报道GSNOR可以通过影响不同靶蛋白的巯基亚硝基化（SNO）修饰水平从而参与一系列疾病的进程，比如动脉粥样硬化，心梗，中毒性肝损伤等。但是，GSNOR在糖尿病血管病变中是否发挥调控作用及其具体机制目前尚不明确，同时，GSNOR抑制剂N6022在糖尿病相关血管病变中的是否能够发挥治疗作用也尚未报道。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种亚硝基谷胱甘肽还原酶的医药用途，通过抑制GSNOR的表达或活性，可有效抑制糖尿病导致的血管内皮功能障碍。
技术方案: GSNOR作为标志物在制备检测糖尿病血管内皮功能障碍试剂盒中的应用。
GSNOR作为标志物在筛选治疗糖尿病血管内皮功能障碍药物中的应用。
抑制GSNOR表达的siRNA在制备治疗糖尿病血管内皮功能障碍药物中的应用。
上述siRNA的序列为:
sense(5'-3'):GCUGAUAUCUCUGUUGCUATT，
antisense(5'-3'): UAGCAACAGAGAUAUCAGCTT。
抑制GSNOR活性的抑制剂N6022在制备治疗糖尿病血管内皮功能障碍药物中的应用。
有益效果：通过转染小干扰RNA，敲除GSNOR基因或注射抑制剂N6022，抑制GSNOR的表达或活性，可有效抑制糖尿病导致的血管内皮功能障碍。
附图说明
图1为人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的检测结果图；其中a为高糖（30mM）处理的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）24h的检测示意图，GSNOR的蛋白水平明显增加。b为量化图，*P<0.05。
图2为小鼠血管组织中GSNOR的蛋白水平检测图：a为链脲霉素（STZ）诱导1型糖尿小鼠血管组织中GSNOR的蛋白水平示意图，可以看出明显增加。b为量化图*P<0.05。
图3为免疫荧光检测链脲霉素（STZ）诱导1型糖尿小鼠血管内皮中GSNOR的蛋白水平示意图。
图4为在HUVEC细胞中敲低GSNOR后，再给予高糖（30mM）处理24h的检测示意图，检测发现，敲低GSNOR后能明显改善高糖导致的内皮细胞间连接的破坏。
图5为在HUVEC细胞中敲低GSNOR后，再给予高糖（30mM）处理24h的检测示意图，检测发现，敲低GSNOR后能明显改善高糖导致的内皮细胞通透性的增加。*P<0.05，# P<0.05。
图6为在HUVEC细胞中给予高糖（30mM）及GSNOR抑制剂N6022（10nM）处理24h的检测示意图，检测发现，N6022能明显改善高糖导致的内皮细胞间连接的破坏。
图7为在HUVEC细胞中给予高糖（30mM）及GSNOR抑制剂N6022（10nM）处理24h的检测示意图，检测发现，N6022能明显改善高糖导致的内皮细胞通透性的增加。*P<0.05，# P<0.05。
图8为在链脲霉素（STZ）诱导的1型糖尿病小鼠中，GSNOR 敲除（KO）小鼠的主动脉舒张功能检测图，可以看出其明显好于野生型小鼠。*P<0.05。
图9为在链脲霉素（STZ）诱导的1型糖尿病小鼠中，GSNOR 敲除（KO）小鼠的肠系膜动脉舒张功能检测图，可以看出其肠系膜动脉对乙酰胆碱的反应性明显好于野生型小鼠。*P<0.05。
图10为在链脲霉素（STZ）诱导的1型糖尿病小鼠中，通过静脉注射Evans Blue检测血管通透性的检测示意图，结果显示，相比于野生型小鼠，GSNOR敲除（KO）小鼠的血管通透性明显得到改善。
图11为在链脲霉素（STZ）诱导的1型糖尿病小鼠主动脉舒张功能检测图，可以看出通过尾静脉注射给予N6022（0.1mg/kg/day）的小鼠的主动脉舒张功能明显好于对照组小鼠。*P<0.05，# P<0.05。
图12为在链脲霉素（STZ）诱导的1型糖尿病小鼠肠系膜动脉舒张功能检测图，可以看出通过尾静脉注射给予N6022（0.1mg/kg/day）的小鼠的肠系膜动脉对乙酰胆碱的反应性明显好于对照组小鼠。*P<0.05，# P<0.05。
图13为在链脲霉素（STZ）诱导的1型糖尿病小鼠中，通过静脉注射Evans Blue检测血管通透性的检测示意图，结果显示，相比于对照组小鼠，通过尾静脉注射给予N6022（0.1mg/kg/day）的小鼠的血管通透性明显得到改善。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：在糖尿病模型中，内皮细胞中GSNOR的表达水平明显增加。
为了研究糖尿病是否影响内皮细胞中GSNOR的蛋白水平，我们用高糖（30mM）处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC）24h，Western blot检测发现高糖处理的内皮细胞中GSNOR表达明显增加（图1）； 在链脲霉素（STZ）诱导的小鼠1型糖尿病模型中，取小鼠主动脉血管组织，Western blot检测发现糖尿病小鼠血管组织中GSNOR表达明显增加（图2），小鼠主动脉血管组织切片的免疫荧光同样显示糖尿病小鼠血管内皮中GSNOR表达明显增加（图3）。
实施例2：抑制GSNOR能改善糖尿病血管内皮功能障碍。
为进一步研究GSNOR蛋白水平的增加是否参与了糖尿病血管内皮功能障碍的发生。细胞水平上，我们利用小干扰RNA（sense:GCUGAUAUCUCUGUUGCUATT，antisense:UAGCAACAGAGAUAUCAGCTT）敲低GSNOR后，再给予高糖（30mM）处理24h，内皮细胞成管实验结果显示，敲低GSNOR后，能明显改善高糖导致的内皮细胞间连接的破坏（图4）以及内皮细胞通透性的增加（图5）；同时，在给予GSNOR抑制剂N6022（10nM）后，能明显改善高糖导致的内皮细胞间连接的破坏（图6）以及内皮细胞通透性的增加（图7）；在链脲霉素（STZ）诱导的1型糖尿病小鼠模型中，分离小鼠主动脉与肠系膜动脉，检测血管舒张功能，结果显示GSNOR 敲除小鼠的主动脉（图8）与肠系膜动脉（图9）舒张功能明显好于野生型小鼠；同时，通过尾静脉注射Evans Blue染料（1%，100μL），60分钟后分离小鼠主动脉观察血管通透性，结果显示，相比于野生型小鼠，GSNOR 敲除小鼠的血管通透性明显得到改善（图10）。同时，在链脲霉素（STZ）诱导的1型糖尿病小鼠模型中，分离小鼠主动脉与肠系膜动脉，检测血管舒张功能，结果显示通过尾静脉注射给予N6022（0.1mg/kg/day）的小鼠的主动脉（图11）与肠系膜动脉（图12）舒张功能明显好于对照组小鼠；通过尾静脉注射Evans Blue染料（1%，100μL），60分钟后分离小鼠主动脉观察血管通透性，结果显示，相比于对照组小鼠，尾静脉注射给予N6022（0.1mg/kg/day）的小鼠的血管通透性明显得到改善（图13）。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 亚硝基谷胱甘肽还原酶的医药用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcugauaucu cuguugcuat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uagcaacaga gauaucagct t 21
Claims (5)
1.GSNOR标志物作为靶标在制备检测糖尿病血管内皮功能障碍试剂盒中的应用。
2.GSNOR作为标志物在筛选治疗糖尿病血管内皮功能障碍药物中的应用。
3.抑制GSNOR表达的siRNA在制备治疗糖尿病血管内皮功能障碍药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述siRNA的序列为
sense(5'-3'):GCUGAUAUCUCUGUUGCUATT，
antisense(5'-3'): UAGCAACAGAGAUAUCAGCTT。
5.抑制GSNOR活性的抑制剂N6022在制备治疗糖尿病血管内皮功能障碍药物中的应用。
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