CN112618570A

CN112618570A - 石墨烯量子点的制备方法及其在制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用

Info

Publication number: CN112618570A
Application number: CN202110013456.1A
Authority: CN
Inventors: 李红良; 折志刚; 邹头君
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan Sailaiya Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-01-07
Filing date: 2021-01-06
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2041-01-06
Also published as: CN112618570B; CN111067918A

Abstract

本发明公开了一种石墨烯量子点的制备方法及其在制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用。本发明以石墨烯量子点为活性成分，在预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物具有以下优点：1、药效明显，石墨烯量子点可以显著抑制L02细胞中的脂质堆积，20μg/ml就能看到明显的变化。2、石墨烯量子点不仅可以调节Fasn、Scd1脂质代谢相关基因，对Il6、Tnfα等炎症因子也具有抑制作用，表现出抗炎效果。3、石墨烯量子点具备良好生物相容性，长期给药病理及血生化指标均显示无明显毒副作用，克服石墨烯材料在生物应用中毒性大的问题。

Description

石墨烯量子点的制备方法及其在制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种石墨烯量子点的制备方法及其在制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用。

背景技术

非酒精性脂肪肝病(NAFLD,nonalcoholic fatty liver disease)是一组除外酒精和其他明确的肝损因素所致的，以肝细胞内脂肪过度沉积(脂肪浸润的肝细胞占总肝细胞的5％以上)为主要特征的代谢综合征，包括单纯性脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)和肝硬化。调查显示，NAFLD在非肥胖人群中的发病率为10％～20％，在25kg/m²＜身体质量指数(BMI，body mass index)＜30kg/m²的人群中约为63.4％，而在BMI＞30kg/m²人群中约为89.1％，NAFLD在Ⅱ型糖尿病患者中的发病率约为50％。儿童NAFLD的发病率也呈上升趋势，约3％，并可能随着年龄增长而增加。NAFLD是NASH、肝硬化以及肝癌三部曲的主要诱发因素。此外，NAFLD常与其他代谢性综合征并存或者相互影响，如腹型肥胖、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、Ⅱ型糖尿病以及致动脉粥样硬化的脂质代谢紊乱。。随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，我国NAFLD的患者人数逐年增加，已经成为慢性肝病的重要病因。据统计，目前全球拥有超过10亿非酒精性脂肪肝患者，我国成人NAFLD的发病率也达20％左右。虽然近年来抗氧化剂、胰岛素增敏剂和细胞保护剂等药物均应用在NAFLD的治疗上，但治疗效果差强人意，目前临床仍无理想的预防和治疗药物。

石墨烯量子点(Graphene Quantum Dots，GQD)是横向、纵向尺寸均在100nm以下的小尺寸石墨烯类结构。与常规石墨烯、氧化石墨烯相比，GQD水溶性极佳、比表面积大、生物低毒性、材料表面基团丰富易于修饰，且具有稳定的光致发光特性，在生物技术、生物医学工程、纳米医学、肿瘤治疗、组织工程、药物释放、生物成像和生物分子传感等方面均具有广泛应用前景。研究表明，GQD具备抗氧化、抗炎、抑制细胞凋亡等多重生物活性，但是GQD在治疗非酒精性脂肪肝疾病治疗中的应用未见报道。与此同时GQD制备方法众多，如水热法、电化学法、化学剥离法、可控合成法等，不同方法制备的GQD性质存在较大差异，如何根据具体应用选择合适GQD制备方法是难点之一。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种石墨烯量子点的制备方法及其在制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用。

为实现上述目的，第一方面本发明提供一种石墨烯量子点的制备方法，步骤如下：

称取1g碳纤维分散于400ml强酸混合溶液中，所述强酸混合溶液中，以体积计，浓硫酸：浓硝酸＝3:1；80℃下回流搅拌反应24h；冷却至室温，加水稀释；添加碳酸钠调节溶液pH至7-8，减压旋蒸，抽滤去除无机盐；所得棕黑色溶液使用3500透析袋透析约3天，即得具有良好生物相容性的石墨烯量子点溶液。

第二方面本发明提供一种石墨烯量子点在制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用，所述石墨烯量子点由上述的方法制得。

作为优选方案，所述石墨烯量子点在调控肝细胞和动物实验中肝细胞的脂质代谢中均具有重要作用，可显著抑制肝细胞脂质积累及炎症应答。

进一步地，以石墨烯量子点为活性成分制备预防、缓解和/或治疗非酒精性脂肪肝病的药物。

更进一步地，所述非酒精性脂肪肝病包括单纯性肝脏脂肪肝变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化和肝癌。

本发明提供石墨烯量子点的用途是其在制备预防、缓解和/或治疗非酒精性脂肪肝及其相关疾病的药物中的应用。发明人的研究表明石墨烯量子点在调控肝细胞的脂质代谢中具有重要作用，通过石墨烯量子点处理L02细胞，发现石墨烯量子点能够显著地抑制肝脏细胞的脂质堆积。在高脂饮食诱导的NASH模型中，石墨烯量子点能够显著抑制小鼠肝脏脂质堆积及炎症细胞浸润，减轻小鼠肝损伤。以石墨烯量子点为活性成分制备的预防、缓解和/或治疗非酒精性脂肪肝及其相关疾病的药物也属于本发明的保护范围。上述非酒精性脂肪肝及其相关疾病包括但不限于：单纯性肝脏脂肪肝变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌等。

本发明的优点及有益效果如下：

本发明所提供的以石墨烯量子点为活性成分的预防、缓解和/或治疗非酒精性脂肪肝及其相关疾病药物具有以下优点：

1、药效明显，石墨烯量子点可以显著抑制L02细胞中的脂质堆积，20μg/ml就能看到明显的变化。此外，石墨烯量子点对HFHC饮食诱导产生的肝脏脂质堆积、炎症也具有明显的改善作用。

2、石墨烯量子点不仅可以调节Fasn、Scd1脂质代谢相关基因，对Il6、Tnfα等炎症因子也具有抑制作用，表现出抗炎效果。

3、石墨烯量子点具备良好生物相容性，长期给药情况下无明显毒性。

附图说明

图1为石墨烯量子点透射电镜TEM图；

图2为石墨烯量子点光电子能谱XPS图；

图3为L02细胞活性检测结果；

图4为L02细胞油红染色结果；

图5为L02细胞脂质代谢和炎症相关基因表达量检测结果；

图6为C57BL/6小鼠NASH造模后体重变化的统计图；

图7为C57BL/6小鼠NASH造模后肝重变化的统计图；

图8为C57BL/6小鼠NASH造模后白脂重变化的统计图；

图9为C57BL/6小鼠NASH造模后肝脏H&E染色图；

图10为C57BL/6小鼠NASH造模后肝脏炎症细胞CD11b免疫荧光染色结果(白色箭头所指即为CD11b阳性细胞)；

图11为C57BL/6小鼠NASH造模后血清生化指标检ALT测结果；

图12为C57BL/6小鼠NASH造模后血清生化指标检AST测结果；

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

1实验动物及饲养

实验动物：选用8-10周龄，体重在23.5-27.5g，雄性C57BL/6小鼠为实验对象。

饲养环境：SPF级实验动物中心，SPF级小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

2实验细胞及培养

实验细胞：选用L02人肝细胞为实验对象，人肝脏细胞系L02购自中国科学院细胞库(目录号GNHu6)。L02人肝细胞系的培养：该细胞培养于DMEM高糖培养基(含10％FBS)中，于37℃，5％CO₂环境中培养。

3 qPCR测试

3.1提取RNA

每500μL细胞悬液加100μL CCl₃，摇晃30s，静置5min后12000g，4℃离心15min。取最上层上清液加入到含有300μL异丙醇的EP管里，混匀，静置10min后12000g，4℃离心10min。可看到试管底部有析出的白色RNA，用75％乙醇(DEPC水配)洗2次，每次每管加800μL75％乙醇，每次12000g，4℃离心5min。弃去上清，挥发干后每管加12μL DEPC水溶解，备用。

3.2 RNA浓度检测

在微量检测板上先加1.5μL DEPC水测空白，显示确定后再依次测样品的浓度，每次记录RNA浓度(ng/μL)。

3.3反转录

根据RNA的浓度计算所需RNA溶液的体积。2μg的RNA用于反转录及扩增。反转录体系16μL＝RNA体积(μL)+DEPC体积(12μL-RNA体积μL)+4μL 4×gDNA。于PCR仪中42℃，2min。扩增体系20μL＝反转录体系16μL+4μL 5×Hiscript，37℃，30min；85℃，5min。使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(04896866001,Roche,Basel,Switzerland)反转录试剂盒根据试剂盒说明书进行反转录实验。

4病理学检测

4.1制备石蜡标本切片

主要操作程序包括：修剪肝脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。

4.2苏木精-伊红(H&E)染色

主要步骤为：取石蜡标本切片55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→双蒸水1min→苏木精溶液5min→水洗1min→1％盐酸酒精1-3s→水洗1min→Scott液1min→水洗1min→伊红溶液3-5min→蒸馏水洗去浮色→70％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。

4.3 CD11B染色

主要步骤为：石蜡切片经烤片、脱蜡、水合、修复后，首先用10％山羊血清封闭小鼠肝脏切片，之后用一抗(Boster,BM3925)于4℃孵育过夜。之后用PBS洗涤，完成后用二抗(goat anti-rabbit IgG(H+L)cross-adsorbed secondary antibody(Thermo FisherScientific,A-11011,Massachusetts,USA))于37摄氏度孵育1h。使用DAPI染核。

【实施例1】石墨烯量子点的制备

称取1g碳纤维分散于400ml强酸混合溶液中(浓硫酸：浓硝酸＝3:1)，80℃下回流搅拌反应24h。冷却至室温，加水稀释。添加碳酸钠调节溶液pH至7-8左右，减压旋蒸，抽滤去除无机盐。所得棕黑色溶液使用3500透析袋透析约3天，即得具有良好生物相容性的石墨烯量子点溶液。图1透射电镜TEM显示所得GQD尺寸在5nm左右。图2光电子能谱(XPS)286.2eV、288.18eV处峰值证明GQD表面含有大量羧基、羟基存在。

【实施例2】石墨烯量子点对L02细胞活力的影响

L02细胞胰酶消化后计数，稀释至3W/ml，接种于96孔板中，每孔100ul，孵育3-4h。然后分别加入0ug/ml、50ug/ml、100ug/ml的GQD水溶液，继续孵育0h、24h、48h，再加CCK检测细胞活力。如图3所示，不同浓度石墨烯量子点对L02细胞活力均无显著影响，证明所制备的石墨烯量子点GQD具有良好生物相容性。

【实施例3】石墨烯量子点对L02细胞中脂肪堆积的影响

将L02细胞分为BSA组，PA/OA组，PA/OA+GQD组。待细胞贴壁后，BSA组使用0.5％BSA+生理盐水处理12h，PA/OA组使用0.2/0.4mM PA/OA+生理盐水处理12h，PA/OA+GQD组使用0.2/0.4mM PA/OA+20μg/ml GQD处理12h，最后进行油红O染色。染色结果如图4：与BSA组相比，PA/OA组均能看到明显脂质蓄积，证明造模成功；此外，PA/OA组与PA/OA+GQD组相比，经石墨烯量子点处理后红色脂肪滴的量明显降低。该结果说明，石墨烯量子点药物处理可以显著抑制L02细胞中脂质堆积。

【实施例4】石墨烯量子点预处理对L02脂质代谢及炎症相关因子的影响

将L02细胞分为BSA组，PA/OA组，PA/OA+GQD组。待细胞贴壁后，BSA组使用0.5％BSA+生理盐水处理12h，PA/OA组使用0.2/0.4mM PA/OA+生理盐水处理12h，PA/OA+GQD组使用0.2/0.4mM PA/OA+20μg/ml GQD处理12h。提取RNA、反转录、点板。上机检测Fasn、Scd1、Il6、Tnf等相关基因表达量的变化。引物信息如下：

检测结果如图5所示，L02细胞经PA/OA刺激后，炎症相关基因Il6、Tnf及脂质合成相关基因Fasn、Scd1的表达均显著上调；而在使用GQD处理后，上述基因的表达上调明显被抑制。说明GQD处理可显著抑制PA/OA刺激诱导的肝细胞脂质积累及炎症应答。

【实施例5】石墨烯量子点对小鼠肝脏中脂质堆积的影响

C57小鼠(共20只)高脂高胆固醇(HFHC)喂养8周(建立NASH模型)时分为两组(每组10只，分别为给药组和对照组)，分别腹腔注射生理盐水和石墨烯量子点(GQD：10mg/kg)(给药频率：每天一次)，继续喂养8周后取材。测定两组小鼠的肝重、白脂重量，并对小鼠肝脏进行H&E染色及CD11b免疫荧光染色，分离血清进行生化检测。

两组小鼠体重、肝重、白脂重的变化结果如图6-8所示，石墨烯量子点给药组小鼠的体重、肝重及脂肪重量与对照组相比显著下降。H&E染色结果如图9所示的，可以观察到对照组小鼠的肝细胞发生脂肪变性，空泡化且融合连成片状，肝脏细胞形态受到严重破坏，而石墨烯量子点给药组中小鼠肝细胞形态得以显著改善。肝脏组织CD11b免疫荧光染色结果如图10所示，CD11b是单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞等细胞的标志物，当小鼠给以石墨烯量子点后，小鼠肝脏组织中CD11b阳性细胞数目显著少于对照组，即给药组肝脏组织炎症浸润的情况显著降低。血清酶活检测结果如图11-12所示，石墨烯量子点组血清ALT及AST酶活均显著低于对照组，说明石墨烯量子点能够显著改善小鼠肝功能。以上结果说明石墨烯量子点对HFHC饮食诱导的非酒精性脂肪肝病具有良好的治疗效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 石墨烯量子点的制备方法及其在制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用

<150> 202010014616.X

<151> 2020-01-07

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> FASN基因(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

ctgcggaaac ttcaggaaat g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> FASN基因(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

ggttcggaat gctatccagg 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> SCD1基因(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

tcttccttat cattgccaac acca 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> SCD1基因(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

gcgttgagca ccagagtgta tcg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> IL6基因(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

tagtccttcc taccccaatt tcc 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> IL6基因(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

ttggtcctta gccactcctt c 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> TNFa基因(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

catcttctca aaattcgagt gacaa 25

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> TNFa基因(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 8

tgggagtaga caaggtacaa ccc 23

Claims

1.一种石墨烯量子点的制备方法，其特征在于：步骤如下：

2.一种石墨烯量子点在制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用，其特征在于：所述石墨烯量子点由权利要求1中的方法制得。

3.根据权利要求2所述的石墨烯量子点在制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用，其特征在于：以石墨烯量子点为活性成分制备预防、缓解和/或治疗非酒精性脂肪肝病的药物。

4.根据权利要求2或3所述的石墨烯量子点在制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用，其特征在于：所述非酒精性脂肪肝病包括单纯性肝脏脂肪肝变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化和肝癌。