CN109276567B - 7-羟基香豆素在制备治疗急性肾损伤的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了7‑羟基香豆素在制备预防或治疗急性肾损伤的药物中的应用。本发明的优点在于：本发明首次公开7‑羟基香豆素作为治疗急性肾损伤的药物中的用途，7‑羟基香豆素可有效减轻急性肾损伤，保护肾功能，其作用机制与7‑羟基香豆素降低炎症因子水平和促进肾小管细胞增殖有关，应用前景广泛，也为急性肾损伤的治疗提供了更多的药物选择。
Description
技术领域
本发明属于制药领域，更具体涉及7-羟基香豆素在制备治疗急性肾损伤的药物中的新应用。
背景技术
急性肾损伤(Acute Kidney Injury，AKI)是临床常见危重疾病，可导致肾脏不完全修复、持续慢性炎症和进展性纤维化，是引起继发性慢性肾脏病、肾衰竭及住院患者死亡的重要原因。迄今为止AKI尚无任何有效治疗措施，因此，寻找可以减轻组织损伤、促进修复、防止慢性纤维化发生的肾脏保护药物具有重要意义。
7-羟基香豆素(7-hydroxycoumarin，7-HC)，又称伞形酮，属于多酚类，分子式为C9H6O3，化学结构式如下：
存在于金苹果、胡萝卜、香菜、当归和山柳兰等植物的果实和根系中。大量的研究表明，7-羟基香豆素具有抗炎抗氧化和免疫调节的生物活性，在治疗糖尿病和抗肿瘤方面具有显著效果，其中抗肿瘤活性是目前国内外研究的热点之一，但尚未报道其用作治疗急性肾损伤的药物的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供7-羟基香豆素在制备治疗急性肾损伤的药物中的用途。。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
一方面，提供7-羟基香豆素在制备预防或治疗急性肾损伤的药物中的应用。
另一方面，提供7-羟基香豆素在制备预防或治疗由急性肾损伤导致的疾病的药物中的应用。
优选地，所述药物7-羟基香豆素的给药浓度为30-90mg/kg。
优选地，所述药物的剂型为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明首次公开7-羟基香豆素作为治疗急性肾损伤的药物中的用途，7-羟基香豆素(7-HC)对顺铂诱发肾小管上皮细胞损伤具有保护和促进增殖的作用，对顺铂诱导肾小管上皮细胞炎症因子具有抑制作用，降低顺铂诱导急性肾损伤模型中血肌酐和血尿素氮的水平，对顺铂诱导急性肾损伤模型中炎症具有抑制作用，对顺铂诱导急性肾损伤模型中肾小管上皮细胞增殖能力具有促进作用，总之，可有效降低急性肾损伤所引起的炎症反应，同时促进肾小管上皮细胞的增殖作用，进而发挥肾脏保护作用，因此，可有效减轻急性肾损伤，保护肾功能，其作用机制与7-羟基香豆素降低炎症因子水平和促进肾小管细胞增殖有关，应用前景广泛，也为急性肾损伤的治疗提供了更多的药物选择。
附图说明
图1为体外实验中7-羟基香豆素(7-HC)对顺铂(Cisplatin)诱发肾小管上皮细胞损伤的影响图，其中图1A为细胞存活率图，图1B为KIM-1蛋白表达图，图1C为KIM-1蛋白的半定量分析图；
图2为体外实验中7-羟基香豆素(7-HC)对顺铂(Cisplatin)诱导肾小管上皮细胞炎症因子的影响，其中图2A为TNF-αmRNA的表达图，图2B为IL-6mRNA的表达图；
图3为体外实验中7-羟基香豆素(7-HC)对顺铂(Cisplatin)诱导的损伤肾小管上皮细胞的增殖能力的影响，其中图3A为细胞存活率图，图3B为c-Myc和cyclin D1蛋白表达图，图3C为c-Myc蛋白的半定量分析图，图3D为cyclin D1蛋白的半定量分析图；
图4为7-羟基香豆素(7-HC)对小鼠急性肾损伤模型中血肌酐和尿素氮水平的影响，其中图4A为肌酐的含量图，图4B为尿素氮的含量图，图4C为KIM-1蛋白的半定量分析图，图4D为KIM-1蛋白的半定量分析图；
图5为7-羟基香豆素(7-HC)对小鼠急性肾损伤模型中炎症因子水平的影响，其中图5A为TNF-α蛋白的半定量分析图，图5B为MCP-1蛋白的半定量分析图；
图6为7-羟基香豆素(7-HC)对鼠急性肾损伤模型中肾小管上皮细胞的增殖的影响，其中图6A为c-Myc和cyclin D1蛋白表达图，图6B为c-Myc蛋白的半定量分析图，图6C为cyclin D1蛋白的半定量分析图；
注：与对照组(NC)比较：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；与模型组(Cis)比较：#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例中所使用的Western Blot法、提RNA、逆转录、扩增等方法均为常规试验方法。
耗材：7-羟基香豆素购于上海源叶生物科技有限公司(中国，批号Z21A7Y13447)；顺铂购于美国Sigma Aldrich公司(美国，批号479306)；肌酐测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所(中国，批号20171212)；尿素氮测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所(中国，批号20180425)；KIM-1一抗购于Santa Cruz Biotechnology(美国，批号sc-518008)；β-actin一抗购于Santa Cruz Biotechnology公司(美国，批号sc-69879)；cyclin D1一抗购于Santa Cruz Biotechnology公司(美国，批号sc-8396)；cMyc一抗购于Santa CruzBiotechnology公司(美国，批号sc-40)。
细胞：人肾小管上皮细胞(HK-2)，购于美国模式菌种收集中心(ATCC)。
小鼠：C57BL/6小鼠，购于安徽医科大学实验动物中心。
Western Blot具体步骤：配胶-上样-电泳(80V，30min；120V，55min)-200mA转膜(根据蛋白分子量确定即分子量多大转膜多少分钟)-封闭3小时(5％脱脂奶粉的TBST)-洗膜(15min每次，3次)-孵育一抗36小时(根据抗体说明书配置)-洗膜(15min每次，3次)-孵育二抗1小时(根据抗体说明书配置)-洗膜(15min每次，3次)-显影。
Real time-PCR程序：95℃-30s(Cycle 1)；95℃-5s，60℃-30s(Cycle 40)。
英汉对照一览表
| KIM-1 | 肾损伤分子 |
| 7-hydroxycoumarin(7-HC) | 7-羟基香豆素 |
| HK-2 | 人肾近曲小管上皮细胞 |
| Cisplatin(Cis) | 顺铂 |
| Cyclin D1 | 细胞周期蛋白D1 |
| Creatinine | 肌酸酐 |
| Blood urea nitrogen，BUN | 尿素氮 |
| TNF-α | 肿瘤坏死因子-α |
| MCP-1 | 单核细胞趋化蛋白-1 |
实施例1：体外实验中7-羟基香豆素(7-HC)对顺铂(Cisplatin)诱发肾小管上皮细胞损伤的保护作用
MTT法：将购于美国模式菌种收集中心(ATCC)的人肾小管上皮细胞(HK2)细胞接种于96孔板中，接种密度约为4000个细胞/孔。培养24h，换用无血清培养基饥饿12小时后，分为8组分别为对照组(NC)、模型组(Cisplatin)和6个7-羟基香豆素梯度剂量治疗组(Cisplatin+7-HC)，在模型组中添加20μM Cisplatin，在6个7-羟基香豆素梯度剂量治疗组中分别添加20μM Cisplatin+2.5μM 7-HC、20μM Cisplatin+5μM 7-HC、20μM Cisplatin+10μM 7-HC、20μM Cisplatin+20μM 7-HC、20μM Cisplatin+40μM 7-HC、20μM Cisplatin+80μM7-HC，继续培养24h。培养结束后每孔加入5g·L-1的MTT溶液20μL，继续培育4h。吸去培养基，每孔加入150μL的DMSO，振荡，混匀。用酶标仪在492nm处测定各孔OD值，记录结果。以细胞存活率(Cell viability)对剂量作图(图1A)。
细胞存活率计算公式：细胞存活率＝(梯度剂量治疗组细胞OD值-对照组细胞OD值)/(模型组细胞OD值-对照组细胞OD值)×100％。
Western Blot：将对数生长期的HK2细胞接种于6孔板中，接种密度约为1.0×105个细胞/ml，分别分为对照组(NC)、模型组(Cisplatin)和3个7-羟基香豆素梯度剂量治疗组(Cisplatin+7-HC)，在模型组中添加20μM Cisplatin，在3个7-羟基香豆素梯度剂量治疗组中分别添加20μM Cisplatin+20μM 7-HC(低剂量组)、20μM Cisplatin+40μM 7-HC(中剂量组)、20μM Cisplatin+80μM 7-HC(高剂量组)，每组重复3-4次实验，继续培养24小时，PBS洗三遍，收集细胞，提取总蛋白，通过Western Blot法检测肾损伤分子1(KIM-1)的蛋白表达(图1B)，并进行半定量分析(图1C)。
从图1A可以看出，即MTT结果显示顺铂刺激的HK2细胞经过由低剂量到高剂量梯度剂量的7-羟基香豆素处理后，该细胞的相对存活率值显著增加；图1B的Western Blot及图1C的半定量分析结果表明顺铂刺激的HK2细胞经过7-羟基香豆素处理后，肾损伤分子KIM-1的蛋白表达水平明显受到抑制，证明7-羟基香豆素对顺铂引起肾小管上皮细胞损伤起保护作用。
实施例2：体外实验中7-羟基香豆素对顺铂诱导肾小管上皮细胞炎症因子(TNF-α和IL-6)的抑制作用
将HK2细胞接种于12孔板中，接种密度约为0.5×105个细胞/孔，分别分为对照组(NC)、模型组(Cisplatin)和3个7-羟基香豆素梯度剂量治疗组(Cisplatin+7-HC)，每组重复3-4次实验，孵育24小时用无血清培养基饥饿12小时，然后在模型组中添加20μMCisplatin，在3个7-羟基香豆素梯度剂量治疗组中分别添加20μM Cisplatin+20μM 7-HC(低剂量组)、20μM Cisplatin+40μM 7-HC(中剂量组)、20μM Cisplatin+80μM 7-HC(高剂量组)，继续培养24小时，PBS洗三遍，收集细胞，提RNA，逆转录成cDNA，扩增。
对逆转录而成的cDNA进行Real time PCR检测肿瘤坏死因子(TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达水平，结果如图2A(TNF-α)和图2B(MCP-1)所示。从图2中可以看出，顺铂明显诱导肾小管上皮细胞中TNF-αmRNA水平的升高，而7-羟基香豆素处理组TNF-αmRNA表达明显被抑制，另一炎症因子MCP-1 mRNA结果显示肾小管上皮细胞受到顺铂刺激后经7-羟基香豆素处理，其MCP-1 mRNA表达明显下降，提示7-羟基香豆素可显著抑制顺铂诱发的炎症反应。
实施例3：体外实验中7-羟基香豆素对顺铂诱导损伤肾小管上皮细胞具有促进增殖作用
MTT法：将人肾小管上皮细胞(HK2)细胞接种于96孔板中，接种密度约为4000个细胞/孔。培养24h，换用无血清培养基饥饿12小时后，分为对照组(NC)和7个7-羟基香豆素梯度剂量治疗组(7-HC)，在7个7-羟基香豆素梯度剂量治疗组中分别添加1.25μM 7-HC、2.5μM7-HC、5μM 7-HC、10μM 7-HC、20μM 7-HC、40μM 7-HC、80μM 7-HC，继续培养24h。培养结束后每孔加入5g·L-1的MTT溶液20μL，继续培育4h。吸去培养基，每孔加入150μL的DMSO，振荡，混匀。用酶标仪在492nm处测定各孔OD值，记录结果。以细胞存活率(Cell viability)对剂量作图(图3A)。
细胞存活率计算公式：细胞存活率＝梯度剂量治疗组细胞OD值/对照组细胞OD值×100％。
Western Blot：将对数生长期的HK2细胞接种于6孔板中，接种密度约为1.0×105个细胞/ml，分别分为对照组(NC)、模型组(Cisplatin)和3个7-羟基香豆素梯度剂量治疗组(Cisplatin+7-HC)，在模型组中添加20μM Cisplatin，在3个7-羟基香豆素梯度剂量治疗组中分别添加20μM Cisplatin+20μM 7-HC(低剂量组)、20μM Cisplatin+40μM 7-HC(中剂量组)、20μM Cisplatin+80μM 7-HC(高剂量组)，每组重复3-4次实验，继续培养24小时，PBS洗三遍，收集细胞，提取总蛋白，通过Western Blot法检测增殖相关蛋白c-Myc和cyclin D1表达水平的变化(图3B)，并对c-Myc和cyclin D1进行半定量分析(图3C-D)。
从图3A可以看出，即MTT结果显示正常HK2细胞经过由低剂量到高剂量梯度剂量的7-羟基香豆素处理后，该细胞的相对存活率值逐渐显著增加，证明7-羟基香豆素对肾小管上皮细胞的增殖起促进作用；图3B的Western Blot及图3C-D的半定量分析结果表明顺铂刺激的HK2细胞经过7-羟基香豆素处理后，增殖相关蛋白c-Myc和cyclin D1表达水平呈剂量依赖性明显上升，证明7-羟基香豆素对顺铂诱导的损伤肾小管上皮细胞具有促进增殖的作用。
实施例4：7-羟基香豆素降低顺铂诱导急性肾损伤模型中血肌酐(Creatinine)和血尿素氮(BUN)的水平
将6-8周龄C57BL/6小鼠(购于安徽医科大学实验动物中心)适应性饲养1周，分为对照组(NC)、模型组(Cisplatin)、7-羟基香豆素低剂量组(Cisplatin+7-HC 30mg/kg)、中剂量组(Cisplatin+7-HC 60mg/kg)、高剂量组(Cisplatin+7-HC 90mg/kg)，每组6-10只。对模型组和7-羟基香豆素低、中、高剂量组小鼠腹腔注射20mg/kg顺铂建立急性肾损伤模型，并对7-羟基香豆素低、中、高剂量组小鼠分别腹腔注射30mg/kg、60mg/kg和90mg/kg7-羟基香豆素，培养3天。
3天后麻醉状态下收取小鼠血清样本及肾组织，并根据血肌酐和尿素氮试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书检测动物模型血清中肌酐和尿素氮的含量，结果如图4A-B所示。
肌酐测试
肌酐含量(μmol/L)＝[(测定A2-K*测定A1)-(空白A2-K*空白A1)]/[(标准A2-K*标准A1)-(空白A2-K*空白)]*标准品浓度(442μmol/L)
注：稀释因子K＝(加样量+酶溶液A体积)/(加样量+酶溶液A体积+酶溶液B体积)＝186/246
尿素氮测试
尿素氮含量(mmol/L)＝(测定OD值-空白测定值)/(标准OD值-空白OD值)*标准浓度(10mmol/L)*样本测试前稀释倍数
图4A为肌酐含量变化图，显示顺铂诱导模型组中血肌酐含量明显升高，肾功能恶化，而不同浓度的7-羟基香豆素有效降低模型组血肌酐水平，图4B为尿素氮含量变化图，同样显示不同浓度的7-羟基香豆素有效降低模型组尿素氮水平，进一步证实7-羟基香豆素对急性肾损伤时肾功能具有保护作用。图4C的Western Blot及图4D的半定量分析结果表明顺铂诱导的模型组经过不同浓度7-羟基香豆素处理后，肾损伤分子KIM-1的蛋白表达水平明显受到抑制，同样证实7-羟基香豆素对急性肾损伤时肾功能具有保护作用。
实施例5：7-羟基香豆素对顺铂诱导急性肾损伤模型中炎症的抑制作用
将6-8周龄C57BL/6小鼠适应性饲养1周，分为对照组(NC)、模型组(Cisplatin)、7-羟基香豆素低剂量组(Cisplatin+7-HC 30mg/kg)、中剂量组(Cisplatin+7-HC 60mg/kg)、高剂量组(Cisplatin+7-HC 90mg/kg)，每组6-10只。对模型组和7-羟基香豆素低、中、高剂量组小鼠腹腔注射20mg/kg顺铂建立急性肾损伤模型，并对7-羟基香豆素低、中、高剂量组小鼠分别腹腔注射30mg/kg、60mg/kg和90mg/kg7-羟基香豆素，培养3天。3天后麻醉状态下收取小鼠血样及肾组织，提取组织RNA，逆转录，扩增。
对逆转录而成的cDNA进行Real-time PCR检测炎症因子TNF-α和MCP-1的表达水平，结果如图5A(TNF-α)和图5B(MCP-1)所示。从图5中可以看出，急性肾损伤模型中炎症因子TNF-αmRNA水平显著上升，而7-羟基香豆素可明显降低炎症因子水平，改善炎症，另一炎症因子MCP-1 mRNA结果同样显示，7-羟基香豆素可降低顺铂引起的模型组肾脏MCP-1 mRNA高表达，这可能是7-羟基香豆素保护急性肾损伤的作用机制之一。
实施例6：7-羟基香豆素对顺铂诱导急性肾损伤模型中肾小管上皮细胞增殖能力的促进作用
将6-8周龄C57BL/6小鼠适应性饲养1周，分为对照组(NC)、模型组(Cisplatin)、7-羟基香豆素低剂量组(Cisplatin+7-HC 30mg/kg)、中剂量组(Cisplatin+7-HC 60mg/kg)、高剂量组(Cisplatin+7-HC 90mg/kg)，每组6-10只。对模型组和7-羟基香豆素低、中、高剂量组小鼠腹腔注射20mg/kg顺铂建立急性肾损伤模型，并对7-羟基香豆素低、中、高剂量组小鼠分别腹腔注射30mg/kg、60mg/kg和90mg/kg7-羟基香豆素，培养3天。3天后麻醉状态下收取小鼠血样及肾组织，提取组织蛋白。通过Western Blot法检测增殖相关蛋白c-Myc和cyclin D1表达水平的变化(图6A)，并对c-Myc和cyclin D1进行半定量分析(图6B-C)。
从图6A可以看出，即Western Blot结果表明小鼠急性肾损伤模型中，增殖相关蛋白c-Myc和cyclin D1表达水平明显下降；从图6B和图6C可以看出，即半定量分析结果显示经过梯度浓度的7-羟基香豆素治疗后，增殖相关蛋白c-Myc和cyclin D1呈剂量依赖性明显上升，证明7-羟基香豆素对顺铂诱导的小鼠急性肾损伤模型具有促进细胞增殖的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.7-羟基香豆素在制备预防或治疗急性肾损伤的药物中的应用。
2.7-羟基香豆素在制备预防或治疗由急性肾损伤导致的疾病的药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
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