CN111184716B - 普乐沙福在制备预防或治疗gsdmd蛋白相关疾病药物中的应用 - Google Patents

普乐沙福在制备预防或治疗gsdmd蛋白相关疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，尤其是普乐沙福在制备治疗GSDMD蛋白相关疾病的药物中的新应用。本发明采用MST技术检测普乐沙福与人GSDMD蛋白的亲和力，通过药效试验评价普乐沙福对人、鼠巨噬细胞死亡率和IL‑1β炎症因子分泌量的影响以及对小鼠EAE和小鼠sepsis的防治作用，结果表明，普乐沙福可显著降低人、鼠巨噬细胞的死亡率，并减少IL‑1β炎症因子的分泌，普乐沙福与人GSDMD蛋白有极强的结合力，同时可显著缓解小鼠EAE症状及提高sepsis模型小鼠存活率，表明普乐沙福是以人GSDMD蛋白为靶点的药物，通过阻止细胞焦亡和炎性因子的释放，缓解MS与sepsis的症状，可以作为预防或治疗MS、sepsis及其他自身免疫性疾病和感染性炎症性疾病的新的药物选择，具有广阔的开发应用价值。

Description

普乐沙福在制备预防或治疗GSDMD蛋白相关疾病药物中的 应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及普乐沙福在制备预防或治疗GSDMD蛋白相关疾病药物中的应用。
背景技术
Gasdermin D蛋白(GSDMD)属于gasdermin蛋白家族，该家族还包括GSDMA，GSDMB，GSDME，DFNB59等成员。在通常情况下，N端和C端结构域紧密地相互作用，使得GSDMD处于无活性自抑制状态，在被炎性caspase切割后GSDMD-N端可以引起细胞焦亡，细胞焦亡本质上是一种程序性细胞坏死，GSDMD-N端寡聚化在细胞膜上形成孔洞，细胞迅速膨胀破裂，最终导致大量细胞内容物释放，并引起强烈的炎症反应。因此，GSDMD蛋白在多种免疫性疾病包括多发性硬化症中具有致病性，同时多种感染性炎症性疾病包括内毒素诱导的脓毒症也是由GSDMD蛋白引发的细胞焦亡所导致的。
神经免疫性疾病是一类以免疫细胞浸润为特征，机体免疫系统对自体神经系统发生异常免疫应答而造成的神经炎症性损伤；在神经免疫性疾病中，炎性细胞大量浸润活化，导致炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、ROS等过量释放，从而造成神经元及轴索的炎症性损伤；大量临床研究和动物实验表明，神经免疫性疾病与多种急慢性神经疾病如多发性硬化、视神经脊髓炎和自身免疫性脑病、阿尔兹海默病和帕金森病等的发生发展有密切联系。
多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫病，多发于中青年，目前在我国的发病率逐年提高。自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)与多发性硬化、视神经脊髓炎等神经炎性疾病在临床表现、免疫和病理方面非常相似，是目前国际公认的神经自身免疫性疾病的一种理想动物模型。目前MS的治疗主要是基于疾病的自身免疫性及EAE动物模型的实验来进行，在MS的急性发作期，通常以糖皮质激素冲击为一线治疗方法，对激素类药物不敏感的患者常采取二线的血浆置换及干细胞移植疗法，然而激素类药物副作用大，且对于急性期患者应用激素是否能减轻疾病的远期功能障碍尚不明确，干细胞移植也存在复发率高及移植死亡率高的弊端；目前FDA批准用于治疗MS的药品或试剂有芬戈莫德、干扰素β-1a、干扰素β-1、格拉莫醋酸盐和那他珠单抗等，但这些MS疗法存在价格高昂，长期使用疗效降低、在许多情况下有明显副作用，常常导致感染等缺陷；因此，现有的MS疗法远未达到生物医学所需。
脓毒症(Sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征，其是严重创伤、烧伤、休克、感染等急危重症患者常见并发症之一，目前仍是ICU病房患者死亡的第一大原因。脓毒症一般分为两阶段：疾病初期由于机体过度的炎症反应造成自身组织损伤，晚期免疫系统受到抑制，淋巴细胞大量凋亡导致机体免疫功能受损；近年来，随着医学技术的不断发展，脓毒症患者的初期生存率略有提高，但由于脓毒症复杂的发病机制，目前尚无明确有效的药物用于该病的临床治疗，致使其总体死亡率及晚期预后仍未得到明显的改善。
普乐沙福(Plerixafor)是一种免疫刺激剂，用于提升血液中的造血干细胞，目前主要在非霍奇金淋巴瘤(NHL)和多发性骨髓瘤(MM)患者自体造血干细胞移植时与粒细胞刺激因子(G-CSF)或粒单核细胞刺激因子(GM-CSF)联合使用，使造血干细胞增殖并释放入外周血中，以治疗自体干细胞移植后的非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤。但未见在预防和治疗感染性炎症疾病和自身免疫性疾病药物中的用途报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供普乐沙福在预防或治疗GSDMD蛋白相关疾病药物中的新应用。
为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：本发明提供了普乐沙福在制备预防或治疗GSDMD蛋白相关疾病药物中的应用，GSDMD蛋白相关疾病包括感染性炎症性疾病和免疫性疾病，其中感染性炎症性疾病包括脓毒症、革兰氏阴性菌感染性疾病，免疫性疾病包括包括多发性硬化症、格林巴利综合征、系统性红斑性狼疮和类风湿关节炎，普乐沙福通过与GSDMD直接结合抑制细胞焦亡并减少免疫细胞的死亡和炎性因子的释放以实现药物的功效。
本试验表明，普乐沙福与人GSDMD有极强的结合力，其是一种以GSDMD蛋白为靶点的药物，与对照组相比，普乐沙福给药组可推迟EAE模型小鼠发病时间并降低临床评分，同时可显著降低EAE模型小鼠的发病率，表明普乐沙福可以预防和治疗GSDMD蛋白引发的多发性硬化症；此外，与对照组相比，普乐沙福给药组可提高sepsis小鼠存活率及单核细胞数，表明普乐沙福可以预防和治疗GSDMD蛋白引发的小鼠脓毒症。
本发明还提供了一种预防或治疗GSDMD蛋白相关疾病的药物，其包括普乐沙福或普乐沙福药学上可接受的盐。
进一步地，所述普乐沙福药学上可接受的盐为普乐沙福与生物素形成的盐。
进一步地，所述药物的剂型为注射剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供了普乐沙福在制备预防或治疗GSDMD蛋白相关疾病药物中的新应用，本发明采用MST技术检测普乐沙福与人GSDMD蛋白的亲和力，通过药效试验评价了普乐沙福对人、鼠巨噬细胞死亡率和IL-1β炎症因子分泌量的影响以及对小鼠EAE模型和小鼠sepsis模型的防治作用，结果表明，普乐沙福可显著降低人、鼠巨噬细胞的死亡率，并减少了IL-1β炎症因子的分泌，普乐沙福与人GSDMD蛋白有极强的结合力，是一种以人GSDMD蛋白为靶点的药物，其通过与GSDMD直接结合抑制细胞焦亡并减少免疫细胞的死亡和炎性因子的释放，对EAE模型小鼠给药处理，普乐沙福可显著降低小鼠临床评分和发病率，对sepsis模型小鼠给药处理，普乐沙福可明显提高小鼠存活率，小鼠外周血中的单核细胞数也显著提升，从而普乐沙福可缓解MS与sepsis的症状，在调控MS和sepsis病理中具有关键的作用，可以作为预防或治疗MS和sepsis的药物，对今后MS和sepsis的预防和治疗或其他自身免疫性疾病和感染性炎症性疾病提供一种新的药物选择，具有广阔的开发应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例1的永生化小鼠骨髓来源巨噬细胞(iBMDMs)乳酸脱氢酶(LDH)释放及细胞上清IL-1β含量结果图，其中：A为iBMDMs释放LDH的统计图，B为iBMDMs上清中IL-1β含量结果图，横坐标UN、LPS、LPS+ATP、5uM组、25uM和100uM分别指代UN组、LPS组、LPS+ATP组、普乐沙福5uM组、普乐沙福25uM组和普乐沙福100uM组，****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01；
图2是实施例2的人单核巨噬细胞系(THP-1)LDH释放统计图，其中：横坐标UN、LPS、LPS+ATP、5uM组、25uM和100uM分别指代UN组、LPS组、LPS+ATP组、普乐沙福5uM组、普乐沙福25uM组和普乐沙福100uM组，****p<0.0001；
图3是实施例3的小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)LDH释放统计图，其中：横坐标UN、LPS、LPS+ATP、1uM组、2uM和10M分别指代UN组、LPS组、LPS+ATP组、普乐沙福1uM组、普乐沙福2uM组和普乐沙福10uM组，*p<0.05，****p<0.0001；
图4是实施例4的利用MST法检测普乐沙福与人GSDMD蛋白的亲和力结果图；
图5是实施例5的普乐沙福对小鼠EAE的防治作用分析结果图，其中：A为构建小鼠EAE模型后，在小鼠发病(免疫后第14天)时开始给药，治疗对照组(Control1)与治疗普乐沙福给药组(Treated1)小鼠的临床评分统计图，B为构建小鼠EAE模型后，在免疫后第5天开始给药，预防对照组(Control2)与预防普乐沙福给药组(Treated2)小鼠的临床评分统计图，C为在免疫后第5天开始给药的EAE模型小鼠对照组(预防对照组)小鼠发病率统计图，D为在免疫后第5天开始给药的EAE模型小鼠给药组(预防普乐沙福给药组)小鼠发病率统计图；
图6是实施例6的普乐沙福对小鼠sepsis的防治作用分析结果图，其中：A为LPS诱导小鼠sepsis模型后，对照组(Control)和普乐沙福给药组(Treated)的小鼠存活曲线；B为LPS诱导小鼠sepsis模型后，对照组(Control)和普乐沙福给药组(Treated)小鼠外周血中单核细胞数统计图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
一、实验材料
1.1、实验所用细胞来源
永生化小鼠骨髓来源巨噬细胞(iBMDMs)由华中科技大学王晨辉课题组提供，培养条件为：使用含10％FBS(Biological Industries)的DMEM培养基(Gibco)，在37℃下5％CO2孵箱(Thermo)培养；
人外周血单核巨噬细胞系(THP-1)来自American Type Culture Collection，培养条件为：使用含10％FBS的RPMI培养基，在37℃下5％CO2孵箱(Thermo)培养；
小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)的制备方法见文献(Yan et al.,2013,Immunity)，培养条件为：使用含有20％L929细胞(小鼠成纤维细胞)培养上清的DMEM培养基(Gibco)，在37℃下5％CO2孵箱(Thermo)培养。
1.2、主要试剂
普乐沙福(Plerixafor)，购自上海陶素生化科技有限公司，形状：干粉，保存条件：-20℃；
细菌脂多糖(LPS)，购自Invivogen公司，形状：干粉，保存条件：-20℃；
腺苷5'-三磷酸二钠盐水合物(ATP)，购自Sigma-Aldrich公司，形状：干粉，保存条件：-20℃；
完全弗氏佐剂购自Sigma-Aldrich，灭活结核杆菌(H37Ra,5mg/ml)购自BDDiagnostics，MOG35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)购自南京肽业生物科技有限公司；
百日咳毒素(PT)购自Sigma-Aldrich公司，保存条件：-20℃；
细菌脂多糖(LPS)购自Invitrogen公司；
佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)购自Sigma-Aldrich公司，形状：粉状，保存条件：-20℃；
人GSDMD重组蛋白购自OriGene公司；
含有10％FBS的DMEM培养基、含有10％FBS的RMPI培养基、含有20％L929细胞(小鼠成纤维细胞)培养上清的DMEM培养基均购自ThermoFisher公司；
Monolith His-Tag Labeling kit(MO-L018，NanoTemper)试剂盒购自Nanotemper公司；细胞毒性检测试剂盒(Cytotoxicity detection kit(LDH)，购自Roche公司)；小鼠IL-1βELISA试剂盒购自福麦斯公司；
1.3、主要仪器及设备
分子相互作用仪Monolith nt.115，NanoTemper公司；流式细胞分析仪C6，BD公司。
1.4、实验动物
C57BL/6小鼠为8-10周龄60只，体重：18-20g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，饲养于南京鼓楼医院动物实验中心SPF级实验室，小鼠饲养温度20-25℃，相对湿度50％-60％，可自由索食和饮水；
二、实验内容及结果
实施例1：普乐沙福可降低永生化小鼠骨髓来源巨噬细胞的细胞毒性及IL-1β分泌
1.1)细胞培养
使用含有10％FBS的DMEM培养基培养永生化小鼠骨髓来源巨噬细胞(iBMDMs)
1.2)iBMDMs分组及处理
第一天，将细胞分种到96孔板上，每孔5*104个细胞；
第二天，将96孔板的iBMDMs随机分为UN组(对照组)、LPS组、LPS+ATP组、普乐沙福5uM组、普乐沙福25uM组及普乐沙福100uM组，每组6个复孔，每孔5*104个细胞，对各孔的iBMDMs离心去上清，然后对UN组加入不含LPS的含10％FBS的DMEM培养基，其余五组加入含LPS(100ng/ml)的含10％FBS的DMEM培养基，在5％CO2孵箱中37℃下培养三小时后，对各组iBMDMs进行如下处理：
UN组：每孔加入20ul的含10％FBS的DMEM培养基，在5％CO2孵箱中37℃下培养一小时；
LPS组：每孔加入20ul的含10％FBS的DMEM培养基，在5％CO2孵箱中37℃下培养一小时；
LPS+ATP组：每孔加入20ul的含10％FBS的DMEM培养基，在5％CO2孵箱中37℃下培养半小时后加入ATP至ATP终浓度为2.5uM，再继续培养半小时；
普乐沙福5uM组：每孔加入含plerixafor的含10％FBS的DMEM培养基(plerixafor在培养基中的终浓度为5uM)在5％CO2孵箱中37℃下培养半小时，然后加入ATP(ATP在培养基中的终浓度为2.5uM)继续培养半小时；
普乐沙福25uM组：每孔加入含plerixafor的含10％FBS的DMEM培养基(plerixafor在培养基中的终浓度为25uM)在5％CO2孵箱中37℃下培养半小时，然后加入ATP(ATP在培养基中的终浓度为2.5uM)继续培养半小时；
普乐沙福100uM组：每孔加入含plerixafor的含10％FBS的DMEM培养基(plerixafor在培养基中的终浓度为100uM)在5％CO2孵箱中37℃下培养半小时，然后加入ATP(ATP在培养基中的终浓度为2.5uM)继续培养半小时；
1.3)各组iBMDMs细胞毒性及IL-1β分泌量检测
对1.2)处理后的iBMDMs细胞离心并收集细胞上清液(iBMDMs-SN)，然后将各孔iBMDMs-SN分别加入新的96孔板对应的孔中，对各孔iBMDMs-SN分别采用CytotoxicityDetection Kit试剂盒按照说明书进行乳酸脱氢酶(LDH)含量检测，采用小鼠IL-1βELISA试剂盒按照说明书进行IL-1β含量检测，使用软件GraphPad Prism 7.0对检测数据统计分析。
1.4)实验结果
图1为各组iBMDMs细胞毒性及IL-1β分泌量检测结果，如图1A所示，普乐沙福给药组(普乐沙福5uM组、普乐沙福25uM组、普乐沙福100uM组)呈剂量依赖性降低小鼠永生化骨髓来源巨噬细胞LDH释放量，且普乐沙福25uM组和普乐沙福100uM组与LPS+ATP组均有统计学差异；如图1B所示，普乐沙福给药组(普乐沙福5uM组、普乐沙福25uM组、普乐沙福100uM组)呈剂量依赖性显著降低小鼠永生化骨髓来源巨噬细胞IL-1β分泌量。
实施例2：普乐沙福可降低人单核巨噬细胞系细胞毒性
2.1)细胞培养
使用含有10％FBS的RPMI培养基(Gibco公司)培养人单核巨噬细胞系(THP-1)。
2.2)THP-1分组及处理
第一天，将细胞分到96孔板上，每孔5*104个细胞
第二天，将96孔板的THP-1随机分为UN组(对照组)、LPS组、LPS+ATP组、普乐沙福5uM组、普乐沙福25uM组及普乐沙福100uM组，每组6个复孔，每孔5*104个细胞，对每孔加入佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)至PMA终浓度为100nM，以刺激各孔细胞分化贴壁，在分化处理4小时后去上清，然后对UN组加入不含LPS的含10％FBS的RPMI培养基，其余五组加入含LPS(100ng/ml)的含10％FBS的RPMI培养基，在5％CO2孵箱中37℃下培养三小时后，对各组THP-1进行如下处理：
UN组：每孔加入20ul的含10％FBS的RPMI培养基，在37℃的5％CO2孵箱中培养一小时；
LPS组：每孔加入20ul的含10％FBS的RPMI培养基，在37℃的5％CO2孵箱中培养一小时；
LPS+ATP组：每孔加入20ul的含10％FBS的RPMI培养基，在37℃的5％CO2孵箱中培养半小时后加入ATP至ATP终浓度为2.5uM，再处理半小时；
普乐沙福5uM组：每孔加入含plerixafor的含10％FBS的DMEM培养基(plerixafor在培养基中的终浓度为5uM)在5％CO2孵箱中37℃下培养半小时，然后加入ATP(ATP在培养基中的终浓度为2.5uM)继续培养半小时；
普乐沙福25uM组：每孔加入含plerixafor的含10％FBS的DMEM培养基(plerixafor在培养基中的终浓度为25uM)在5％CO2孵箱中37℃下培养半小时，然后加入ATP(ATP在培养基中的终浓度为2.5uM)继续培养半小时；
普乐沙福100uM组：每孔加入含plerixafor的含10％FBS的DMEM培养基(plerixafor在培养基中的终浓度为100uM)在5％CO2孵箱中37℃下培养半小时，然后加入ATP(ATP在培养基中的终浓度为2.5uM)继续培养半小时；
2.3)各组THP-1细胞毒性检测
对2.2)处理后的THP-1细胞离心并收集细胞上清液(THP-1-SN)，然后将各孔THP-1-SN分别加入新的96孔板对应的孔中，对各孔THP-1-SN分别采用Cytotoxicity DetectionKit试剂盒按照说明书进行乳酸脱氢酶(LDH)含量检测，使用软件GraphPad Prism 7.0对检测数据统计分析。
2.4)实验结果
图2为THP-1细胞毒性检测结果，普乐沙福给药组(普乐沙福5uM组、普乐沙福25uM组、普乐沙福100uM组)呈剂量依赖性降低人外周血单核细胞系LDH释放量，且普乐沙福100uM组与LPS+ATP组有显著统计学差异(****p<0.0001)。
实施例3：普乐沙福可降低小鼠骨髓来源巨噬细胞的细胞毒性
3.1)细胞培养
使用含有20％L929细胞(小鼠成纤维细胞)培养上清的DMEM培养基培养小鼠骨髓分化巨噬细胞(BMDMs)，培养条件为：第一天，取出小鼠股骨骨髓，使用含20％L929细胞培养上清的DMEM培养基培养分化4天；第五天，将BMDMs细胞分种到96孔板上，每孔5*104个细胞，并将培养基替换为含10％FBS的DMEM培养基继续培养；
3.2)BMDMs分组及处理
步骤3.1)细胞培养第六天，将3.1)中96孔板的BMDMs随机分为UN组、LPS组、LPS+ATP组、普乐沙福1uM组、普乐沙福2uM组及普乐沙福10uM组，每组6个复孔，每孔5*104个细胞，对各孔的BMDMs去上清，然后对UN组加入不含LPS的含10％FBS的DMEM培养基，其余五组加入含LPS(100ng/ml)的含10％FBS的DMEM培养基，在37℃的5％CO2孵箱中培养三小时后，对各组BMDMs进行如下处理：
UN组：每孔加入20ul的含10％FBS的DMEM培养基，在37℃的5％CO2孵箱培养一小时；
LPS组：每孔加入20ul的含10％FBS的DMEM培养基，在37℃的5％CO2孵箱培养一小时；
LPS+ATP组：每孔加入20ul的含10％FBS的DMEM培养基，在5％CO2孵箱中37℃下培养半小时后加入ATP至ATP终浓度为2.5uM，再继续培养半小时；
普乐沙福1uM组：每孔加入含plerixafor的含10％FBS的DMEM培养基至终浓度为1uM处理半小时后，加入ATP至终浓度为2.5uM，再处理半小时；
普乐沙福2uM组：每孔加入含plerixafor的含10％FBS的DMEM培养基至终浓度为2uM处理半小时后，加入ATP至终浓度为2.5uM，再处理半小时；
普乐沙福10uM组：每孔加入含plerixafor的含10％FBS的DMEM培养基至终浓度为10uM处理半小时后，加入ATP至终浓度为2.5uM，再处理半小时；
3.3)各组BMDMs细胞毒性检测
对2.2)处理后的BMDMs细胞离心并收集细胞上清液(BMDMs-SN)，然后将各孔BMDMs-SN分别加入新的96孔板对应的孔中，对各孔BMDMs-SN分别采用CytotoxicityDetection Kit试剂盒按照说明书进行乳酸脱氢酶(LDH)含量检测并使用软件GraphPadPrism 7.0对数据统计分析。
3.4)实验结果
图3为BMDMs细胞毒性检测结果，普乐沙福给药组(普乐沙福1uM组、普乐沙福2uM组、普乐沙福10uM组)呈剂量依赖性降低小鼠骨髓来源巨噬细胞LDH释放量，且普乐沙福2uM组和普乐沙福10uM组与LPS+ATP组有显著统计学差异(*p<0.05，****p<0.0001)。
实施例4：普乐沙福可结合人GSDMD蛋白
4.1)分子间相互作用分析技术(MST)检测普乐沙福与人GSDMD蛋白的亲和力
4.1.1)根据Monolith His-Tag Labeling kit(MO-L018，NanoTemper)试剂盒说明书，将plerixafor稀释为100uM，然后进行10倍梯度浓度稀释，设16个浓度，并分别置于16个ep管中；
4.1.2)根据Monolith His-Tag Labeling kit(MO-L018，NanoTemper)试剂盒说明书，在16个ep管中分别加入人GSDMD重组蛋白使其终浓度为50nM，然后加入染料；
4.1.3)室温下反应30分钟后，用毛细管依次吸取各ep管内溶液，并使用分子相互作用仪Monolith nt.115进行能量检测，并使用软件MO.Affinity Analysisv2.2.4进行结果分析。
4.2)实验结果
如图4所示的普乐沙福与人GSDMD蛋白的亲和力检测结果，普乐沙福与人GSDMD蛋白的解离常数Kd＝75.7nM，表示普乐沙福与人GSDMD蛋白有极强的结合力，证明普乐沙福是一种以人GSDMD蛋白为靶点的药物，结合实施例1～3的检测结果，推测普乐沙福通过与GSDMD直接结合以抑制细胞焦亡并减少免疫细胞的死亡和炎性因子的释放。
实施例5：普乐沙福对EAE的防治作用
5.1)C57BL/6小鼠EAE诱导
对C57BL/6小鼠(8-10周龄)皮下注射250ug完全溶于完全弗氏佐剂并包含有400ug灭活结核杆菌(H37Ra,5mg/ml，BD Diagnostics)的MOG35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)，分别于免疫第0天及第3天向小鼠腹腔注射500ng/只百日咳毒素(Sigma-Aldrich)；
5.2)EAE模型小鼠分组及药物治疗处理
5.2.1)EAE模型小鼠分组：将步骤5.1)构建的EAE小鼠模型随机分为预防对照组(Control2)、预防普乐沙福给药组(Treated2)，治疗对照组(Control1)、治疗普乐沙福给药组(Treated1)，每组10只；
5.2.2)临床评分标准如下：
0分，无临床症状；
0.5分，尾部轻度瘫痪；
1分，尾部完全瘫痪；
2分，双侧后肢不完全瘫痪；
2.5分，截瘫(双侧后肢完全瘫痪)；
3分，截瘫并前肢无力或轻度瘫痪；
4分，四肢完全瘫痪；
5分，死亡；
5.2.3)药物治疗处理：将普乐沙福溶于无菌PBS中并按照5mg/kg剂量对各组EAE模型小鼠给药，具体给药方案如下：
预防普乐沙福给药组及预防对照组：预防普乐沙福给药组从小鼠EAE模型免疫后第5天起开始给药，两天一次，直至评分恢复至0分；预防对照组对小鼠EAE模型腹腔注射相同体积无菌PBS；
治疗普乐沙福给药组及治疗对照组：治疗普乐沙福给药组从治疗普乐沙福给药组评分>0时开始给药，每天一次，直至评分恢复至0分；治疗对照组对小鼠EAE模型腹腔注射相同体积无菌PBS；
5.3)实验结果
MS是一种常见的神经免疫性疾病，主要的机制是炎性细胞的浸润以及神经髓鞘的损伤，因此我们评估了plerixafor是否对MS具有预防或治疗作用；如图5A所示，EAE模型小鼠在免疫后第14天EAE小鼠开始发病并进入急性期，此时开始进行plerixafor给药，1次/天，结果表明，预防普乐沙福给药组相比预防对照组的临床评分显著降低；图5B～5D为EAE模型小鼠在免疫后第5天EAE小鼠启动期时开始进行plerixafor隔天给药，如图5B所示，治疗普乐沙福给药组与治疗对照组相比，EAE小鼠发病时间推迟、临床评分降低；对比图5C所示的治疗对照组EAE小鼠发病率结果和图5D所示的治疗普乐沙福给药组EAE小鼠发病率结果可见，治疗对照组和治疗普乐沙福给药组的EAE小鼠发病率分别为71％和25％，可见普乐沙福对小鼠EAE症状具有预防和治疗的作用。
实施例6：普乐沙福对小鼠sepsis的防治作用
6.1)C57BL/6小鼠分组及处理
将20只C57BL/6小鼠(8-10周龄)随机分为对照组(Control)和普乐沙福给药组(Treated)，每组10只，分别在LPS诱导前12h、2h和诱导后6h对C57BL/6雌鼠腹腔进行普乐沙福(5mg/kg)注射，对照组注射相同体积的无菌PBS；
6.2)构建小鼠sepsis模型与给药
对6.1)中对照组(Control)和普乐沙福给药组(Treated)的C57BL/6雌鼠进行LPS(20mg/kg)腹腔注射以诱导小鼠sepsis模型，在普乐沙福注射后的36h内，每2h记录各组C57BL/6雌鼠生存情况，采用Log-Rank检验对各组小鼠的生存曲线进行统计学分析；
6.3)小鼠的外周血单核细胞数统计分析
小鼠sepsis模型造模12h后，各组小鼠采用眼眶取血法取外周血进行细胞表面染色，使用相应流式抗体进行细胞表面抗原Ly6C、CD11b染色，然后使用常规流式分析法对各组小鼠的外周血单核细胞进行分析；
6.4)实验结果
由图6A所示的对照组(Control)和普乐沙福给药组(Treated)小鼠存活曲线可见，普乐沙福给药组(Treated)相比对照组(Control)小鼠存活率升高，使用Log Rank法统计两组生存曲线有统计学差异(*p<0.05)；由图6B所示的对照组(Control)和普乐沙福给药组(Treated)小鼠外周血细胞分析结果可见，普乐沙福给药组(Treated)与对照组(Control)相比外周血单核细胞数量明显增多，表明普乐沙福对sepsis模型小鼠具有预防或治疗的作用。
综上所述，普乐沙福可显著降低人、鼠巨噬细胞的死亡率，并减少IL-1β炎症因子的分泌；普乐沙福治疗组小鼠EAE症状明显缓解，包括临床评分和发病率的显著降低，在LPS诱导的sepsis模型小鼠中，普乐沙福治疗组相比对照组，小鼠存活率有明显的升高，外周血中的单核细胞数也显著提升，普乐沙福通过与GSDMD直接结合抑制了细胞焦亡并减少了免疫细胞的死亡和炎性因子的释放，从而缓解MS与sepsis的症状，普乐沙福在调控MS和sepsis病理中具有关键的作用，可以作为预防或治疗MS和sepsis的药物，对今后MS和sepsis的预防和治疗具有重要意义，进一步地，可以为预防和治疗自身免疫性疾病和感染性炎症性疾病提供一种新的药物选择。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.普乐沙福在制备预防或治疗多发性硬化症药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的普乐沙福在制备预防或治疗多发性硬化症药物中的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂。
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