CN109771446B

CN109771446B - 唾液链球菌k12在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用

Info

Publication number: CN109771446B
Application number: CN201910148022.5A
Authority: CN
Inventors: 栗占国; 李静; 何菁; 靳家扬; 覃俊杰; 李胜辉
Original assignee: Peking University People's Hospital (peking University Second Clinical Medical College)
Current assignee: Peking University People's Hospital (peking University Second Clinical Medical College)
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2039-02-28
Also published as: CN109771446A

Abstract

本发明提供了唾液链球菌K12在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用，属于自身免疫性疾病的治疗技术领域，所述唾液链球菌K12预防性干预可显著抑制实验性关节炎的发生发展，使关节炎发病率下降30％～70％，并保护关节滑膜组织免受炎性细胞浸润和侵蚀破坏；此外，唾液链球菌对实验性关节炎也具有治疗作用。唾液链球菌K12可显著下调Tfh细胞，GCB细胞，DC细胞和Neu细胞的比例，并抑制促炎细胞因子IL‑6的表达，促进抗炎细胞因子IL‑10的分泌。唾液链球菌可通过抑制免疫反应而促进免疫稳态重建，为类风湿性关节炎的治疗提供了潜在靶点；能够靶向性调节异常的免疫细胞，从上游途径治疗疾病，调节免疫平衡。

Description

唾液链球菌K12在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用

技术领域

本发明属于自身免疫性疾病的治疗技术领域，尤其涉及唾液链球菌K12 在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。

背景技术

自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎(RA)，系统性红斑狼疮(SLE)和干燥综合征(SS)，以免疫性炎症为突出表现，血清中出现多种致病性自身抗体和多系统受累是该类疾病的主要临床特征。类风湿性关节炎病变主要侵及关节，关节症状一般反复发作，关节破坏日益严重，最后导致程度不等的功能障碍和畸形。除关节外，皮肤类风湿结节、动脉炎、心包炎、巩膜炎、淋巴结炎、肝脾肿大、神经病变等也不少见。我国类风湿性关节炎的患病率为0.28-0.41％，患者多达500万之多，未经正规治疗致残率高达75％ (Rheumatology(Oxford),2012,51(4):721-729)。我国在2006年进行的第二次全国残疾人抽样调查中，致残性关节病在导致肢体残疾的21类病因中排第2位 (20.1％)，仅次于脑血管病(20.6％)，而其中79.4％为RA致残(中华医学杂志,2009,89(21):1873-1875)。系统性红斑狼疮患者发病初期多表现为低热、面部皮疹、乏力、脱发、关节痛等临床症状，严重者会出现抽搐、晕厥等神经系统症状，晚期多发展为慢性肾炎甚至肾衰竭。该病在我国的患病率约为70/10万人，患病人数高达90万，5年生存率仅为50-85％，预后差，严重威胁患者的生活质量，给患者及社会带来了沉重的精神和经济负担 (Rheumatology(Oxford),2012,51(4):721-729)。

迄今为止，自身免疫病的病因及发病机制尚不明确，治疗仅限于暂时缓解和改善病情，不能从根本上控制疾病的发生发展。因此，全面而深入地探究自身免疫的发病机制，寻找特异性的早期诊断指标及有效治疗靶点，具有重要的理论意义和临床应用价值。新近研究显示，机体共生菌群失调是自身免疫病发病的重要诱因，其在自身免疫病发生发展中的作用逐渐被认可并受到重视。共生菌群随免疫系统协同发展，共同进化。宿主进化出一系列途径限制免疫系统对共生菌的应答，而共生微生物则整合环境、基因和免疫信号，影响宿主代谢、免疫力和对感染的应答。当各种内源(基因突变、疾病)或外源性(饮食、药物、空气)因素引起共生菌群失调时，则会引发异常免疫反应，造成局部甚至全身免疫反应失衡，与自身免疫病的发病密切相关。

目前，自身免疫病的治疗仅限于缓解疾病。然而，过度使用激素、免疫抑制剂以及生物制剂等抑制免疫反应并不能达到有效缓解疾病的目的，而且通常会伴随感染等不良反应。因此寻找一种能调控免疫失衡和重建免疫耐受的治疗方法显得尤为重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供唾液链球菌K12在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用；唾液链球菌可显著改善免疫失衡反应，并可有效抑制实验性关节炎的发生发展。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

唾液链球菌K12在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。

优选的，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎。

优选的，所述预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物还包括唾液链球菌 K12药学上接受的辅料。

优选的，所述药物的剂型为口内含服剂或滴鼻剂。

本发明提供了唾液链球菌K12在制备调控免疫细胞分化的药物中的应用。

优选的，所述唾液链球菌K12能够下调Tfh细胞和生发中心B细胞在淋巴细胞亚群中的比例。

优选的，所述唾液链球菌K12能够下调浆细胞样树突状细胞pDC、单核细胞来源的树突状细胞mDC和中性粒细胞Neu在淋巴细胞亚群中的比例。

本发明提供了唾液链球菌K12在制备促进抗炎细胞因子IL-10的表达的药物中的应用。

本发明提供了唾液链球菌K12在制备抑制促炎细胞因子IL-6的表达的药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供的唾液链球菌K12在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用，所述唾液链球菌K12可调控免疫细胞的比例和细胞因子的表达，具有改善免疫失衡状态，促进免疫稳态重建的作用。根据本发明实施例记载，由DBA/1小鼠构建的胶原诱导性关节炎(CIA)模型，给予唾液链球菌预防性或治疗性干预，发现唾液链球菌预防性干预可显著抑制实验性关节炎的发生发展，使关节炎发病率下降30％～70％，并保护关节滑膜组织免受炎性细胞浸润和侵蚀破坏；此外，唾液链球菌对实验性关节炎也具有治疗作用，可显著缓解关节炎的肿胀症状。进一步研究发现唾液链球菌可促进抗炎细胞因子IL-10的分泌，并减少促炎因子IL-6的表达。同时，唾液链球菌可显著下调Tfh和生发中心B(germinalcenterB，GCB)细胞的比例。由上述结果可见，唾液链球菌可通过抑制免疫反应而促进免疫稳态重建，为类风湿性关节炎的治疗提供了潜在靶点；本发明利用唾液链球菌靶向性调节异常的免疫细胞，从上游途径治疗疾病，调节免疫平衡。

附图说明

图1为类风湿性关节炎患者扁桃体菌群二代测序分析结果，其中a为主成分分析，b为多样性分析，c为差异细菌分析结果；

图2为唾液链球菌抑制实验性关节炎发生发展的流程和结果，其中a为预防性干预示意图，b为预防组小鼠关节炎发病率，c为预防组小鼠关节炎评分，d为预防组小鼠关节CT拍摄图，e为预防组小鼠关节组织病理图及其评分结果，f为治疗性干预示意图，g为治疗组小鼠关节炎评分，h为治疗组小鼠关节组织病理分析。

图3为唾液链球菌对CIA小鼠体内免疫细胞以及细胞因子的调控结果，其中a-c分别为滤泡辅助性T细胞(Tfh)，生发中心B细胞 (GCB)，树突状细胞(DC)以及中性粒细胞(Neu)的比例，d为细胞因子IL-10和IL-6的表达。

具体实施方式

本发明提供了唾液链球菌K12在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。在本发明中，所述唾液链球菌K12来源于BLIS Technologies Ltd.NZ；在本发明中，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和干燥综合征，在本发明具体实施过程中，优选的以类风湿性关节炎为例。本发明中，所述药物的剂型优选为口服剂或滴鼻剂，所述预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物还包括唾液链球菌K12药学上接受的辅料，本发明对所述辅料的种类和用量没有特殊限定，根据具体的剂型选择本领域常规的辅料即可。本发明中，所述唾液链球菌K12的的推荐剂量优选为1～2.5×10⁹ cfu每天。

本发明提供了唾液链球菌K12在制备调控免疫细胞比例的药物中的应用。本发明中，通过构建实验性关节炎动物模型，将所述唾液链球菌K12 作用于小鼠，证实唾液链球菌K12能够下调Tfh细胞和生发中心B细胞、浆细胞样树突状细胞pDC、单核细胞来源的树突状细胞mDC和中性粒细胞 Neu在淋巴细胞亚群中的比例。本发明中，所述唾液链球菌K12通过调控免疫细胞的比例，抑制免疫反应而促进免疫稳态重建。本发明对所述药物的剂型没有特殊要求采用本领域常规剂型即可，优选为口内含服制剂或滴鼻剂；本发明对所述药物的辅料没有特殊限定，根据所述药物的剂型选择合适的辅料即可。

本发明提供了唾液链球菌K12在制备促进抗炎细胞因子IL-10的表达、抑制促炎细胞因子IL-6的表达的药物中的应用。将所述唾液链球菌K12作用于实验性关节炎小鼠，证实其能够促进小鼠外周血中抗炎细胞因子IL-10 的表达、并抑制促炎细胞因子IL-6的表达。本发明对所述药物的剂型没有特殊要求，采用本领域常规剂型即可，优选为口内含服制剂或滴鼻剂；本发明对所述药物的辅料没有特殊限定，根据所述药物的剂型选择合适的辅料即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

类风湿性关节炎患者扁桃体菌群中唾液链球菌显著减少

实施方法

(1)类风湿性关节炎RA患者以及健康受试者的扁桃体菌群样本采集： 1)嘱咐受试者轻轻漱口，注意避免触及咽喉部；2)使用湿润的无菌棉拭子沾取受试者扁桃体表面，注意避免触及唾液、舌背、上腭、口腔内壁等部位，防止菌群污染；3)菌群样本暂时保存在-80℃低温冰箱中，备用。

(2)扁桃体菌群二代测序分析：1)使用DNA提取试剂盒(Catalog No. 12888-100，MO BIO Laboratories，Carlsbad，CA 92010，USA)提取样本中全部菌群的基因组DNA；2)利用Illumina建库试剂盒进行文库构建，并严格按照Illumina公司推荐的文库质检方案进行质检；3)合格文库根据Illumina Miseq测序操作指南进行Paired-end测序，所述测序委托深圳市谱元基因研究院进行。

(3)运用生物信息学统计分析方法分析测序数据:

1)菌群整体结构

群落生态学中研究微生物多样性，通过单样品的多样性分析(α-多样性) 可以反映微生物群落的复杂度和多样性，包括observed species指数、chao指数、shannon指数，simpson指数以及PD whole tree指数。利用QIIME软件计算样品的α-多样性指数的值。β-多样性(β-diversity)分析是用来比较不同样品在物种多样性方面存在的差异大小，表示方式为主成分分析PCA。根据各样品差异性的统计结果，对样品进行聚类分析并计算样品间距离，以判断各样品物种组成的相似性。距离越小，说明两个样品的物种组成越相似。

2)菌群分类学组成差异分析

使用秩和检验，分析疾病组与对照组菌群在分类学组成上的差异， P<0.05有统计差异。

研究结果

分析结果如图1所示，其中(a)为PCA(principal component analysis)分析，横纵坐标均表示主成分，括号中的百分比则表示主成分对样品分组差异的贡献率，贡献率大小随主成分级别增加而降低，图中每个点代表一个样本。从图中可以看出，与健康受试者相比，类风湿关节炎患者扁桃体菌群的组成结构明显偏离于正常范围。(b)为UniFrac分析：衡量β-多样性指数的指标，考虑了物种间的进化距离，指数越大表示样品间的差异越大，可以看出类风湿关节炎患者个体间的菌群差异性显著增加。**P<0.01。(c)扁桃体菌群差异物种分析

与健康受试者相比，类风湿性关节炎患者扁桃体菌群的组成结构明显异常(图1a，PERMANOVA检验，P＝0.001)，患者菌群的物种多样性明显降低(图 1b，RA中位值6.56vs HC中位值6.12，秩和检验，n＝220，P<0.01)。进一步分析RA患者与健康人扁桃体菌群的差异物种，结果显示RA患者扁桃体菌群中唾液链球菌(Streptococcus salivarius)所占比例明显减少(图1c，RA平均丰度0.008vs HC平均丰度0.0148，秩和检验，P＝0.03778)，而唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)的相对丰度显著增加(图1c，RA平均丰度1.46*10^-6 vs HC平均丰度2.16*10^-7，秩和检验，P＝0.03743)。由此可见，患者扁桃体菌群中的唾液链球菌特异性减少，提示唾液链球菌在类风湿性关节炎的发病中可能具有重要的免疫调控作用。

实施例2

唾液链球菌抑制实验性关节炎发生发展

实施方法

(1)构建实验性关节炎(CIA)小鼠模型：1)溶解胶原，将牛Ⅱ型胶原 (CⅡ)溶于0.1mol冰醋酸中，将CⅡ终浓度调至4mg/mL，4℃过夜。

2)乳化胶原，将完全溶解的CⅡ与等体积弗氏完全佐剂(CFA)混合，使二者充分乳化，制成终浓度为2mg/mL的胶原乳剂。

3)初次免疫，DBA/1小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司，雄性，6-8周龄)尾根部去毛，多点皮内注射总量为为200μg的胶原乳剂。

4)加强免疫，初次免疫后第21天，将Ⅱ型胶原溶于0.1mol冰醋酸中 (浓度4mg/mL)，加入等体积弗氏不完全佐剂(IFA)制成胶原乳剂(终浓度2mg/mL)。尾根部多点皮内注射总量为100μg的胶原乳剂。

(2)唾液链球菌定植：1)预防性定植，初次免疫当天开始给药，方式为滴鼻联合口内(K12-N+O)以及单独口内给药(K12-O)，剂量为1*10⁸cfu/只，每周给药3次(图2a)。2)治疗性定植，小鼠关节炎发病后给予K12定植，方式为滴鼻联合口内，剂量为1*10⁸cfu/只(K12-N+O)和2*10⁸cfu/只(K12-2(N+O))，每周给药3次(图2f)。

(3)关节炎发生率以及关节炎评分记录：1)关节炎发生率：加强免疫后(即初次免疫后第22天)开始每天观察小鼠关节炎发病情况，记录发病时间及发病率，发生率＝(发病小鼠只数/小鼠总只数)*100。2)关节炎评分：观察小鼠关节肿胀情况，进行评分。评分由2名实验人员同时独立进行，取两人评分的平均值作为最终评分。评分关节包括小鼠的前后肢共四个足关节，每个关节评分标准如下：肿胀脚趾少于2个为1分，多于2个为2分，脚掌肿胀为1分，脚踝肿胀为1分。每个关节最高4分，每只小鼠最高16 分。每组小鼠的关节炎平均分＝所有小鼠关节评分总和/小鼠只数。

(4)关节影像学以及组织病理学检测：1)采用CT呈像技术对小鼠受累关节进行拍摄，通过三维重建技术，重点观察骨质侵蚀以及关节肿胀情况。 2)组织病理，对像--四肢关节；固定--4％福尔马林固定48h；脱钙--脱钙液处理30天；切片--纵向延长轴对半切开，暴露骨髓，骨髓面朝下，石蜡包埋，切片；染色--常规HE染色，加封盖玻片保存。关节滑膜组织病理评分标准： 0分：正常；1分：滑膜增生和炎症细胞浸润；2分：血管翳形成，关节软骨破坏；3分：大部分关节软骨破坏及软骨下骨侵蚀；4分：关节完整性丧失，关节强直。

实验结果

小鼠关节炎发生率监测结果显示，疾病对照组(CIA)小鼠关节炎发生率为90％，而唾液链球菌滴鼻联合口内处理组(K12-N+O)小鼠关节炎发生率为 30％，唾液链球菌口内处理组(K12-O)小鼠关节炎发生率为60％(图2b)，可以看出唾液链球菌明显降低了关节炎的发生率，表明唾液链球菌可有效抑制实验性关节炎发病。同时，疾病对照组(CIA)小鼠关节炎评分平均可达4分，而唾液链球菌滴鼻联合口内处理组(K12-N+O)小鼠关节炎平均分为0.9，唾液链球菌口内处理组(K12-O)小鼠关节炎平均分为1.8(图2c)，唾液链球菌可显著降低关节炎评分，表明唾液链球菌可有效抑制实验性关节炎的发展。

进一步，Miro-CT呈像以及组织病理学分析结果显示，唾液链球菌可抑制关节骨组织破坏以及滑膜组织炎细胞浸润，CIA组关节组织病理评分平均 1.61，而唾液链球菌滴鼻联合口内处理组(K12-N+O)关节组织病理评分平均0.35，唾液链球菌口内处理组(K12-O)关节组织病理评分平均0.75(图2d和e)。此外，使用唾液链球菌治疗实验性关节炎，发现唾液链球菌单倍剂量 (K12-N+O，1*10⁸cfu/只)处理组小鼠关节炎和组织病理平均分分别为8和1.81，剂量加倍(K12-2(N+O),2*10⁸cfu/只)后关节炎和组织病理平均分分别为平均分为6.9和1.59，而CIA组关节炎和组织病理平均分分别为10.88和2.5，可以看出唾液链球菌可显著抑制实验性关节炎进展，有效缓解关节肿胀症状，并抑制关节滑膜组织炎性浸润和骨破坏(图2g和h)。

实施例3

唾液链球菌调控CIA小鼠体内免疫细胞分化以及细胞因子表达

实施方法

(1)流式细胞术检测淋巴细胞亚群比例：分离CIA小鼠关节引流淋巴结(腋窝和腘窝淋巴结)，使用1640培养基和滤网将淋巴结研磨成单细胞悬液，调整细胞数量为2～3×10⁶/100μL，加染流式抗体(eBioscience,U.S.A.)，洗涤重悬后上机检测。

(2)ELISA试剂盒检测细胞因子表达：小鼠麻醉后眼球取血，全血静置120min，4℃，1800rpm，离心20min。收集上层血清，ELISA试剂盒检测细胞因子IL-6和IL-10，操作方法依据试剂盒(Multisciences Biotech Co.,Ltd) 说明。

表1所用试剂盒名称和货号(2)

货号	试剂盒名称
		EK2102/2	Mouse IL-10 ELISA Kit
EK2062/2	Mouse IL-6 ELISA Kit

实验结果

淋巴细胞亚群分析结果如图3所示，图3中免疫细胞亚群比例和细胞因子含量表示为mean±sd，每组小鼠n＝8只，*P<0.05，**P<0.01。其中，Tfh： T follicular cell，滤泡辅助性T细胞；GCB：germinal center B，生发中心B 细胞；pDC:plasmacytoid dendriticcell，浆细胞样树突状细胞；mDC: monocyte-derived dendritic cell，单核细胞来源树突状细胞；Neu:neutrophil，中性粒细胞；IL：interleukin，白细胞介素。

由图3可知，唾液链球菌可明显下调滤泡辅助性T(Tfh)细胞(图3a， CIA:17.63±1.985，K12-N+O:13.51±0.9357，K12-O:13.89±2.355)，生发中心B(GCB)细胞(图3b，CIA:2.401±1.107，K12-N+O:1.028±0.686，K12-O: 1.181±0.761)，浆细胞样树突状细胞pDC(图3c，CIA:1.303±0.324， K12-N+O:0.66±0.203，K12-O:1.236±0.283)和单核细胞来源的树突状细胞 mDC(图3c，CIA:3.685±0.681，K12-N+O:2.715±0.733，K12-O:4.193±0.402)以及中性粒细胞(Neu)的比例(图3c，CIA:0.2314±0.0285，K12-N+O: 0.0798±0.0411，K12-O:0.123±0.0407)。细胞因子检测结果显示，唾液链球菌可促进抗炎因子IL-10的分泌(图3d，CIA:75.8±41.73pg/ml，K12-N+O: 236.8±69.55pg/ml，K12-O:200.1±55.98pg/ml)，并抑制促炎因子IL-6的表达(图3d，CIA:348.1±130.4pg/ml，K12-N+O:112.8±79.46pg/ml，K12-O: 107.4±39.54pg/ml)。

由上述实施例可知，本发明提供的唾液链球菌通过调控免疫细胞的分化以及细胞因子的表达，可抑制免疫反应而促进免疫稳态重建，为类风湿性关节炎的治疗提供了潜在靶点；本发明利用唾液链球菌靶向性调节异常的免疫细胞，从上游途径治疗疾病，调节免疫平衡。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.唾液链球菌（ Streptococcus salivarius ） K12在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物还包括唾液链球菌K12药学上接受的辅料。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为口内含服剂或滴鼻剂。

4.唾液链球菌K12在制备调控免疫细胞分化的药物中的应用，其特征在于，所述免疫细胞为Tfh细胞、生发中心B细胞、浆细胞样树突状细胞pDC、单核细胞来源的树突状细胞mDC和中性粒细胞Neu。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述唾液链球菌K12能够下调Tfh细胞和生发中心B细胞在淋巴细胞亚群中的比例。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述唾液链球菌K12能够下调浆细胞样树突状细胞pDC、单核细胞来源的树突状细胞mDC和中性粒细胞Neu在淋巴细胞亚群中的比例。