CN101906166A - 一种链球菌重组亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药领域。本发明提供了一种疫苗组合物及其制备方法，其中所述疫苗组合物中包括将猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)、甘油醛脱氢酶(GAPDH)以及新发现的膜蛋白吡啶二硫酸核苷酸氧化还原酶(HM6)基因融合表达而形成的融合蛋白，该融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护率。本发明还提供了编码该融合蛋白的基因及扩增该基因用的试剂和方法。

Description

一种链球菌重组亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种基因工程重组蛋白疫苗，具体地说，涉及一种预防猪链球菌病的基因工程重组亚单位疫苗。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的猪致病菌，目前已知的血清型有35个，其中血清2型(Streptococcus suis type 2，SS2)为全球范围的优势流行株，能够引发猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎、支气管肺炎等疾病以及急性死亡；同时，SS2是一种重要的人畜共患传染病病原菌，并感染人，导致严重疾患甚至致死。

猪链球菌2型目前尚无用于临床的基因工程疫苗。本研究对猪链球菌某些免疫原性蛋白进行分析，将某个免疫原性蛋白基因进行表达或多个免疫原性蛋白基因进行串连表达，将获得的产物用于免疫预防。本发明通过串联表达猪链球菌2型的毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)、甘油醛脱氢酶(GAPDH)以及新发现的膜蛋白吡啶二硫酸核苷酸氧化还原酶(HM6)，通过免疫攻毒保护试验研究其免疫原性和保护效果，探讨研制新一代亚单位疫苗的可能性。

溶菌酶释放蛋白(MRP)是猪链球菌2型菌体表面重要的菌体蛋白，分子量为136000，是该菌重要的保护性抗原，其结构和分布复杂(Smith Hilde E，Vecht Uri，Gielkens Arno L J，et al.Cloning and Nucleotide Sequence of the Gene Encoding the 136-KD Surface Protein (Muramidase-Released Protein)of Streptococcus suis Type 2.Infect Immun，1992，60：2361～2367)。

甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)与黏附有关[Brassard，J.，M.Gottschalk，et al.(2004).″Cloning and purification of the Streptococcus suis serotype 2glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and its involvement as an adhesin.″Vet Microbiol102(1-2)：87-94；Wang，K.and C.Lu(2007).″Adhesion activity of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in a Chinese Streptococcus suis type 2strain.″Berl Munch Tierarztl Wochenschr120(5-6)：207-9。王楷宬(王楷宬.猪链球菌2型甘油醛脱氢酶的基因检测及其黏附作用[D].南京：南京农业大学，2006)在SS1、2、7、9中均检测到gapdh基因，而SS2无毒株T15则缺少该基因，并证实该蛋白具有免疫原性。

膜蛋白吡啶二硫酸核苷酸氧化还原酶(HM6)为张炜等[Zhang，W.and C.P.Lu(2007).″Immunoproteomic assay of membrane-associated proteins of Streptococcus suis type 2 Chinavaccine strain HA9801.″Zoonoses Public Health 54(6-7)：253-9]在2007年通过免疫蛋白组学的方发法筛选得到，是一种具有免疫原性的蛋白。

发明内容

本发明的目的在于通过串联表达猪链球菌2型的免疫原性蛋白，研制新一代亚单位疫苗。具体而言通过串联表达猪链球菌2型的3种免疫原性蛋白，即溶菌酶释放蛋白(MRP)、甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、吡啶二硫酸核苷酸氧化还原酶(HM6)。

本发明的另一个目的是提供一种编码本发明所述融合蛋白的基因。

本发明是通过以下技术方案实现的，在本发明中对猪链球菌2型的免疫原性蛋白MRP、GAPDH以及HM6进行原核表达，再将MRP与HM6进行串联原核表达，最终将GAPDH、MRP、HM6三者串联原核表达。

一方面，本发明提供了一种具有免疫原性的融合蛋白。在本发明的一个实例中，其中GAPDH片段位于该融合蛋白的氨基端，MRP片段位于该融合蛋白的中部，HM6片段位于该融合蛋白的羧基端，所述融合蛋白GAPDH-MRP-HM6具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

实验证实，用本发明所述的融合蛋白GAPDH-MRP-HM6免疫接种斑马鱼，所述融合蛋白进入斑马鱼体内以后，刺激斑马鱼体内外周免疫器官的B淋巴细胞，使其活化、增生、分化为浆细胞，产生针对猪链球菌MRP、GAPDH和HM6特异性抗体分子，借助于ADCC、补体活化以及粘附抑制等途径清除进入体内的猪链球菌2型，因而对猪链球菌病有预防作用。

另一方面，本发明提供了一种编码本发明所述融合蛋白的嵌合基因。该嵌合基因由MRP、HM6和GAPDH蛋白基因的多核苷酸片段融合形成的。在本发明的一个实例中，该嵌合基因具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。所示的核苷酸序列，克隆自HA9801株。该菌系姚火春等1998年从江苏爆发猪链球菌病的病猪中分离获得的，具体分离过程及该菌株特征参见文献：姚火春等，猪链球菌1998分离株病原特性鉴定，南京农业大学学报，1999，22(2)：67～70，该文献在此全文引入作为参考。本发明中的HA9801菌株已于2005年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO.1446，该菌株的保藏证明已随申请号为200610075969.0的中国发明专利申请提交。

另一方面，本发明还提供了一种重组构建体，其中包括上述编码本发明所述融合蛋白的基因，该基因被可操作地连接于表达调控区域。

另一方面，本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞已被上述重组构建体转化。另一方面，本发明还提供了一种制备本发明所述融合蛋白的方法，该方法包括：(a)扩增得到融合基因；(b)获得含融合基因的重组构建体；(c)用所述重组构建体转化宿主细胞；(d)将转化后的宿主细胞置于足以表达该融合蛋白的条件下进行培养。

另一方面，本发明还提供了所述融合蛋白在制备用于预防或治疗猪链球菌疾病药物中的用途，其中所述的猪链球菌病是由猪链球菌2型引发的。

另一方面，本发明还提供了一种疫苗组合物，其中包括本发明所述的具有免疫原性的融合蛋白，以及药物学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。本发明提供的免疫保护力试验证明该疫苗组合物能够有效预防和/或治疗猪链球菌疾病。

另一方面，本发明还提供了用于制备所述融合基因的试剂，其中包含核苷酸序列如SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的引物。

本发明的优点：

本发明所述的融合蛋白GAPDH-MRP-HM6具有下述优点：

(1)具有良好的免疫原性，实验证实施用本发明所述融合蛋白GAPDH-MRP-HM6刺激产生的免疫应答明显强于单独施用MRP、HM6和GAPDH时激发的免疫应答，显然三者之间产生了协同作用，融合蛋白的保护作用明显增强。

(2)使用方便，施用含该融合蛋白的疫苗组合物后，即能提供对猪链球菌2型的免疫保护；

下列实施例的给出是为了更好地理解和阐述本发明，而决不应理解为对本发明的任何限制。

除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。

实施例

实施例1

1.1获取猪链球菌2型MRP-HM6融合抗原表位的编码基因

猪链球菌2型HA9801株系姚火春等[南京农业大学学报，1999，22(2)：67～70]1998年从江苏爆发猪链球菌病的病猪中分离、鉴定，已于2005年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO.1446。挑取兔血琼脂平板上HA9801株单菌落接种至含5％犊牛血清(购自卫岗血清厂)的Todd-Hewitt broth(THB)肉汤中，37℃静置培养过夜，取0.5mL菌液离心，提取染色体DNA，溶于PH8.0TE缓冲液中，冻存备用。

提取猪链球菌2型HA9801株基因组DNA的方法参照按Michael W Lema等(Michael WL，Brown A，Collins A.A general method foe the extraction of DNA from bacterial.J Microbiol Methods，1994，19：167-172)的方法稍加改进，步骤如下：分别挑取兔血平板上HA9801菌落接种到Todd-Hewit肉汤，37℃静止培养过夜；取0.5mL菌液离心沉淀，TE缓冲液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，pH7.4)洗涤菌体；以冷丙酮悬浮菌体6000g离心5min，并干燥；37℃用溶菌酶(2mg/mL)200uL处理菌体1h，加TESN裂解液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，1％Sarkosyl，6mol/LNaI，pH7.4)裂解；加等体积异丙醇沉淀DNA，10000g离心10min；沉淀悬浮于200uL40％异丙醇中，离心洗涤；70％乙醇洗涤沉淀；干燥的沉淀溶于100uLTE缓冲液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，pH8.0)，4℃备用。

采用聚合酶链反应(PCR)方法自猪链球菌2型HA9801株染色体DNA中分离MRP及HM6蛋白融合基因MRP-HM6。引物P1和P2可扩增S.Suis 98HAH33MRP基因开放阅读框(ORF)298-828bp间531bp的片段。hm6引物P3和P4可扩增HA9801株HM6蛋白基因开放阅读框(ORF)760-1523bp间964bp的片段，引物P1与P4两端分别添加EcoR I与Xho I酶切位点和保护性碱基，采用的引物序列分别是：

mrp上游引物P1：5′GTAGAATTCGAACAGGTAACATCAGA  3′(SEQ ID NO：6)

mrp下游引物P2：5′GCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCAAAG

                  AGTAACGAATGTA  3′(SEQ ID NO：7)

hm6上游引物P3：5′GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCATCA

                  AAGGTCGTAGCATC  3′(SEQ ID NO：8)

hm6下游引物P4：5′AACTCGAGGAACATCAAGAAAGGC  3′。(SEQ ID NO：9)

所述PCR操作程序是：在一500μL微量离心管中加入下列试剂：

模板DNA                 2μL

10x PCR buffer          10μL

25mM MgCl₂              8μL

2.5mM dNTPs             8μL

引物                    各0.25μL

ddH₂O                   70μL

Tag酶                   3μL

混匀后，立即进行PCR反应。PCR循环参数：94℃变性4min后，进入循环，94℃30s，55℃30s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸10min。

1.2目的片断的回收和纯化：

PCR产物经1％琼脂糖电泳后，切下目的条带，用DNA快速纯化试剂盒提取凝胶中目的片段，具体步骤按试剂盒说明书进行操作。即：琼脂糖电泳后割下含DNA的琼脂糖块，使体积尽可能小，放入1.5mL ependoff管中；按每100mg琼脂糖块加入300μL结合缓冲液的比例加入结合缓冲液，将ependoff管涡旋振荡15～30s，置50℃水浴10min，使琼脂块完全溶化，每2～3min涡旋振荡一次；按每100mg琼脂糖块加入150μL异戊醇的比例加入异戊醇，涡旋振荡彻底混匀；将溶化后的溶液移入吸附柱中，12000g、15～25℃离心1min，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中加入500μL洗脱缓冲液，12000g、15～25℃离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中再次加入200μL洗脱缓冲液，静置1min后，12000g、15～25℃离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；12000rpm、15～25℃离心1min，彻底除去吸附柱中的洗脱液；将吸附柱放入一只干净的1.5mL ependoff管中，在吸附膜中央加入50～100μL溶解缓冲液，静置1min后，12000g、15～25℃离心1min，回收产物即为纯化的目的片段，回收产物-20℃冻存备用。

1.3含mrp基因重组质粒酶切：

在0.5mL的eppendorf管依次加入：

重组质粒            8μL

10X buffer 1        2μL

BamHI               1μL

Sacl                1uL

ddH₂O                    8μL

混匀，37℃水浴酶切2h，65℃15min终止反应。

按Roche DNA快速回收试剂盒说明书回收酶切产物

1.4基因融合：

0.5mL ependorff管中依次加入：

载体DNA                  0.5μL

PCR回收产物              4μL

10X连接buffer            2μL

T₄DNA连接酶              1μL

dd H₂O                   12.5μL

16℃连接过夜。

将含融合基因的的重组质粒转化大肠杆菌BL₂₁，感受态购自天为公司，用限制性内切酶酶切的方法及重组质粒测序的方法鉴定重组克隆。

重组质粒冰冻保存于-20℃，重组菌在含20～50％甘油培养液中保存于-20℃或-70℃。

融合基因的序列测定采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行测序。结果表明，所得到的融合基因的序列与设计的完全一致。

1.5质粒pET-28a(+)的扩增、提取

接种含pET-28a(+)空质粒的宿主菌DH5α至LB肉汤(含Amp100μg/ml)中，37℃摇振培养12～14h。按QIAGEN质粒提取试剂盒说明书进行。

取3mL菌液至1.5mL ependoff管中，4℃、8000rpm离心3min，彻底弃上清；加250μLp1缓冲液至ependoff管中，重新溶解菌泥沉淀，混匀；加250μLp2缓冲液至ependoff管中，轻轻颠倒混匀4～6次，静置4min，可见溶液变澄清；加350μLN3缓冲液至ependoff管中，立即轻轻颠倒混匀4～6次；4℃、12000rpm离心10min，将上清吸至QIAprep柱中；4℃、12000rpm离心1min，甩去离心柱内的弃液；加0.5mL PB缓冲液至QIA prep柱中，4℃、12000rpm离心1min，甩去柱内的弃液；加0.75mLPE缓冲液至柱中，4℃、12000rpm离心1min，甩去离心柱内的弃液；再次离心1min；彻底弃去柱内的液体；将离心柱安置干净的1.5mL ependoff管中，加入50μL EB缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.5)至柱子中央，37℃静置1～2min，4℃、12000rpm离心1min，收集洗脱液，即为提取的质粒，-20℃冻存备用。

1.6质粒pET-28a(+)酶切

在0.5mL的eppendorf管依次加入：

质粒                8μL

10X buffer          12μL

EcoR I              1μL

Xho I               1μL

ddH₂O               8μL

混匀，37℃水浴酶切2h，65℃15min终止反应。

按Roche DNA快速回收试剂盒说明书回收酶切产物。

1.7重组质粒的构建

0.5mL ependorff管中依次加入：

载体DNA                   0.5μL

MRP-HM6基因PCR回收产物    4μL

10X连接buffer             2μL

T₄DNA连接酶               1μL

ddH₂O                     12.5μL

16℃连接过夜

实施例2

2.1获取猪链球菌2型GAPDH-MRP-HM6融合抗原表位的编码基因

猪链球菌2型HA9801株系姚火春等(南京农业大学学报，1999，22(2)：67～70)1998年从江苏爆发猪链球菌病的病猪中分离、鉴定，已于2005年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO.1446。挑取兔血琼脂平板上HA9801株单菌落接种至含5％犊牛血清(购自卫岗血清厂)的Todd-Hewitt broth(THB)肉汤中，37℃静置培养过夜，取0.5mL菌液离心，提取染色体DNA，溶于PH8.0TE缓冲液中，冻存备用。

提取猪链球菌2型HA9801株基因组DNA的方法参照按Michael W Lema等(Michael W L，Brown A，Collins A.A general method foe the extraction of DNA from bacterial.J Microbiol Methods，1994，19：167-172)的方法稍加改进，步骤如下：分别挑取兔血平板上HA9801菌落接种到Todd-Hewit肉汤，37℃静止培养过夜；取0.5mL菌液离心沉淀，TE缓冲液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，pH7.4)洗涤菌体；以冷丙酮悬浮菌体6000g离心5min，并干燥；37℃用溶菌酶(2mg/mL)200μL处理菌体1h，加TESN裂解液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，1％Sarkosyl，6mol/LNaI，pH7.4)裂解；加等体积异丙醇沉淀DNA，10000g离心10min；沉淀悬浮于200uL40％异丙醇中，离心洗涤；70％乙醇洗涤沉淀；干燥的沉淀溶于100μLTE缓冲液(10mM/LTris-HCl，1mM/LEDTA，pH8.0)，4℃备用。

采用聚合酶链反应(PCR)方法自猪链球菌2型HA9801株染色体DNA中分离GAPDH全基因去除起始与终止密码子后的1005bp的片段(P5和P6)及重组重组质粒mrp-hm6-Pet28a的mrp-hm6片段(P7和P8)。采用的引物序列分别是：

gapdh上游引物P5：5′CAGGATCCGTAGTTAAAGTTGGTA  3′(SEQ ID NO：10)

gapdh下游引物P6：5′TCCACCTCCACCTCCTTTAGCGATTTTTGCG  3′(SEQ IDNO：11)

mrp-hm6上游引物P7：5′GGAGGTGGAGGTGGAGAACAGGTAACA

                      TCAGA  3′(SEQ ID NO：12)

mrp-hm6下游引物P8：5′AACTCGAGGAACATCAAGAAAGGC  3′(SEQ ID NO：13)

所述PCR操作程序是：在一500μL微量离心管中加入下列试剂：

模板DNA                     10μL

模板重组质粒                10μL

10x PCR buffer              10μL

25mM MgCl₂                  8μL

2.5mM dNTPs                 8μL

引物                        各0.25μL

ddH₂O                       70μL

Tag酶                       3μL

混匀后，立即进行PCR反应。PCR循环参数：94℃变性4min后，进入循环，94℃30s，55℃30s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸10min。

2.2目的片断的回收和纯化：

将PCR扩增的串联片段GAPDH-MRP-HM6融合基因片段用胶回收试剂盒回收，PCR产物经1％琼脂糖电泳后，切下目的条带，用DNA快速纯化试剂盒提取凝胶中目的片段，具体步骤按试剂盒说明书进行操作，即：琼脂糖电泳后割下含DNA的琼脂糖块，使体积尽可能小，放入1.5mL ependoff管中；按每100mg琼脂糖块加入300μL结合缓冲液的比例加入结合缓冲液，将ependoff管涡旋振荡15～30s，置50℃水浴10min，使琼脂块完全溶化，每2～3min涡旋振荡一次；按每100mg琼脂糖块加入150μL异戊醇的比例加入异戊醇，涡旋振荡彻底混匀；将溶化后的溶液移入吸附柱中，12000g、15～25℃离心1min，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中加入500μL洗脱缓冲液，12000g、15～25℃离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中再次加入200μL洗脱缓冲液，静置1min后，12000g、15～25℃离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；12000rpm、15～25℃离心1min，彻底除去吸附柱中的洗脱液；将吸附柱放入一只干净的1.5mL ependoff管中，在吸附膜中央加入50～100μL溶解缓冲液，静置1min后，12000g、15～25℃离心1min，回收产物即为纯化的目的片段，回收产物-20℃冻存备用。

2.3目的片段的连接和转化

连接pMD18T Simple Vector(TAKAR公司)，转化于感受态细胞TOP10(天为公司)中。通过蓝白斑筛选阳性菌落，命名为mrp-hm6-pMD18T Simple，提取质粒，进行PCR和酶切鉴定。EcoR I与Xho I双酶切mrp-hm6-pMD18T Simple，琼脂糖电泳后回收目的串联片段，与EcoR I与Xho I双酶切过的载体pET-28a连接，转化于感受态大肠杆菌BL21中，PCR以及酶切反应进行克隆的鉴定。阳性质粒命名为MRP-HM6-pET28a，对鉴定的阳性克隆测序(由上海英骏生物有限公司完成)。

2.4质粒pET-28a(+)的扩增、提取

接种含pET-28a(+)空质粒的宿主菌DH5α至LB肉汤(含Amp 100μL/mL)中，37℃摇振培养12～14h。按QIAGEN质粒提取试剂盒说明书进行。

取3mL菌液至1.5mL ependoff管中，4℃、8000rpm离心3min，彻底弃上清；加250μLp1缓冲液至ependoff管中，重新溶解菌泥沉淀，混匀；加250μLp2缓冲液至ependoff管中，轻轻颠倒混匀4～6次，静置4min，可见溶液变澄清；加350μLN3缓冲液至ependoff管中，立即轻轻颠倒混匀4～6次；4℃、12000rpm离心10min，将上清吸至QIAprep柱中；4℃、12000rpm离心1min，甩去离心柱内的弃液；加0.5mL PB缓冲液至QIAprep柱中，4℃、12000rpm离心1min，甩去柱内的弃液；加0.75mLPE缓冲液至柱中，4℃、12000rpm离心1min，甩去离心柱内的弃液；再次离心1min；彻底弃去柱内的液体；将离心柱安置干净的1.5mL ependoff管中，加入50μL EB缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.5)至柱子中央，37℃静置1～2min，4℃、12000rpm离心1min，收集洗脱液，即为提取的质粒，-20℃冻存备用。

2.5质粒pET-28a(+)酶切

在0.5mL的eppendorf管依次加入：

质粒                8μL

10X buffer          12μL

EcoR I              1μL

Xho I               1μL

ddH₂O               8μL

混匀，37℃水浴酶切2h，65℃15min终止反应。

按Roche DNA快速回收试剂盒说明书回收酶切产物。

2.6重组质粒的构建

0.5mL ependorff管中依次加入：

载体DNA                     0.5μL

Mrp-HM6基因PCR回收产物      4μL

10X连接buffer               2μL

T₄DNA连接酶                 1μL

dd H2O                      12.5μL

16℃连接过夜

2.7感受态细胞的制备和转化

从新鲜LB平板挑取单菌落的DH5α接种10mLLB肉汤，37℃剧烈摇振培养3～4h后，冰上放置10min；4℃、6000rpm离心4min，以冰预冷的0.1mol/mL CaCl₂悬浮沉淀，置冰浴10min；4℃、6000rpm离心4min，加400μL冰预冷的0.1mol/mL CaCl₂重新悬浮沉淀，4℃放置待用；取200μL感受态细胞至eppendorff管中，加入10μL的连接产物，立即混匀，冰上放置30min；42℃热休克90s，迅速转移至冰浴2min，然后加入800μL 37℃预热的LB培养基，37℃缓慢摇振2h；取100μL培养液涂布LB平板(含Amp 100μg/mL)37℃培养14～16h。

2.8含mrp基因重组质粒酶切：

在0.5mL的eppendorf管依次加入：

重组质粒                8μL

10X buffer 1            2μL

BamHI                   1μL

Sacl                    1μL

ddH₂O                   8μL

混匀，37℃水浴酶切2h，65℃15min终止反应。

按Roche DNA快速回收试剂盒说明书回收酶切产物

2.9基因融合：

0.5mL ependorff管中依次加入：

载体DNA                 0.5μL

PCR回收产物             4μL

10X连接buffer           2μL

T₄DNA连接酶             1μL

ddH₂O                   12.5μL

16℃连接过夜。

将含融合基因的的重组质粒pET-S-M转化大肠杆菌BL21，感受态制备的方法及细菌的转化同上，用限制性内切酶酶切的方法及重组质粒测序的方法鉴定重组克隆。

重组质粒冰冻保存于-20℃，重组菌在含20～50％甘油培养液中保存于-20℃或-70℃。

融合基因的序列测定采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行测序，核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。结果表明，所得到的融合基因的序列与设计的完全一致。

实施例3猪链球菌2型GAPDH-MRP-HM6融合基因的表达

将重组融合质粒转化感受态大肠杆菌BL₂₁(TaKaRa公司产品)，以氨苄平板筛选。挑取单菌落接种含Amp的LB肉汤5mL，28℃摇振4～5h，接种含Amp的LB肉汤1000mL，28℃剧烈摇振4～5h，当OD₆₀₀达0.6时，加IPTG(Sigma公司产品)诱导，37℃剧烈摇振2～4h。三角烧瓶于冰上5分钟，4℃5000g离心5分钟，弃上清，收集细菌，立即使用或冻存。

实施例4猪链球菌2型GAPDH-MRP-HM6基因片段融合蛋白的纯化

重组菌经IPTG诱导后，离心，菌体沉淀以pH7.2、浓度为10m Mol的PBS溶液洗涤2次后，加入50mL pH7.2、浓度为10mMol的PBS溶液重新悬浮沉淀，以超声波仪进行破碎，破碎功率设定为800瓦、共破碎100次，每次破碎10s钟，间隔15s。破碎完毕后10000rpm离心10min，收集上清。取20μL离心后的上清，加等量SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5min，BL₂₁空宿主菌亦经同样的处理作为对照，后进行SDS-PAGE。电泳结果如图1所示。电泳后凝胶经染色、脱色后，以薄层扫描测定融合蛋白占菌体总蛋白的含量，同时以BIO-RAD(Smart Spec^TM3000)测定上清内菌体蛋白的总量。

破碎上清以His亲和层析柱层析(QIAGEN公司产品)，纯化重组蛋白，并以BIO-RAD(Smart Spec^TM 3000)测定收集蛋白的浓度。采用常规的SDS-PAGE方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis 6.36-6.49，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)测定蛋白的纯度，蛋白纯度为99％。

实施例5重组蛋白疫苗对仔猪的免疫保护效力试验

5.1菌株和质粒

猪链球菌2型HA9801株系姚火春等从江苏1998年爆发猪链球菌病的病猪中分离、鉴定。

5.2实验动物

成年野生斑马鱼AB系斑马鱼，体长4-5cm，免疫前饲养1周，确证无疫病。试验鱼共350尾，50尾/组。

5.3试验方法

5.3.1免疫用亚单位疫苗的制备

将本实验室构建的mrp-pET28a、hm6-pET28a、gapdh-pET28a重组菌以及gapdh-mrp-hm6-pET28a分别经IPTG诱导表达，以His亲和层析柱层析(QIAGEN公司产品)纯化，将蛋白浓度调整至2.0mg/mL。

5.3.2融合蛋白免疫原的制备

将重组菌的纯化融合蛋白调整浓度至2.0mg/mL，直接用作免疫原。

5.3.3疫苗动物免疫实验及攻击

将300尾鱼分成6组，每组50尾。第一组用纯化的MRP融合蛋白亚单位疫苗免疫，第二组纯化的HM6融合蛋白亚单位疫苗免疫，第四组用纯化的GAPDH融合蛋白亚单位疫苗免疫，第五组用纯化的GAPDH-MRP-HM6融合蛋白免疫，第六组为对照组。经鱼类麻醉剂MS-222(杭州动物药品厂生产，批号080610)麻醉后腹腔注射，每尾25μL。融合蛋白、HA9801灭活苗及PBS对照组注射剂量分别为50μg、1×10⁷CFU及25μL，首免14d后同样剂量、途径进行二免。免疫期间水温控制在25±1℃。

免疫保护性评价：

二免两周后以50LD₅₀SS2江苏分离株HA9801通过腹腔注射进行攻毒，连续观察7d。攻毒期间水温控制在29±1℃。测定相对保护率(RPS)，计算公式^[17]为：相对保护率(％)＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％。

5.4试验结果及结论

二免两周后以50LD₅₀ SS2HA9801腹腔注射攻毒。MRP、HM6、GAPDH、MRP-HM6及GAPDH-MRP-HM6融合蛋白免疫组的相对保护率分别为38％、38％、32％、50％、48％，SS2HA9801全菌灭活苗组的相对保护率达到62％，PBS对照组从12h鱼陆续出现腹腔出血症状并死亡，5d内对照组鱼全部死亡。具体见表

表1融合蛋白的免疫保护效力试验

结论是重组融合蛋白对猪有48％的免疫保护率，经过优化和添加适当佐剂，其免疫保护效力会更高，其可作为预防猪链球菌亚单位疫苗。

Claims (10)

1.一种具有免疫原性的融合蛋白，其由猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)溶菌酶释放蛋白(MRP)、甘油醛脱氢酶(GAPDH)、吡啶二硫酸核苷酸氧化还原酶(HM6)融合而形成。

2.权利要求1所述的融合蛋白，其中GAPDH片段位于该融合蛋白的氨基端，MRP片段位于该融合蛋白的中部，HM6片段位于该融合蛋白的羧基端。

3.权利要求2所述的融合蛋白，其中所述的融合蛋白具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

4.一种用于预防和/或治疗猪链球菌疾病的重组蛋白疫苗，其中含有权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白，以及药物学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。

5.权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白在制备用于预防和/或治疗猪链球菌疾病药物中的用途。

6.一种融合基因，其具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

7.一种重组构建体，其中包含权利要求6所述的融合基因，该基因被可操作地连接于表达调控区域。

8.一种宿主细胞，该宿主细胞已被权利要求7所述的重组构建体转化。

9.用于制备权利要求6所述融合基因的试剂，其中包含核苷酸序列如SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的引物。

10.一种制备权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白的方法，该方法包括：(a)使用权利要求7所述试剂扩增得到融合基因SEQ ID NO：4；(b)获得含融合基因SEQ ID NO：4的重组构建体；(c)用所述重组构建体转化宿主细胞；(d)将转化后的宿主细胞置于足以表达该融合蛋白的条件下进行培养。