CN102140430B - 一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株、疫苗及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株、疫苗及应用，属于动物细菌基因工程技术领域。本发明利用重组自杀性质粒介导的等位交换技术得到不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株SalmonellatyphimuriumSL13441（其保藏号为CCTCC NO：M2010301）。该菌株缺失了鼠伤寒沙门氏菌一个重要毒力调节基因cya基因，缺失后鼠伤寒沙门氏菌株毒力显著减弱，但仍具有免疫原性。本发明还公开了利用该基因缺失菌株制备鸡沙门氏菌基因缺失疫苗及其在制备疫苗中的应用，所制得疫苗符合生物安全性要求。本发明制备的基因缺失疫苗可有效防止鸡沙门氏菌的感染，性能稳定、安全性好、成本低、使用方便，具有显著的经济和社会效益。

Description

一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株、疫苗及应用

技术领域

本发明涉及一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株，同时还涉及一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗及该菌株在制备疫苗中的应用，属于动物细菌基因工程技术领域。

背景技术

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium，St）属于沙门氏菌属B群，是一群宿主非特异性肠道致病菌，具有广泛的宿主谱，存在于许多家禽（鸡、鸭、鸽等）、家畜（猪、牛、羊、马、狗、猫等）、鼠类、飞鸟及人类的肠道中。根据糖发酵和酒石酸盐利用实验，可将本菌分成38个生物型，利用噬菌体可将其分为207个噬菌体型（陆承平. 2001. 兽医微生物学（第三版）.北京：中国农业出版社. 223-231）。在鸡白痢已控制的地区，本菌是鸡群中最多见的沙门氏菌感染菌型之一。它具有极广泛的致病性，能致各种畜禽、特种经济动物、试验动物及人的副伤寒，表现为胃肠炎或败血症。这些年来，副伤寒发病率逐年增高，在牛、羊和马中所致的流产及急性胃肠炎的频率已超过都柏林和马流产沙门氏菌。由沙门氏菌引起的副伤寒不仅给养殖业造成很大经济损失，而且菌体污染肉类食品，继而进入人类食物链而引起人类的食物中毒，成为人类沙门氏菌感染的潜在来源，临床上以急性、发热、恶心、呕吐和腹泻为主要症状，并且常引起医院内婴幼儿感染，严重危害人类健康。因此，鼠伤寒沙门氏菌在公共卫生方面具有重要意义。

目前，临床上常采用药物控制的方法来减轻沙门氏菌的危害（李郁，魏建忠，李超，王伟，王强，滕克东. 2008. 同时感染雏鸡群的两种血清型沙门菌的鉴定及药敏试验. 中国家禽，30(4):45-46）。但是多次反复用药不仅使成本上升，而且带来了耐药性和药物残留等食品安全问题，这表明仅仅依赖药物控制不是治疗该病的上选对策。由于多重耐药沙门氏菌不断出现，以及基于食品安全方面的考虑，疫苗接种免疫预防沙门氏菌病是一个理想的选择。尽管常规灭活疫苗一直在使用，但由于其产生的保护水平低且持续时间短，以及免疫途径不方便等原因，使得常规疫苗的使用效果不理想（张欣. 2001. 减毒沙门氏菌活疫苗研究现状及其在家禽业的应用.中国家禽，23(20):44-46）。

与灭活疫苗和亚单位疫苗不同，减毒沙门氏菌活疫苗能更有效地激发宿主的体液免疫、细胞免疫以及局部黏膜免疫反应（朱麟，王红宁. 2008. 禽用减毒沙门菌活载体疫苗的研究进展. 中国家禽，30(21):27-30; Spreng S, Dietrich G, Weidinger G. 2006. Rational design of Salmonella-based vaccination strategies. Methods, 38(2):133-143）。据报道，用减毒或无毒活菌注射或口服免疫动物，效果优于灭活菌苗（陆承平. 2001. 兽医微生物学（第三版）.北京：中国农业出版社. 223-231）。目前针对动物鼠伤寒沙门氏菌病的疫苗主要有鼠伤寒沙门氏菌灭活疫苗和鸡用鼠伤寒沙门氏菌活疫苗Zoosaloral H、牛用鼠伤寒沙门氏菌活疫苗Zoosaloral R及鸽用鼠伤寒沙门氏菌活疫苗Zoosa T。Zoosaloral H、Zoosaloral R和Zoosa T是利用甲基硝基亚硝基胍经化学诱变方法得到的一种鼠伤寒沙门氏菌DT009株腺嘌呤(Ade^-)和组氨酸(His^-)营养突变体(Frech G, Weide-Botjes M, Nussbeck E, Rabsch W, Schwarz S. 1998. Molecular characterization of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium DT009 isolates: differentiation of the live vaccine strain Zoosaloral from field isolates. FEMS Microbiol. Lett. 167(2):263-269)。另外一种鸡用鼠伤寒沙门氏菌活疫苗AviPro

Salmonella vac T是鼠伤寒沙门氏菌415株的代谢漂移突变株(Linde K, Beer J, Bondarenko V. 1990. Stable Salmonella live vaccine strains with two or more attenuating mutations and any desired level of attenuation. Vaccine. 8(3):278-282; Methner U, Barrow PA, Martin G, Meyer H. 1997. Comparative study of the protective effect against Salmonella colonisation in newly hatched SPF chickens using live, attenuated Salmonella vaccine strains, wild-type Salmonella strains or a competitive exclusion product. Int J Food Microbiol. 35(3):223-230)。人的鼠伤寒沙门氏菌病尚无疫苗供预防使用。

与沙门氏菌致病性密切相关的毒力因子主要有脂多糖、肠毒素、细胞毒素、侵袭力等。人们已通过各种基因工程手段构建了多种沙门氏菌的基因突变株，其缺失突变株毒力降低，丧失了对动物的致病力，但仍保留良好的侵袭力和免疫原性，并对黏膜组织有很强嗜性(Darji A , zur Lage S , Garbe AI , Chakraborty T, Weiss S. 2000. Oral delivery of DNA vaccines using attenuated Salmonella typhimurium as carrier. FEMS Immunol Med Microbiol, 27:341-349)。目前，基因缺失研究的靶标基因主要有galE 、 aro 、 pur 、 ompR 、 cya 、 crp 、 asd 、 dam 、 phoP/phoQ 、 sop等(Karasova D, Sebkova A, Vrbas V, Havlickova H, Sisak F, Rychlik I. 2009. Comparative analysis of Salmonella enterica serovar Enteritidis mutants with a vaccine potential. Vaccine, 27(38):5265-5270)。其中，crp和cya是研究较多的靶标基因之一，编码环化腺苷酸合成酶的cya (adenylate cyclase, cya)基因和编码腺苷酸环化酶(cAMP)受体蛋白的crp(cAMP receptor protein, crp)基因是沙门氏菌的重要毒力调节基因，cya和crp基因的突变株影响参与碳水化合物和氨基酸代谢的基因表达和菌毛与鞭毛外膜蛋白的合成(Alper MD, Ames BN. 1978. Transport of antibiotics and metabolite analogs by systems under cyclic AMP control: positive selection of Salmonella typhimurium cya and crp mutants. Bacteriol, 133(1):149-157; Kennedy MJ, Yancey RJ, Sanchez MS, Rzepkowki RA, Kelly SM, Curtiss R Ⅲ. 1999. Attenuation and immunogenicity of ∆cya ∆crp derivatives of Salmonella choleraesuis in pigs. Infect Immun, 67(9):4628-4636)。

用于构建沙门氏菌基因缺失弱毒疫苗株的常规基因工程手段存在不少缺陷。例如，利用转座子介导的突变方法存在随机性，只适合于表型发生明显变化突变子的筛选，而不导致明显表型变化的突变菌株就不能够通过这些方法获得；传统的利用同源重组导致靶基因突变方法虽然精确，但获得的突变菌株最后往往含有抗性标记，由于不符合生物安全性要求不能作为疫苗株用于疫苗生产。

发明内容

本发明的目的在于获得一种遗传背景清晰、免疫原性好、安全性强、无抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株；

本发明的第二个目的是利用鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株制备鼠伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗；

本发明的第三个目的是鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株在制备鼠伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株—鼠伤寒沙门氏菌（分类命名：Salmonella typhimurium）SL13441，于2010年11月13日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号: CCTCC NO：M 2010301。

本发明的基本构建方法是：利用基因工程技术缺失了鼠伤寒沙门氏菌强毒株SL1344（简称SL1344，下同；南京农业大学惠赠）的一个毒力调节基因cya基因，从而构建成新的突变株SL1344∆cya，将该新菌株命名为SL13441。

通过大量的生物学实验数据证明本发明制备的基因缺失菌株SL13441可用于制备针对鸡沙门氏菌感染的弱毒活疫苗，包括下列步骤：

（a）鼠伤寒沙门氏菌SL1344 cya基因缺失菌株的构建：首先从鼠伤寒沙门氏菌SL1344基因组中扩增出cya基因上下臂片段（1364bp和1111bp），并经中间载体pBluescriptⅡSK将其克隆至自杀性质粒pRE112上，从而构建含缺失1182bp cya基因的重组自杀性质粒pRE∆cya。运用重组自杀性质粒介导的等位交换技术原理筛选SL1344的∆cya缺失菌株；

（b）鼠伤寒沙门氏菌cya基因缺失菌株SL13441的生物学特性：通过表型鉴定、遗传稳定性、生长特性研究其生物学特性；

（c）鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株SL13441疫苗的制备；

（d）鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株SL13441疫苗的毒力测定：通过感染1日龄雏鸡计算其LD50，从而评价缺失菌株SL13441疫苗的毒力情况；

（e）鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株SL13441疫苗对雏鸡体的免疫效力检测：4日龄雏鸡口服接种约10⁸CFU疫苗SL13441。于免疫后第3d、5d、7d、14d、21d、28d、35d各组随机剖杀5只鸡，剖杀前无菌采血并检测实验鸡日增重及免疫器官指数，观察该疫苗对鸡正常生长发育的影响。通过MTT以初步评价免疫雏鸡细胞免疫水平和ELISA方法测定免疫鸡体液免疫水平。同时通过细菌分离试验检测缺失菌株SL13441疫苗在体内部分组织中的数量；

（f）鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株SL13441疫苗免疫雏鸡的保护性试验：4日龄雏鸡口服免疫组10⁸CFU疫苗SL13441，免疫两周后，使用约10⁸CFU鼠伤寒沙门氏菌强毒株SL1344和10⁹CFU鸡白痢沙门氏菌C79-13对雏鸡口服攻毒，观察雏鸡对沙门氏菌攻击的抵抗力。

本发明的主要效果和优点：

（1）本发明的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株毒力明显降低，不反强，安全性好，能从根本上阻断鼠伤寒沙门氏菌的传播。免疫鸡后不影响其正常生长发育，无任何不良副作用，并且可作为一种有效的微生态制剂寄生于雏鸡肠内，更好的协调肠道菌群，从而促进饲料的消化吸收，提高日增重。因此，用该亲本菌株构建的基因缺失突变菌株制成疫苗，具有广阔的市场应用前景；

（2）本发明鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株具有良好的免疫保护性，保留了针对鼠伤寒沙门氏菌感染的免疫保护效力，针对鸡白痢沙门氏菌的感染亦有一定保护效力。因此，可产生显著的经济和社会效益；

（3）本发明鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株不含抗性标记，遗传背景清晰，性状稳定，完全符合疫苗生物安全性要求；

（4）使用简单，通过口服进行接种，因此大大减少接种时的人工成本。

附图说明

图1：是cya基因片段扩增相关引物设计位置，图中数字1～2547为编码cya基因序列位置；

图2：是本发明制备的转移质粒pRE∆cya的物理图谱；

图3：是本发明制备的转移质粒pRE∆cya构建的流程图；

图4：是本发明中不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌cya基因缺失菌株∆ cyaSL1344的PCR检测电泳图谱；

图4A：基因缺失菌株∆ cyaSL1344的PCR鉴定图(pc5/pc6)，图中M为DNA marker (1kb)；1为H₂O对照；2为筛选的基因缺失菌株∆ cya SL1344 (1565bp)；3为亲本菌株SL1344对照(2702bp)；

图4B：基因缺失菌株∆ cyaSL1344的PCR鉴定图(pc7/pc6)，图中M为DNA marker (1kb)；1为H₂O对照；2为pRE112质粒对照；3为筛选的基因缺失菌株∆ cyaSL1344 (1620bp)；4为亲本菌株SL1344对照(2857bp)；

图5：基因缺失菌株∆cya SL1344与亲本菌株SL1344在含和不含1%麦芽糖的麦康凯琼脂培养基上的生长情况，图中A为亲本菌株SL1344在麦康凯琼脂培养基上的生长情况；B为基因缺失菌株∆cya SL1344在麦康凯琼脂培养基上的生长情况；C为亲本菌株SL1344在含1%麦芽糖的麦康凯琼脂培养基上的生长情况；D为基因缺失菌株∆cya SL1344在含1%麦芽糖的麦康凯琼脂培养基上的生长情况；

图6：是本发明中的不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株∆ cya SL1344的生长特性实验结果；

图7：是本发明中一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株∆ cya SL1344的遗传稳定性实验结果。图中M：DNA Marker (1kb)；1为H₂O对照；2为SL1344对照；3～7为15、30、45、60和75代缺失菌株∆ cyaSL1344模板的扩增结果；

图8：雏鸡免疫后各个时间点淋巴细胞刺激指数；

图9：雏鸡免疫后各个时间点血清IgG抗体含量。

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明作进一步说明。

实施例1 鼠伤寒沙门氏菌SL1344 cya基因缺失菌株SL13441的构建

1、cya相关引物设计

参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov/登录的鼠伤寒沙门氏菌LT2株的cya基因序列(GenBank No：AE006468.1)设计7条cya相关引物（见图1、表1），用于鼠伤寒沙门氏菌亲本菌株SL1344（南京农业大学惠赠）和基因缺失菌株∆ cyaSL1344的构建与鉴定。各引物均由上海生工生物公司合成。

表1 PCR引物

2、鼠伤寒沙门氏菌SL1344 cya基因上下游片段cya1（上臂）与cya2（下臂）的克隆

将鼠伤寒沙门氏菌SL1344在LB固体培养基（10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g 氯化钠，12g琼脂粉，超纯水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min）上“之”字形划线，37℃培养24h。挑取单菌落接种于LB液体培养基（10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，超纯水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min）中，37℃、200r/min振摇培养16h。按细菌基因组提取试剂盒（购自大连TaKaRa公司）说明书提取基因组作为PCR模板。

首先从鼠伤寒沙门氏菌强毒株SL1344基因组中分别扩增cya基因上下游片段cya1（上臂）和cya2（下臂），扩增片段大小分别为1364bp和1111bp，在上臂两端分别引入BamH I和Xba I酶切位点，下臂两端分别引入Kpn I和Xho I酶切位点。cya1和cya2扩增反应25μL体系为：模板DNA 1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，2mmol/L dNTPs 1μL，2U/μL Taqase 0.5 μL，ddH₂O 18μL（PCR相关试剂均购自大连TaKaRa公司），再加入20μL石蜡。扩增循环参数为：95℃预变性5min，95℃变性1min，56℃退火90sec，72℃延伸2min，30个循环后，72℃延伸10min。PCR产物于0.8%琼脂糖凝胶电泳分析。将得到的目的基因克隆至pMD18-T载体（购自大连TaKaRa公司），阳性克隆送大连TaKaRa公司进行外源基因序列的测定。

3、自杀性质粒pRE∆cya的构建

用Xba I和BamH I分别双酶切pMD18-T-cya1和中间转移载体pBluescriptSK(+)（购自美国Stratagene公司），回收纯化后用T₄ DNA ligase（购自大连TaKaRa公司）连接，16℃水浴12h，转化JM109感受态细胞（购自大连TaKaRa公司），涂布于LB固体平板，37℃培养12h，转接LB液体培养基，37℃、200r/min振摇培养12h，使用小量质粒提取试剂盒（购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）制备质粒，通过PCR和酶切鉴定质粒pSKcya1。然后用Xho I和Kpn I分别双酶切质粒pMD18-T-cya2与质粒pSKcya1。回收纯化后连接，转化JM109感受态细菌，37℃培养12h，转接LB液体培养基，37℃、200r/min振摇培养12h，小量制备质粒，通过PCR和酶切鉴定含cya1和cya2的中间转移质粒pSK∆cya。再用Xba I和Kpn I分别双酶切转移质粒pSK∆cya和自杀性质粒pRE112(由美国华盛顿大学Dr. Roy Curtiss III教授惠赠)，回收纯化后连接，16℃水浴18h，转化大肠杆菌χ7213感受态细胞(由美国华盛顿大学Dr. Roy Curtiss III教授惠赠)，37℃培养18h，转接于LB液体培养基，37℃、200r/min振摇培养18h后提取质粒，通过PCR和酶切鉴定质粒pRE∆cya，构建重组菌株χ7213(pRE∆cya)，pRE∆cya物理图谱见图2，构建流程如图3所示。

4、鼠伤寒沙门氏菌SL1344 cya基因缺失菌株SL13441的构建

以χ7213 (pRE∆cya)为供体菌，SL1344为受体菌进行接合转移，两步法筛选缺失菌株。供体菌和受体菌分别在相应LB液体培养基中37℃培养过夜，无菌磷酸盐缓冲液（PBS，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，超纯水定容至1000mL，121℃高压灭菌30min）洗两遍，调整菌浓度至OD₆₀₀为0.8，各取100μL菌悬液混合。将无菌硝酸纤维滤膜贴于固体LB平板上，将混合菌液滴于滤膜上，37℃培养12h，同时做供体和受体对照。用无菌PBS将滤膜菌液洗下，取100μL涂布含氯霉素（Cm，终浓度30µg/mL）的固体LB平板，37℃培养12h，将Cm抗性菌落同时转接含Cm和5%蔗糖的LB平板，筛选Cm抗性(Cm^r)接合子，提取基因组，用引物pc5/pc6扩增鉴定（见图4A）。阳性接合子在无抗性无NaCl的LB液体培养基中37℃培养12h，连续10倍稀释，涂布含5%蔗糖的无NaCl的固体LB平板，挑取单菌落复制在含Cm和5%蔗糖的固体平板，筛选Cm敏感(Cm^s)菌落。提取基因组，再次用引物pc5/pc6扩增鉴定，缺失菌株∆ cyaSL1344进一步用引物pc7/pc6鉴定（见图4B），同时将扩增产物送大连TaKaRa公司进行序列测定。PCR鉴定和测序结果表明，缺失菌株∆ cyaSL1344构建成功，将此缺失菌株命名为SL13441。

实施例2 鼠伤寒沙门氏菌cya基因缺失菌株SL13441的生物学特性

1、基因缺失菌株SL13441的表型鉴定

根据沙门氏菌单因子血清（购自浙江宁波天润生物药业有限公司）说明书鉴定缺失菌株SL13441的血清型。将基因缺失菌株SL13441（实验编号：缺失菌株∆ cyaSL1344）与亲本菌株SL1344划线接种含和不含1%麦芽糖的麦康凯琼脂平板，然后转接葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇等碳源及H₂S等生化鉴定管（购自杭州天和微生物试剂有限公司）研究其生化特性情况。结果表明基因缺失菌株SL13441血清型与亲本菌株SL1344一致，仍为1,4,5,12:i:1,2。基因缺失菌株SL13441的生化特性与亲本株SL1344并不完全一致（见图5）。与亲本菌株SL1344相比，基因缺失菌株SL13441的个别生化特性发生了明显改变（见表2）。基因缺失菌株SL13441失去了利用果糖、木糖、甘露醇、山梨醇等的能力，但保留了利用葡萄糖的能力。

表2 缺失菌株∆ cyaSL1344与亲本菌株SL1344的生化特性比较

注：Glu–葡萄糖；Mal–麦芽糖；Ara-阿拉伯糖；Gly-丙三醇；Suc–蔗糖；Lac-乳糖；Fru-果糖；Xyl-木糖；Sor-山梨醇；Man-甘露醇；Rha-鼠李糖；H₂S用三糖铁生化鉴定管。

2、基因缺失菌株SL13441的生长特性检测

基因缺失菌株SL13441（实验编号：缺失菌株∆ cyaSL1344）在LB固体培养基37℃培养12h，其菌落直径约为0.36mm，较亲本菌株SL1344 (0.78mm)明显较小。缺失菌株SL13441与亲本菌株SL1344在LB液体培养基中37℃培养过夜，无菌生理盐水连续10倍稀释，取100μL适当稀释度菌液均匀涂布于LB固体平板上，每个稀释度做3个重复，37℃培养过夜，计数，取平均值计算原液的CFU。然后以终浓度约为10⁶CFU/mL转接于相同液体培养基，37℃、200r/min培养，每1h取样平板计数及测OD₆₀₀值，绘制生长曲线。结果显示，缺失菌株SL13441生长速度显著慢于亲本菌株SL1344（见图6）。

3、基因缺失菌株SL13441的遗传稳定性测定

将基因缺失菌株SL13441（实验编号：缺失菌株∆ cyaSL1344）在固体LB平板上划线培养，挑取单菌落到LB固体培养基中，37℃培养36h，随机挑取单菌落转接到LB固体培养基中，连续传代75次。利用cya基因引物pc6/pc7进行PCR检测，鉴定基因缺失菌株SL13441的cya缺失基因的遗传稳定性。从图7可以看出，基因缺失菌株SL13441的15、30、45、60和75代模板均能扩增出缺失型的1632bp的∆cya片段，亲本菌株SL1344扩增出野生型的2857bp的cya片段，表明本发明制备的基因缺失菌株SL13441能够稳定遗传缺失了1182bp的cya基因片段。

实施例3 鼠伤寒沙门氏菌cya基因缺失菌株SL13441疫苗的制备

将基因缺失菌株SL13441（实验编号：缺失菌株∆cyaSL1344）在LB固体培养基上划线培养24h，用无菌生理盐水刮洗下培养物，10000r/min离心5min，弃上清，再加适量的灭菌生理盐水悬浮菌液。10000r/min离心5min，洗涤1～2次。再用灭菌生理盐水悬浮细菌后，连续10倍稀释以平板计数法测定活菌数，最终根据试验需要用灭菌生理盐水调整适当细菌浓度，得到试验用的备用疫苗。

实施例4 鼠伤寒沙门氏菌cya基因缺失菌株SL13441疫苗的毒力测定

为测定基因缺失菌株SL13441（实验编号：缺失菌株∆ cyaSL1344）对雏鸡的毒力情况，将100只雏鸡（沙门氏菌检测均为阴性）平均分为2个大组，每大组分为5小组，另做空白和无菌生理盐水对照组（每组10只雏鸡）。第1大组雏鸡口服感染基因缺失菌株SL13441，每小组每只分别口服感染4.18×10⁹CFU、8.34×10⁸CFU、1.67×10⁸CFU、3.34×10⁷CFU和6.68×10⁶CFU；第2大组雏鸡口服感染亲本菌SL1344，每小组每只分别口服感染1.23×10⁷CFU、2.46×10⁶CFU、4.93×10⁵CFU、9.86×10⁴CFU和1.97×10⁴CFU。记录死亡情况，并按照Reed and Muench法(Reed L J, Muench H. 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg, 27:493-497)计算半数致死剂量(median lethal dose, LD₅₀)，以评价基因缺失菌株SL13441与亲本菌株SL1344相比毒力减弱程度。结果表明，空白和无菌生理盐水对照组均无鸡只死亡，而浓度为1.97×10⁴CFU亲本株SL1344就可使个别雏鸡发生死亡，最高浓度（1.23×10⁷CFU）可使8只雏鸡死亡；而本发明的基因缺失菌株SL13441（实验编号：缺失菌株∆ cyaSL1344）口服感染的雏鸡，在最高剂量4.18×10⁹CFU时有4只雏鸡死亡。计算结果表明亲本株SL1344 LD₅₀为3.43×10⁵CFU，基因缺失菌株SL13441口服攻毒LD₅₀为5.73×10⁹CFU，基因缺失菌株SL13441的毒力较亲本菌株SL1344约降低了16706倍（见表3）。这表明本发明的基因缺失菌株SL13441与亲本菌株SL1344相比毒力明显降低。

表3 本发明的基因缺失疫苗菌株与亲本株毒力比较试验

实施例5 本发明的鼠伤寒沙门氏菌cya基因缺失菌株SL13441对雏鸡体的免疫效力检测

1、雏鸡的免疫程序

为评价基因缺失菌株SL13441（实验编号：缺失菌株∆ cyaSL1344）的免疫效力，将200只4日龄雏鸡（沙门氏菌检测均为阴性）平均分为2组，分别为本发明制备的基因缺失菌株SL13441疫苗组和非免疫对照组。免疫途径为口服接种0.5mL（约含1.0×10⁸CFU）免疫用液或灭菌生理盐水。于免疫后第3d、5d、7d、14d、21ｄ、28d、35d各组随机剖杀5只鸡，剖杀前无菌采血并检测实验鸡日增重及免疫器官指数，并通过MTT法以初步评价免疫雏鸡细胞免疫水平和ELISA方法测定免疫鸡体液免疫水平（标准ELISA方法，参照Zhao Z, Xue Y, Wu B, Tang X, Hu R, Xu Y, Guo A, Chen H. 2008. Subcutaneous vaccination with attenuated Salmonella enterica serovar Choleraesuis C500 expressing recombinant filamentous hemagglutinin and pertactin antigens protects mice against fatal infections with both S. enterica serovar Choleraesuis and Bordetella bronchiseptica. Infect Immun. 76(5):2157-2163）。同时通过细菌分离试验检测基因缺失菌株SL13441疫苗在体内部分组织中的分布数量。

2、免疫接种对雏鸡生长发育的影响

为了评价本发明制备的基因缺失菌株SL13441疫苗免疫雏鸡的生长发育情况，于免疫后第3d、5d、7d、14d、21d、28d、35d各组随机剖杀5只雏鸡，称重并取脾脏、胸腺和法氏囊计算各免疫器官指数，结果表明，免疫组与对照组各个时间点雏鸡免疫器官指数无显著差异（P>0.05）。基因缺失菌株SL13441疫苗免疫组雏鸡平均日增重为9.894±0.376g，与对照组8.973±0.447g相比稍增高。这表明基因缺失菌株SL13441免疫4日龄雏鸡不会影响其生长发育，特别是免疫器官的正常发育，保证了诱导产生免疫效果的重要条件。并且剖检后未见有肉眼可见的病理变化，这也进一步说明该疫苗对雏鸡具有一定的安全性。

3、基因缺失菌株SL13441在体内部分组织中的分布数量

为了评价本发明制备的基因缺失菌株SL13441疫苗在体内部分组织中的分布数量，于免疫后第3d、5d、7d、14d、21d、28d、35d、42d各组随机剖杀5只雏鸡，无菌取肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结接种于含有1%麦芽糖的麦康凯培养基中检测细菌数量，结果表明，第3d、5d、7d、14d、21d和28d在肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结中均能检测到缺失菌株SL13441，但在第35d仅在肝脏检测到，同时第42d在肝脏也没有检测到该菌，说明被完全清除。

4、免疫雏鸡细胞免疫水平检测

为了测定本发明制备的基因缺失菌株SL13441疫苗免疫雏鸡后诱导的细胞免疫水平，于免疫后第3d，5d，7d，14d，21d，28d，35d各组随机抽取5只雏鸡，无菌心脏采血，分离外周血淋巴细胞，用MTT法检测活性淋巴细胞增殖反应，根据公式：SI=(OD免疫组－OD培养基对照)/(OD空白对照组－OD培养对照)，计算各个点的刺激指数(Stimulation Index, SI)（见图8）。从图中可以看出，本发明制备的基因缺失菌株SL13441疫苗免疫接种可有效刺激雏鸡机体T淋巴细胞免疫功能，并在接种后2～3周左右细胞免疫功能达到最强(P<0.01)。

5、免疫雏鸡体液免疫水平检测

为了测定本发明制备的基因缺失菌株SL13441疫苗免疫雏鸡后诱导的体液免疫水平，于免疫后第3d，5d，7d，14d，21d，28d，35d每组随机选取5只雏鸡经心脏采血，分离血清，分别检测抗沙门氏菌血清抗体，取平均值（见图9）。从图9中可以看出，基因缺失菌株SL13441疫苗组血清IgG抗体明显高于对照组(P<0.05)，免疫组雏鸡血清IgG抗体含量呈逐渐上升趋势，在第2～3周左右抗体含量达到最高(P<0.01)。上述试验结果表明本发明制备的基因缺失菌株SL13441疫苗免疫雏鸡后能诱导机体产生特异性的抗沙门氏菌的体液免疫应答。

实施例6 本发明基因缺失菌株SL13441疫苗免疫雏鸡的保护性试验

1、基因缺失菌株SL13441疫苗对鼠伤寒沙门氏菌强毒株攻击雏鸡的保护性评价

为了评价本发明制备的基因缺失菌株SL13441疫苗免疫雏鸡后对同源菌株攻击的抵抗力，将60只4日龄雏鸡（沙门氏菌检测均为阴性）平均分为减毒疫苗组、灭活疫苗对照组、生理盐水对照组。减毒疫苗组口服接种10⁸CFU鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株SL13441（实验编号：缺失菌株∆ cyaSL1344）。灭活疫苗对照组肌肉注射500μL鼠伤寒沙门氏菌SL1344灭活疫苗。生理盐水对照组口服500μL生理盐水。免疫两周后，均使用约10³×LD₅₀（约含1.0×10⁸CFU）鼠伤寒沙门氏菌强毒株SL1344对雏鸡口服攻毒，连续观察28d。记录雏鸡发病及死亡情况（见表4）。生理盐水对照组雏鸡攻毒后2d出现精神沉郁，怕冷、扎堆，腹泻等临床症状，第3d开始死亡，第5d出现死亡高峰，直至第28d存活一只，死亡率为95%，剖检发现均具有沙门氏菌的病理变化；灭活疫苗对照组攻毒后3d个别雏鸡出现精神沉郁、食欲下降症状，第4d有鸡只发生死亡，随后几天零星死亡，第6d出现死亡高峰，至第15d亦有鸡死亡，死亡率为35%，剖检死亡鸡发现具有沙门氏菌的病理变化；减毒疫苗组雏鸡攻毒后第5d有3只雏鸡精神沉郁，但2d后转于正常，其他鸡只无明显发病症状，全部存活。以上结果表明，基因缺失菌株SL13441免疫雏鸡后具有良好的免疫效力，可有效抵抗高剂量（约10³×LD₅₀）鼠伤寒沙门氏菌SL1344强毒株的攻击，其保护率为100%。

表4 本发明制备的基因缺失菌株SL13441疫苗对鼠伤寒沙门氏菌强毒株口服攻击雏鸡的保护性评价

2、基因缺失菌株SL13441疫苗对鸡白痢沙门氏菌强毒株攻击雏鸡的保护性评价

为了评价本发明制备的基因缺失菌株SL13441疫苗免疫雏鸡后对异源菌株攻击的抵抗力，将60只4日龄雏鸡（沙门氏菌检测均为阴性）平均分为减毒疫苗组、灭活疫苗对照组、生理盐水对照组。减毒疫苗组口服接种10⁸CFU鼠伤寒沙门氏菌基因缺失菌株SL13441（实验编号：缺失菌株∆ cyaSL1344）。灭活疫苗对照组肌肉注射500μL鼠伤寒沙门氏菌SL1344灭活疫苗。生理盐水对照组口服500μL生理盐水。免疫两周后，均使用约10³×LD₅₀（约含1.0×10⁹CFU）鸡白痢沙门氏菌强毒株C79-13对雏鸡口服攻毒，连续观察28d。记录雏鸡发病及死亡情况（见表5）。生理盐水对照组雏鸡攻毒后2d出现精神沉郁，表现出沙门氏菌病临床症状，第3d开始死亡，第5d出现死亡高峰，死亡率为85%，剖检发现均具有沙门氏菌的病理变化；灭活疫苗对照组攻毒后3d个别雏鸡出现精神沉郁、食欲下降、拉稀症状，第4d有鸡只发生死亡，随后几天零星死亡，第6d出现死亡高峰，至第16d亦有鸡死亡，死亡率为70%，剖检死亡鸡发现具有沙门氏菌的病理变化；免疫组雏鸡攻毒后第5d有3只雏鸡精神沉郁，食欲减退，拉白色稀粪，并在第6d精神状态不佳的雏鸡死亡2只，其他鸡只没有出现发病症状或仅有一过性轻微症状。结果表明，基因缺失菌株SL13441免疫雏鸡后具有良好的免疫效力，可有效抵抗高剂量（约10³×LD₅₀）鸡白痢沙门氏菌C79-13强毒株的攻击，其保护率为90%。

表5 本发明制备的基因缺失菌株SL13441疫苗对鸡白痢沙门氏菌强毒株攻击雏鸡的保护性评价

本发明实施例的试验结果显示，本发明的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗(SL13441)免疫雏鸡后能激发机体产生高效价针对沙门氏菌的特异性抗体，雏鸡口服几乎无毒力，安全性好。在免疫保护力试验中，对鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌具有很高的攻毒保护率。

Claims (4)

1.一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株，其特征在于，该菌株是鼠伤寒沙门氏菌SL13441：Salmonella typhimurium SL13441，其保藏号为CCTCC NO：M2010301。

2.一种如权利要求1所述的不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株的制备方法，其特征在于，cya基因缺失菌株的构建：从鼠伤寒沙门氏菌亲本菌株基因组中扩增出cya基因上臂片段1364bp和下臂片段1111bp，并经中间载体pBluescriptⅡSK将其克隆至自杀性质粒pRE112上，从而构建含缺失1182bp cya基因的重组自杀性质粒pREΔcya；再运用重组自杀性质粒介导的等位交换技术原理筛选鼠伤寒沙门氏菌SL13441：Salmonellatyphimurium SL13441；其中，cya基因上臂片段由引物pc1GCTCTAGATGTATGTAGCGCATCTTTC和引物pc2TTTGGATCCGTCGAGCAATTCGTTGTG扩增获得；cya基因下臂片段由引物pc3TTTCTCGAGGTCAGTCGCTTCTATTCG和引物pc4TTTGGTACCTGTTACTCCCTCCTGGTT扩增获得。

3.包含权利要求1所述的一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗。

4.权利要求1所述的不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株在制备鼠伤寒沙门氏菌基因缺失疫苗中的应用。

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