CN112410360A

CN112410360A - 一种鸡病原细菌菌影及其制备方法和应用

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Publication number: CN112410360A
Application number: CN202011340847.6A
Authority: CN
Inventors: 刘青; 孔庆科
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2021-01-18
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2021-02-26

Abstract

本发明公开了一种鸡伤寒沙门菌菌影及其制备方法和应用，属于鸡疫苗技术领域。所述制备方法首先制备具有E基因和SN基因的载体，将载体转化进鸡伤寒沙门菌asd缺失株感受态细胞制备得到所述鸡伤寒沙门菌菌影。进一步，利用所述鸡伤寒沙门菌菌影可以制备菌影疫苗。本发明制备的菌影疫苗，比灭活疫苗的保护效率更好，产生的菌影疫苗所携带的活细菌不会对鸡的健康造成影响，可以对鸡伤寒沙门菌的侵袭产生很好的免疫保护效果。该方法技术可以应用到其它细菌上，产生无活细菌的菌影，用于疫苗或其它用途。

Description

一种鸡病原细菌菌影及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于鸡疫苗技术领域，具体地涉及一种鸡病原细菌菌影及其制备方法和应用。

背景技术

禽伤寒(Fowl Typhoid，FT)是由鸡伤寒沙门菌(Salmonella gullinarum，SG)引起的一种败血性传染病，各个年龄阶段的禽类均易感，死亡率可达10％-50％。由于国内养殖业饲养管理水平较差，不能有效控制鸡伤寒沙门菌在畜禽之间的传播，给养殖业造成了巨大的经济损失。生产上比较常见的是鸡伤寒沙门菌减毒活疫苗，但是减毒活疫苗安全性较低，可能会对环境造成污染。因此研发一种具有高免疫原性的安全疫苗具有十分重要的意义。

菌影是指缺少核酸、细胞质和胞质内容物的死菌菌体，它是通过生理生化等方法裂解细菌，在压强作用下使细菌内容物流出，形成的细菌空壳。与传统疫苗相比，菌影完整保留了细菌表面的抗原结构，具有很高的安全性和免疫效应，同时还具有佐剂的性质，且能够载入外源抗原、DNA疫苗、药物等物质，制备方法简单快捷，因此是一种十分优秀的灭活疫苗候选物。

发明内容

本发明的目的是提取一种鸡病原细菌菌影并进一步利用其制备疫苗。为此，采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种具备双裂解功能的ES基因，具有SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列序列。所述ES基因是将E基因和SN基因整合而来。

本发明第二方面提供(1)E基因和SN基因或(2)本发明第一方面所述的ES基因在制备具有双裂解功能的载体中的应用。

本发明第三方面提供一种具有双裂解功能的载体，包括(1)E基因和SN基因或(2)本发明第一方面所述的ES基因。

在本发明中，所述E基因和SN基因分别具有SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述E基因利用E-1F和E-1R引物从pET28α-E质粒进行PCR扩增并克隆得到。其中，E-1F和E-1R引物分别具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述SN基因利用SN-1F和SN-1R引物从MW2全基因组进行PCR扩增并克隆得到。其中，SN-1F和SN-1R引物分别具有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述EN基因是利用E-2F和SN-1R为上下游引物进行融合PCR扩增得到。其中，E-2F引物具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

进一步地，所述载体是分别将所述ES基因和载体双酶切后进行连接得到的。

本发明第四方面提供本发明第三方面所述的载体在制备用于构建鸡病原细菌菌影的试剂盒中的应用。

本发明第五方面提供一种用于构建鸡病原细菌菌影的试剂盒，包括本发明第三方面所述的载体。

在本发明中，所述载体为pBAD-hisA载体。

本发明第六方面提供一种构建鸡病原细菌菌影的方法，包括利用本发明第三方面所述的载体转化鸡病原细菌asd缺失株的步骤。

在本发明的一些实施方案中，所述鸡病原细菌asd缺失株是利用asd自杀质粒转入鸡病原细菌得到的。

本发明第七方面提供一种鸡病原细菌菌影，其是利用本发明第五方面所述的试剂盒或本发明第六方面所述的方法制备得到的。

本发明第八方面提供本发明第七方面所述的鸡病原细菌菌影在制备用于预防鸡病原细菌感染的疫苗中的应用。

本发明第九方面提供用于预防鸡病原细菌感染的疫苗，包括本发明第七方面所述的鸡病原细菌菌影。

本发明还可进一步提供本发明第七方面所述的鸡病原细菌菌影在制备用于疫苗佐剂中的应用。

进一步地，所述鸡病原细菌菌影可以载入包括但不限于外源抗原、DNA疫苗和药物。

在本发明中，所述鸡病原细菌为鸡伤寒沙门菌。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明制备的鸡伤寒沙门菌菌影是一种十分优良的疫苗候选物疫苗，制备的疫苗比灭活疫苗的保护效率更好，产生的菌影疫苗所携带的活细菌不会对鸡的健康造成影响，可以对鸡伤寒沙门菌的侵袭产生很好的免疫保护效果。该方法技术可以应用到其它细菌上，产生无活细菌的菌影，用于疫苗或其它用途。

本发明的鸡伤寒沙门菌菌影可以用于制备疫苗佐剂，具体地，在所述鸡伤寒沙门菌菌影中载入包括但不限于外源抗原、DNA疫苗和药物。

附图说明

图1示出了E基因的PCR扩增结果。M：Maker III；1-2：裂解E基因。

图2示出了pBAD+E质粒的PCR扩增结果。M：Maker III；1-6：阳性克隆。

图3示出了双裂解基因的PCR和融合结果。M：Maker III；1：E；2：SN；3：E-SN。

图4示出了pBAD+ES质粒PCR检测结果。M：Maker III；1-3：阳性克隆。

图5示出了上下游同源臂融合结果。M：Maker III；1：asd-U；2：asd-D；3：asd-arm。

图6示出了自杀质粒PCR检测结果，M：Maker III；1:阴性对照；2-3:自杀质粒。

图7鸡伤寒沙门菌asd缺失株PCR检测结果。M：Maker III；1、3、6：野生菌株；2、4、5、7、8：鸡伤寒沙门菌asd缺失株。

图8示出了pE4173阳性菌株PCR检测。M：Maker III；1-3：阳性菌株。

图9示出了pES4173阳性菌株PCR检测。M：Maker III；1-3：阳性菌株。

图10示出了重组菌在不同起始浓度下的裂解曲线。A：pE4173阳性菌株；B：pES4173阳性菌。

图11示出了鸡伤寒沙门菌菌影扫描电镜照片。A：5μm；B：2μm。

图12示出了外膜蛋白核酸和SDS-PAGE凝胶电泳。A.M:Marker III；1:OMP；B.M:Marker；1:OMP。

图13示出了各组鸡血清特异性抗体igG的动态变化P值≤0.05或者0.01认为著有统计学差异，*P<0.05，**P<0.01。

图14示出了攻毒后各组肝脏病理变化。1：菌影疫苗组肝脏；2：灭活疫苗组肝脏；3-4：空白对照组肝脏。

图15示出了攻毒后各组心脏和肠道病理变化。1：菌影疫苗组心脏；2：灭活疫苗组心脏；3：空白对照组心脏；4：菌影疫苗组肠道；5：灭活疫苗组肠道；6：空白对照组肠道。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

在本发明的下述实施例中，所用的到菌株和质粒如表1。

表1所用的菌株和质粒

参考NCBI-GeneBan上发布的phiX174噬菌体裂解基因，金黄色葡萄球菌核酸酶A以及鸡伤寒沙门菌的全基因序列，使用SnapGene软件设计了用于构建裂解质粒pBAD+E，pBAD+ES以及鸡伤寒沙门菌asd缺失株的所使用的引物(表2)，并由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

表2所用的引物

所用主要试剂如下表3。

表3所用的主要试剂

其他试剂以及配置方法如下：

LB培养基的配制：

胰蛋白胨5.0g、酵母提取物2.05g、氯化钠5.0g、琼脂粉7.05g，放入蓝盖瓶中，加适量去离子水，使用玻璃棒搅拌混匀溶解，然后定容至500mL，121℃高压灭菌20min后倒入无菌平板中；LB液体培养基配方为固体培养基减去琼脂粉。

营养肉汤培养基：

营养肉汤培养基粉末6.5g、琼脂粉7.5g，放入蓝盖瓶中，加适量去离子水，使用玻璃棒搅拌混匀溶解，定容至500mL，121℃高压灭菌15min后倒入无菌平板中；液体培养基配方为固体培养基减去琼脂粉。

TAE缓冲液与琼脂糖凝胶的配制：

Tris 4.84g、Na₂EDTA·2H₂O 0.744g、1.14mL冰醋酸放入锥形瓶中，加适量去离子水，使用玻璃棒混匀溶解，定容至1000mL。

1％琼脂糖凝胶：

琼脂糖1g、TAE缓冲液100mL，放入锥形瓶中加热溶解，加入核酸染料2μL，晃动锥形瓶混匀后在胶板上倒制。

实施例1裂解质粒和鸡伤寒沙门菌asd缺失株的构建

1裂解质粒pBAD+E的构建

1.1 E基因的克隆

以pET28α-E质粒为模板，E-1F和E-1R为上下游引物PCR克隆E基因，序列如下所示(SEQ ID NO.12)：

ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCTTGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACGTGCGTCAAAAATTACGTGCGGAAGGAGTGA

具体的PCR体系及反应程序如下表4和表5。

表4扩增E基因PCR反应体系(50μL)

表5 PCR反应程序

取6μL进行1％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，裂解基因E的条带大约为276bp与预期大小一致且单一。使用DNA纯化回收试剂盒(天根，目录号DP214)，纯化回收目的基因片段，具体操作步骤可参照试剂盒说明书。回收产物标记为E gene，使用核酸蛋白仪测定测定回收产物的DNA浓度，-20℃保存。

1.2 pBAD-hisA质粒抽提

将保存有pBAD-hisA质粒的大肠杆菌从-80℃冰箱中取出，复苏至LB(Amp)平板上，挑单克隆接种到LB液体培养基中，过夜振荡培养。使用质粒抽提试剂盒(天根，目录号DP103)，提取pBAD-hisA质粒，具体操作步骤参照说明书。提取的质粒使用核酸蛋白测定仪测定浓度，-20℃保存。

1.3 E基因和pBAD-hisA质粒酶切

使用NcoⅠ和HindⅢ限制性内切酶将pBAD-hisA质粒以及E基因酶切成具有相同黏性末端的DNA片段，反应条件(37℃，1.5h)，具体酶切体系如表6、表7。使用DNA纯化回收试剂盒纯化回收酶切产物，回收产物标记为pBAD-cut、E-cut，核酸蛋白测定仪测定相应DNA浓度，-20℃保存。

表6 pBAD-hisA质粒酶切体系(50μL)

表7基因E酶切体系(50μL)

1.4酶切片段的连接

将pBAD-cut、E-cut按一定比例混合，使用T4连接酶(16℃，过夜)将两段线性DNA连接在一起。连接反应体系见表8。

表8 pBAD-cut、E-cut连接体系(10μL)

1.5 TOP10感受态制备

(1)将TOP10过夜培养的菌液接种于含300mL LB液体培养基的锥形瓶中，恒温摇床中振荡培养(37℃，180r/min)，培养至菌液OD₆₀₀约为0.8。

(2)将菌液放于冰上静置15min。

(3)将菌液分装于预冷的50mL无菌离心管中，离心(4℃，5000r/min)10min后，弃去上清，收集菌体。

(4)40mL预冷的无菌ddH₂O重悬菌体，离心(4℃，5000r/min)10min后，弃去上清，收集菌体。

(5)重复步骤4。

(6)预冷的30mL无菌10％甘油重悬菌体，离心(4℃，5000r/min)10min后，弃去上清，收集菌体。

(7)预冷的1mL无菌10％甘油重悬菌体，100μL分装与无菌离心管中，标记，-80℃冰箱保存。

1.6连接产物的转化

(1)使用移液枪吸取连接产物2μL加入感受态细胞中，轻轻吹打混匀，注意不要有气泡产生。

(2)将混合物沿电转杯杯壁加入预冷电转杯的底部，轻弹电转杯使液面水平并擦干电转杯表面水渍。注意电转杯中不能有气泡。

(3)将电转杯放入电转仪，在1.5kv条件下进行电转。

(4)电转结束后，立即取出电转杯并加入600μL SOC液体培养基，使用移液枪轻轻吹打混匀。

(5)将菌液用无菌涂布棒均匀涂布于LB(Amp)固体培养基，37℃恒温培养箱中培养24h。

1.7转化子鉴定

(1)无菌牙签从平板上挑取单菌落在LB(Amp)固体培养基上扩大培养。

(2)随机挑取单菌落进行PCR鉴定。以单菌落为模板，E-1F和E-1R为上下游引物，具体的PCR体系如下表9，反应程序参照表5。

表9菌落PCR鉴定反应体系(10μL)

(3)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，条带大小与预期一致且单一。将阳性转化子扩大培养后抽提质粒，送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。以T7 Term为测序引物对pBAD+E质粒进行基因测序，将测序结果利用SnapGene进行比对，结果表明，基因已正确插入，无碱基突变。将确定构建成功的裂解质粒命名为pBAD+E。

2构建双裂解质粒pBAD+ES

2.1金黄色葡萄球菌MW2全基因组提取

从-80℃冰箱中取出金黄色葡萄球菌MW2，复苏至LB平板上，37℃恒温培养箱中过夜培养。从平板上挑取单菌落扩大培养后，使用DNA提取试剂盒抽提MW2基因组(天根，目录号DP302)，具体操作步骤可参照试剂盒说明书。

2.2 E基因和SN基因的克隆

(1)以pET28α-E质粒模板，E-2F和E-2R为上下游引物PCR扩增E基因；以模板MW2全基因组为模板，SN-1F和SN-1R为上下游引物PCR扩增SN基因。SN基因的序列如下(SEQ IDNO.13)

ATGGCAACTTCAACTAAAAAATTACATAAAGAACCTGCGACATTAATTAAAGCGATTGATGGTGATACGGTTAAATTAATGTACAAAGGTCAACCAATGACATTTAGACTATTATTGGTGGATACACCTGAAACAAAGCATCCTAAAAAAGGTGTAGAGAAATATGGTCCTGAAGCAAGTGCATTTACGAAAAAAATGGTAGAAAATGCAAAGAAAATTGAAGTCGAGTTTGACAAAGGCCAAAGAACTGATAAATATGGACGTGGCTTAGCGTATATTTATGCTGATGGAAAAATGGTAAACGAAGCTTTAGTTCGTCAAGGCTTGGCTAAAGTTGCTTATGTTTATAAACCTAACAATACACATGAACAACTTTTAAGAAAAAGTGAAGCACAAGCGAAAAAAGAGAAATTAAATATTTGGAGCGAAGACAACGCTGATTCAGGTCAATAA

具体的PCR体系及反应程序参照表4和表5。

(2)取6μL进行1％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。SN基因的条带大小约为450bp，融合基因ES大小约为740bp左右，结果与预期大小一致。DNA纯化回收试剂盒纯化回收目的基因片段，回收产物分别标记为E和SN，使用核酸蛋白测定仪测定相应DNA浓度，-20℃保存。

2.3 E基因和SN基因融合

以纯化回收的E和SN作为模板，E-2F和SN-1R为上下游引物进行融合PCR。PCR体系如表10。融合产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，如鉴定结果与预期大小一致且单一，DNA纯化回收试剂盒纯化回收目的基因片段，回收产物分别标记为ES，ES基因的序列如下(SEQ IDNO.14)：

ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCTTGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACGTGCGTCAAAAATTACGTGCGGAAGGAGTGACCAACAGTATATAGTATGGCAACTTCAACTAAAAAATTACATAAAGAACCTGCGACATTAATTAAAGCGATTGATGGTGATACGGTTAAATTAATGTACAAAGGTCAACCAATGACATTTAGACTATTATTGGTGGATACACCTGAAACAAAGCATCCTAAAAAAGGTGTAGAGAAATATGGTCCTGAAGCAAGTGCATTTACGAAAAAAATGGTAGAAAATGCAAAGAAAATTGAAGTCGAGTTTGACAAAGGCCAAAGAACTGATAAATATGGACGTGGCTTAGCGTATATTTATGCTGATGGAAAAATGGTAAACGAAGCTTTAGTTCGTCAAGGCTTGGCTAAAGTTGCTTATGTTTATAAACCTAACAATACACATGAACAACTTTTAAGAAAAAGTGAAGCACAAGCGAAAAAAGAGAAATTAAATATTTGGAGCGAAGACAACGCTGATTCAGGTCAATAA

表10 E和SN融合PCR反应体系(10μL)

2.4 ES基因和pBAD-hisA质粒酶切

使用NcoⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶将pBAD-hisA质粒以及ES基因，酶切成具有相同黏性末端的DNA片段，反应条件(37℃，1.5h)。具体酶切体系参照上文，使用DNA纯化回收试剂盒纯化回收酶切产物，标记为pBAD-cut、ES-cut核酸蛋白测定仪测定相应DNA浓度，保存备用。

2.5 pBAD-cut、ES-cut连接

将pBAD-cut、ES-cut按一定比例混合，使用T4连接酶(16℃，过夜)将两段线性DNA连接在一起。连接反应体系参照表8。

2.6连接产物转化

将连接产物电转入TOP10感受态中，具体步骤参照上文。

2.7转化子鉴定

将单菌落在固体培养基上扩大培养，随机挑取单菌落进行PCR鉴定。以单菌落为模板，E-2F和SN-1R上下游引。具体的PCR体系参照表9，反应程序参照表3。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，条带大小与预期一致且单一。

挑阳性转化子扩大培养，抽提菌株质粒，送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。使用SnapGene将测序结果与预期的序列进行对比，结果表明，基因已正确插入，无碱基突变。将构建成功的裂解质粒命名为pBAD+ES，阳性菌株和质粒及时保存于-80℃冰箱。

3 asd自杀质粒的构建

3.1基因组的抽提

将c4173菌株从-80℃冰箱复苏至LB平板后，37℃过夜培养。挑取单克隆接种于液体培养基中，过夜振荡培养。使用DNA提取试剂盒抽提c4173全基因组，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

3.2 asd基因上下游同源臂的扩增和回收

以c4173全基因组为模板，用引物asd-1F/1R和asd-2F/2R分别PCR扩增asd基因的上下游同源臂DNA片段(大小约300bp)。具体PCR体系和反应程序参照上文。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5。上下游同源臂大小分别为300bp，315bp与预期大小一致。纯化回收目的基因片段。回收产物分别标记为asd-U和asd-D。使用核酸蛋白测定仪测定相应DNA浓度，-20℃保存。

3.3 asd基因上下游同源臂的融合和回收

以纯化回收的asd-U和asd-D为模板，以asd-1F/asd-2R为上下游引物，进行融合PCR。具体PCR反应体系和反应程序参照上文，把2×prime STAR Max高保真酶替换成2×TaqDNA聚合酶，目的是使融合产物两端加上“A”碱基。融合产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示，融合后600bp左右，与预期大小一致且条带单一，DNA纯化回收试剂盒回收目的基因片段，回收产物分别标记为asd-arm，核酸蛋白测定仪测定相应DNA浓度，-20℃保存备用。

3.4 pRE112质粒的抽提和酶切

将保存有pRE112质粒的7213菌株从-80℃冰箱复苏至LB平板(Cm；DAP)，37℃过夜培养。从平板上挑取单菌落接种于液体培养基中(Cm；DAP)，过夜振荡培养。使用质粒提取试剂盒抽提pRE112质粒，核酸蛋白测定仪测定相应DNA浓度。

使用AhdⅠ限制性核酸内切酶将pRE112质粒酶切成线性片段，反应条件为(37℃，1.5h)，具体酶切体系参照上文。使用DNA纯化回收试剂盒纯化回收酶切产物，标记为pRE112-cut，核酸蛋白测定仪测定相应DNA浓度，-20℃保存。

3.5同源臂片段与质粒的连接

将加pRE112-cut和asd-arm按一定比例混合，进行过夜连接(16℃)，连接反应体系见表11。

表11 pRE112-cut和asd+arm连接体系(20μL)

3.6 7232感受态的制备

具体参照上文TOP10感受态制备步骤。

3.7连接产物的转化

将连接产物电转化入7232感受态细胞中，具体步骤参照上文，培养基更换为LB(Cm)固体培养基上。

3.8转化子的鉴定

从培养基上随机挑取单菌落，用平板划线的方式扩大培养，进性菌落PCR鉴定。具体参照上文裂解质粒的菌落PCR检测。

自杀质粒PCR结果如图6所示，表明asd上下游同源臂已插入载体，成功构建asd自杀质粒。

将阳性克隆扩大培养后抽提质粒，将构建成功的自杀质粒命名“pss304”，阳性菌株和质粒及时保存于-80℃冰箱。

4鸡伤寒沙门菌asd缺失株的构建

4.1同源重组供体菌的制备

同源重组的供体菌是含有自杀质粒pss304的7213工程菌株。将自杀质粒pss304电转化转入7213菌株。7213菌株感受态制备，电转化以及阳性菌株鉴定参照上文。

4.2接合转移

(1)将受体菌(SG)和供体菌(含pss304的7213菌株)分别复苏至LB平板上以及含的LB(Cm；DAP)平板上，过夜培养。

(2)挑取c4173和7213(含pss304)的单菌落分别接种于5mL LB和LB(DAP；Cm)液体培养基中，过夜振荡培养。

(3)将过夜培养的菌液按1:100的比例接种于液体培养基中，振荡培养(37℃，180r/min)至OD₆₀₀≈0.6。

(4)分别取200μL受体菌和400μL供体菌混加入无菌离心管管中，轻轻振荡混匀，加入正置的LB固体培养基中，置于37℃恒温培养箱中，使培养基端倾斜少许，培养24h。此阶段SG基因组与自杀质粒开始整合。

4.3氯霉素正筛选

(1)用接种环将接合转移后的菌苔从平板上刮下，在LB(Cm)平板梯度划线稀释，37℃恒温培养箱中培养，直至有单菌落出现。如培养基上仍为菌苔，可减少菌量后重复操作。

(2)挑取经第一次氯霉素筛选后长出的单菌落，再次划线于LB(Cm)固体培养基上，37℃恒温培养箱培养10～16h。

4.4蔗糖负筛选

(1)分批次挑取LB(Cm)平板上筛选出的阳性单菌落，分别接种于3mL LB液体培养基，振荡培养至OD₆₀₀约为0.3。

(2)将菌液分别稀释10²和10³倍后，各取100μL菌液涂布于不含NaCl，含有10％蔗糖的LB平板，常温培养24-48h。

4.5菌落PCR检测

挑取蔗糖平板上生长出的单菌落，分别在LB(Cm)平板和LB平板以及LB(DAP)平板板划线，37℃恒温培养12h，观察平板上的生长情况。如果LB(Cm)平板和LB平板不生长而LB(DAP)板上生长良好的为疑似正确突变株。

以疑似正确突变株作为模板，以asd-1F和asd-2R为引物进行菌落PCR鉴定，PCR反应体系表和程序参照表9以及表4。PCR扩增产物用于1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。结果如图7，缺失株和野生株PCR产物大小与预期一致。鉴定正确的突变株保存在-80℃冰箱，并做好标记。

实施例2鸡伤寒沙门菌菌影的制备

1裂解菌株的制备

1.1鸡伤寒沙门菌asd缺失株感受态制备

制备鸡伤寒沙门菌asd缺失株的感受态细胞，具体步骤参照实施例1TOP10感受态制备步骤，其中LB培养基要加入DAP。

1.2裂解质粒电转感受态及鉴定

将裂解质粒pBAD+E和pBAD+ES分别电转化入鸡伤寒沙门菌asd缺失株感受态细胞中，具体电转化步骤参照实施例1。涂布棒涂板时，培养基为营养肉汤培养基(Amp；DAP)，37℃培养24h，观察平板表面有无疑似阳性转化子长出。将疑似阳性转化子在平板上扩大培养后，以E-1F/E-1R和E-2F/SN-1R为上下游引物进行菌落PCR鉴定，PCR扩增产物用于1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

结果如图8、图9所示，可知条带大小与预期大小一致(E基因：276bp；E+SN：726bp)，且条带单一，无明显杂带，可以确定该菌株为含有裂解质粒的阳性菌株。鉴定正确的阳性菌株分别命名为pE4173，pES4173。

2裂解质粒最优裂解条件的确定

(1)将pE4173，pES4173菌株分别接种取于5mL营养肉汤培养基(Amp；DAP)中，过夜振荡培养(37℃，180r/min)。

(2)将过夜培养菌液接种于含有50mL营养肉汤(Amp；DAP)液体培养基的锥形瓶中，恒温摇床中振荡培养(37℃，180r/min)，培养至菌液OD₆₀₀值为0.2、0.4、0.6、0.8左右时停止培养。无菌条件下，从每个锥形瓶中取100μL菌液置于无菌EP管中，4℃冰箱中备用。

(3)向每个锥形瓶中加入适量L(+)阿拉伯糖，轻轻摇晃锥形瓶振荡混匀，将锥形瓶中的菌液以5mL每管的体积分装于无菌玻璃试管中，每组做好标记。

(4)恒温摇床中振荡培养(37℃，180r/min)，每隔30min从每组中取出一个试管，分光光度计测量菌液OD₆₀₀值并记录。

(5)当OD₆₀₀值趋于稳定，不再变化时停止培养，从试管取出100μL菌液置于无菌EP管中，备用。

(6)从EP管中取出诱导前以及诱导后的菌液，用无菌PBS溶液倍比稀释，稀释至1.0×10^-9。从每个梯度取出100μL菌液包被Amp+DAP营养肉汤培养基上，倒置风干，置于37℃恒温培养箱过夜培养，每一个梯度重复三次。计算平板上的菌落数，三次重复取平均值。

(7)绘制裂解曲线，计算裂解率。裂解率＝(1-诱导后CFU/诱导前CFU)×100％，最优裂解条件就是裂解率最高对应的初始OD₆₀₀值和诱导持续时间。

(8)比较两个裂解菌株的裂解率和诱导持续时间，初探两个裂解质粒的优劣。

重组菌pE4173和pES4173的OD₆₀₀值变化曲线如图10A和B所示。通过观察比较两个重组菌在不同起始浓度下的裂解曲线发现：在加入诱导剂后，细菌增殖速度低于裂解速度，菌液OD₆₀₀值不断下降；当细菌增殖速度与裂解速度相等时，OD₆₀₀值逐渐趋于平缓；一段时间后，细菌增殖速度大于裂解速度，OD₆₀₀渐渐升高。裂解曲线的走势与预期一致。同时发现，不同起始浓度的两个重组菌分别在诱导2h和2.5h后OD₆₀₀值最低。

两个重组菌株在不同起始浓度下其裂解率如表12。pE4173在OD₆₀₀值＝0.4，诱导2.5h，裂解率最高，可达99.38％；pES4173质粒在OD₆₀₀值＝0.4，诱导2h，裂解率最高，可达99.85％。在相同起始浓度的条件下，重组菌pES4173的裂解率比重组菌pE4173要高，其诱导时间相对更短。因此，综合比较两个重组菌的裂解曲线和裂解率，可以初步得出，相同条件下，双裂解质粒pBAD+ES的裂解性能比单裂解质粒pBAD+E更优。

表12两个重组菌在不同起始浓度下的裂解率

3制备鸡伤寒沙门菌asd缺失株菌影

(1)将pES4173过夜菌液接种于含200mL(Amp；DAP)营养肉汤液体培养基的锥形瓶中，恒温摇床振荡培养(37℃，200r/min)，培养至OD₆₀₀约为0.4，加入3mL阿拉伯糖溶液，混匀，振荡培养2h。

(2)将200mL诱导后的菌液平均分装于50mL无菌离心管中，4℃，5000rpm，离心10min，弃去上清。

(3)无菌PBS溶液洗涤菌体沉淀，4℃，5000rpm，离心10min，弃去上清。

(4)重复步骤3。

(5)将收集的菌体置于20mL西林瓶中，-20℃预冻12h，-80℃预冻4h。

(6)将预冻后的菌体置于冻干机中，过夜冻干后压盖。将鸡伤寒沙门菌asd缺失株菌影干粉置于-80℃冰箱中保存。

4鸡伤寒沙门菌菌影扫描电镜观察

(1)将pES4173过夜菌液接种于含有50mL新鲜营养肉汤(Amp；DAP)液体培养基的锥形瓶中，恒温摇床中振荡培养(37℃，180r/min)，培养至菌液OD₆₀₀值约为0.4。

(2)向锥形瓶中加入1mL L(+)阿拉伯糖溶液，振荡混匀，恒温摇床中振荡培养(37℃，180r/min)培养约1.5h。

(3)将诱导后的菌液5000rpm离心1000min，加2.5％戊二醛4℃过夜固定菌体。

收集处理菌影，进行扫描电镜观察，观察结果如图11。从图11中可以看出某些鸡伤寒沙门菌未裂解，还保留的原有的细菌形态，呈长杆状，如图11A中箭头1所指处。由于某些细菌细胞内容物已经在压强作用下流出，菌体已发生了明显的皱缩，如图11B中箭头2所指处。菌影的两端或中部可见大小不等的孔洞，如图11B中红色箭头3所指处，是菌影的最显著特征。

实施例3鸡伤寒沙门菌菌影免疫效果的检测

1鸡伤寒沙门菌野生株半数致死量测定

(1)使用平板计数的方法，确定SG野生株在OD₆₀₀＝0.9时的菌落数，重复操作3次，取平均值。

(2)参照实施例2方法准备鸡伤寒沙门菌菌液，分装于50mL无菌离心管中，离心(4℃，5000r/min)10min。

(3)弃去上清，无菌PBS溶液重悬，离心(4℃，5000r/min)10min。

(4)重复步骤3。

(5)根据鸡伤寒沙门菌野生株的CFU值，将菌体通过稀释或者浓缩得到浓度为1.0×10⁹、1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁵CFU/mL的菌液。

(6)口服接种7日龄罗曼白鸡，100μL/只，每组15只，接种后观察并记录2周内罗曼鸡的发病死亡情况。

(8)将试验数据带入改良寇氏法计算计算鸡伤寒沙门菌野生株的LD₅₀。

根据试验结果，具体如表13，使用改良寇氏法计算鸡伤寒沙门菌的半数致死量，野生型鸡伤寒沙门菌LD₅₀为5×10⁵cfu。

表13鸡伤寒沙门菌野生株攻毒结果

2鸡伤寒沙门菌菌影疫苗和灭活疫苗的制备

2.1鸡伤寒沙门菌灭活疫苗的制备

(1)将鸡伤寒沙门菌野生株过夜菌液接种于100mL液体LB培养基中，振荡培养至OD₆₀₀值为0.9。

(2)将菌液放入高压灭菌锅中，121℃灭菌20min。

(3)灭活菌液室温冷却至室温，分装于无菌离心管中，离心(4℃，5000rpm)10min，弃去上清。

(4)无菌PBS溶液重悬菌体，离心(4℃，5000rpm)10min，弃去上清。

(5)重复步骤4。

(6)将收集的菌体用无菌PBS溶液将菌体沉淀稀释为1.0×10⁹CFU/mL的菌液，4℃保存备用。

2.2鸡伤寒沙门菌菌影疫苗的制备

(1)将pES4173过夜菌液1：100接种于200mL(Amp；DAP)营养肉汤液体培养基的锥形瓶中，培养至OD600nm≈0.4，加入L(+)阿拉伯糖溶液，诱导2h。

(2)将200mL诱导后的菌液分装于50mL无菌离心管中，离心10min(4℃，5000rpm)，弃去上清。

(3)无菌PBS溶液洗涤菌体沉淀，离心(4℃，5000rpm)10min，弃去上清。

(4)重复步骤3。

(5)将收集的菌体使用无菌PBS稀释，3号麦氏比浊管进行对比，稀释成1.0×10⁹cfu/mL的菌液。

2.3无菌试验

将制备的鸡伤寒沙门菌菌影疫苗和高温灭活苗随机抽样，用无菌PBS溶液稀释，分别吸取100μL接种于营养肉汤和营养肉汤(DAP)平板上，37℃培养24h，如果平板上无细菌生长，证明其已完全灭活。

菌影疫苗经平板计数试验检测结果表明，经37℃培养24h,如果平板上无细菌生长，证明菌影疫苗中无活菌。

3疫苗保护效果的测定

3.1分组免疫

(1)雏鸡准备与分组

将4日龄罗曼蛋鸡，适应性饲养一周。随机分成3组，每组20只，每日更换干净饲料及饮水，10日龄开始免疫接种。

(2)免疫程序

免疫前禁水禁食12h，通过颈部皮下注射的方式对每只鸡进行免疫，空白对照组按照相同方式接种等体积的无菌PBS溶液，免疫每天观察鸡群的精神状态和死亡情况。具体免疫程序如表14。

(3)样品采集与处理

分别在首次免疫前3天、首次免疫和第二次免疫后10天，翅下静脉采血。37℃静置2小时后，置于4℃冰箱中过夜以充分析出血清，4000rpm离心20min，收集血清，分装后于-80℃冰箱保存。

表14免疫分组和免疫程序

3.2鸡伤寒沙门菌外膜蛋白OMP提取

(1)挑鸡伤寒沙门菌单克隆接种在5mL LB液体培养基中，恒温摇床振荡培养(37℃，200r/min)。过夜菌液1：100稀释，振荡培养至OD_600nm≈0.9。离心(4℃，5000rpm)10min，弃去上清液收集菌体。

(2)菌体用10mM HEPES缓冲液重悬，离心(4℃，5000rpm)10min，弃去上清液收集菌体。

(3)重复步骤(2)，菌体重悬于30mL HEPES缓冲液。

(4)将装有菌液的离心管放入适量冰水混合中，超生破碎仪破碎菌液，直至菌液清亮。

(5)将破碎菌液分装于离心管中，超速离心(4℃，12000rpm)20min，弃去上清。

(6)向菌液中加入0.2mL 2％N-十二烷基肌氨酸钠溶液，室温孵育30min，轻轻振荡混匀，细胞质膜在此阶段形成。

(7)超速离心(4℃，12000rpm)20min，弃去上清，用0.2mL HEPES缓冲液重悬菌体。

(8)超速离心(4℃，12000rpm)5min，弃去上清，用0.2mL HEPES缓冲液重悬菌体，-20℃保存备用。

(9)使用蛋白含量检测试剂盒检测提取的外膜蛋白OMP的含量，同时将提取的外膜蛋白与proteinloading buffer混匀，进行SDS-PAGE凝胶电泳，检测外膜蛋白的纯度。

检测结果如图12所示，结果显示提取的外膜蛋白无明显的核酸污染。

3.3抗体水平检测

以提纯的鸡伤寒沙门菌OMP为抗原包被ELISA板，采用间接ELISA法测定血清中的抗体水平。

(1)抗原包被

将提取的鸡伤寒沙门菌OMP按照0.2mg/mL浓度稀释于包被液中，每孔100μL加入96孔板，事先预留2排孔作为标准孔。将Purified mouse igG1.k isotope contral抗原按1μg/mL的浓度稀释于包被液中，每标准孔100μL加入标准孔中。4℃冰箱中过夜包被。向96孔板中加入无菌PBST溶液，每孔300μL，静止30s，甩去板中液体，重复三次，在干净报纸上拍干。随后加入封闭液，每孔300μL，室温封闭2h，洗涤三次，拍干备用。

(2)一抗孵育

将血清以1:200的比例稀释于抗体稀释液中，每孔100μL加入96孔板中；将MouseIgG2b-UNLB按1μg/mL的浓度稀释于抗体稀释液中，事先在标准孔中除第一孔外，加入100μL抗体稀释液，在标准孔的第一孔中加入200μL Mouse IgG2b-UNLB，用枪头从第一孔吸取100μL加入第二孔，轻轻吹打混匀，不要产生气泡，从第二孔中吸取100μL加入第三孔，以此类推，最后一孔弃去100μL。室温孵育2h，PBST溶液洗涤3次，拍干备用。

(3)二抗孵育

1:5000稀释Goat Anti-Chicken IgG-BIOT和Goat Anti-Mouse IgG.Human ads-BIOT二抗，每孔100μL加入样本孔以及标准孔中，室温孵育2h，无菌PBST溶液洗涤3次，拍干备用。

(4)AP底物孵育

使用PBS溶液将AP底物稀释5000倍，每孔100μL加入96孔板中，室温孵育1h，PBST溶液洗涤3次，拍干备用。

(5)显色与读数

向含有AP底物的96板中加入浓度为1mg/mL显色液PNPP，每孔10μL，室温避光孵育15-30min；向96孔板中加入100μL浓度0.2mol/mL的NaOH溶液终止反应并于酶标仪中读取405nm波长处的吸光值。

ELISA检测结果如图13所示，结果表明在免疫前各组免疫水平差异不显著；在第一次免疫后，菌影疫苗组免疫水平与灭活疫苗组差异不显著，但显著高于空白对照组；第二次后免疫后，菌影疫苗组和灭活疫苗组所产生的免疫水平显著高于空白对照组，同时菌影疫苗组免疫水平与灭活疫苗组差异显著。

3.4攻毒

具体操作参照1，使用200倍LD₅₀的浓度的菌液(1.0×10⁹CFU/mL)进行攻毒。攻毒前禁食禁水12h，每只100μL，口服攻毒；攻毒后，观察6h后再喂食喂水。观察并记录3周内罗曼鸡的发病死亡，采食和饮水情况；死亡的鸡只进行病理解剖观察各组织病理变化。

3.4.1攻毒后的免疫保护情况

攻毒4天后，空白对照组大部分鸡只出现精神沉郁，闭眼缩头呆立，被毛粗乱，爱扎堆，常拥挤在一起，不喜饮食，喜饮，拉绿色糊状稀粪有时会带血。攻毒7天后出现死亡，死亡2只，死亡鸡仰躺，口鼻部有水样粘液，在攻毒后10天左右，死亡率到达顶峰；灭活疫苗组和菌影疫苗组有部分鸡出现空白对照组的情况，但无死亡现象。

10天后，灭活疫苗组和菌影组均出现死亡现象，但大部分鸡只精神尚可，有少部分鸡嗜睡；精神不振；食欲饮欲不佳。16天后，各组鸡只精神明显好转，无死亡情况。通过计算各组保护率发现，菌影疫苗组对鸡伤寒沙门菌的保护效果明显高于灭活疫苗组和空白对照组，具体情况如表15。

表15鸡伤寒沙门菌攻毒后各组保护率

3.4.2攻毒后各组临床病理变化

如图14、图15所示，攻毒后，菌影疫苗组肝脏、脾脏等实质器官无明显病理变化，心脏表面有少量类似马立克氏病肿瘤的白色结节，肠道呈粉红色，无明显病变，表面毛细血管轻微充血。

灭活疫苗组肝脏有轻微充血肿胀，心脏表面有白色结节，心脏轻微变形，心包增厚，内含有纤维素渗出液，肠道充血肿胀，肠壁增厚，肠道表面毛细血管充血，胰腺充血肿大。

空白对照组肝脏肿大变形，覆盖整个腹腔，胆囊肿大，肝脏背面有胆囊印迹。心肌上布满白色结节，心脏显著变形，心包增厚，内含黄色或纤维素渗出液，肠道出血，肠壁变薄，表面有坏死性的结节，肠道内有大量墨绿色粪便。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种鸡病原细菌菌影及其制备方法和应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catgccatgg tacgctggac tttgtgggat 30

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccaagcttt cactccttcc gcacgtaatt ttt 33

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg tacgctggac tttgtgggat a 31

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actatatact gttggtcact ccttccgcac gtaatttttg 40

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaacagtat atagtatggc aacttcaact aaaaaattac ata 43

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccggaattct tattgacctg aatcagcgtt gtct 34

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggaaacggg cacatatcga taccg 25

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctgcaatag ctaacaaaaa gcagccaaag tcgcaag 37

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctgcttttt gttagctatt gcagcgctta tcgggc 36

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttgtggcgtc actccatctc actg 24

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctagttatt gctcagcgg 19

<210> 12

<211> 276

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggtacgct ggactttgtg ggataccctc gctttcctgc tcctgttgag tttattgctg 60

ccgtcattgc ttattatgtt catcccgtca acattcaaac ggcctgtctc atcatggaag 120

gcgctgaatt tacggaaaac attattaatg gcgtcgagcg tccggttaaa gccgctgaat 180

tgttcgcgtt taccttgcgt gtacgcgcag gaaacactga cgttcttact gacgcagaag 240

aaaacgtgcg tcaaaaatta cgtgcggaag gagtga 276

<210> 13

<211> 453

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggcaactt caactaaaaa attacataaa gaacctgcga cattaattaa agcgattgat 60

ggtgatacgg ttaaattaat gtacaaaggt caaccaatga catttagact attattggtg 120

gatacacctg aaacaaagca tcctaaaaaa ggtgtagaga aatatggtcc tgaagcaagt 180

gcatttacga aaaaaatggt agaaaatgca aagaaaattg aagtcgagtt tgacaaaggc 240

caaagaactg ataaatatgg acgtggctta gcgtatattt atgctgatgg aaaaatggta 300

aacgaagctt tagttcgtca aggcttggct aaagttgctt atgtttataa acctaacaat 360

acacatgaac aacttttaag aaaaagtgaa gcacaagcga aaaaagagaa attaaatatt 420

tggagcgaag acaacgctga ttcaggtcaa taa 453

<210> 14

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atggtacgct ggactttgtg ggataccctc gctttcctgc tcctgttgag tttattgctg 60

ccgtcattgc ttattatgtt catcccgtca acattcaaac ggcctgtctc atcatggaag 120

gcgctgaatt tacggaaaac attattaatg gcgtcgagcg tccggttaaa gccgctgaat 180

tgttcgcgtt taccttgcgt gtacgcgcag gaaacactga cgttcttact gacgcagaag 240

aaaacgtgcg tcaaaaatta cgtgcggaag gagtgaccaa cagtatatag tatggcaact 300

tcaactaaaa aattacataa agaacctgcg acattaatta aagcgattga tggtgatacg 360

gttaaattaa tgtacaaagg tcaaccaatg acatttagac tattattggt ggatacacct 420

gaaacaaagc atcctaaaaa aggtgtagag aaatatggtc ctgaagcaag tgcatttacg 480

aaaaaaatgg tagaaaatgc aaagaaaatt gaagtcgagt ttgacaaagg ccaaagaact 540

gataaatatg gacgtggctt agcgtatatt tatgctgatg gaaaaatggt aaacgaagct 600

ttagttcgtc aaggcttggc taaagttgct tatgtttata aacctaacaa tacacatgaa 660

caacttttaa gaaaaagtga agcacaagcg aaaaaagaga aattaaatat ttggagcgaa 720

gacaacgctg attcaggtca ataa 744

Claims

1.一种具备双裂解功能的ES基因，其特征在于，具有SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列序列。

2.(1)E基因和SN基因或(2)权利要求1所述的ES基因在制备具有双裂解功能的载体中的应用，其特征在于，所述E基因和SN基因分别具有SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.12所示核苷酸序列。

3.一种具有双裂解功能的载体，其特征在于，包括(1)E基因和SN基因或(2)权利要求1所述的ES基因，其中，所述E基因和SN基因分别具有SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示核苷酸序列。

4.权利要求3所述的载体在制备用于构建鸡病原细菌菌影的试剂盒中的应用。

5.一种用于构建鸡病原细菌菌影的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的载体。

6.根据权利要求3所述的载体或权利要求4所述的应用或权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为pBAD-hisA载体。

7.一种构建鸡病原细菌菌影的方法，其特征在于，包括利用权利要求3所述的载体转化鸡伤寒沙门菌asd缺失株的步骤。

8.一种鸡病原细菌菌影，其特征在于，其是利用权利要求5所述的试剂盒，或权利要求7所述的方法制备得到的。

9.权利要求8所述的鸡病原细菌菌影在制备用于预防鸡病原细菌感染的疫苗中的应用。

10.一种用于预防鸡病原细菌感染的疫苗，其特征在于，包括权利要求8所述的鸡病原细菌菌影。