CN110283843A

CN110283843A - 一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法

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Publication number: CN110283843A
Application number: CN201910598288.XA
Authority: CN
Inventors: 邹修平; 陈善春; 王丽娟; 何永睿; 彭爱红; 龙琴
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-07-04
Filing date: 2019-07-04
Publication date: 2019-09-27
Anticipated expiration: 2039-07-04
Also published as: CN110283843B

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，属于植物基因工程领域，通过构建S1和S2 sgRNA指导的CRISPR/Cas9编辑载体，利用农杆菌介导法转化晚锦橙上胚轴，使CsWRKY22蛋白功能丧失或减少，实现了CsWRKY22基因在柑橘基因组中的成功编辑，获得CsWRKY22突变体转基因植株，增强植株对柑橘溃疡病的抗性，获得溃疡病抗性高的柑桔。

Description

一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法。

背景技术

柑橘溃疡病是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一。几乎能危害所有的柑橘品种。柑橘溃疡病菌通过侵染柑橘的叶片、枝条以及果实从而引起落叶、枯枝和落果，导致果品产量下降，品质变劣，严重影响柑橘的经济价值。柑橘溃疡病病原菌为柑橘黄单胞杆菌致病变种Xanthomonas citri subsp.citri(Xcc)，该病原菌是热带和亚热带国家商业柑橘中最具破坏性的病原体之一，形状呈杆状，是革兰氏阴性细菌，具有一个极性鞭毛，生长在好氧的环境，定殖于寄主组织的细胞间隙。目前，柑橘生产上尚无从根本上解决柑橘溃疡病病害的技术措施，只能采取销毁发病植株或发病果园等一系列破坏性措施，来彻底清除柑橘溃疡病。为此，对果农来说，经济损失非常严重。针对柑橘溃疡病问题无法完全解决，因此需要寻找更好的方法。利用抗性种质资源，结合植物基因工程手段挖掘抗病基因，并培育抗病品种增强柑橘对溃疡病的抗性，是最为经济，同时也是从根本上解决这一难题的最为有效的途径。

由于柑橘中大部分品种都有雄(雌)性不育、较长的童期、基因组高度的杂合、多胚性及珠心胚干扰严重等的特点，通过常规育种方法进行柑橘溃疡病抗性改良是困难且耗时的。与传统育种相比，植物基因工程具有周期短、效率高以及可控性强等优点，已成为柑橘品种改良一种重要手段。自1989年Kobayashi等利用原生质体为受体获得转基因胚性愈伤以来，柑橘转基因技术研究取得了较大的进展。中国农业科学院柑桔研究所陈善春等[6]进行柑橘抗溃疡病基因工程育种研究，先后将抗菌肽D基因、Cecropin B基因和Shiva A基因双基因转入溃疡病高度易感的主栽柑桔品种锦橙、新会橙、沙田柚、脐橙等中，经过转基因植株温室和田间抗病性评价，筛选到11个转基因株系对柑橘溃疡病感病性显著降低。随后，许多与抗病相关的外源基因相继被导入柑橘基因组中，并获得了许多形状改良的转基因材料，比如水稻Xa21、欧文氏菌hrpN、苹果MdSPDS、辣椒Bs2基因等，这些基因均不同程度地提高了转基因植株对柑橘溃疡病的抗病性。通过转入抗体基因的方法获得柑橘抗溃疡病体系的研究也取得了一定成果。例如，pthA基因是柑橘溃疡病亚洲型菌系的致病基因，胡春华等克隆出pthA基因，并制备出pthA抗体得到了单链抗体基因并导入甜橙中，获得了溃疡病抗性提高的转基因植株。特别是，近年来开始兴起的CRISPR/Cas9技术已成为柑橘品种改良的重要途径之一，该技术能通过定向精确的修饰基因组，在动植物基因功能和作物遗传改良研究中得到广泛应用。

最近，CRISPR/Cas9技术已成功用于柑橘分子生物学研究中。Peng等对柑橘溃疡病感病基因CsLOB1启动子进行CRISPR/Cas9靶向敲除从而获得了对柑橘溃疡病抗性显著提高的株系。同时，美国弗罗里达大学Jia等利用CRISPR/Cas9技术对邓肯葡萄柚中CsLOB1基因编码序列进行编辑，成功得到六株编辑突变体株系，对突变体株系进行抗病性评价，接种溃疡病病菌四天后有四株无明显症状产生，虽在接种后期发生病变，但病变组织与野生型相比较小，且其中有两株对柑橘溃疡病表现了明显的抗性。以上研究结果暗示，在柑橘中敲除溃疡病感病相关基因可能会增强柑橘对溃疡病的抗性。

我们实验室前期研究表明，植物免疫反应PTI(PAMP-triggered immunity)的标志基因CsWRKY22与柑橘品种溃疡病感病性紧密相关，在晚锦橙中超量表达CsWRKY22显著增强了植株对溃疡病的感病性，暗示CsWRKY22是柑橘溃疡病的一个感病基因，但沉默或敲除CsWRKY22能否增强柑橘溃疡病抗性有待深入研究。因此，本发明拟在此基础上，进一步利用CRISPR/Cas9技术对柑橘CsWRKY22基因进行编辑，以期获得对溃疡病有显著抗性的突变体柑橘株系。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明公开一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，该方法对柑橘感病基因CsWRKY22进行定点编辑，获得溃疡病抗性高的柑桔。

本发明通过下述技术方案实现：

一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，利用CRISPR/Cas9技术定点突变柑橘感病基因CsWRKY22，使其蛋白功能丧失或减少，增强植株对柑橘溃疡病的抗性，获得溃疡病抗性提高的柑桔。

其中，柑橘感病基因CsWRKY22为CsWRKY22^G和CsWRKY22^c等位基因，含有两个内含子和三个外显子。用于编辑CsWRKY22的植物表达载体为含有特异靶向CsWRKY22基因sgRNA引导序列的CRISPR/Cas9载体。

CsWRKY22^G和CsWRKY22^c的编码序列如SEQ ID No：9和SEQ ID No：10所示。

进一步的，用于高效特异指导Cas9编辑CsWRKY22基因的sgRNA序列为S1，S2，S3，S4。

进一步的，用于创制突变体的转化方法为农杆菌介导的柑橘遗传转化方法，具体为：

将CsWRKY22基因sgRNA引导序列的CRISPR/Cas9载体导入柑橘中，实现CsWRKY22基因定点突变，并获得抗性显著提高的突变体植株。所述突变体植株包括CsWRKY22序列突变的转基因植株和材料。

具体的，上述方法包括以下几个步骤：1)获得柑橘CsWRKY22基因组序列；2)获得敲除CsWRKY22基因所需的sgRNA序列；3)将步骤2)中得到的sgRNA序列构建Cas9植物表达载体；4)将步骤3)得到的植物表达载体整合到柑橘基因组中；5)将通过步骤4)获得的柑橘进行进一步的培养，栽培，并获得转基因的柑橘植株；6)将通过步骤5)获得的转基因柑橘进行进一步的检测筛选出突变体植株；7)将通过步骤6)获得的突变体植株进行进一步的溃疡病抗性评价。

其中，步骤1)中所述的CsWRKY22基因组序列是以晚锦橙DNA为模板克隆得到的。

其中，步骤2)中所述的敲除CsWRKY22基因所需的sgRNA序列首先由步骤1中克隆得到的CsWRKY22基因序列特征为模板，利用体外活性检测筛选得到的。

其中，步骤3)中所述的sgRNA序列与Cas9植物表达载体融合以构建表达载体的方法为本领域的常规方法，使用的载体是质粒载体puc119-gRNA和植物表达载体PGN-pcocas9。

其中，步骤4)中所述的将表达载体整合到柑橘的基因组所使用的方法为常用的植物转基因方法，比如根癌农杆菌介导法或基因枪法。

其中，步骤6)中所述的筛选突变体植株是利用常规的T-克隆检测法。

其中，步骤7)中所述的溃疡病抗性评价方法是利用离体接菌法。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

本发明一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，通过构建S1和S2sgRNA指导的CRISPR/Cas9编辑载体，利用农杆菌介导法转化晚锦橙上胚轴，获得三株CsWRKY22突变体转基因植株，实现了CsWRKY22基因在柑橘基因组中的成功编辑，从而增强了柑橘溃疡病抗性。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明CsWRKY22全长基因的PCR扩增电泳图谱：其中，M：DNA marker；1、2：CsWRKY22全长基因。

图2为本发明CsWRKY22基因序列：其中，A：CsWRKY22基因结构示意图；粗箭头示外显子；B：CsWRKY22基因CDS序列比对图；框选字母：两条等位基因差异碱基；S1-4(删除4)S4：4个sgRNA位点。

图3为本发明晚锦橙中CsWRKY22等位基因的氨基酸序列：浅灰色背景字母表示两种蛋白质之间的差异；NLS，核定位序列；箭头：CsWRKY22基因中内含子的剪接位点。

图4为本发明sgRNA活性体外检测电泳图谱：其中，M：DNA分子marker；S1-S4：各sgRNA指导Cas9酶切的产物，CK：空白对照。

图5为本发明pGN-proCas9-WRKY22sgRNA载体T-DNA结构示意图。

图6为本发明转基因植株的PCR鉴定图谱：M：DNA分子marker；P:载体质粒对照；N:非转基因对照；1-6：转基因植株。

图7为本发明CsWRKY22转基因柑橘突变体序列：灰色背景字母表示PAM位点，虚线表示碱基缺失。

图8中，a：CsWRKY22柑橘突变体株系和对照植株表型观察；b：CsWRKY22柑橘突变体株系和对照植株的发病情况。

图9中，a：CsWRKY22柑橘突变体株系和对照植株的平均病斑面积；b：CsWRKY22柑橘突变体株系和对照植株的病情指数；*表示0.05差异水平(T-test检测)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。

实施例一

1.DNA的提取

选取柑橘叶脉0.1-1g，使用Aidlab公司试剂盒(cat.No.DN15)提取基因组DNA，-20℃保存备用。

2.基因组序列的PCR扩增

扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。

3.DNA片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5α

紫外灯下，用洁净的刀片切下含目的片段的琼脂糖凝胶块。胶回收方法参照试剂盒(购自Omega公司)的使用说明书进行，回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。

酶切体系的建立和反应条件均参考TaKaRa公司限制性内切酶试剂盒的说明书进行。酶切回收的片段，或者扩增获得的回收片段按连接酶试剂盒说明书克隆到pGEM-T/pGEM-TEasy(Promega)载体上。连接反应体系如下：

10×T4 DNA连接缓冲液5μL

载体DNA片段1μL

外源连接产物DNA片段3μL

T4 DNA连接酶1μL

______________________________

载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比＝1:3。

16℃连接1h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，37℃培养。

实施例二

以晚锦橙基因组为模板，WRKY22-f/WRKY22-r为引物(表6)，PCR扩增晚锦橙CsWRKY22全长基因，目的产物电泳条带大小约为1.2kb(图1),测序分析发现晚锦橙CsWRKY22基因含三个外显子和两个内含子，且在晚锦橙中有两个等位基因，编码序列上含有丰富的单碱基多态性SNP，根据第一个SNP“G/C”差异，分别将两个等位基因命名为CsWRKY22^G和CsWRKY22^C(图2)。未检测到插入或缺失，表明两个等位基因编码相同功能的WRKY22蛋白。

对晚锦橙Cs WRKY22编码序列CDS进行T克隆大规模(27克隆子以上)测序分析，三次重复实验测序表明，CsWRKY22^G和CsWRKY22^C在晚锦橙基因组中的杂合度为3:1，即晚锦橙基因组中含有三个拷贝的CsWRKY22^G和一个拷贝的CsWRKY22^c(表1)。

实施例三

1.sgRNA的设计

基于WRKY22基因组(图2)和蛋白质序列(图3)，执行WRKY22生物学功能的序列均位于第二和第三外显子上，因此为了有效失活WRKY22蛋白功能，本发明以WRKY22第一外显子序列为靶标，筛选潜在的Cas9靶点。根据靶点的位置和GC含量选择其中4个(S1/S2/S3/S4)sgRNA(表2)。靶点的序列分别为S1：5’-CCTCCTTTCGGTTGAGCTGC-3’；S2：5’-GGCCTCCATCGACTTTGTTA-3’；S3：5’-GATTTGCAAGCCATAGTAAG-3’；S4：5’-ACATCTTGTTGCAGACTCGA-3’。此4个sgRNA靶点分析评价结果见表2。

2.sgRNA活性鉴定

对上述sgRNA进行体外活性验证，操作步骤如下：

(1)sgRNA体外反转录。

使用sgRNA体外转录试剂盒(Novoprotein公司)合成目标sgRNA(引物为WRKY22sgRNA-X-F)。胶回收扩增产物后，加1μL DNaseI至回收产物中，37℃反应10min，以去除DNA模板，将反应产物放入75℃反应10min，终止反应。制备好的sgRNA置于-20℃保存。

(2)用于检测sgRNA活性的目的片段扩增。

以晚锦橙基因组DNA为模板，以引物A-F/A-R扩增目的片段，扩增片段长度为890bp，该片段包含目标sgRNA序列。对扩增成功的目的片段进行电泳纯化。

(3)sgRNA活性检测

按如下体系进行sgRNA活性检测。

体外酶切反应体系如下(20μL)：

dsDNA 200nM

sgRNA 100nM 100nM

Cas9酶1μg

10×Reaction Buffer 2μL

_______________________________

用RNase Free Water补足20μL的酶切体系

37℃反应1h再加入1μL蛋白酶K去除Cas9蛋白酶，在37℃条件下反应20min。酶切产物在1.2％琼脂糖凝胶中120V的电压条件下电泳30min。在UV条件下，用Biospectrum300Imaging system对电泳图谱进行拍照。

(4)利用imageJ软件分析条带的含量，并计算酶切效率。

结果表明，S1和S2sgRNA具有明显的活性(图4)。

实施例四

植物表达载体的构建

根据sgRNA体外活性验证，采用sgRNA-1，sgRNA-2两个位点构建Cas9表达载体。所有限制性内切酶购自TaKaRa公司，按照使用说明书操作。

(1)合成sgRNA

将设计好的引物(引物为WRKY22sgRNA-X-f/r)稀释到10mmol·L-1浓度(即常用PCR浓度)，然后每对引物各取10μL混匀退火，使其形成双链DNA。退火程序为：65℃变性30min，然后放置至室温，在避光条件下缓慢退火2h，-20℃备用。

(2)酶切质粒PUC119-gRNA载体并连接sgRNA与PUC119-gRNA载体

连接反应体系同上，16℃条件下连接1h，转化大肠杆菌(步骤同上)。菌液PCR验证阳性克隆，扩增引物为AtU6-f与合成sgRNA对应的反向引物。验证正确的克隆提取质粒测序。

(3)酶切pGN-proCas9载体和含sgRNA的PUC119-gRNA载体

获得正确的含sgRNA的PUC119-gRNA载体后，BamHI/SalI酶切sgRNA载体和pGN-proCas9载体，回收sgRNA片段连入酶切回收后的pGN-proCas9载体，转化大肠杆菌，阳性克隆测序并经BamHI/SalI酶切确认后，筛选正确的pGN-proCas9质粒，命名为pCas9-WS1和pCas9-WS2，用电击法进行转化农杆菌。用BamHI/SalI对阳性克隆农杆菌质粒进行双酶切验证，阳性质粒保存于﹣20℃，对应菌液保存于﹣80℃备用。图5为pCas9-WS1和pCas9-WS2载体T-DNA结构示意图。

实施例五

1、用电击法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌EHA105。

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电击转化法导入农杆菌EHA105。

2、pCas9-WS1和pCas9-WS2载体整合到柑橘基因组，通过根癌农杆菌介导的方法进行柑橘的遗传转化。

表5:根癌农杆菌介导的柑橘遗传转化用培养基

MS:Murashige&Skoog，1962

上述的表达载体通过农杆菌介导上胚轴的方法导入晚锦橙。具体方法如下：

1、晚锦橙实生苗上胚轴的获得

取新鲜晚锦橙洗净，用70％酒精表面消毒，在无菌的条件下取出种子，剥掉种皮，接种在MS固体培养基上萌发，28℃下暗培养2周，然后在16h/d的光周期下培养1周。取萌发幼苗上胚轴切成1cm左右的茎段，用于农杆菌介导的遗传转化。

2、转化农杆菌的制备

用于转染的农杆菌菌液加入30％的无菌甘油保存于-70℃超低温冰箱中。转染前，在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基(0.5％蔗糖(W/V)，0.1％细菌用酵母提取物(W/V)，1％细菌用胰化蛋白胨(W/V)，0.05％MgSO₄.7H₂O(W/V)，1.5％的琼脂粉(W/V)pH7.0)上划线培养。挑农杆菌单菌落，接种于5mL含相同抗生素的LB液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养过夜。待长出单菌落后，挑取单菌落于50mg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；待菌液的OD₆₀₀达到1以上时，用不含有卡那霉素的LB液体培养基稀释至0.2左右，继续振荡培养3h左右；待菌液达到对数生长期(OD为0.5左右)时，于5000r/min离心10min，弃上清，再悬浮将农杆菌悬浮于ph为5.4的MS液体培养基中用于转染。

3、晚锦橙上胚轴茎段的转化

将切成1cm左右的晚锦橙上胚轴茎段在农杆菌中浸泡10～15min，然后用无菌的滤纸将上胚轴表明的菌液吸干；将外植体转移到共培养基中，26℃暗培养2d。

4、转化子的筛选

共培养完成后，将上胚轴转移到筛选培养基中，28℃暗培养7d。然后，将外植体在28℃，16h光照下培养，每两周继代一次。

5、转化子的成苗培养

待幼芽长到1cm以上时，将其离体嫁接到无菌锦橙实生苗上，在成苗培养基中进行培养；待幼苗长到5cm左右时将其嫁接到枳实生苗上，在温室中进行培养。获得的转基因柑橘在表型和生长发育上与野生型的对照没有明显区别。

实施例六

外源基因整合的PCR检测

取柑橘叶片100mg，按照Aidlab公司新型植物基因组DNA快速提取试剂盒说明书操作方法(cat.No.DN15)，提取GUS染色为阳性的转基因植株叶片的总DNA，以引物Cas9-f和Cas9-r，对阳性植株总DNA中的目的基因进行PCR扩增，鉴定转基因植株。扩增的目标基因为大小约为900bp的Cas9特异片段。反应体积50μL，PCR反应条件:94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35次循环；72℃3min。结果见图6。

实施例七

转基因植株的突变体鉴定

对转基因株系的叶片提取DNA，根据WRKY22的基因组DNA序列，设计包含不同sgRNA的引物(引物为WRKY22sgRNA-X-Mf/Mr)。然后以上述提取的DNA为模板，进行PCR验证。反应体积50μL，PCR扩增条件同上。将PCR扩增出的目的片段进行回收，并将目的片段连接到T载体上，Sanger测序分析转基因植株突变情况。

图7显示，三株转基因植株W1-1，W2-2和W2-3靶点突变情况。W1-1株系含有A碱基插入、A/G替换、1个和3个碱基删除突变，突变率为85.7％。W2-2株系含有A、T和G碱基插入、T/A替换、以及1、8、18和44个碱基的删除突变，突变率为79.2％。W2-3株系含有A碱基插入和38个碱基的连续删除突变，突变率为68.2％。

实施例八

突变体脱靶效应重测序分析

提取转基因和野生型植株中提取总DNA。构建插入大小约为400bp测序文库，于Illumina Hiseq2500上测序，以甜橙基因组为参考基因组，使用BWAv0.7.16软件将获得的reads进行拼接和注释。使用CRISPR-P Web工具查找目标sgRNA的潜在脱靶位点和序列。使用GATK^[17]软件进行变异检测，找到参考基因组、野生型亲本和敲除株系之间任意有差异的位点，输出。然后，使用BLASTN算法搜索在转基因品系中含有潜在的脱靶序列(允许少于5个错配碱基)的reads数。最后，基于潜在脱靶序列3’末端的PAM序列统计含有脱靶突变的reads数。基于脱靶突变reads数与重叠潜在脱靶序列的总reads数的比率计算每个潜在脱靶位点的脱靶频率。结果见表3和表4：突变体系中检测到的SNP和插入缺失的数量与野生型对照植株相当(表3)。序列分析表明，在W1-1株系的O2位点，W2-2株系的O5位点和W2-3株系的O3，O4和O5位点检测到脱靶突变。脱靶频率约为3.0～16.0％。在W2-2和W2-3系中未检测到O6脱靶突变(表4)。

实施例九

CsWRKY22突变体的溃疡病抗病性评价

以野生型晚锦橙的成熟叶片为对照材料，分别取野生型晚锦橙的成熟叶片以及CsWRKY22各突变体植株的成熟叶片，利用针刺接种法对实验叶片接种溃疡病菌。用于测定植物对柑橘溃疡病抗性的溃疡病菌选取本实验室保存的柑橘溃疡病菌菌落。首先对溃疡病菌进行活化，挑取柑橘溃疡病菌落置于LB液体培养基中，28℃恒温摇床振荡培养过夜后，用LB液体培养基将其稀释成OD 600值为0.1的菌液，28℃恒温摇床进行二次菌液活化，根据Zou等制备0.5×10⁵CFU ml^-1细菌悬浮液^[18]。根据Peng等^[19]研究突变体植株对XccYN1的植物抗病性，具体方法如下：将接种的叶子先用清水清洗干净，并在75％的乙醇中杀菌3～5秒后无菌水清洗2～3次，再置于150mm培养皿中，用1mL左右的无菌水润湿的约18cm³(2cm×3cm×3cm)无菌棉球并将其置于叶柄上以保持湿度。用实验室封口膜密封培养皿。将接种的材料保持在28℃，45μmol m^-2s^-1照射，16小时光周期和60％RH，并在培养10天后拍摄照片。用Image J V1.47软件统计计算所有接种斑点的面积。单个品系的疾病强度基于三叶中24个穿孔的病变区域的平均值，用三个生物学重复进行实验。按照病斑面积将病情分为8个级别，以字母R表示病斑面积，8个级别分别为0级(R﹤＝0.25mm²)，1级(0.25mm²﹤R﹤＝0.5mm²)，2级(0.5mm²﹤R﹤＝0.75mm²)，3级(0.75mm²﹤R﹤＝1mm²)，4级(1.0mm²﹤R﹤＝1.25mm²)，5级(1.25mm²﹤R﹤＝1.5mm²)，6级(1.5mm²﹤R﹤＝1.75mm²)，7级(R﹥1.75mm²)。统计病情指数：DI＝100×Σ[各级病斑数×相应级数值]/(病斑总数×最大级数)。结果见图8和图9。结果显示，CsWRKY22转基因柑橘突变体株系中，W2-2和W2-3株系的平均病斑面积和病情指数均小于对照植株(CK)其中，W2-3株系的抗性水平显著高于对照植株。而且，表型比较显示CsWRKY22突变体转基因植株与野生型对照植株没有明显差异(图8)，说明突变CsWRKY22不会影响柑橘植株的表型。

结论是：本研究共获得三株CsWRKY22突变体转基因植株，突变效率在68％以上，抗性评价表明突变CsWRKY22能显著增强柑橘对溃疡病的抗性。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明做出各种变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

表1 CsWRKY22基因杂合性分析

χ2检验即频数分布值3:1的拟合优度检验，当χ2小于3.84即认为CsWRKY22^G和CsWRKY22^C在基因组中的杂合度为3:1.

表2候选sgRNAs信息学分析

表3转基因植株重测序突变情况汇总

表4转基因植株潜在脱靶情况分析

表6引物：

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1238

<212> DNA

<213> 人工序列(1)

<400> 1

gaattcacta gtgattacag gtccgatctt gacgagggat tttgtttgca tggactggga 60

tttgcaagcc atagtaagag gttgcagcag tgaggcctcc atcgactttg ttatggacaa 120

gccacagtct tataacttat ctccttcgag tctgcaacaa gatgtgagat tcaaatttcc 180

tgatgtcagt gaaaccacaa cgattttgga tgagctagag gaactttaca agcccttcta 240

tccacaaact atactaacca gcacatccat ttctgctccc acggaagtta ataaaaagcc 300

aaagaagctg cgaaagcagc ggcctaagct ttccgattct gcaagtaata ccgatcatcc 360

tgcagctcaa ccgaaaggag ggttagtaat ttattattca tatttgtatg tatatgctta 420

tctatcctaa tgagcgattg aaatgatgat tattatcgta tactgatttt ttattatgtt 480

ttaatttgct tgattagcag gaagaatcaa cacaaaagag tagtgcaaag ggtgacagcg 540

gattgtctcg catgtgataa gtgggcttgg cgtaaatacg ggcagaaacc cataaaggga 600

tccccttatc caaggtgatg attgttgata aatttaattt tgcaagcaag cgatcaagat 660

ttgaatagct tagaccccgt aagttaagtt attcacatag ttatatgatc attttgttta 720

atgtacgcag gagctattat cggtgcagca gctcaaaagg atgtttggca aggaaacagg 780

tggaacgaag cagtgcagat ccgggagtat ttattataac ctatggtgcc gagcataacc 840

acggccaccc aacacgccga agcgctcttg caggaagcac gcgtagcaag ctggcctcaa 900

tgtcaaaggc tcaaggtccc gcccagaaca aaccacttga accagcgtcg gaggcatccg 960

ctgaattagg tgaccttgtg taccaaggga acattaaaaa agaagacgaa aatgtgttct 1020

tagatggcca agaaattgaa cttgtcatgc ctgatttaac atttagcgat gaactaatgt 1080

tcccaagctt ggaggatttg gaagggtttt tattggatca atttccagat cataacatta 1140

acatgtctgc ggatgataac tcttggttca ttgatgaatc tgttaccctg aacggtggtc 1200

tctgacacct gccgcaggca cacataataa tcgaattc 1238

<210> 2

<211> 1236

<212> DNA

<213> 人工序列(2)

<400> 2

gaattcgact atgtccgatc ttgacgaggg attttgtttg catggactgg gatttgcaag 60

ccatagtaag aggttgcagc actgaggcct ccatcgactc tgttatggac aagccacagt 120

cttataactt ttctccctcg agtctgcaac aagatgtgag attcaaattt cctgatgtca 180

gtgaaactac aacgattttg gatgagctag aggaacttta caagcccttc tatccacaaa 240

ctatactaac cagcacatcc atttctgctc ccaccgaagt taataaaaag ccgaagaagc 300

tgcgaaagca gcagcgtaag ctttccgatt ctgcaagtaa taccgatcat cctgcagctc 360

aaccgaaagg agggtcagta atttattatt catgtttgta tgtatatgct tatctatcct 420

aatgagcgat tgaaatgatg attataatcg tatactgatt ttgtattatg ttttaatttg 480

cttgattagc aggaagaatc aacacaaaag agtagtgcaa agggtgacag cggattgtct 540

cgcatgtgat aagtgggctt ggcgtaaata cgggcagaaa cccataaagg gatcccctta 600

tccaaggtga tgattgttga taaatttaat ttttcaagca agcgatcaag atttgaacag 660

cttagacccc gtaagttaag ttattcacat agttatatga tcattttgtt taatgtacgc 720

aggagctatt atcggtgcag cagctcaaaa ggatgtttgg caaggaaaca ggtggaacga 780

agcagtgcag atccgggagt atttattata acctatggtg ccgagcataa ccacggccac 840

ccaacacgcc gaagcgctct tgcaggaagc acacgtagca agctggcctc aatgtcaaag 900

gctcaaggtc ccgcccagaa agaaccattt gaaccagcgt cggaggcatc cgctgaatta 960

ggtgaccttg tgtaccaagg gaacattaaa aaagaagacg aaaatgcgtt caaagatggc 1020

caagaaaatg aacttgtcat gcctgattta acatttggcg atgaactaat gttcccaagc 1080

ttggaggatt tggaagggtt tttattggat caatttccag atcataacat taacatttct 1140

gcggatgaca actcttggtt cattgatgaa tctgttaccc tgaacggtgg tctctgacac 1200

ctgccgcagg cacacataat aatcactagt gaattc 1236

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(3)

<400> 3

cctcctttcg gttgagctgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(4)

<400> 4

ggcctccatc gactttgtta 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(5)

<400> 5

gatttgcaag ccatagtaag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(6)

<400> 6

acatcttgtt gcagactcga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(7)

<400> 7

acaggtccga tcttgacgag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(8)

<400> 8

attatgtgtg cctgcggcag 20

<210> 9

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列(9)

<400> 9

atggactggg atttgcaagc catagtaaga ggttgcagca gtgaggcctc catcgacttt 60

gttatggaca agccacagtc ttataactta tctccttcga gtctgcaaca agatgtgaga 120

ttcaaatttc ctgatgtcag tgaaaccaca acgattttgg atgagctaga ggaactttac 180

aagcccttct atccacaaac tatactaacc agcacatcca tttctgctcc cacggaagtt 240

aataaaaagc caaagaagct gcgaaagcag cggcctaagc tttccgattc tgcaagtaat 300

accgatcatc ctgcagctca accgaaagga gggaagaatc aacacaaaag agtagtgcaa 360

agggtgacag cggattgtct cgcatgtgat aagtgggctt ggcgtaaata cgggcagaaa 420

cccataaagg gatcccctta tccaaggagc tattatcggt gcagcagctc aaaaggatgt 480

ttggcaagga aacaggtgga acgaagcagt gcagatccgg gagtatttat tataacctat 540

ggtgccgagc ataaccacgg ccacccaaca cgccgaagcg ctcttgcagg aagcacgcgt 600

agcaagctgg cctcaatgtc aaaggctcaa ggtcccgccc agaacaaacc acttgaacca 660

gcgtcggagg catccgctga attaggtgac cttgtgtacc aagggaacat taaaaaagaa 720

gacgaaaatg tgttcttaga tggccaagaa attgaacttg tcatgcctga tttaacattt 780

agcgatgaac taatgttccc aagcttggag gatttggaag ggtttttatt ggatcaattt 840

ccagatcata acattaacat gtctgcggat gataactctt ggttcattga tgaatctgtt 900

accctgaacg gtggtctctg a 921

<210> 10

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列(10)

<400> 10

atggactggg atttgcaagc catagtaaga ggttgcagca ctgaggcctc catcgactct 60

gttatggaca agccacagtc ttataacttt tctccctcga gtctgcaaca agatgtgaga 120

ttcaaatttc ctgatgtcag tgaaactaca acgattttgg atgagctaga ggaactttac 180

aagcccttct atccacaaac tatactaacc agcacatcca tttctgctcc caccgaagtt 240

aataaaaagc cgaagaagct gcgaaagcag cagcgtaagc tttccgattc tgcaagtaat 300

accgatcatc ctgcagctca accgaaagga gggaagaatc aacacaaaag agtagtgcaa 360

agggtgacag cggattgtct cgcatgtgat aagtgggctt ggcgtaaata cgggcagaaa 420

cccataaagg gatcccctta tccaaggagc tattatcggt gcagcagctc aaaaggatgt 480

ttggcaagga aacaggtgga acgaagcagt gcagatccgg gagtatttat tataacctat 540

ggtgccgagc ataaccacgg ccacccaaca cgccgaagcg ctcttgcagg aagcacacgt 600

agcaagctgg cctcaatgtc aaaggctcaa ggtcccgccc agaaagaacc atttgaacca 660

gcgtcggagg catccgctga attaggtgac cttgtgtacc aagggaacat taaaaaagaa 720

gacgaaaatg cgttcaaaga tggccaagaa aatgaacttg tcatgcctga tttaacattt 780

ggcgatgaac taatgttccc aagcttggag gatttggaag ggtttttatt ggatcaattt 840

ccagatcata acattaacat ttctgcggat gacaactctt ggttcattga tgaatctgtt 900

accctgaacg gtggtctctg a 921

Claims

1.一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术定点突变柑橘感病基因CsWRKY22，使其蛋白功能丧失或减少，增强植株对柑橘溃疡病的抗性。

2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，所述柑橘感病基因CsWRKY22为CsWRKY22^G和CsWRKY22^c等位基因，含有两个内含子和三个外显子，CsWRKY22^G具有如SEQ ID No：1所示核苷酸序列，CsWRKY22^c具有如SEQ ID No：2所示核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，用于编辑柑橘感病基因CsWRKY22的植物表达载体为含有特异靶向CsWRKY22基因sgRNA引导序列的CRISPR/Cas9载体。

4.根据权利要求3所述的一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，用于特异指导Cas9编辑CsWRKY22基因的sgRNA序列为S1、S2、S3和S4，S1、S2、S3和S4分别具有如SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，用于创制突变体的转化方法为农杆菌介导的柑橘遗传转化方法，具体为：

将CsWRKY22基因sgRNA引导序列的CRISPR/Cas9载体导入柑橘中，实现CsWRKY22基因定点突变，并获得抗性显著提高的突变体植株。

6.根据权利要求5所述的一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，所述突变体植株包括CsWRKY22序列突变的转基因植株和材料。

7.根据权利要求2所述的一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，所述柑橘感病基因CsWRKY22提取所采用的引物为WRKY22-f和WRKY22-r，分别具有如SEQ ID No：7和SEQ ID No：8所示核苷酸序列。