CN114106121A

CN114106121A - FvGR3蛋白及其编码基因和用途

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Publication number: CN114106121A
Application number: CN202111299896.4A
Authority: CN
Inventors: 连红莉; 许鹏博; 曹明浩; 肖坤; 李歆渝
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-11-04
Filing date: 2021-11-04
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2041-11-04
Also published as: CN114106121B

Abstract

本发明属于植物生物工程技术领域，特别涉及FvGR3蛋白及其编码基因和用途。所述的FvGR3蛋白包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白。本发明通过CRISPR‑Cas9基因敲除技术，结合草莓基因遗传转化法，得到一个草莓FvGR3基因的缺失突变体。对该突变体及野生型草莓进行果实大小、匍匐茎的节间长短和叶片的表型统计，发现与野生型草莓相比，突变体草莓可明显提高果实的横径长度和横纵径比值，能明显缩短匍匐茎的节间长度，并使叶片变小、变圆和变皱，说明该基因具有调控植物器官发育的功能，为创制植物育种和/或培育高产植物提供了新技术，具有潜在的育种价值。

Description

FvGR3蛋白及其编码基因和用途

技术领域

本发明属于植物生物工程技术领域，特别涉及FvGR3蛋白及其编码基因和用途。

背景技术

草莓属于蔷薇科草莓属，其果实果肉多汁、风味浓郁，是一种经济价值较高的鲜食水果之一。草莓的果实属于“假果”，其真实的生物学意义上的果实是分布于表面的种子，其又被称为瘦果，而我们日常食用的部分是草莓的花托部分在生长素的作用下膨大而形成的。

草莓果实的大小及形状一直以来也都是广大生物学家和育种学家关注的重点问题。草莓果实形态多样，有圆形、长圆形、短圆形、纺锤形、圆锥形等。最近有科学家通过激素处理果实来观察果实的大小和形状，发现生长素可以促进草莓果实的横径变大，赤霉素可以促进草莓果实的纵径变长，而脱落酸会抑制草莓果实的横径和纵径的变长。到目前为止，已发现的控制草莓果实的形状和大小的基因数量非常有限，且已发现的基因也主要是涉及激素合成与代谢或者激素信号转导途径中的基因，尚未发现其他基因参与调控草莓果实的大小和形状。

实际生产中，草莓苗的繁殖主要依靠匍匐茎。在高温长日照条件下，草莓的腋芽急速伸长形成匍匐茎。匍匐茎继续伸长，其前端形成的小的营养繁殖体在接触到土或者基质的部分会发育成根，从而形成子株。生产上就是利用这些子株来繁殖草莓苗。一条匍匐茎能产生多少个子株决定了一个母株生产草莓苗的能力。在匍匐茎长度一定的条件下，子株与子株之间的节间长度就是限制该匍匐茎产生子株数量的关键因素。目前，关于匍匐茎的研究主要集中在匍匐茎的发生机制解析，尚未见控制匍匐茎节间长度的基因及功能被报道。

现有技术中，关于同时能调控果实或匍匐茎等器官发育的基因的功能报道非常少。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供FvGR3蛋白及其编码基因和用途，进而解决现有技术中的问题。

本发明的第一方面，提供FvGR3蛋白，所述的蛋白为(1)至(3)中的一项或多项的蛋白：

(1)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；

(2)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白；

(3)在(1)或(2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

本发明的第二方面，提供与如所述的蛋白相关的生物材料，包括如下任一种：

a)编码如所述的蛋白的多核苷酸；

b)含有a)所述的多核苷酸的重组表达载体；

c)含有a)所述的多核苷酸的生物工程菌，或含有b)所述的重组表达载体的生物工程菌；

d)含有a)所述的多核苷酸的转基因植物细胞，或含有b)所述的重组表达载体的转基因植物。

根据本申请的技术方案，a)中，所述的多核苷酸的序列包括如SEQ ID NO.1所示序列。

本发明的第三方面，提供如所述的FvGR3蛋白或如所述的生物材料在调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物中的用途。

本发明的第四方面，提供如上文所述的FvGR3蛋白或如上文中所述的多核苷酸作为靶标在制备和/或筛选调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物的产品中的用途。

本发明的第五方面，提供如上文所述的FvGR3蛋白或如上文中所述的多核苷酸作为靶标制备和/或筛选得到的调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物的产品。

根据本申请的技术方案，所述产品包括调控如上文所述的FvGR3蛋白活性或含量的物质；

和/或，所述产品包括调控如上文所述的FvGR3蛋白的编码基因表达的物质。

所述调控FvGR3蛋白的编码基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

所述调控FvGR3蛋白的编码基因表达可为抑制或降低所述FvGR3基因表达，所述抑制或降低FvGR3基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

根据本申请的技术方案，所述产品包括CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9系统中，上文所述的FvGR3蛋白的编码基因的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

本发明的第六方面，提供一种调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物的方法，导入如上文所述的产品，以调控如上文所述的FvGR3蛋白活性或含量和/或调控如上文所述的FvGR3蛋白的编码基因表达，从而调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物。

根据本申请的技术方案，所述的植物器官包括果实、匍匐茎和叶片。所述的调控植物器官发育包括调控果实、调控匍匐茎和调控叶片的发育。

根据本申请的技术方案，所述调控植物器官发育包括B1)-B5)中任一项或多项：

B1)调控植物果实的大小；

B2)调控植物果实的形状；

B3)调控植物匍匐茎的节间长度；

B4)调控植物叶片的大小；

B5)调控植物叶片的形状。

优选地，所述调控植物器官发育包括如下中的任一项或多项：

C1)植物果实的横径变大和/或横纵径比值变大；

C2)植物果实变大；

C3)植物匍匐茎的节间长度变短；

C4)植物叶片变小；

C5)植物叶片变圆、变皱。

根据本申请的技术方案，所述的植物育种包括培育植物器官发育改变的植物。优选地，所述的植物育种包括培育新植株和/或新种子。

根据本申请的技术方案，所述培育高产植物，通过改变植物器官发育，得到的高产植物。所述改变植物器官发育包括如下任一项或多项：C1)植物果实的横径变大和/或横纵径比值变大；C2)植物果实变大；C3)植物匍匐茎的节间长度变短；C4)植物叶片变小；C5)植物叶片变圆、变皱。

本发明FvGR3基因经过基于CRISPR-Cas9系统的敲除实验成功获得了该基因的敲除转基因植株，收获转基因阳性植株和野生型植物进行果实、匍匐茎和叶片表型鉴定的结果表明，敲除目的基因可显著增加植物果实的横径和横纵径比值，缩短匍匐茎的节间长度和缩小叶片，从而证明基因FvGR3在植物器官发育过程和/或植物育种和/或培育高产植物中具有重要的生物学功能。

根据本申请的技术方案，所述植物为双子叶植物或单子叶植物，优选地，为草莓。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明构建的含草莓FvGR3的CRISPR/Cas9载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，获得FvGR3突变体新种质。

2.本发明通过基因编辑技术将草莓FvGR3基因的序列在草莓中进行改变，获得突变体植株，使突变体中不能正常产生该基因编码的蛋白质。通过本发明获得的突变体植株的草莓果实与野生型相比，果实的横径和横纵径比值显著变大，说明敲除FvGR3基因起到了改变草莓果实大小和/或形状状的功能。此外，与野生型草莓相比，本发明获得的突变体草莓的匍匐茎的节间长度明显变短，叶片明显变小、变圆和变皱缩，从而使得该突变体的匍匐茎可以产生更多的子株，在农业生产上具有十分重要的应用。

附图说明

图1显示为本发明的实施例1中重组表达载体JH19-FvGR3的构建原理示意图。

图2显示为本发明的实施例2中转基因草莓的PCR产物的电泳图。

图3A显示为本发明的实施例2中FvGR3基因在突变体和野生型中的靶位点对比结果图。其中加下划线的三个碱基，即GGG，是Cas9发挥剪切功能所需的PAM位点。

图3B显示为本发明的实施例2中突变体草莓和野生型草莓果实的表型实拍图。其中，标尺为10mm。

图3C显示为本发明的实施例2中突变体草莓和野生型草莓的匍匐茎的表型实拍图。其中，白色箭头指示的是匍匐茎的第一子株和第二子株的位置。

图4显示为本发明的实施例2中野生型草莓和突变体草莓果实的横径长度的统计结果图。其中，**，p<0.01。

图5显示为本发明的实施例2中野生型草莓和突变体草莓果实的纵径长度的统计结果图。

图6显示为本发明的实施例2中野生型草莓和突变体草莓果实的横纵径比值图。其中，**，p<0.05。

图7显示为本发明的实施例2中野生型草莓和突变体草莓的匍匐茎的节间长度的统计结果图。其中，**，p<0.01。

图8显示为本发明的实施例2中野生型草莓和突变体草莓的叶片表型的实拍图。其中，标尺为2cm。

图2至图8中附图说明如下

WT 野生型草莓

Mutant 突变体草莓

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本发明将拟南芥的AGG3(拟南芥登录号AT5G20635)蛋白与二倍体森林草莓(Fragaria vesca“Hawaii-4”)的蛋白质数据库做blast比对分析，获得草莓中AGG3的同源蛋白，命名为FvGR3。本发明通过CRISPR-Cas9基因敲除技术，结合草莓基因遗传转化法，得到一个草莓FvGR3基因的缺失突变体。与野生型草莓相比，缺失突变体草莓可明显提高果实的横径长度和横纵径比值，且能明显缩短匍匐茎的节间长度及使叶片变小、变圆、变皱，说明该基因具有调控果实植物器官发育的功能，能够用于获得植物新种质。

本发明的一方面，提供了一种FvGR3蛋白，所述蛋白为(1)至(3)中的一项或多项的蛋白：(1)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(2)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白；(3)在(1)或(2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

SEQ ID NO.2所示序列具体为：

MAAQSGCSAPVVPSLPPPAPKSPPQYPDLYGKRRETARVQMLEREIGFLEEELKSVERLQPASKCCKEIADFVTANPDPLIPTNRKKRRSCRFWKWLCGMPCFSLSSICCCCCCDGCSLEMPRCSCCSCSSCSSCSGSGCGSCSGPCNCKSCFSCKSCFSCKSCFSCKSCFSCKSCFSCKSCFSCPSLPKWQCCCSCPRSRCCSCPRSRCCKTNSCSCSKNCCTLPSCSCSCPDCSCLNCFKWKCSCPKC PKVRPCCCCKITCCNPCSICL*

本发明的另一方面，还提供了与上文所述的蛋白相关的生物材料，包括如下任一种：

a)编码如上文所述的蛋白的多核苷酸；

b)含有a)所述的多核苷酸的重组表达载体；

c)含有a)所述的多核苷酸的生物工程菌，或含有b)所述重组表达载体的生物工程菌；

d)含有a)所述的多核苷酸的转基因植物细胞，或含有b)所述重组表达载体的转基因植物。

本发明的a)编码如上文所述的蛋白的多核苷酸，多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA；DNA可以是单链的或是双链的；DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.1中的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ IDNO.2所示序列的蛋白，但与SEQ ID NO.1中的编码区序列有差别的核酸序列。

SEQ ID NO.1所示序列具体为：

ATGGCAGCTCAGTCTGGTTGTTCTGCTCCGGTGGTTCCTTCTCTTCCGCCGCCAGCTCCAAAGTCGCCGCCGCAGTACCCAGATTTGTATGGCAAGCGCAGAGAAACCGCCAGGGTTCAGATGCTTGAGAGGGAAATTGGCTTTCTTGAGGAGGAACTAAAATCTGTTGAACGCCTTCAACCCGCATCCAAATGCTGCAAAGAGATTGCTGATTTTGTGACTGCCAATCCAGATCCGTTAATACCTACAAATCGAAAGAAACGACGATCATGTCGCTTTTGGAAATGGCTATGTGGAATGCCCTGTTTTAGCTTGTCATCGATTTGCTGTTGCTGCTGTTGTGATGGGTGCTCTCTAGAAATGCCACGCTGCTCCTGCTGCAGTTGCTCCAGCTGCAGTTCATGCAGCGGTTCAGGTTGCGGTTCATGCAGTGGTCCATGTAACTGTAAATCGTGTTTCAGTTGCAAATCATGTTTCAGTTGCAAATCGTGTTTCAGTTGCAAATCGTGTTTCAGTTGCAAATCATGTTTCAGTTGCAAATCGTGTTTCAGTTGCCCTTCACTACCAAAGTGGCAGTGTTGCTGCTCATGTCCCCGATCTCGTTGCTGCTCATGTCCCCGATCCCGTTGCTGCAAAACTAATTCATGTTCGTGCAGCAAAAATTGCTGCACTTTACCATCATGTTCGTGTTCATGTCCCGATTGCTCTTGTTTGAATTGTTTCAAATGGAAATGCTCTTGTCCTAAATGTCCGAAGGTACGGCCTTGTTGCTGTTGTAAAATAACCTGCTGTAACCCTTGCAGTATATGTTTGTAG

本发明的含有a)所述多核苷酸的重组表达载体。本发明中，编码所述蛋白的多核苷酸序列可插入到表达载体中形成重组表达载体中。术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本发明中的表达载体不局限于下述实施例中提到的含有Cas9的JH19载体。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含FvGR3蛋白编码的核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本发明的含有a)所述多核苷酸的生物工程菌、或含有b)所述重组表达载体的生物工程菌，所述生物工程菌含有如上述所述的重组表达载体或基因组内整合有如第二方面所述的多核苷酸。生物工程菌以使其能够表达蛋白质。生物工程菌可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。不局限于本申请中所采用的大肠杆菌感受态TOP10。

本发明的含有a)所述多核苷酸的转基因植物细胞，或含有b)所述重组表达载体的转基因植物。本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作即可。

本发明的另一方面，提供如上文所述的FvGR3蛋白或如所述的生物材料在调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物中的用途。

本发明的另一方面，提供如上文所述的FvGR3蛋白或如上文中所述的多核苷酸作为靶标在制备和/或筛选调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物的产品中的用途。

本发明中，所述的FvGR3蛋白或所述的多核苷酸作为靶标在制备和/或筛选调控植物器官发育和/或植物育种的产品具体是指：将FvGR3基因或FvGR3蛋白作为作用对象，对产品进行筛选，以找到可以促进或抑制FvGR3基因的表达水平，促进或抑制FvGR3蛋白的表达或活性的产品作为调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物的备选产品。

本发明的另一方面，提供如上文所述的FvGR3蛋白或如上文中所述的多核苷酸作为靶标制备和/或筛选得到的调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物的产品。

本发明的所述产品包括调控如上文所述的FvGR3蛋白活性或含量的物质；和/或，所述产品包括调控如上文所述的FvGR3蛋白的编码基因表达的物质。

本发明中，所述调控FvGR3蛋白的编码基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

本发明中，所述调控FvGR3蛋白的编码基因表达可为抑制或降低所述FvGR3基因表达，所述抑制或降低FvGR3基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

本发明的所述产品包括CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9系统中上文所述的FvGR3蛋白的编码基因的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。所述CRISPR/Cas9系统的构建方法为：根据FvGR3基因确定靶位点，根据靶位点序列设计两条单链DNA，分别包括如SEQ ID NO.4所示序列和SEQ ID NO.5所示序列，将两条单链DNA进行杂交，所得双链DNA片段与Bsa I酶切后的载体JH4连接，得到中间载体JH4-FvGR3；然后采用Gateway反应使JH4-FvGR3与含有Cas9的JH19发生同源重组，得到重组表达载体JH19-FvGR3，即CRISPR/Cas9系统。

本发明的另一方面，提供一种调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物的方法，导入如上文所述的产品，以调控如上文所述的FvGR3蛋白活性或含量和/或调控如上文所述的FvGR3蛋白的编码基因表达，从而调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物。

本发明中，所述的植物器官包括果实、匍匐茎和叶片。所述的调控植物器官发育包括调控果实、调控匍匐茎和调控叶片的发育。

本发明的所述调控植物器官发育包括B1)-B5)中任一项或多项：

B1)调控植物果实的大小；

B2)调控植物果实的形状；

B3)调控植物匍匐茎的节间长度；

B4)调控植物叶片的大小；

B5)调控植株叶片的形状。

C1)植物果实的横径变大和/或横纵径比值变大；

C2)植物果实变大；

C3)植物匍匐茎的节间长度变短；

C4)植物叶片变小；

C5)植株叶片变圆、变皱。

本发明的所述的植物育种包括培育植物器官发育改变的植物。优选地，所述的植物育种包括培育新植株和/或新种子。所述的植物器官发育改变包括如下中的一项或多项：植物果实的大小的改变；植物果实的形状的改变；植物的匍匐茎的节间长度的改变；植物的叶片大小的改变；植株的叶片形状的改变。

本发明的所述培育高产植物，通过改变植物器官发育，得到的高产植物。所述改变植物器官发育包括如下任一项或多项：C1)植物果实的横径变大和/或横纵径比值变大；C2)植物果实变大；C3)植物匍匐茎的节间长度变短；C4)植物叶片变小；C5)植物叶片变圆、变皱。

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作既可以。所述的植物不限于双子叶植物或单子叶植物。更具体地，所述双子叶植物包括草莓、拟南芥、紫花苜宿、矮牵牛、棉花、矮牵牛和蓖麻。在本发明的一个具体实施例中，所述植物优选草莓。

在本发明的一个具体实施方式中，通过农杆菌介导将重组表达载体JH19-FvGR3转化于草莓，制备草莓突变体，包括如下步骤：1)将重组表达载体JH19-FvGR3转化于农杆菌GV3101中，得到重组菌GV3101/JH19-FvGR3；2)重组菌GV3101/JH19-FvGR3与草莓的愈伤组织共培养。其中，所述共培养包括以下步骤：将草莓的愈伤组织浸泡到重组菌GV3101/JH19-FvGR3的菌液，转到共培养培养基中，接着转到再生培养基，最后转到增殖培养基中培养，获得转基因阳性植株；经PCR扩增鉴定，确认靶序列的核苷酸序列被改变，筛选出靶序列发生改变并导致FvGR3基因编码的蛋白质提前终止的草莓即为突变体草莓。

突变体草莓经培养后发现，突变体草莓果实的横径长度和横纵径比值明显大于野生型草莓，横径长度的平均值比野生型草莓提高了27％以上(p<0.01)，横纵径比值的平均值比野生型草莓提高了20％以上(p<0.05)；突变体草莓的匍匐茎的节间长度小于野生型草莓，突变体草莓的节间长度的平均值比野生型草莓缩短了75％以上；突变体草莓的叶片也变小、变圆和变皱缩，通过上文调控草莓器官发育从而使得相同长度的匍匐茎，突变体草莓可以产生更多的子株，得到高产草莓。

本发明通过CRISPR-Cas9基因敲除技术，结合草莓基因遗传转化法，得到一个草莓FvGR3基因的缺失突变体。对该突变体及野生型草莓进行果实、匍匐茎和叶片的表型统计，发现与野生型草莓相比，突变体草莓可显著提高果实的横径长度和横纵径比值，说明该基因具有调节果实大小和/果实形状的功能；此外，突变体草莓的匍匐茎的节间长度与野生型相比明显变短，说明该基因具有调节匍匐茎长短的功能；而且突变体草莓的叶片小于野生型草莓叶片大小，且突变体草莓的叶片变圆和变皱，说明该基因具有调节草莓叶片大小和/或形状的功能，因此FvGR3在植物器官发育过程和/或植物育种和/或培育高产植物中具有重要的生物学功能。

实施例1重组表达载体JH19-FvGR3的构建

拟南芥的AGG3(拟南芥登录号AT5G20635；拟南芥数据库网址为：https://www.arabidopsis.org/)蛋白与二倍体森林草莓((Fragaria vesca“Hawaii-4”)的蛋白质数据库(草莓的数据库网址为：https://www.rosaceae.org/organism/24344)做Blast比对分析，获得草莓中AGG3的同源蛋白，命名为FvGR3(基因ID为FvH4_1G08850)。

本实施例中，构建重组表达载体JH19-FvGR3，包括如下步骤：

1.1具体步骤如下：

a)通过CRISPR/Cas9靶位点筛选网站https://crispr.dbcls.jp/找出敲除FvGR3基因所用的靶位点的序列CAAGCGCAGAGAAACCGCCAGGG(SEQ ID NO.3；加下划线的最后三个碱基，即GGG，是Cas9发挥功能所需的PAM位点)。靶标序列选好后，设计正向引物，其反向互补引物作为反向引物，然后分别在正向引物和反向引物的5’端加上BsaⅠ酶切的接头。特别的，由于本实施例所用JH19载体的缘故，在合成引物时需将靶序列的第一个碱基C变为G，从而使得加上酶切位点的正向引物和反向引物如下：

FvGR3-F1:5’-gctcGAAGCGCAGAGAAACCGCCA-3’(SEQ ID NO.4)

FvGR3-R1:5’-aaacTGGCGGTTTCTCTGCGCTTC-3’(SEQ ID NO.5)

注：引物中的前4个碱基，即gctc和aaac酶切位点，是为构建载体而人为引入的BsaⅠ酶切位点碱基，不属于FvGR3的靶基因序列。

1.2通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构的退火片段

退火的反应体系为：10×T4 ligase buffer(NEB)contains ATP 1μL；FvGR3-F1和FvGR3-R1各2μL；10×T4 Polynucleotide Kinase 1μL；最后用无菌水补足体积到10μL。

退火的反应程序为：37℃30min，95℃1min，然后开始以1℃/min的速度降温到25℃即可，得到退火片段。

1.3酶切质粒JH4并纯化

采用Bsa I限制性内切酶酶切JH4质粒(JH4质粒具体信息见文献Zhou et al.,Plant Biotechnology Journal.(2018)16,1868–1877.)，并纯化，得到酶切回收的JH4质粒。

酶切的反应体系为：10×Cutsmart buffer 5μL；JH4质粒3μL(500ng-1μg)；Bsa I限制性内切酶2μL；最后用无菌水补足体积到50μL。酶切反应在37℃水浴中反应2h即可。

酶切后的产物用天根生化的产物回收试剂盒进行产物纯化，具体步骤参照试剂盒说明书进行即可。

1.4连接反应

将步骤1.2得到的退火片段与步骤1.3得到的酶切回收的JH4质粒按照如下反应体系进行连接反应。

连接反应体系为：取7μL退火片段，1μL T4 DNA连接酶，10×T4 DNA连接酶Buffer1μL，酶切回收的JH4质粒1μL。连接反应在16℃反应1h，得到连接产物。

1.5转化感受态细胞

将步骤1.4得到的连接产物转化至大肠杆菌感受态TOP10(购买于上海维地生物技术有限公司，货号：DL1010)中，挑取阳性克隆验证，得到正确的JH4-FvGR3质粒。

1.6构建JH19-FvGR3重组载体

采用Ase I限制性内切酶对步骤1.5得到的JH4-FvGR3质粒进行酶切。

酶切反应体系为：10×Cutsmart buffer 5μL；JH4-FvGR3质粒3μL(500ng-1μg)；Ase I限制性内切酶2μL；最后用无菌水补足体积到50μL。酶切反应在37℃水浴中反应2h即可。

酶切后的产物用天根生化的产物回收试剂盒进行产物纯化，获得线性化的JH4-FvGR3质粒，具体步骤参照试剂盒说明书进行即可。

通过Gateway反应使线性化的JH4-FvGR3与JH19质粒(JH19质粒具体信息见文献Zhou et al.,Plant Biotechnology Journal.(2018)16,1868–1877.)发生同源重组，获得CRISPR/Cas9敲除用载体JH19-FvGR3质粒。

Gateway反应体系为：线性化的JH4-FvGR3质粒3μL(100ng-1μg)；JH19质粒1μL(150-300ng)；5×LR Clonase Reaction Buffer 2μL；最后加无菌水补足体积至10μL，在25℃反应12h即可。

将Gateway反应得到的反应产物转化至大肠杆菌感受态TOP10中，挑取阳性克隆验证，得到序列正确的重组表达载体即为CRISPR/Cas9载体，将该重组表达载体记为JH19-FvGR3。

图1为本实施例中重组表达载体JH19-FvGR3的构建原理示意图。

实施例2转化草莓及突变体表型鉴定

本实施例中，采用农杆菌介导法将实施例1得到的重组表达载体转化于草莓中，并对得到的突变体草莓进行表型鉴定，包括如下：

2.1准备菌液

取2μL实施例1得到的重组表达载体JH19-FvGR3加入50μL GV3101农杆菌感受态细胞中(购买于上海维地生物技术有限公司，货号：AC1001)，轻轻混匀，冰浴30min后于液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入1mL YEP(pH＝7.0)液体培养基，28℃，200rpm/min震荡培养，3h后在室温，13000rpm/min离心后去掉900μL上清，用剩余的约100μL上清重悬菌体沉淀，最后将菌液涂布于含50mg/L Rif和50mg/L Kan的YEP(pH＝7.0)固体培养基平板上，28℃倒置培养3天。

在上一步获得的平板上挑取含重组表达载体JH19-FvGR3的GV3101农杆菌单菌落，接种于5mL含有50mg/LKan和50mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃条件下200rpm/min振荡培养过夜。第二天按照1:100的比例取2mL过夜培养菌液接种到200mL含有50mg/L Kan和50mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃条件下200rpm/min振荡培养直至OD 600的值达到0.2。然后在25℃条件下，4000rpm/min离心20min收集菌体后，用等量MS液体培养基重悬菌体沉淀并添加乙酰丁香酮至终浓度为200umol/L。将重悬后的菌液置于黑暗条件下，100rpm/min，室温活化2h后即可使用，得到重组菌GV3101/JH19-FvGR3的菌液。

2.2遗传转化植株

将在组培瓶内生长30天的无菌草莓苗的叶片剪成1㎝大小，将叶片置于诱导培养基(MS+2％蔗糖+3.4mg/L 6-BA+0.3mg/L IBA)上，在23℃培养箱中黑暗培养30天，诱导愈伤组织的形成。

将培养好的草莓愈伤组织置于步骤2.1得到的重组菌GV3101/JH19-FvGR3的菌液中，黑暗条件下轻轻摇晃1h后取出，用无菌的干滤纸吸干愈伤组织上多余的农杆菌菌液，然后置于共培养培养基(MS+2％蔗糖+3.4mg/L 6-BA+0.3mg/L IBA)上。在黑暗条件下培养3天后，将愈伤组织转移到含有500mg/L特美汀和4mg/L潮霉素的再生培养基(MS+2％蔗糖+3.4mg/L 6-BA+0.3mg/L IBA)中进行抗性芽筛选。在抗性芽再生出后，将抗性芽转移到新的附加500mg/L特美汀和4mg/L潮霉素的增殖培养基(MS+2％蔗糖+0.3mg/L IBA)中进行增殖培养直到获得T0代转基因草莓。

2.3转基因草莓的鉴定

继续培养步骤2.2得到的T0代转基因草莓，直至生长到8-9片叶子时，取幼嫩的叶片提取DNA，先通过PCR鉴定抗性植株中是否有Cas9基因的存在，存在Cas9基因的植株为转基因阳性植株。

PCR鉴定的引物为：

正向引物Cas9-F1：5'-TCTCGTCTCATAGAGCCCTG-3'(SEQ ID NO.6)

反向引物Cas9-R1：5'-GAAGAAAGATTGGGACCCTAAG-3'(SEQ ID NO.7)

PCR的反应体系为：待检测植株DNA样品2μL；Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCRBuffer 2.5μL，dNTPs 0.5μL，正反向引物各0.5μL，最后加无菌水补足体积到25μL。

PCR反应程序为：94℃5min；94℃10s，55℃20s，72℃30s，30个循环；72℃再延伸5min，12℃保存。

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认是否有目标条带出现，有Cas9目标条带的植株为转基因阳性植株。

图2为本实施例中转基因草莓的提取DNA的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中：图中M为DNA分子量Marker，从上到下的条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；1和2为野生型草莓DNA样品；3-12为遗传转化所获得的草莓植株DNA样品。

从图2可知，编号为3、4、6和8号对应的植株为转基因阳性植株。

2.4突变体株系的鉴定

以步骤2.3得到的转基因阳性植株的DNA为模板，通过PCR扩增含有FvGR3基因靶序列的短片段，通过测序确认靶序列的位点是否被编辑，即确认靶序列的核苷酸序列是否被改变，筛选出靶序列发生改变并导致FvGR3基因编码的蛋白质提前终止的植株即为突变体植株。

PCR检测所用引物为：

FvGR3-F2：5'-GCCGCTTCTTAGTCTTCTCAC-3'(SEQ ID NO.8)

FvGR3-R2：5'-GCTTTAGGCACACTTGCTTAG-3'(SEQ ID NO.9)

PCR的反应体系和反应程序同步骤2.3。

2.5表型鉴定

将野生型和步骤2.4得到的突变体的种子同时播种，待小苗出土生长至4叶期时移栽至人工气候室中，温度设置为24℃，湿度为50％，光周期设置为16h光照/8h黑暗，在此条件下培养至草莓开花时用直尺测量匍匐茎的节间长度。当果实成熟后用游标卡尺测量果实的横径和纵径长度，并计算横纵径的比值；观察叶片。

图3A为本实施例中FvGR3基因在突变体基因和野生型基因的靶位点对比结果图。

图3B为本实施例中突变体草莓和野生型草莓果实的表型的实拍图。其中标尺为10mm，WT代表野生型草莓，mutant代表突变体草莓。

从图3B可知，突变体草莓果实明显比野生型草莓大。

图3C为本实施例中突变体草莓和野生型草莓的匍匐茎的表型的实拍图。其中，白色箭头指示的是匍匐茎的第一子株和第二子株的位置。

从图3C可知，突变体草莓的匍匐茎的节间距离明显低于野生型草莓。

图4为本实施例中野生型草莓和突变体草莓果实的横径长度的统计结果图。**表示突变体草莓和野生型草莓果实的横径长度之间具有极显著差异。

从图4和表1可知，野生型草莓果实的横径长度为13.68±0.52，突变体草莓果实的横径17.51±1.09；与野生型草莓相比突变体草莓果实的横径的平均值极显著提高了27％以上(p<0.01)。

图5为本实施例中野生型草莓和突变体草莓果实的纵径长度的统计结果图。

从图5和表1可知，与野生型草莓相比，突变体草莓果实的纵径长度没有明显变化(p>0.05)。

图6为本实施例中野生型草莓和突变体草莓果实的横纵径比值图。

从图6和表1可知，野生型草莓果实的横纵径比值为0.75±0.09，突变体草莓果实的横纵径比值为0.91±0.03；与野生型草莓相比，突变体草莓果实的横纵径比值的平均值显著提高20％以上(p<0.05)。

从图3、图4、图6和表1可知，突变体草莓果实的横径和横纵径比值发生了明显变化，表明FvGR3基因具有调控草莓果实大小的功能。

图7为本实施例中野生型草莓和突变体草莓的匍匐茎的节间长度的统计结果图。

从图7和表1可知，突变体草莓的匍匐茎的节间长度为38.27±7.73，野生型草莓的匍匐茎的节间长度21.83±3.45；与野生型草莓相比，突变体草莓的匍匐茎节间长度的平均值极显著缩短了75％以上(p<0.01)，匍匐茎节间长度缩短从而使得相同长度的匍匐茎可以产生更多的子株。

具体统计结果见表1。

表1.野生型和突变体果实横纵径长度及匍匐茎节间长度统计表

*代表有显著差异；**代表有极显著差异。

图8为本实施例中野生型草莓和突变体草莓的叶片表型的实拍图。

从图8可知，与野生型草莓相比，突变体草莓的叶片变小、变圆，以及叶片边缘变皱缩。

本发明第一次发现了基因FvGR3在调控草莓果实、匍匐茎和叶片中的应用，通过改变FvGR3基因使其无法行使功能获得的突变体草莓的果实明显变大、匍匐茎的节间长度受到抑制，叶片变小、变圆，以及叶片边缘变皱缩，从而有利于产生更多子株。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> FvGR3蛋白及其编码基因和用途

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 271

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Ala Gln Ser Gly Cys Ser Ala Pro Val Val Pro Ser Leu Pro

1 5 10 15

Pro Pro Ala Pro Lys Ser Pro Pro Gln Tyr Pro Asp Leu Tyr Gly Lys

20 25 30

Arg Arg Glu Thr Ala Arg Val Gln Met Leu Glu Arg Glu Ile Gly Phe

35 40 45

Leu Glu Glu Glu Leu Lys Ser Val Glu Arg Leu Gln Pro Ala Ser Lys

50 55 60

Cys Cys Lys Glu Ile Ala Asp Phe Val Thr Ala Asn Pro Asp Pro Leu

65 70 75 80

Ile Pro Thr Asn Arg Lys Lys Arg Arg Ser Cys Arg Phe Trp Lys Trp

85 90 95

Leu Cys Gly Met Pro Cys Phe Ser Leu Ser Ser Ile Cys Cys Cys Cys

100 105 110

Cys Cys Asp Gly Cys Ser Leu Glu Met Pro Arg Cys Ser Cys Cys Ser

115 120 125

Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Ser Gly Ser Gly Cys Gly Ser Cys Ser

130 135 140

Gly Pro Cys Asn Cys Lys Ser Cys Phe Ser Cys Lys Ser Cys Phe Ser

145 150 155 160

Cys Lys Ser Cys Phe Ser Cys Lys Ser Cys Phe Ser Cys Lys Ser Cys

165 170 175

Phe Ser Cys Lys Ser Cys Phe Ser Cys Pro Ser Leu Pro Lys Trp Gln

180 185 190

Cys Cys Cys Ser Cys Pro Arg Ser Arg Cys Cys Ser Cys Pro Arg Ser

195 200 205

Arg Cys Cys Lys Thr Asn Ser Cys Ser Cys Ser Lys Asn Cys Cys Thr

210 215 220

Leu Pro Ser Cys Ser Cys Ser Cys Pro Asp Cys Ser Cys Leu Asn Cys

225 230 235 240

Phe Lys Trp Lys Cys Ser Cys Pro Lys Cys Pro Lys Val Arg Pro Cys

245 250 255

Cys Cys Cys Lys Ile Thr Cys Cys Asn Pro Cys Ser Ile Cys Leu

260 265 270

<210> 2

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcagctc agtctggttg ttctgctccg gtggttcctt ctcttccgcc gccagctcca 60

aagtcgccgc cgcagtaccc agatttgtat ggcaagcgca gagaaaccgc cagggttcag 120

atgcttgaga gggaaattgg ctttcttgag gaggaactaa aatctgttga acgccttcaa 180

cccgcatcca aatgctgcaa agagattgct gattttgtga ctgccaatcc agatccgtta 240

atacctacaa atcgaaagaa acgacgatca tgtcgctttt ggaaatggct atgtggaatg 300

ccctgtttta gcttgtcatc gatttgctgt tgctgctgtt gtgatgggtg ctctctagaa 360

atgccacgct gctcctgctg cagttgctcc agctgcagtt catgcagcgg ttcaggttgc 420

ggttcatgca gtggtccatg taactgtaaa tcgtgtttca gttgcaaatc atgtttcagt 480

tgcaaatcgt gtttcagttg caaatcgtgt ttcagttgca aatcatgttt cagttgcaaa 540

tcgtgtttca gttgcccttc actaccaaag tggcagtgtt gctgctcatg tccccgatct 600

cgttgctgct catgtccccg atcccgttgc tgcaaaacta attcatgttc gtgcagcaaa 660

aattgctgca ctttaccatc atgttcgtgt tcatgtcccg attgctcttg tttgaattgt 720

ttcaaatgga aatgctcttg tcctaaatgt ccgaaggtac ggccttgttg ctgttgtaaa 780

ataacctgct gtaacccttg cagtatatgt ttgtag 816

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caagcgcaga gaaaccgcca ggg 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctcgaagcg cagagaaacc gcca 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaactggcgg tttctctgcg cttc 24

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctcgtctca tagagccctg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaagaaagat tgggacccta ag 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gccgcttctt agtcttctca c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctttaggca cacttgctta g 21

Claims

1.一种FvGR3蛋白，其特征在于，所述的蛋白为(1)至(3)中的一项或多种的蛋白：

(1)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；

(3)在(1)或(2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

2.与如权利要求1所述的蛋白相关的生物材料，其特征在于，包括如下任一种：

a)编码如权利要求1所述的蛋白的多核苷酸；

b)含有a)所述的多核苷酸的重组表达载体；

3.如权利要求2所述的生物材料，其特征在于，a)中，所述的多核苷酸的序列包括如SEQID NO.1所示序列。

4.如权利要求1所述的FvGR3蛋白或如权利要求2或3所述的生物材料在调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物中的用途。

5.如权利要求1所述的FvGR3蛋白或如权利要求2或3中所述的多核苷酸作为靶标在制备和/或筛选调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物的产品中的用途。

6.如权利要求1所述的FvGR3蛋白或如权利要求2或3中所述的多核苷酸作为靶标制备和/或筛选得到的调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物的产品。

7.如权利要求6所述的产品，其特征在于，所述的产品包括调控如权利要求1所述的FvGR3蛋白活性或含量的物质；

和/或，所述的产品包括调控如权利要求1所述的FvGR3蛋白的编码基因表达的物质。

8.如权利要求7所述的产品，其特征在于，其特征在于，所述的产品包括CRISPR/Cas9系统，所述的CRISPR/Cas9系统中，如权利要求1所述的FvGR3蛋白的编码基因的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

9.一种调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物的方法，其特征在于，导入如权利要求6-8任一项所述的产品，以调控如权利要求1所述的FvGR3蛋白活性或含量和/或调控如权利要求1所述的FvGR3蛋白的编码基因表达，从而调控植物器官发育和/或植物育种和/或培育高产植物。

10.如权利要求4或5所述的用途或如权利要求6-8任一项所述的产品或权利要求9所述的方法，其特征在于，所述调控植物器官发育包括B1)-B5)中的任一项或多项：

B1)调控植物果实的大小；

B2)调控植物果实的形状；

B3)调控植物匍匐茎的节间长度；

B4)调控植物叶片的大小；

B5)调控植物叶片的形状。