CN115960188B - 一种FvNAC073蛋白质及其编码基因和用途 - Google Patents

一种FvNAC073蛋白质及其编码基因和用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物生物技术领域，公开了一种FvNAC073蛋白质及其编码基因和用途。一种FvNAC073蛋白质，所述蛋白质为如下(1)或(2)的蛋白质：(1)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。本发明的FvNAC073基因具有调控植物果实糖分生物合成和/或糖分积累的功能，能促进植物果实糖分含量的增加，为分子育种提供新的基因资源。

Description

一种FvNAC073蛋白质及其编码基因和用途
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，特别涉及一种FvNAC073蛋白质及其编码基因和用途。
背景技术
果实的成熟及品质的形成涉及多个方面的代谢系统，还受环境及激素等多因素调控，是一个比较复杂的生物学过程。目前我国的草莓主要式是以温室栽培为主，光照以及栽培措施受到限制，多数草莓品质果实着色不好，含糖量低，风味偏淡，这在一定程度上制约了草莓产业的发展。因此，从分子层面上研究果实成熟中糖代谢的调控机制可以为实际生产中通过转基因工程改良草莓的品质提供理论支持。
在最近的研究中，在草莓中描述了一种新的NAC TF FaRIF(FaNAC035)，FaRIF是通过调节植物激素生物合成和信号传导、成熟相关的转录因子、能量代谢和特定过程例如细胞壁重塑、苯丙烷途径和糖含量等促进草莓果实成熟。尽管研究报道表明，FaRIF可能通过糖含量等特定过程来调节草莓果实成熟，但关于FaRIF的调节机制通过特异性结合哪些蛋白质并调节哪些基因来影响果实成熟是未知的(Martín-Pizarro et al.,2021)。Moyano在Fragaria vesca中NAC家族中鉴定出112个NAC蛋白，显示有6个基因的mRNA水平在整个成熟和衰老阶段均有所增加。Carrasco-Orellana等人发现，来自智利草莓Fragariachiloensis的FcNAC1与草莓成熟有关，并表明FcNAC1通过调节软化过程中的果胶代谢参与草莓果实的成熟发育。
关于草莓成熟过程中糖代谢的调控机理研究较少，NAC转录因子是植物特有的一大类的蛋白家族，它参与植物生长发育、抗逆和激素信号转导等多种途径，并参与草莓果实的发育和成熟过程，但是关于NAC转录因子如何调控草莓成熟过程的糖分积累未见报道。
然而，尚未在草莓中描述任何与蔗糖积累相关的NAC蛋白的分子机制，为了完善草莓果实成熟调控的信号传导网络，本研究系统分析了FvNAC073在草莓果实成熟过程中糖分积累的转录调控机制。既有利于在分子方面了解草莓果实中糖分积累的分子机理，也有利于为生产上通过转基因技术改进草莓果实品质提供理论支撑。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种FvNAC073蛋白质及其编码基因和用途，进而解决现有技术中的问题。
本发明首先从草莓基因组中克隆FvNAC073基因，利用过表达与沉默技术研究FvNAC073对草莓糖分合成的调控作用，并通过酵母单杂交技术和转录激活实验来揭示其调控机制。本发明证明FvNAC07能够正向调控糖分特别是蔗糖的生物合成，增加蔗糖的含量，为通过基因工程手段提高草莓果实中糖分含量和提高草莓品质提供基因资源。
本发明的第一方面提供一种FvNAC073蛋白质，所述蛋白质为如下(1)或(2)的蛋白：
(1)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
本发明的第二方面提供与如上文所述的蛋白质相关的生物材料，包括a)-b)中至少一项：
a)编码如上文所述蛋白质的多核苷酸；
b)含有a)所述多核苷酸的重组表达载体；
c)含有a)所述多核苷酸的生物工程菌，或含有b)所述重组表达载体的生物工程菌。
根据本申请的技术方案，a)中，所述多核苷酸的序列包括如SEQ ID NO.1所示序列。
本发明的第三方面提供如上文所述的FvNAC073蛋白质或如上文所述的生物材料中的多核苷酸作为靶标在制备或筛选植物果实糖分生物合成和/或糖分积累的产品中的用途。
根据本申请的技术方案，所述产品包括FvNAC073抑制剂，所述FvNAC073抑制剂选自如下A1)-A3)中的一种或多种；
A1)所述FvNAC073抑制剂是指对FvNAC073具有抑制效果的化合物；
A2)所述FvNAC073抑制剂为产品的唯一有效成分或有效成分之一；
A3)所述FvNAC073抑制剂选自双链RNA、shRNA、抗体或小分子化合物。
根据本申请的技术方案，所述产品包括FvNAC073促进剂，所述FvNAC073促进剂选自如下B1)-B2)中的一种或两种；
B1)所述FvNAC073促进剂是指对FvNAC073具有促进效果的化合物；
B2)所述FvNAC073促进剂为产品的唯一有效成分或有效成分之一。
本发明的第四方面提供如上文所述的蛋白质或上文所述的生物材料在调控植物果实糖分生物合成和/或糖分积累中的用途。
根据本申请的技术方案，所述用途包括下述中的一项或多项：
1)调控植物果实糖分生物合成；
2)调控植物果实糖分含量；
3)调控植物果实糖分积累；
4)调控植物果实品质；
5)制备1)～4)中的相关产品；
6)培育1)～4)中的相关植物。
本发明的第五方面提供一种调控和/或培育植物果实糖分生物合成和/或糖分积累的方法，所述方法包括如下步骤中的一项或多项：
D1)导入如上文所述的FvNAC073蛋白；
D2)导入如上文所述的生物材料；
D3)导入如上文所述的用途中的FvNAC073促进剂；
D4)导入如上文所述的用途中的FvNAC073抑制剂；
D5)降低如上文所述的FvNAC073蛋白质的表达量和/或活性。
根据本申请的技术方案，通过同源重组法、RNAi沉默法或CRISPR法降低FvNAC073蛋白的表达量和/或活性。
根据本申请的技术方案，所述步骤D1)或D2)或D3)中的一项或多项，用于提高植物果实糖分生物合成和/或糖分积累。
根据本申请的技术方案，所述步骤D4)或D5)中的一项或两项，用于降低植物果实糖分生物合成和/或糖分积累。
根据本发明的技术方案，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。优选地，为草莓。
根据本申请的技术方案，所述糖分包括蔗糖、果糖和葡萄糖。优选地，为蔗糖。
本发明具有以下有益效果：
1)本发明通过亚细胞定位实验发现FvNAC073蛋白定位在烟草叶片原生质体的细胞核中。转录自激活实验显示FvNAC073基因具有很强的转录自激活活性。FvNAC073蛋白结构N端有一个保守的NAC结构域，C端有一个非保守的转录激活结构域，编码蛋白约37KD(332个氨基酸)。
2)本发明从二倍体草莓中克隆出FvNAC073基因，成功构建了重组表达载体，采用农杆菌介导法将含有FvNAC073基因的重组表达瞬时注射八倍体“红颜”草莓果实中发现，与注射空载的对照相比，过表达FvNAC073基因，能显著促进果实中蔗糖的积累，说明FvNAC073基因具有促进草莓果实中蔗糖合成、提高糖分积累的功能。
3)本发明还通过农杆菌介导法将构建好的FvNAC073-RNAi沉默载体在八倍体“红颜”草莓果实中瞬时注射，结果发现，沉默FvNAC073显著降低了草莓果实中的蔗糖，说明FvNAC073基因表达下降具有抑制果实中蔗糖合成、减少糖分积累的功能。
4)本发明构建的含FvNAC073基因功能的表达载体，不仅构建了过表达FvNAC073基因的载体，还构建了RNAi干扰的沉默载体，同时采用农杆菌介导的方法在草莓果实中实现瞬时表达试验，获得FvNAC073基因过表达和沉默的新种质，为调控草莓果实蔗糖生物合成、糖分含量或糖分积累的分子育种提供新的基因资源。
附图说明
图1显示为本发明的实施例3中FvNAC073蛋白的共聚焦显微镜图。
图2显示为本发明的实施例4中FvNAC073转录因子自激活实验的实拍图。
图3显示为本发明的实施例5中EV-OE和FvNAC073-OE以及EV-RNAi和FvNAC073-RNAi在0d、3d、5d和7d的实拍图。
图4显示为本发明的实施例5中EV-OE和FvNAC073-OE以及EV-RNAi和FvNAC073-RNAi果实的糖含量图。其中，图A为EV-OE和FvNAC073-OE中葡萄糖、蔗糖和果糖的含量，图B为EV-RNAi和FvNAC073-RNAi中葡萄糖、蔗糖和果糖的含量。
图5显示为本发明的实施例5中EV-OE和FvNAC073-OE以及EV-RNAi和FvNAC073-RNAi果实中基因FvNAC073、FvSPS1和FvSUS2的相对表达量图。
图6显示为本发明的实施例5中EV-OE和FvNAC073-OE以及EV-RNAi和FvNAC073-RNAi果实中基因FvNAC073、FvSPS3和FvSUC2的相对表达量图。
具体实施方式
本发明的第一方面，提供了一种FvNAC073蛋白质，所述蛋白质为如下(1)或(2)的蛋白：(1)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
SEQ ID NO：2所示序列具体为：
MTWHSDEEEEEERAAVQSITPSSATYPQQSKNNKNNEISSCPSCGHPIDFQDQAGIHDLPGLPAGVKFDPTDQEILQHLEAKVLTDTRKLHPLIDEFIPTLDGENGICSTHPEKLPGVNKEGQIRHFFHRPSKAYTTGTRKRRKVHTEEDGSETRWHKTGKTRPVLANGAVKGFKKILVLYTNYGRQRKPEKTNWVMHQYHLGNNEEEKDGELVLSKVFYQTQPRQCGTGTPSIRDGGPPLLNPFDSHHYKGQVNIRSGQDGIPLPLPPKKAGVMEYYNHNHPGPFMNYEHPHLIQGGQNREIPAQLIPNMVLQGDGSSLFRYNAADTSKGN
本发明的另一方面，还提供了与上文所述的蛋白质相关的生物材料，包括a)-b)中至少一项：
a)编码如上文所述蛋白质的多核苷酸；
b)含有a)所述多核苷酸的重组表达载体；
c)含有a)所述多核苷酸的生物工程菌，或含有b)所述重组表达载体的生物工程菌。
本发明中，a)编码第一方面所述的蛋白质的多核苷酸，可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA；DNA可以是单链的或是双链的；DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白的编码区序列可以与SEQ ID NO.1中的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.2所示序列的蛋白，但与SEQ ID NO.1中的编码区序列有差别的核酸序列。
在本发明的一个具体实施例中，所述的多核苷酸从森林草莓“Rugen”的组织中提取出来。所述多核苷酸如SEQ ID NO：1所述序列。
SEQ ID NO：1所示序列具体为：
ATGACATGGCACTCAGATGAGGAAGAGGAAGAAGAGAGGGCAGCAGTTCAGTCAATAACTCCCTCCTCTGCAACATATCCTCAGCAATCTAAGAATAATAAGAACAATGAAATATCATCATGCCCGTCTTGTGGCCACCCTATAGATTTTCAAGACCAGGCTGGAATTCATGATTTGCCGGGACTACCAGCAGGGGTGAAATTTGATCCGACGGACCAGGAGATTCTTCAACATTTGGAGGCAAAAGTGCTCACTGATACCAGAAAGCTTCATCCACTCATTGATGAATTCATACCAACGCTTGATGGAGAGAATGGAATCTGCTCTACCCACCCAGAAAAGCTACCAGGAGTTAACAAAGAAGGACAGATCCGCCACTTTTTTCACCGACCCTCAAAGGCCTATACCACCGGAACCAGGAAGCGAAGGAAGGTTCACACCGAAGAAGATGGAAGCGAGACAAGATGGCACAAAACGGGCAAGACAAGGCCAGTCCTAGCCAATGGAGCAGTCAAGGGTTTCAAAAAGATCTTGGTCCTCTACACCAACTACGGCAGGCAAAGGAAGCCCGAGAAGACGAATTGGGTGATGCACCAGTACCACCTTGGCAACAATGAAGAAGAAAAAGATGGGGAGCTAGTGCTATCTAAGGTCTTTTACCAAACACAACCTAGGCAATGTGGTACTGGCACTCCAAGTATCAGAGATGGTGGTCCTCCATTGTTGAATCCATTTGATAGCCATCATTATAAAGGTCAAGTGAATATTCGTAGTGGCCAAGATGGGATTCCTCTTCCTCTTCCTCCAAAGAAGGCTGGTGTTATGGAGTATTACAATCATAATCATCCTGGTCCTTTTATGAACTATGAGCATCCTCATCTAATTCAAGGAGGCCAGAATAGGGAAATCCCAGCTCAACTAATTCCTAACATGGTTCTTCAAGGTGACGGGTCTTCGTTGTTTCGATACAATGCTGCAGATACAAGCAAAGGAAACTAA
本发明中，FvNAC073基因的多核苷酸全长序列或其片段可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明的实施例记载的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
在本发明的一个具体实施例中，所述SEQ ID NO.1所示的多核苷酸通过包括如下步骤的方法获得：提取森林草莓“Rugen”基因组总RNA，将所获得的基因组总RNA通过反转录获得cDNA，根据SEQ ID NO.1所示的多核苷酸，设计上游引物和下游引物；以所述的cDNA为模板，以SEQ ID NO.3所示序列为上游引物和以SEQ ID NO.4所示序列为下游引物，经PCR扩增后得到所述的多核苷酸。
需要说明的是，在本发明实施例中，“多核苷酸”可以是指，该多核苷酸已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，也可以指该多核苷酸已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
本发明中，b)含有a)所述多核苷酸的重组表达载体。本发明中，编码所述蛋白质的多核苷酸序列可插入到表达载体中形成重组表达载体。
在本发明一个具体实施例中，将第一方面得到FvNAC073基因的PCR扩增产物连接到pLB载体上，得到重组表达载体(中间载体)pLB-FvNAC073。
本发明中，c)中含有a)所述多核苷酸的生物工程菌、或含有b)所述重组表达载体的生物工程菌。所述生物工程菌含有如上述所述的重组表达载体或基因组内整合有如上文所述的多核苷酸。培养生物工程菌，以使其能够表达蛋白。生物工程菌可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。不局限于本申请中所采用的大肠杆菌JM107、农杆菌GV3101、酵母pLexA/pGBKT7-BD。
本发明的另一方面，还提供了FvNAC073蛋白或上文所述的生物材料中的多核苷酸作为靶标在制备或筛选调控植物果实糖分生物合成和/或糖分积累产品中的用途。
本发明中，所述糖分包括蔗糖、葡萄糖和果糖。优选地，为蔗糖。
本发明中，所述FvNAC073基因作为靶标在制备或筛选调控植物果实糖分合成和/或糖分积累的产品具体是指：将FvNAC073基因或FvNAC073蛋白作为作用对象，对产品进行筛选，以找到可以促进或抑制FvNAC073基因的表达水平，或促进或抑制FvNAC073蛋白的表达或活性的产品作为调控植物果实糖分生物合成和/或糖分积累的备选产品。
本发明中，所述调控植物果实糖分生物合成和/或糖分积累的产品包括能够特异性抑制FvNAC073基因的转录或翻译，或能够特异性抑制FvNAC073蛋白的表达或活性的分子，从而降低植物中FvNAC073基因的表达水平，达到抑制植物果实糖分生物合成和/或降低糖含量和/或降低糖分积累的目的。
本发明中，所述调控植物果实糖分合成和/或糖含量的产品包括能够特异性促进FvNAC073基因的转录或翻译，或能够特异性促进FvNAC073蛋白的表达或活性的分子，从而提高植物果实中FvNAC073基因的表达水平，达到促进制植物果实糖分生物合成或提高植物果实糖含量和/或提高糖分积累的目的。
本发明中，所述产品包括FvNAC073抑制剂，所述FvNAC073抑制剂是指对FvNAC073具有抑制效果的化合物或所述FvNAC073抑制剂为产品的唯一有效成分或有效成分之一；或，所述产品包括FvNAC073促进剂，所述FvNAC073促进剂是指对FvNAC073具有促进效果的化合物或所述FvNAC073促进剂为产品的唯一有效成分或有效成分之一。
本发明中，所述产品必然包括FvNAC073抑制剂或FvNAC073促进剂，并以FvNAC073抑制剂或FvNAC073促进剂作为前述功效的有效成分。
本发明中，所述产品中，有效成分可仅为FvNAC073抑制剂或FvNAC073促进剂，亦可包含其他可起到抑制或促进效果的分子。本发明中，所述产品可以为单成分物质，也可以为多成分物质。本发明中，所述产品的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
本发明中，所述FvNAC073抑制剂或所述FvNAC073促进剂包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
本发明的另一方面，提供如上文所述的蛋白质或上文所述的生物材料在调控植物果实糖分生物合成和/或糖分积累中的用途。
本发明中，所述用途包括下述中的一项或多项：
1)调控植物果实糖分生物合成；
2)调控植物果实糖分含量；
3)调控植物果实糖分积累；
4)调控植物果实品质；
5)制备1)～4)中的相关产品；
6)培育1)～4)的相关植物。
本发明的另一方面，还提供一种调控植物果实糖分生物合成和/或糖分积累的方法，所述方法包括如下步骤中的一项或多项：
D1)导入如上文所述的FvNAC073蛋白；
D2)导入如上文所述的生物材料；
D3)导入如上文所述的FvNAC073促进剂；
D4)导入如上文所述的FvNAC073抑制剂；
D5)降低如上文所述的FvNAC073蛋白质的表达量和/或活性。
本发明中，所述步骤D1)或D2)或D3)中的一项或多项，用于提高植物果实糖分生物合成和/或糖分积累；或，所述步骤D4)或D5)中的一项或两项，用于降低植物果实糖分糖生物合成和/或糖分积累。
本发明中，培育促进糖分生物合成或提高糖分积累或增加糖含量的转基因植物方法，包括将所述的FvNAC073蛋白和/或所述的生物材料和/或所述的FvNAC073促进剂导入受体植物中，得到转基因植物。
本发明中，培育抑制糖分生物合成或抑制糖分积累或降低糖分含量的转基因植物的方法，包括降低如上文所述的FvNAC073蛋白质的表达量和/或活性，或，所述的FvNAC073抑制剂导入受体植物中，得到转基因植物。
本发明中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。优选地，为草莓。
本发明中，所述糖分包括蔗糖、果糖和葡萄糖。优选地，为蔗糖。
本发明中，通过同源重组法、RNAi沉默法或CRISPR法降低FvNAC073蛋白的表达量和/或活性。
本发明的另一方面，还提供FvNAC073沉默载体(PFGC5941-FvNAC073-RNAi)，所述FvNAC073沉默载体为采用同源重组法对所述FvNAC073蛋白的编码基因进行敲除。
本发明的另一方面，还提供FvNAC073过表达载体(pHB-FvNAC073-YFP)，所述FvNAC073过表达载体为采用同源重组法构建获得。
本申请的过表达载体pHB-FvNAC073-YFP、沉默载体PFGC5941-FvNAC073-RNAi和酵母过表达载体BD-FvNAC073的构建方法都是采用同源重组的方法，设计的引物中分别引入的酶切位点为BamH I、NcoI和BamHⅠ、EcoRI和XhoI，并用这些酶切位点对相应的载体进行酶切，利用同源重组酶进行连接，转化获得重组的表达载体。
本发明的一个更加具体实施例为：
(1)重组表达载体(中间载体)pLB-FvNAC073的构建
a)以森林草莓Rugen的叶片为材料，提取叶片的总RNA，然后通过反转录获得cDNA；
b)设计引物FvNAC073-F1和FvNAC073-R1，以cDNA为模板，进行PCR反应，得到FvNAC073全长基因序列；
FvNAC073-F1引物：5'-ATGACATGGCACTCAGATGAGGA-3'(SEQ ID NO.3)
FvNAC073-R1引物：5'-GTTTCCTTTGCTTGTATCTGCAGC-3'(SEQ ID NO.4)
c)将FvNAC073与pLB载体连接，得到重组表达载体(中间载体)pLB-FvNAC073。
(2)过表达载体pHB-FvNAC073-YFP的构建
以重组表达载体(中间载体)pLB-FvNAC073为模板，利用引物FvNAC073-F2和FvNAC073-R2进行PCR扩增得到带有BamH I酶切位点的FvNAC073基因片段，采用同源重组法将带有BamH I酶切位点的FvNAC073基因片段与经BamH I酶切处理的pHB-YFP载体连接，得到过表达载体pHB-FvNAC073-YFP。
FvNAC073-F2：5'-ttcctgcagcccgggggatccATGACATGGCACTCAGATGAGGA-3'(SEQ IDNO.5)
FvNAC073-R2：5'-gataccgtcactagtggatccGTTTCCTTTGCTTGTATCTGCAGC-3'(SEQID NO.6)
(3)沉默载体PFGC5941-FvNAC073-RNAi(或FvNAC073-RNAi)的构建
以重组表达载体(中间载体)pLB-FvNAC073为模板，利用引物FvNAC073-RNAi-F1和FvNAC073-RNAi-R1进行PCR扩增得到带有NcoI和BamHⅠ酶切位点的FvNAC073基因片段，采用同源重组法将带有NcoI和BamHⅠ酶切位点的FvNAC073基因片段与经NcoI酶切处理的PFGC5941载体连接，得到沉默载体PFGC5941-FvNAC073-RNAi。所述的FvNAC073基因片段为SEQ ID NO.2所示序列中170-460bp之间的片段。
FvNAC073-RNAi-F1/R1引物(含有NcoI酶切位点)：
FvNAC073-RNAi-F1：5'-ttacatttacaattaccatggATGATTTGCCGGGACTAC-3'(SEQ IDNO.7)
FvNAC073-RNAi-R1：5'-tcgattgggcgcgccccatggTCTCGCTTCCATCTTCTT-3'(SEQ IDNO.8)
FvNAC073-RNAi-F2/R2引物(含有BamHⅠ酶切位点)
FvNAC073-RNAi-F2：5'-caatttgcaggtatttggatccTCTCGCTTCCATCTTCTT-3'(SEQID NO.9)
FvNAC073-RNAi-R2：5'-tctctagactcacctaggatccATGATTTGCCGGGACTAC-3'(SEQID NO.10)
(4)酵母过表达载体BD-FvNAC073的构建
以重组表达载体(中间载体)pHB-FvNAC073-YFP为模板，利用引物BD-FvNAC073-F1和BD-FvNAC073-R进行PCR扩增得到带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的FvNAC073基因片段，采用同源重组法将带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的FvNAC073基因片段与经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切处理的pLexA/pGBKT7-BD载体连接，得到酵母过表达载体BD-FvNAC073。
BD-FvNAC073-F：gattatgcctctcccgaattcATGACATGGCACTCAGATGAGGA(SEQ IDNO.11)
BD-FvNAC073-R：agaagtccaaagcttctcgagGTTTCCTTTGCTTGTATCTGCAGC(SEQ IDNO.12)
在本发明的一个具体实施方式中，通过农杆菌介导分别将过表达载体pHB-FvNAC073-YFP、沉默载体FvNAC073-RNAi，注射到处于白果期的草莓果实中，每隔一天取草莓果实，观察草莓果实颜色的变化并拍照记录；同时测定草莓果实中糖分含量、FvNAC073基因以及与糖分相关基因的相对表达量。结果发现，与仅转染空载体pHB的阴性对照组相比，FvNAC073过表达显著增加了草莓果实中的蔗糖含量，果糖和葡萄糖含量变化不显著，同时FvNAC073和FvSPS1的相对表达量显著升高，FvSPS3的相对表达量相对无显著变化，而FvSUS2和FvSUC2显著降低；与阳性对照组(EV-RNAi)相比，沉默FvNAC073后蔗糖、果糖和葡糖糖含量均呈下降趋势，但差异不显著，且FvNAC073和FvSPS1基因的相对表达量显著降低，FvSPS3的相对表达量相对无显著变化，而FvSUS2和FvSUC2的相对表达量显著升高。这些结果表明FvNAC073可以促进草莓果实中蔗糖的积，并可能通过促进FvSPS1和抑制FvSUS2的表达来调节蔗糖积累。
FvNAC073能够调控草莓果实中蔗糖的生物合成或调控草莓果实中的糖含量，而草莓果实中的含糖量不仅是影响果实甜度的物质，还是酸、类胡萝卜素和其它营养成分及芳香物质等合成的基础原料，因此，果实的含糖量或糖的积累是衡量和决定果实品质的重要因子。因此，对FvNAC073基因进行功能研究，既有利于在分子方面了解草莓果实蔗糖生物合成机理，也有利于筛选高甜度的草莓品种的分子育种工作，也为今后进行草莓糖含量性状的改良提供候选基因，该发明对草莓的规模化生产具有重要意义。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1草莓FvNAC073基因的克隆
本实施例中，进行草莓FvNAC073基因的克隆，包括如下：
1.1植物材料的获得
取森林草莓“Rugen”的嫩叶0.1g，置于1.5mL离心管中，置于液氮中迅速冷却，然后在低温下研磨成粉末备用，用于提取RNA。
1.2RNA的抽提
以步骤1.1得到粉末为对象，按照天根RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(购自天根生化，Cat：DP441)的操作说明书，提取总RNA。
1.3RNA反转录为cDNA
根据步骤1.2得到的总RNA为模板，按照全式金cDNA合成试剂盒(Cat：AE311-02)的操作说明，得到cDNA。
1.4基因克隆
根据草莓FvNAC073基因的核苷酸序列，设计扩增编码区的上游引物和下游引物：
FvNAC073-F1引物：5'-ATGACATGGCACTCAGATGAGGA-3'(SEQ ID NO.3)
FvNAC073-R1引物：5'-GTTTCCTTTGCTTGTATCTGCAGC-3'(SEQ ID NO.4)
以步骤1.3得到的cDNA为模板，按照下述反应体系和反应程序进行PCR扩增反应，得到PCR产物。
PCR反应体系为：12.5μL PrimeSTAR Max Premix，引物FvNAC073-F1和FvNAC073-R1各0.4μL，cDNA 1μL，最后加无菌的蒸馏水补足到25μL。
PCR反应程序：98℃预变性1min；98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸20s，从变性到延伸共循环30个循环；72℃充分延伸10min，25℃保存。
1.5载体构建
将步骤1.4得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。PCR扩增产物的片段大小为799bp，切取目的条带，按照胶回收试剂盒(生工生物，Cat：B518131)的操作说明回收。
将上述回收的目的片段无缝连接到pLB载体(天根生化，Cat:VT205)，得到pLB-FvNAC073中间载体，然后将pLB-FvNAC073中间载体通过化学转化的方法转化到大肠杆菌感受态细胞JM107中，涂布于LB平板(含100mg/L的氨苄青霉素)上，37℃过夜培养。
对过夜后的菌落进行PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆菌液提取质粒，经测序后获得FvNAC073的全长基因序列，如SEQ ID NO.1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示序列。
SEQ ID NO.1所示序列具体为：
ATGACATGGCACTCAGATGAGGAAGAGGAAGAAGAGAGGGCAGCAGTTCAGTCAATAACTCCCTCCTCTGCAACATATCCTCAGCAATCTAAGAATAATAAGAACAATGAAATATCATCATGCCCGTCTTGTGGCCACCCTATAGATTTTCAAGACCAGGCTGGAATTCATGATTTGCCGGGACTACCAGCAGGGGTGAAATTTGATCCGACGGACCAGGAGATTCTTCAACATTTGGAGGCAAAAGTGCTCACTGATACCAGAAAGCTTCATCCACTCATTGATGAATTCATACCAACGCTTGATGGAGAGAATGGAATCTGCTCTACCCACCCAGAAAAGCTACCAGGAGTTAACAAAGAAGGACAGATCCGCCACTTTTTTCACCGACCCTCAAAGGCCTATACCACCGGAACCAGGAAGCGAAGGAAGGTTCACACCGAAGAAGATGGAAGCGAGACAAGATGGCACAAAACGGGCAAGACAAGGCCAGTCCTAGCCAATGGAGCAGTCAAGGGTTTCAAAAAGATCTTGGTCCTCTACACCAACTACGGCAGGCAAAGGAAGCCCGAGAAGACGAATTGGGTGATGCACCAGTACCACCTTGGCAACAATGAAGAAGAAAAAGATGGGGAGCTAGTGCTATCTAAGGTCTTTTACCAAACACAACCTAGGCAATGTGGTACTGGCACTCCAAGTATCAGAGATGGTGGTCCTCCATTGTTGAATCCATTTGATAGCCATCATTATAAAGGTCAAGTGAATATTCGTAGTGGCCAAGATGGGATTCCTCTTCCTCTTCCTCCAAAGAAGGCTGGTGTTATGGAGTATTACAATCATAATCATCCTGGTCCTTTTATGAACTATGAGCATCCTCATCTAATTCAAGGAGGCCAGAATAGGGAAATCCCAGCTCAACTAATTCCTAACATGGTTCTTCAAGGTGACGGGTCTTCGTTGTTTCGATACAATGCTGCAGATACAAGCAAAGGAAACTAA
SEQ ID NO.2所示序列具体为：
MTWHSDEEEEEERAAVQSITPSSATYPQQSKNNKNNEISSCPSCGHPIDFQDQAGIHDLPGLPAGVKFDPTDQEILQHLEAKVLTDTRKLHPLIDEFIPTLDGENGICSTHPEKLPGVNKEGQIRHFFHRPSKAYTTGTRKRRKVHTEEDGSETRWHKTGKTRPVLANGAVKGFKKILVLYTNYGRQRKPEKTNWVMHQYHLGNNEEEKDGELVLSKVFYQTQPRQCGTGTPSIRDGGPPLLNPFDSHHYKGQVNIRSGQDGIPLPLPPKKAGVMEYYNHNHPGPFMNYEHPHLIQGGQNREIPAQLIPNMVLQGDGSSLFRYNAADTSKGN
具体的化学转化方法为：
将中间载体与大肠杆菌感受态混匀，在冰上放置30min；42℃热水浴70S，冰浴2min；加入1mL不加抗生素的LB液体培养基；置于37℃，220rpm摇床振荡培养30min；6,000rpm，离心2-3min，弃去上清，吸打混匀，涂布至加有相应抗生素的LB平板；倒置于37℃培养箱中培养12-16小时。
实施例2同源重组法构建过表达载体pHB-FvNAC073-YFP
本实施例中，采用同源重组法构建过表达载体pHB-FvNAC073-YFP，包括如下：
2.1在FvNAC073基因中引入酶切位点
以实施例1中步骤1.5得到的pLB-FvNAC073中间载体作为模板，设计引入BamH I酶切位点引物(过表达载体)。
引物如下：
FvNAC073-OE引物(引入BamH I酶切位点)：
FvNAC073-F2：5'-ttcctgcagcccgggggatccATGACATGGCACTCAGATGAGGA-3'(SEQ IDNO.5)
FvNAC073-R2：5'-gataccgtcactagtggatccGTTTCCTTTGCTTGTATCTGCAGC-3'(SEQID NO.6)
注：引物序列中小写的碱基序列是含有载体上的序列和酶切位点，是为了构建载体而人为引入的，不属于FvNAC073基因的序列。
然后，按照下面的PCR反应体系进行PCR扩增，获得含有酶切位点的FvNAC073基因产物。
PCR反应体系为：12.5μL PrimeSTAR Max Premix，引物FvNAC073-F2和FvNAC073-R2各0.4μL，中间载体pLB-FvNAC073 0.1μL，最后加无菌的蒸馏水补足到25μL。
PCR反应程序：98℃预变性1min；98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸20s，从变性到延伸共循环30个循环；72℃充分延伸10min，25℃保存。
PCR扩增产物通过产物纯化，回收含有酶切位点的FvNAC073基因片段，然后用限制内切酶进行酶切，得到FvNAC073基因片段。
2.2酶切反应
用限制性内切酶BamH I对载体pHB-YFP(原始载体)进行单酶切，得到酶切后的载体。
单酶切反应体系为：10×Digest Buffer 5μL，pHB-YFP载体质粒4μL，酶1μL，最后加无菌的蒸馏水补足到50μL，瞬时离心混匀后置于37℃酶切2h，85℃灭活10min备用。
2.3连接反应
将本实施例中步骤2.1的FvNAC073基因片段和步骤2.2的酶切后的载体然后按照如下体系进行连接反应：
表1.连接反应体系
上述组分混匀后置于37℃连接45min，构建得到重组表达载体。
2.4筛选阳性克隆菌株，测序
将步骤2.3得到的重组表达载体采用同实施例1中转化方法相同的方法转化到大肠杆菌感受态细胞JM107中，涂板于LB平板(含有50mg/L的卡纳霉素)上，37℃过夜培养。
对过夜后的菌落进行PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆摇菌，提取质粒后经测序验证基因序列的正确性，得到过表达载体pHB-FvNAC073-YFP。
实施例3同源重组法构建沉默载体PFGC5941-FvNAC073-RNAi
本实施例中，采用同源重组法构建沉默载体PFGC5941-FvNAC073-RNAi(或FvNAC073-RNAi)，包括如下：
3.1在FvNAC073基因中引入酶切位点
以实施例1中步骤1.5得到的中间载体pLB-FvNAC073作为模板，设计引入NcoI和BamHⅠ酶切位点。
引物如下：
FvNAC073-RNAi-F1/R1引物(含有NcoI酶切位点)：
FvNAC073-RNAi-F1：5'-ttacatttacaattaccatggATGATTTGCCGGGACTAC-3'(SEQ IDNO.7)
FvNAC073-RNAi-R1：5'-tcgattgggcgcgccccatggTCTCGCTTCCATCTTCTT-3'(SEQ IDNO.8)
FvNAC073-RNAi-F2/R2引物(含有BamHⅠ酶切位点)
FvNAC073-RNAi-F2：5'-caatttgcaggtatttggatccTCTCGCTTCCATCTTCTT-3'(SEQID NO.9)
FvNAC073-RNAi-R2：5'-tctctagactcacctaggatccATGATTTGCCGGGACTAC-3'(SEQID NO.10)
序列中有下划线的碱基为酶切位点。
然后，按照下面的PCR反应体系进行PCR扩增，获得含有NcoI和BamHⅠ酶切位点的FvNAC073基因片段的产物。
PCR反应体系:12.5μL PrimeSTAR Max Premix，引物FvNAC073-RNAi-F1/R1和FvNAC073-RNAi-F2/R2各0.4μL，中间载体pLB-FvNAC073 0.1μL，最后加无菌的蒸馏水补足到25μL。
PCR反应程序：98℃预变性1min；98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸20s，从变性到延伸共循环30个循环；72℃充分延伸10min，25℃保存。
PCR扩增产物通过产物纯化，回收含有NcoI和BamH Ⅰ酶切位点的FvNAC073基因片段。
3.2酶切连接反应
用限制性内切酶NcoI对PFGC5941载体进行单酶切，并回收经酶切后的载体片段，然后与本实施例中步骤3.1得到的含有NcoI和BamH Ⅰ酶切位点的FvNAC073基因片段按照2.3反应体系进行连接反应，得到重组表达载体。
3.3中间载体筛选阳性克隆菌株，测序
将步骤3.2得到的重组表达载体采用同实施例1的化学转化方法转化到大肠杆菌感受态细胞JM107中，涂板于LB平板(含有50mg/L的卡纳霉素)上，37℃过夜培养。
对过夜后的菌落进行PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆摇菌，提取质粒后经测序验证基因序列的正确性，得到重组表达载体PFGC5941-FvNAC073。
3.4筛选阳性克隆菌株，测序
用限制性内切酶BamH Ⅰ对本实施例中步骤3.3得到的重组表达载体PFGC5941-FvNAC073进行单酶切，回收含有BamH Ⅰ酶切位点的目标片段，然后与本实施例3.3得到重组表达载体PFGC5941-FvNAC073按照2.3反应体系进行连接反应。
将得到的重组表达载体采用同实施例1的化学方法转化到大肠杆菌感受态细胞JM107中，涂板于LB平板(含有50mg/L的卡纳霉素)上，37℃过夜培养。
对过夜后的菌落进行PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆摇菌，提取质粒后经测序验证基因序列的正确性，得到用于沉默FvNAC073基因的重组表达载体FvNAC073-RNAi。
实施例4FvNAC073蛋白的亚细胞定位
本实施例中，将实施例2中测序正确的过表达载体pHB-FvNAC073-YFP转化于农杆菌GV3101中，进一步利用本氏烟的叶片进行亚细胞定位研究，包括如下：
4.1过表达载体转化农杆菌
取50μL农杆菌GV3101感受态细胞一支置于冰上，待其溶解后加入实施例2中步骤2.4得到经测序正确的1μL过表达载体pHB-FvNAC073-YFP，用移液器轻轻吸打混匀后置于冰上静置30min，然后置于液氮中冷冻1min，再置于37℃温育3min使其解冻。随后，加入1mL不含抗生素的YEP液体培养基，于30℃摇床中220rpm振荡培养3h，然后在常温下13000rpm离心1min，去掉900μL上清后吸打重悬菌体沉淀。最后取100μL菌液涂布于含有50mg/L Rif(利福平)和50mg/L Kan(卡纳霉素)的YEP固体培养基上，30℃倒置培养3d，挑取单克隆进行PCR检测，选取阳性克隆摇菌，得到含有过表达载体的农杆菌GV3101。
4.2FvNAC073蛋白的亚细胞定位
含有过表达载体的农杆菌GV3101在YEP培养基中培养，大摇至OD600＝0.6-0.8，室温6000rpm，20min离心收集菌体，用含有10mM MES、100pM AS和10mM MgCl2的侵染缓冲液(PH为5.6)重悬菌体，28℃避光活化菌体2h，得到含有过表达载体的农杆菌液，标记为P35S::FvNAC073-YFP。
同时以PHB::YFP作为阴性对照，其为原始载体pHB-YFP导入农杆菌GV3101中形成的农杆菌液。
然后使用不带针头的注射器将P35S::FvNAC073-YFP和PHB::YFP渗入本氏烟草的叶子中。在黑暗中孵育36-40小时后，通过共聚焦显微镜(Leica TCS SP5II)检查烟叶样品以检测各种荧光蛋白的表达。
图1为本实施例中FvNAC073蛋白的共聚焦显微镜图。
从图1可知，FvNAC073-YFP融合蛋白定位在细胞核中。
实施例5FvNAC073转录因子的自激活实验
本实施例，构建酵母过表达载体BD-FvNAC073并进行转录因子的自激活试验，包括如下：
5.1酵母过表达载体BD-FvNAC073的构建
以实施例2得到的过表达载体pHB-FvNAC073-YFP为模板，设计包含EcoRⅠ和XhoⅠ的引物，如BD-FvNAC073-F和BD-FvNAC073-R，对FvNAC073基因的全长进行PCR扩增回收目的片段，得到基因片段。
将pLexA/pGBKT7-BD载体用EcoRⅠ和XhoⅠ限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行回收，得到酶切后的BD载体。
将基因片段和酶切后的BD载体通过同源重组酶进行连接，然后将连接产物转化到大肠杆菌感受态JM107中，再通过菌落PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆进行摇菌、抽取质粒并进行测序验证，最终得到酵母过表达载体BD-FvNAC073。提取质粒-20℃备用。
BD-FvNAC073-F含有EcoRⅠ酶切位点，BD-FvNAC073-R含有XhoⅠ酶切位点。
BD-FvNAC073-F：gattatgcctctcccgaattcATGACATGGCACTCAGATGAGGA(SEQ IDNO.11)
BD-FvNAC073-R：agaagtccaaagcttctcgagGTTTCCTTTGCTTGTATCTGCAGC(SEQ IDNO.12)
5.2FvNAC073转录因子的自激活试验
在1.5mL的EP管中加入下述溶液并充分混合得到混合溶液，溶液具体见表1。
表1
同时，以BD空载(pLexA)和p8op-LacZ是阴性对照。
取EGY48酵母感受态细胞1.5mL，13000×g离心1min，在超净台中弃去上清，收集菌体沉淀，向上述菌体沉淀中加入100μL one step Buffer，涡旋振荡混匀，加入到上述的表1得到的混合溶液中。涡旋混匀，45℃水浴30min。水浴结束后，涡旋混匀，然后全部涂布于SD/-His-Ura生长培养基上，30℃倒置培养3天。one step Buffer的配方见表2。
表2
从生长3d的生长培养基上挑取6个长势一致的单菌落接种于含有2mL SD/-His-Ura液体生长培养基的离心管中，30℃，220rpm振荡培养24h。转移培养产物至1.5mL无菌离心管中，13000×g离心1min。弃掉1400μL上清，剩余约100μL上清液与菌体沉淀振荡混匀。取10μL混匀液点在含有X-gal的SD/-Trp-Ura分析培养基平板上，30℃约培养12h。12h后观察菌斑颜色变化情况，并拍照记录。
图2为本实施例中FvNAC073转录因子自激活实验的实拍图。
从图2可知，含有BD-FvNAC073和p8op-LacZ的酵母细胞在含有X-gal的SD-Ura/-His培养基中生长并呈蓝色，相反，含有BD和p8op-LacZ的阴性对照的颜色没有变化，这表明FvNAC073具有转录激活活性。
实施例6农杆菌介导FvNAC073基因瞬时注射草莓
本实施例中，将实施例2中的过表达载体pHB-FvNAC073-YFP和实施例3的沉默载体FvNAC073-RNAi分别转化于农杆菌GV3101后，进一步通过瞬时注射入草莓果实中，拍照观察并收集果实进行生理指标及糖代谢基因的表达检测，包括如下：
6.1瞬时注射草莓果实
将分别含有过表达载体pHB-FvNAC073-YFP和沉默载体FvNAC073-RNAi的农杆菌菌株进行活化，加入含有50mg/L Rif(利福平)和50mg/L Kan(卡纳霉素)的液体YEP培养基中，大摇至OD600＝0.6-0.8时，于室温6000rpm离心20min收集菌体，用含有10mM MES，100pM AS以及10mM MgCl2的侵染缓冲液(PH5.6)重悬菌体，28℃避光活化菌体2h，分别得到含有过表达载体pHB-FvNAC073-YFP和沉默载体FvNAC073-RNAi的侵染菌液。
选择生长环境相同、着生位置相近、大小发育时期一致的白果期的“红颜”草莓果实，进行瞬时注射。具体为：
用1mL注射器针尖从果蒂基部插入果实中，分别将侵染菌液缓慢注入“红颜”草莓果实，至全果出现浸渍状，分别得到转入过表达载体pHB-FvNAC073-YFP和沉默载体FvNAC073-RNAi的草莓，分别将草莓称为FvNAC073-OE和FvNAC073-RNAi。
同时设立阴性对照组(EV-OE)和阳性对照组(EV-RNAi)，阴性对照组(EV-OE)为将空载体pHB采用与过表达载体pHB-FvNAC073-YFP相同的构建方法和农杆菌介导法注射转入草莓，将该草莓称为EV-OE；阳性对照组(EV-RNAi)为将PFGC5941空载体通过农杆菌介导法注射转入草莓，将该草莓称为EV-RNAi。瞬时注射后，每隔一天取5颗草莓果实，观察草莓果实颜色的变化并拍照记录；去除种子后的草莓果实用液氮磨成粉末，然后保存于-80℃，用于测定糖含量和蔗糖代谢相关基因的相对表达量。
6.2瞬时注射后，草莓果实表型的观察及糖含量测定
草莓果实中果糖、蔗糖、葡萄糖含量的提取采用HPLC检测。包括如下：
1)取3g草莓粉末，用6mL去离子水超声处理15min，然后以10,000rpm/min离心15min，取上清液通过0.22μm膜过滤，滤液通过HPLC检测。
糖含量检测采用LC3000高效液相色谱仪(CXTH、BJ、CHN)、示差检测器(KNAUER、GERMAN)，ZORBAX NH2色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相为乙腈-水(75:25，含少量氢氧化铵)。流速为0.6mL/min，柱温为25℃。
2)绘制标准曲线：将葡萄糖、蔗糖、果糖标准品用超纯水稀释成终浓度均为100ng/mL的混合液作为母液，然后将母液进行梯度稀释成6.125、12.5、25、50ng/mL，分别绘制蔗糖、葡萄糖和果糖的标准曲线，分别以蔗糖、葡萄糖和果糖糖含量为横坐标，峰面积为纵坐标，得到标准曲线。
每一样品重复进样3次，根据标准曲线换算相应的糖含量，计算平均值和标准偏差。
图3为本实施例中EV-OE、FvNAC073-OE、EV-RNAi、FvNAC073-RNAi草莓分别在注射后0d、3d、5d和7d的实拍图。
图4为本实施例中EV-OE和FvNAC073-OE以及EV-RNAi和FvNAC073-RNAi草莓果实的糖含量图。其中，图A为EV-OE和FvNAC073-OE草莓中葡萄糖、蔗糖和果糖的含量，图B为EV-RNAi和FvNAC073-RNAi草莓中葡萄糖、蔗糖和果糖的含量；sucrose为蔗糖，fructose为果糖，glucose为葡萄糖。
从图4可知，FvNAC073过表达显著增加了草莓果实中的蔗糖含量，而沉默FvNAC073降低了草莓果实中的蔗糖含量。
6.3瞬时注射后，草莓果实中与糖代谢相关基因的研究
1)RNA的提取
用天根RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取步骤6.1得到的粉末，得到总RNA。
2)cDNA的获得
以步骤6.3中1)得到的总RNA为模板，按照全式金cDNA合成试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA。
3)荧光定量PCR分析
设计特异性引物以分析草莓果实中与糖代谢相关基因如FvNAC073、FvSPS1、FvSUS2、FvSPS3和FvSUC2的相对表达量。
根据糖代谢相关基因FvNAC073、FvSPS1、FvSUS2、FvSPS3和FvSUC2的核苷酸序列，利用Primer premier v6.0引物设计软件，设计用于Real-time PCR中定量分析的特异性引物。
FvNAC073基因的引物如下：
正向引物FvNAC073-F3：5′-GAGGGCAGCAGTTCAGTCAAT-3′(SEQ ID NO.13)
反向引物FvNAC073-R3：5′-TCTCCATCAAGCGTTGGTATG-3′(SEQ ID NO.14)
FvSPS1基因的引物如下：
正向引物FvSPS1-F：5′-GAGCCTTGAATGTCCCAATGT-3′(SEQ ID NO.15)
反向引物FvSPS1-R：5′-ATCTCCTGTCTGGTGCTGGTT-3′(SEQ ID NO.16)
FvSPS3基因的引物如下：
正向引物FvSPS3-F：5′-CGTAGATTGGAGTTATGGAGAG-3′(SEQ ID NO.17)
反向引物FvSPS3-R：5′-CGAATGATGTAAGAACCACTGC-3′(SEQ ID NO.18)
FvSUS2基因的引物如下：
正向引物FvSUS2-F：5′-CCACCAATGACACCATACTCTGA-3′(SEQ ID NO.19)
反向引物FvSUS2-R：5′-AGTAGCCATGTGGAGACACGATA-3′(SEQ ID NO.20)
FvSUC2基因的引物如下：
正向引物FvSUC2-F：5′-ACCATCCTCGCACTCACATCC-3′(SEQ ID NO.21)
反向引物FvSUC2-R：5′-CCAAGTCATACAGCCTGCCATT-3′(SEQ ID NO.22)
内参基因为Fvactin基因，引物如下：
Fvactin-F：5′-GAGGCTCCATCTTAGCATCC-3′(SEQ ID NO.23)
Fvactin-R：5′-ACAATTGAAGGGCCTGATTC-3′(SEQ ID NO.24)
荧光定量分析：以步骤6.3中2)合成的cDNA为模板，分别用基因FvNAC073、FvSPS1、FvSUS2、FvSPS3、FvSUC2、内参基因Fvactin的特异性引物扩增进行荧光定量PCR分析，Real-time PCR反应在BIO-RAD Chromo 4实时定量仪上进行。反应体系为20μL，反应采用三步法，94℃变性20s，接着36个循环：94℃ 15s；58℃ 15s；72℃ 25s。
反应结束后将数据导出到Excel表上，利用公式计算各基因的相对表达量。
图5为本实施例中EV-OE和FvNAC073-OE以及EV-RNAi和和FvNAC073-RNAi草莓果实中基因FvNAC073、FvSPS1和FvSUS2的相对表达量图。其中，A图为EV-OE和FvNAC073-OE果实中基因FvNAC073、FvSPS1和FvSUS2的相对表达量，B图为EV-RNAi和FvNAC073-RNAi果实中基因FvNAC073、FvSPS1和FvSUS2的相对表达量。
从图5可知，过表达FvNAC073能使草莓果实中FvSPS1的表达量显著增加，FvSUS2的表达量显著降低，过表达FvNAC073的草莓果实中FvSPS1的表达量与蔗糖含量的变化保持一致(图4)。
从图5可知，敲除FvNAC073能使草莓果实中FvSPS1的表达量显著下降，FvSUS2的表达量显著增加，敲除FvNAC073的草莓果实中FvSPS1的表达量与蔗糖含量的变化保持一致(图4)。
从图5综合可知，FvSPS1与蔗糖积累是正相关，FvSUS2与蔗糖积累是负相关，FvNAC073的表达量与FvSPS1的表达量呈正相关。
图6为本实施例中EV-OE和FvNAC073-OE以及EV-RNAi和FvNAC073-RNAi果实中基因FvNAC073、FvSPS3、FvSUC2的相对表达量图。其中，A图为EV-OE和FvNAC073-OE果实中基因FvNAC073、FvSPS3、FvSUC2的相对表达量，B图为EV-RNAi和FvNAC073-RNAi果实中基因FvNAC073、FvSPS3、FvSUC2的相对表达量。
从图6图可知，过表达FvNAC073和敲除FvNAC073均不影响草莓果实中FvSPS3的相对表达量，过表达FvNAC073能显著降低FvSUC2的相对表达量，而敲除FvNAC073能显著增加FvSUC2的相对表达量，说明FvNAC073的表达量与FvSUC2的表达量呈负相关。
综合图3、图4、图5和图6，FvNAC073调控蔗糖积累的途径不依赖FvSPS3的表达，可能通过促进FvSPS1的表达和抑制FvSUS2的表达来调节蔗糖的积累。
本发明通过亚细胞定位实验发现FvNAC073蛋白定位在烟草叶片原生质体的细胞核中。转录自激活实验显示FvNAC073基因具有很强的转录自激活活性。FvNAC073蛋白结构N端有一个保守的NAC结构域，C端有一个非保守的转录激活结构域，编码蛋白约37KD(332个氨基酸)。本发明从二倍体草莓中克隆出FvNAC073基因，成功构建了重组表达载体，采用农杆菌介导法将含有FvNAC073基因的重组表达瞬时注射八倍体“红颜”草莓果实中发现，与注射空载的对照相比，过表达FvNAC073基因，能显著促进果实中蔗糖的积累，说明FvNAC073基因具有促进草莓果实中蔗糖合成、提高糖分积累的功能。本发明还通过农杆菌介导法将构建好的FvNAC073-RNAi沉默载体在八倍体“红颜”草莓果实中瞬时注射，结果发现，沉默FvNAC073显著降低了草莓果实中的蔗糖，说明FvNAC073基因表达下降具有抑制果实中蔗糖合成、减少糖分积累的功能。本发明为通过改变FvNAC073基因的表达来调控草莓果实糖分生物合成和/或糖分含量提供基础，并为分子育种改变草莓糖分生物合成和/或糖分含量提供候选基因，能为生产上通过转基因技术改进草莓果实品质提供理论支撑。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (6)

1.FvNAC073作为靶标在筛选提高或降低草莓果实中蔗糖含量的产品中的用途，所述FvNAC073的序列为SEQ ID NO.2所示。
2.FvNAC073蛋白或与所述FvNAC073蛋白相关的生物材料在增加草莓果实中蔗糖含量或制备增加草莓果实中蔗糖含量的相关产品中的用途；
所述生物材料为如下中的至少一项：
a）编码所述蛋白的多核苷酸；
b）含有a）所述多核苷酸的重组表达载体；
c）含有a）所述多核苷酸的生物工程菌，或含有b）所述重组表达载体的生物工程菌；
所述FvNAC073的序列为SEQ ID NO.2所示。
3.FvNAC073蛋白或与所述FvNAC073蛋白相关的生物材料在调控草莓果实品质或制备调控草莓果实品质的相关产品中的用途；
所述生物材料为如下中的至少一项：
a）编码所述蛋白的多核苷酸；
b）含有a）所述多核苷酸的重组表达载体；
c）含有a）所述多核苷酸的生物工程菌，或含有b）所述重组表达载体的生物工程菌；
所述FvNAC073的序列为SEQ ID NO.2所示。
4.FvNAC073蛋白或与所述FvNAC073蛋白相关的生物材料在培育草莓中的用途；
所述生物材料为如下中的至少一项：
a）编码所述蛋白的多核苷酸；
b）含有a）所述多核苷酸的重组表达载体；
c）含有a）所述多核苷酸的生物工程菌，或含有b）所述重组表达载体的生物工程菌；
所述FvNAC073的序列为SEQ ID NO.2所示。
5.一种调控草莓果实中蔗糖含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤中的一项或多项：
D1）导入所述FvNAC073蛋白，以提高蔗糖含量；
D2）导入与所述FvNAC073蛋白质相关的生物材料，以提高蔗糖含量；
D3）降低草莓中FvNAC073蛋白的表达量，以降低蔗糖含量；
所述FvNAC073的序列为SEQ ID NO.2所示。
6.一种培育草莓的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤中的一项或多项：
D1）导入所述的FvNAC073蛋白，以培育蔗糖含量提高的草莓；
D2）导入与所述FvNAC073蛋白相关的生物材料，以培育蔗糖含量提高的草莓；
D3）降低草莓中FvNAC073蛋白的表达量，以培育蔗糖含量降低的草莓；
所述FvNAC073的序列为SEQ ID NO.2所示。
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