CN114369603B

CN114369603B - 抑制桂花香气物质合成相关OfMYB1R基因及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN114369603B
Application number: CN202210034178.2A
Authority: CN
Inventors: 杨秀莲; 杨展栋; 严欣; 丁卉芬; 宰舟颖; 岳远征; 施婷婷; 王良桂
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Jinggu Environmental Construction Co ltd
Priority date: 2022-01-12
Filing date: 2022-01-12
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-01-12
Also published as: CN114369603A

Abstract

本发明公开了一种抑制桂花香气物质合成相关OfMYB1R基因及其编码蛋白和应用，属于植物分子生物学领域。该OfMYB1R基因，是一种MYB‑related转录因子基因，命名为OfMYB1R201，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过克隆得到基因序列的全长，在此基础上构建了超表达载体并进行本氏烟草的瞬时转化。结果发现，瞬时转化植株的桂花主要香气物质β‑紫罗兰酮物质含量相较于对照组CK，有显著下降，表明OfMYB1R201在抑制桂花花香物质方面发挥了重要作用。作为抑制桂花香气物质合成过程中重要转录因子OfMYB1R201基因，可用于桂花基因工程中提高观赏性状及遗传品质等繁育工作。

Description

抑制桂花香气物质合成相关OfMYB1R基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种抑制桂花香气物质合成相关OfMYB1R基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

桂花(Osmanthus fragrans)，木犀科木犀属常绿阔叶观赏树种，素以香花著称。桂花的寿命长，适应性广，广泛分布于多个城市。MYB-related转录因子家族是植物特有的一类转录因子家族，参与了次生代谢产物合成、细胞形态发生调控、细胞扩张、周期蛋白转录调控、下胚轴伸长和叶片衰老等过程，对植物的发育过程有十分重要的生物学意义。相关研究表明，MYB-related转录因子可以调控花青素和类黄酮等次生代谢产物的合成。前人对R2R3型MYB转录因子在调控桂花花香物质合成的过程进行了大量的研究工作，并取得了一定的成果。但同样为MYB家族的重大成员，MYB-related亚家族调控桂花花香物质合成的研究还未见报道。因此，研究发掘桂花基因组中调控花香物质合成的重要相关基因具有重要意义，此举将为后期桂花优良品质繁育及提升桂花观赏性状具有重要的促进作用。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的第一技术问题在于提供一种抑制桂花香气物质合成相关OfMYB1R基因；本发明所要解决的第二技术问题在于提供该抑制桂花香气物质合成相关OfMYB1R基因的表达蛋白；本发明所要解决的第三技术问题在于提供OfMYB1R基因在抑制桂花香气物质合成中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种抑制桂花香气物质合成相关OfMYB1R基因，是一种MYB-related转录因子基因，命名为OfMYB1R201，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的抑制桂花香气物质合成相关OfMYB1R基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

含有所述的抑制桂花香气物质合成相关OfMYB1R基因的重组表达载体或重组菌株。

进一步的，含有抑制桂花香气物质合成相关OfMYB1R基因的重组表达载体为Super1300-OfMYB1R201。

所述的OfMYB1R基因在抑制桂花香气物质合成中的应用，具体包括以下步骤：

1)构建含有如SEQ ID NO.1所示的OfMYB1R基因的重组表达载体；

2)将步骤1)得到的重组表达载体转化农杆菌，得到重组农杆菌；

3)用重组农杆菌侵染植物，并进行香气物质GC-MS测定。

进一步的，所述农杆菌为农杆菌GV3101。

进一步的，所述植物为本氏烟草。

进一步的，用重组农杆菌侵染植物，瞬时转化植株正常生长48h，采集瞬时转化植株叶片进行GC-MS香气物质测定，检测瞬时转化植株与空白对照组CK的香气物质变化。

所述的抑制桂花香气物质合成相关OfMYB1R基因在桂花育种中的应用。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供的一种抑制桂花香气物质合成相关OfMYB1R201基因，是一种MYB-related转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过克隆得到基因序列的全长，在此基础上构建了超表达载体并进行本氏烟草的瞬时转化。结果发现，瞬时转化植株的桂花主要香气物质β-紫罗兰酮物质含量相较于对照组CK，有显著下降，且其他物质含量也明显低于对照组CK的含量，表明OfMYB1R201在抑制桂花花香物质方面发挥了重要作用。作为抑制桂花香气物质合成过程中重要转录因子OfMYB1R201基因，可用于桂花基因工程中提高观赏性状及遗传品质等繁育工作。

附图说明

图1为目的基因OfMYB1R201扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图2为目的基因OfMYB1R201扩增片段与Super1300载体连接转化后阳性单菌落检测图；

图3为双酶切后的载体琼脂糖凝胶电泳图；

图4为转化农杆菌GV3101后的菌检琼脂糖凝胶电泳图；

图5为瞬时转化植株香气物质成分分析图；图中，横坐标的物质为VIP＞1且p＜0.05差异性显著的物质；

图6为瞬时转化植株半定量电泳图；图中，泳道L1-L4为对照组瞬时转化植株，泳道L5-L10为目的基因瞬时转化植株的条带。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本申请所用材料为日香桂盛花期花朵，所用的本氏烟草实生苗由南京林业大学王良桂课题组提供。2021年6月，将瞬时超表达载体注射入生长健康35天的本氏烟草叶片中，注射后放置于生长室(日照：15/9h，144μmol·m^-2·s^-1)，正常生长2天后，用无菌剪刀剪下注射过超表载体的叶片装入灭菌的离心管中，立即放入液氮中速冻，然后置于-80℃冰箱内保存。

本实施例采用TIANGEN植物RNA提取试剂盒(DP432)提取植物总RNA。采用TaKaRaPrimeScript^TM RT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒将所提取到的RNA反转录成cDNA，最后得到的cDNA加水稀释10倍后于-20℃冰箱保存。

实施例1

一、构建桂花OfMYB1R201基因的超表达载体

(1)获取目的基因

根据南京林业大学王良桂课题组已发表的桂花全基因组数据库(http：//117.78.20.255/)，筛选得到1个基因序列，与模式植物拟南芥的序列进行比对，判断该基因属于MYB-related基因家族，根据该基因家族成员在染色体上的位置命名为OfMYB1R201。

(2)设计引物

利用BioXM软件对该基因的核苷酸全长序列进行酶切位点分析，选择KpnI和SmaI作为限制性内切酶酶切位点。利用CE design软件设计引物。按要求进行相关信息的填写，具体包括1300载体(Super1300载体)上的酶切位点附近的序列、目的基因全长、按照5′端和3′端的顺序填写酶切位点，即可得到扩增载体MYB1R201-1300的引物(MYB1R201-1300F、MYB1R201-1300R)。同时，从NCBI数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)提取1300载体正向引物(1300F)和本氏烟草的内参基因L25序列并设计L25正反向引物(L25F、L25R)，将设计好的序列由捷瑞生物公司合成，具体如下：

MYB1R201-1300F：5′-aagcttctgcaggggcccgggATGGAATCCAAAGTTTATAGGAATCC-3′；

MYB1R201-1300R：5′-gcccttgctcaccatggtaccGACAAGGCAACTCTCATGTTGTGA-3′；

1300F：5′-AACGCTTTACAGCAAGAACGGAAT G-3′；

L25F：5′-GCTAAGGTTGCCAAGGCTGTC-3′；

L25R：5′-TAAGGTATTGACTTTCTTTGTCTGA-3′；

OfMYB1R201F：5′-ATCGCCTGGAGTGAATGCTAC-3′；

OfMYB1R201R：5′-CACCAAGTAATGCGTTCACAGC-3′。

(3)目的基因扩增

以稀释10倍的桂花cDNA为模板，进行PCR扩增，体系(20μL)如下：

正向引物MYB1R201-1300F 1μL，反向引物MYB1R201-1300R 1μL，cDNA 1μL，PrimeSTAR 10μL(高保真PCR酶购买于宝日医生物技术(北京)有限公司高速高保真PCR酶R045A)，ddH₂O 7μL。反应条件为：98℃变性10s；58℃退火15s；72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min；16℃终止反应。将获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后利用试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司AG21005)进行切胶回收。

(4)双酶切Super1300载体

提前将双酶切Super1300载体从-80℃超低温冰箱中取出进行活化和摇菌，按照质粒提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取Super1300载体质粒，随后进行双酶切实验，体系(20μL)为：限制性内切酶KpnI 1μL，限制性内切酶SmaI 1μL，Buffer 2μL(Buffer为Takara限制性内切酶附带)，载体质粒XμL，ddH₂O补足至20μL。

其中X(μL)＝1000ng/载体质粒浓度(ng/μL)。将离心管微微震荡，使其混匀，瞬时离心6s，置于37℃的水浴锅内培养1h。将双酶切后的载体进行琼脂糖凝胶电泳，然后利用试剂盒进行切胶回收(湖南艾科瑞生物工程有限公司)，下同。

(5)扩增片段与Super1300载体的连接转化

连接体系(20μL)如下：目的基因回收产物XμL，Super1300载体双酶切回收产物YμL，连接酶2μL，Buffer 1μL，ddH₂O Add to 20μL(连接酶和Buffer源于南京诺唯赞生物科技有限公司同源重组试剂c112)。

其中X(μL)＝200ng/目的基因回收产物浓度(ng/μL)，Y(μL)＝200ng/质粒双酶切回收产物浓度(ng/μL)。将离心管微微震荡，使其混匀，瞬时离心6s，置于37℃的水浴锅内培养30min，冰上2min。

转化：超净工作台内，用移液枪取5μL的连接产物于50μL的Trelief^TM5α感受态细胞，轻弹混匀，冰浴5min，42℃水浴60s，再冰浴2min，加250μL液体LB(不含Kana)，37℃，200rpm的摇床内孵育30min。

涂板：取200μL孵育后的菌液，用灭菌的玻璃棒均匀涂布在LB固体培养基上(内含50mg/L的Kana)并晾干，用封口膜后倒置在37℃恒温培养箱内培养12-14h。

(6)阳性单菌落检测和测序

当培养基上长出菌后，于超净工作台内进行单菌落检测。每个基因挑取8个饱满的单菌落，依序依次在含Kana抗性的LB固体培养基上进行备份，并用无菌牙签将相应的单菌落沾取至以下20μL体系中进行菌检：1300F 1μL，OfMYB1R201-1300R 1μL，Green Mix 10μL(Green Mix购于南京诺唯赞生物科技有限公司)，ddH₂O 8μL。

PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min；16℃终止反应。将获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，挑取3个长度正确的阳性单菌落送测，测得OfMYB1R201基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，选取碱基错配率最低的阳性单菌落提取质粒进行后续实验。

二、转化农杆菌GV3101

(1)将保存在-80℃超低温冰箱内的GV3101感受态取出放在冰上融化。每33μL感受态加入1μL质粒，吸打混匀后依次冰浴20min、液氨速冻5min、37℃水浴5min、冰浴5min。

(2)加500μL无抗性的LB液体培养基，28℃，200rpm摇床上培养1h。

(3)培养完成后，将菌液6000rpm，离心1min，弃去部分上清液，留100μL均匀涂布于LB固体培养基上(内含50mg/L Kana)，封口膜密封，倒置于28℃培养箱中培养40-48h。

(4)菌检和备份：菌检中的目的条带正确且亮度一致，则将备份的板子中相对应的菌落挑入LB液体培养基(内含50mg/L Kana)中摇菌，再将菌液和50％甘油按3∶7的体积比保菌，液氮中速冻后保存在-80℃超低温冰箱内。

三、侵染本氏烟草并进行香气物质GC-MS测定

(1)摇菌：将Super1300空载、P19辅助表达载体和已转入农杆菌的GFP：：Super1300-OfMYB1R201目标基因融合表达载体的菌液于-80℃取出常温融化至冰水混合状态后插入冰中融化，按照300μL菌液加入30mL LB液体培养基中(含Kana 10μg·mL^-1)，28℃、200rpm避光振荡培养，直至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8之间。

(2)准备混合菌液：称取0.0196g的乙酰丁香酮(AS)粉末，使用二甲基亚砜助溶(在通风橱操作)，再加入适量无菌水定容到100ml，获得母液，取母液15ml加入85ml的无菌水，从而获得150μmol·L^-1的AS；称取0.2035g的MgCl₂和0.2135g的2-(N-吗啉)乙磺酸一水物(MES)加入到配好的150μmol·L^-1的AS溶液中；将菌液时进行离心(4℃、5000rpm、10min)，弃上清，收集菌体，使用当天配制的缓冲液进行重悬，最后按照最佳比例混合(P19辅助载体：目的基因(V∶V)＝5∶7)，充分震荡混匀后活化3h。

(3)侵染：生长健壮的35-40d左右的本氏烟草提前2天控水，使用1mL一次性注射器将混合菌液注入本氏烟草叶片背面。

(4)培养：将注射过目的基因混合菌液的瞬时转化植株和注射过空载体菌液的瞬时转化植株浇透水，放于生长室中培养2天(日照：15/9h，144μmol·m^-2·s^-1)。

(5)瞬时转化植株的香气物质测定：室温下(25±2℃)用无菌剪刀剪下0.4g本氏烟草叶片，记录叶片重量后放置于密封的1ml萃取瓶中，加入内标溶液(1/10000葵酸乙酯∶1微的葵酸乙酯标样加入到10ml的甲醇)后摇晃混匀后平衡15min；在温度45℃的水浴锅中，密封后用65μm DB/5MS的萃取头插入萃取瓶中部，萃取30min后将萃取头插入色谱柱TRACETR-5MS C30m×0.25mm×0.25gym)，载气为高纯度氦气(He)，氦气流速为1mL/min，不分流进样，进样口温度250℃，解吸附时间为3min；温度程序为：首先温度60℃，保持2min，第一个升温程序为60℃上升到150℃，速度为5℃/min，第二个升温程序为150℃升至250℃速度为10℃/min，再保持1min；质谱条件为离子源温度250℃，电离方式EI，电子能量70eV。

(6)瞬时转化植株的香气物质分析：将数据中的硅氧化物杂质去除后，计算出各种物质的相对含量，将物质的相对含量导入SIMCA5.0中计算VIP＞1的物质并对其中差异性p＜0.05的物质进行统计分析，表明OfMYB1R201对差异性p＜0.05的香气物质具有重要的抑制作用。

(7)瞬时转化植株的半定量验证：采用TIANGEN植物RNA提取试剂盒(DP432)提取植物总RNA。采用TaKaRa PrimeScript^TM RT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒将所提取到的RNA反转录成cDNA，最后得到的cDNA加水稀释10倍后于取1μL作为模板，1300F1μL，MYB1R201-1300R 1μL，Green Mix 10μL，ddH₂O 7μL，配成20μL的体系进行半定量实验，半定量实验中PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸45s，35个循环；72℃总延伸10min；16℃终止反应；将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 抑制桂花香气物质合成相关OfMYB1R基因及其编码蛋白和应用

<130> 1

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1050

<212> DNA

<213> OfMYB1R201基因(Artificial)

<400> 1

atggagttat tttcagcaca accagaccta tctctacaaa tcagcctccc aaatagcaaa 60

ccctcatcag gttggagaat aagagaagat gaaatggatt tggggttctg gaaaagagct 120

ctagattcta gaaactcagt ctcttcaatg gctaagcctg aaaacagttt cgggctttct 180

ttatcggatc aaagggtttc agaacctgac tgtacccaac ttcaccttct tcagaacaat 240

acaaacaatt tcatccacca gtttccacag caaaacctcc gtcttcagcc tttccaccat 300

caagggctga gcccggagct cagtttcttg aggcccataa gaggaattcc agtttaccaa 360

aaccctccag ccttcccatt tcctcatcag caaaatttcg atgcatctgt accatcttcc 420

actcctaata gcactgctgc aagcagcaat tttcagcctc aaagcctaat gaggtcaagg 480

tttctttcga ggttcccggc taaaaggaac atgagggctc cccggatgcg gtggactact 540

acccttcatt cccgttttgt tcatgctgtt gagctcttgg gtggccatga aagagctaca 600

cccaagtcag ttctagagct aatggacgtt aaagatctca cgttggcaca tgttaaatcc 660

catttacaga tgtatagaac agtgaagtca actgacagag tatcagctaa ctcgggacaa 720

tcagacatgt tcgaaaacgg gtcatccggg gataattcgg atgatttact gttggagttt 780

cagaactcaa ggaagtcaga attttcactt cagcaaaata ggaatcaaga taaggactgt 840

cataacctgt ggagcaactc ctcaagagaa gcttggttgc atggcaaaac aatggaatgt 900

ggagggaaca aaatgccatc ctctcttgag aaggatatgg aaccaaggtg cttaagctat 960

gacagagtat cagaaatgag ctcatcaagc ctatcagaga cgagcaccaa agagcccaat 1020

ttggaattca ctttggggag ggcacagtga 1050

<210> 2

<211> 349

<212> PRT

<213> OfMYB1R201基因的表达蛋白(Artificial)

<400> 2

Met Glu Leu Phe Ser Ala Gln Pro Asp Leu Ser Leu Gln Ile Ser Leu

1 5 10 15

Pro Asn Ser Lys Pro Ser Ser Gly Trp Arg Ile Arg Glu Asp Glu Met

20 25 30

Asp Leu Gly Phe Trp Lys Arg Ala Leu Asp Ser Arg Asn Ser Val Ser

35 40 45

Ser Met Ala Lys Pro Glu Asn Ser Phe Gly Leu Ser Leu Ser Asp Gln

50 55 60

Arg Val Ser Glu Pro Asp Cys Thr Gln Leu His Leu Leu Gln Asn Asn

65 70 75 80

Thr Asn Asn Phe Ile His Gln Phe Pro Gln Gln Asn Leu Arg Leu Gln

85 90 95

Pro Phe His His Gln Gly Leu Ser Pro Glu Leu Ser Phe Leu Arg Pro

100 105 110

Ile Arg Gly Ile Pro Val Tyr Gln Asn Pro Pro Ala Phe Pro Phe Pro

115 120 125

His Gln Gln Asn Phe Asp Ala Ser Val Pro Ser Ser Thr Pro Asn Ser

130 135 140

Thr Ala Ala Ser Ser Asn Phe Gln Pro Gln Ser Leu Met Arg Ser Arg

145 150 155 160

Phe Leu Ser Arg Phe Pro Ala Lys Arg Asn Met Arg Ala Pro Arg Met

165 170 175

Arg Trp Thr Thr Thr Leu His Ser Arg Phe Val His Ala Val Glu Leu

180 185 190

Leu Gly Gly His Glu Arg Ala Thr Pro Lys Ser Val Leu Glu Leu Met

195 200 205

Asp Val Lys Asp Leu Thr Leu Ala His Val Lys Ser His Leu Gln Met

210 215 220

Tyr Arg Thr Val Lys Ser Thr Asp Arg Val Ser Ala Asn Ser Gly Gln

225 230 235 240

Ser Asp Met Phe Glu Asn Gly Ser Ser Gly Asp Asn Ser Asp Asp Leu

245 250 255

Leu Leu Glu Phe Gln Asn Ser Arg Lys Ser Glu Phe Ser Leu Gln Gln

260 265 270

Asn Arg Asn Gln Asp Lys Asp Cys His Asn Leu Trp Ser Asn Ser Ser

275 280 285

Arg Glu Ala Trp Leu His Gly Lys Thr Met Glu Cys Gly Gly Asn Lys

290 295 300

Met Pro Ser Ser Leu Glu Lys Asp Met Glu Pro Arg Cys Leu Ser Tyr

305 310 315 320

Asp Arg Val Ser Glu Met Ser Ser Ser Ser Leu Ser Glu Thr Ser Thr

325 330 335

Lys Glu Pro Asn Leu Glu Phe Thr Leu Gly Arg Ala Gln

340 345

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> MYB1R201-1300F(Artificial)

<400> 3

aagcttctgc aggggcccgg gatggaatcc aaagtttata ggaatcc 47

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> MYB1R201-1300R(Artificial)

<400> 4

gcccttgctc accatggtac cgacaaggca actctcatgt tgtga 45

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> L25F(Artificial)

<400> 5

gctaaggttg ccaaggctgt c 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> L25R(Artificial)

<400> 6

taaggtattg actttctttg tctga 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> OfMYB1R201F(Artificial)

<400> 7

atcgcctgga gtgaatgcta c 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> OfMYB1R201R(Artificial)

<400> 8

caccaagtaa tgcgttcaca gc 22

Claims

1.OfMYB1R基因在抑制桂花香气物质合成中的应用，所述的OfMYB1R基因序列如SEQ IDNO .1所示；所述的桂花香气物质为壬醛和β-紫罗兰酮。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建含有的OfMYB1R基因的重组表达载体；

3)用重组农杆菌侵染桂花或本氏烟草，并进行香气物质GC-MS测定。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述农杆菌为农杆菌GV3101。

4.OfMYB1R基因在桂花育种中的应用，所述的OfMYB1R基因序列如SEQ ID NO .1所示；所述OfMYB1R基因抑制桂花香气物质，所述桂花香气物质为壬醛和β-紫罗兰酮。