CN113583986B

CN113583986B - GhCYP94C1基因在调控植物开花期中的应用

Info

Publication number: CN113583986B
Application number: CN202110889040.6A
Authority: CN
Inventors: 王寒涛; 田苗苗; 魏恒玲; 马亮; 喻树迅; 芦建华; 付小康; 康萌
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-08-03
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2041-08-03
Also published as: CN113583986A

Abstract

本发明提供了一种GhCYP94C1基因在调控植物开花期中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，GhCYP94C1基因在提高促进植物开花中得以应用；本发明从荧光定量结果表明该GhCYP94C1基因与开花时间相关，从陆地棉中克隆出棉花CYP94C1基因，该基因构建过表达载体，浸花法转化拟南芥，转基因拟南芥提前萌发和开花。因此，转基因拟南芥中开花相关基因的表达量极显著高于非转基因拟南芥，表明，GhCYP94C1正调控拟南芥的开花。

Description

GhCYP94C1基因在调控植物开花期中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种GhCYP94C1基因在调控植物开花期中的应用。

背景技术

棉花是我国重要的经济作物和纺织原料，对中国农业经济的发展具有重要意义。我国粮棉争地的矛盾突出，短季棉品种的选育和推广，可以缓解粮棉争地的矛盾，早熟性状是培育短季棉需要攻克的重要关键之一，早花是棉花早熟性状重要指标(喻树迅等，2003)。

大量的研究表明，细胞色素P450在调节植物的生长发育、抗毒抗虫以及非生物胁迫等方面起着重要的作用。

细胞色素P450(Cytochromes P450)是一类与线粒体、内质网等细胞器膜联结的含有亚铁血红素的蛋白质，是一个古老的基因超家族(Oprea et al.,1997)，在几乎所有生物的基因组中都发现了P450基因(也称为CYP)，随着研究的发现其数量在植物中呈爆炸式的增长，植物中P450基因约占植物基因组总基因的1％(Mizutani and Ohta.,2010)。在拟南芥中，发现AtCYP94C1基因GUS染色结果显示在花簇和幼苗染色最深，cyp94c1突变体与野生型拟南芥开花时间存在显著差异说明该基因在与幼苗发育和花发育中起着重要作用(Bruckhoff et al.,2016)。水稻中CYP87A3在生长素通路中起着重要作用，CYP87A3是主要的植物生长素应答基因，可以调节水稻生长发育(Chaban et al.,2003)。水稻中细胞色素P450基因OsDWARF48调控水稻株高，OsDWARF48基因通过调控BR合成及信号转导途径能够与GA和IAA协同作用促进水稻生长，使得株高变高(李臻等.,2018)。人类细胞色素P450基因CYP1A1、CYP2B6和CYP2C19转进入水稻，转基因水稻植物对除草剂表现出很高的耐受性(Kawahigashi et al.,2006)。拟南芥中CYP94B3基因促进拟南芥根部伸长(Koo et al.,2011)。P450家族基因在棉花研究主要集中在棉花抗病虫害上。相关研究表明，海岛棉P450家族中GbCYP86A1-1基因在黄萎病(Verticilliumdahliae)诱导下表达，显著提高棉花抗性(Wang et al.,2020)。沉默GbCYP86A1-1导致对大丽芽孢杆菌的抗性严重受损，而在拟南芥中过表达GbCYP86A1-1则提高了抗性(Wang et al.,2020)。陆地棉中CYP749A16基因是抗TFS除草剂的关键基因，沉默CYP749A16(Gh_D10G1401)能使耐受性棉花品种Stoneville474产生敏感性(Thyssen et al.,2018)。在亚洲棉悬浮培养的酵母细胞中，黄萎病菌显著诱导CYP706B1的表达，并且CYP706B1参与棉花催化棉酚生物合成的早期步骤，与棉花腺体发育及棉籽中调控棉酚含量有关(Luo et al.，2010)。以上研究表明P450家族的一些基因参与了植物生长发育调控的过程。

通过酵母实验找到与GhWRKY27互作的基因GhCYP94C1，发现GhCYP94C1基因在早晚熟品种中表达量有明显差异(Gu et al.,2019)。因此猜测该基因很有可能与棉花早熟早花相关，并对该基因进行克隆及其功能验证。关于棉花中CYP94C1基因在调控开花方面的功能鲜有报道。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一种GhCYP94C1基因在调控植物开花期中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种包含上述基因的重组质粒。

本发明的第三个目的是提供一种包含上述基因的重组载体。

为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：

GhCYP94C1基因在调控植物开花期中的应用。

进一步地，GhCYP94C1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，GhCYP94C1基因编码多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，GhCYP94C1基因在提高促进植物开花中的应用。

进一步地，植物包括棉花和拟南芥。

为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：

一种重组质粒，其含有GhCYP94C1基因片段，该GhCYP94C1基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.3所示的序列。

为达到上述第三个目的，本发明的解决方案是：

一种重组载体，其包括GhCYP94C1基因和载体。

进一步地，GhCYP94C1基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.3所示的序列。

进一步地，载体为PBI121。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明从荧光定量结果表明该GhCYP94C1基因与开花时间相关，从陆地棉中克隆出棉花CYP94C1基因，该基因构建过表达载体，浸花法转化拟南芥，转基因拟南芥提前萌发和开花。因此，转基因拟南芥中开花相关基因的表达量极显著高于非转基因拟南芥，表明，GhCYP94C1正调控拟南芥的开花。

附图说明

图1为本发明的GhCYP94C1基因在WT、Line 1、Line 2和Line 3植株中转录情况示意图(WT为非转基因拟南芥，Line 1、Line 2和Line 3为三个转基因拟南芥株系(方框内为长出两片子叶的拟南芥)。

图2为本发明的GhCYP94C1基因在WT、Line 1、Line 2和Line 3植株的根系情况示意图(WT为非转基因拟南芥，Line 1、Line 2和Line 3为三个转基因拟南芥株系)。

图3为本发明的GhCYP94C1基因在WT、Line 1、Line 2和Line 3植株的种子情况示意图(WT为非转基因拟南芥，Line 1、Line 2和Line 3为三个转基因拟南芥株系)。

图4为本发明的GhCYP94C1基因在WT、Line 1、Line 2和Line 3植株的开花情况示意图(WT为非转基因拟南芥，Line 1、Line 2和Line 3为三个转基因拟南芥株系)。

具体实施方式

本发明提供了一种GhCYP94C1基因在调控植物开花期中的应用。

实验材料

1.棉花材料

本实验选取的棉花材料为陆地棉TM-1。对于田间实验(不同组织)，该品种种植在中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室试验田(安阳白璧)，管理措施为正常大田管理。

对于激素胁迫处理实验，该品种种植在温室中，当棉花长到第三叶展平的时候，进行脱落酸浓度为200μmol/L，赤霉素浓度为50μmol/L，茉莉酸甲酯浓度为100μmol/L的激素处理，清水作为对照处理。分别在激素处理后的0h、0.5h、1h、3h、6h、9h、12h和24h取叶片，立即放入液氮后，储存在-80℃，用于后期样品RNA的提取，每个样品设置三个生物学重复。

2.试剂和耗材

限制性内切酶、修饰酶、PCR反应体系相关酶、胶回收试剂盒、克隆试剂盒、质粒小题试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，DNA提取试剂盒购自OMEGA公司。

其他药品：琼脂糖为西班牙原装产品，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，氨苄青霉素等购自宝生物工程(大连)有限公司，大肠杆菌感受态细胞DH5α购自北京天根生化科技公司。

培养基：LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L。

LB固体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉15g/L，定容至1L。

LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板；1/2MS固体培养基：1/2MS 22g/L，琼脂粉(agar powder)8g/L，蔗糖(sucrose)30g/L。

主要仪器：PCR扩增仪(BIO-RAD)，高速离心机(Hettich MIKRO 200R)，电泳设备(BIO-RAD)，凝胶成像系统(BIO-RAD)，荧光定量PCR仪(ABI7500)，电热恒温培养箱(上海森信)，恒温培养振荡器(上海智城)，人工气候试验箱(赛福)，人工气候室。

实施例1：

棉花GhCYP94C1基因和启动子的克隆与生物信息学分析

从Cotton FGD上获得GhCYP94C1(Gh_D08G0085.1)的基因序列，采用Oligo 7软件设计引物，采用PCR(Polymerase Chain Reaction)的方法从陆地棉TM-1中扩增，其CDS长度为1554bp，共编码517个氨基酸，相对分子质量(MW)为58841.07kDa，理论等电点(pI)为8.71，亲水性的平均值(GRAVY)为-0.024。

上游引物：GhCYP94C1-F：5′-ATGAATCATTCAATTTCAAACCT-3′(SEQ ID NO.1)；

下游引物：GhCYP94C1-R：5′-TTAAGCTTCCCTTCGTTGGACTA-3′(SEQ ID NO.2)。

开放阅读框序列(SEQ ID NO.3)为：

ATGAATCATTCAATTTCAAACCTTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTTATGGTTCAACTACACATGCACTATTTTCTCCTTCATCTTCTTCACTTTCACGTTCTCATTTTCCCTCTTTTCATTATCAATCTTCATTTTAAGATTAAAACTATGGTGTAAATGTTCAACTTGCCAATCATTCCTCACTTCAAGTTGGTCCAAAGATTTCAATAACCTGTGTGATTGGTATACTCACCTTCTTTCAAAATCGCCGACGGGAACAATCCATATTCATATCCTCGGCAATATCATCACCGCCGATCCTAAAAACGTCGAACACATATTAAAAACAAAGTTCGAAAATTACCCAAAAGGAAAACCATTCTCGATTCTCCTCGGTGATTTACTCGGCAAAGGTATATTTAACGTCGATGGTGATTCATGGAAATTTCAAAGAAAAATGGCTAGTCTTGAACTTGGTAGTGTTTCCATTAGAATGCATGCTTTTAATATCGTTAAATCGGAGATTCAAACTAGACTTATCCCTCTTTTAAACTCAGTTTCCGGTCAGGTTTTAGATATACAGGATGTGTTTAGAAGATTTTCTTTTGATAATATTTGTAAATTTTCATTCGGGTTTGATCCTTGCTGCCTTGAATTATCGTTGCCGATGCCGGCGTCGGAGTTTGCGGAGGCTTTTGATTTGGCGTCGAAGTTATCGGCACAAAGAGGGTTGTCGTCGTCGTCTTTGATATGGAAAGTTAAAAGGGTATTGAATTTAGGGTCTGAAAAAGAGCTTAAAAGCGCCATTAAAATGGTGGATCAATTTGCTCAACGTATGATTAATCAACGACGGGAACTTGGTTTTTCCGACAAGAGTGATCTTTTGTCGAGATTTATGGCGACAATGATCGACGACGACCAGTATCTTCGTGACATTGTCGTTAGTTTCCTTTTGGCTGGTCGTGATACGGTTGCTTCCGGTCTAACTAGTTTCTTCTGGTTATTATCTCAAAACCCGAAAGTCGAGTTCGCCATTAGAGACGAACTCGAAAAGGTCACTGCCGGGATTTCGCCGAGCGACGATCAAGATTTCGTAATGTTCGATCAAATGCGTGAAATGCATTATTTGCACGCGGCATTATGCGAGAGCTTACGGTTGTTTCCGCCGGTTCAATTGGACTCGAAGTTCGCTCAACACGACGACGTTTTGCCTGATTTTACTTTTGTAAGGAAAGGTACTAGGGTCACTTACCATCCCTACGCGATGGGTCGGATGGAACGGGTTTGGGGCTCCGATTGTCTTGAATTCAAACCGGAAAGATGGTTGAAAAACGCTAGATATGTACCCGAAAACCCATACAAGTACCCGGTTTTCCAAGCCGGGTTAAGGGTTTGTTTAGGGAAGGAAATGGCATTAGTGGAGATGAAATGTGTGGTTCTAGCCATAATCAAACGGTTCAACATTCAGGTTGCTGATCCGAATCAAGCACCAACGTTCGCCCCGGGTCTCACTGCCACCGTGAGAGGCGGCTTACCAGTTCTAGTCCAACGAAGGGAAGCTTAA。

编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)为：

MNHSISNLSSSSSSSSSSLWFNYTCTIFSFIFFTFTFSFSLFSLSIFILRLKLWCKCSTCQSFLTSSWSKDFNNLCDWYTHLLSKSPTGTIHIHILGNIITADPKNVEHILKTKFENYPKGKPFSILLGDLLGKGIFNVDGDSWKFQRKMASLELGSVSIRMHAFNIVKSEIQTRLIPLLNSVSGQVLDIQDVFRRFSFDNICKFSFGFDPCCLELSLPMPASEFAEAFDLASKLSAQRGLSSSSLIWKVKRVLNLGSEKELKSAIKMVDQFAQRMINQRRELGFSDKSDLLSRFMATMIDDDQYLRDIVVSFLLAGRDTVASGLTSFFWLLSQNPKVEFAIRDELEKVTAGISPSDDQDFVMFDQMREMHYLHAALCESLRLFPPVQLDSKFAQHDDVLPDFTFVRKGTRVTYHPYAMGRMERVWGSDCLEFKPERWLKNARYVPENPYKYPVFQAGLRVCLGKEMALVEMKCVVLAIIKRFNIQVADPNQAPTFAPGLTATVRGGLPVLVQRREA。

具体克隆基因的过程为：

1.取样方法

在棉花的盛花期，取成熟的棉花叶片，速冻于液氮，存于-80℃冰箱备用。

2.RNA的提取

以下所有离心步骤均在室温下进行。

1)匀浆处理：100mg植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入700μL的裂解液SL(使用前加入β-巯基乙醇)，立即剧烈震荡使样品混匀。注意1：对于预期RNA得率小于10μg的植物样本，请使用100mg的起始样本量；对于富含淀粉的样本或成熟叶片，请将裂解液SL用量增加至700μL。注意2：由于植物多样性非常丰富，而且同种植物的不同生长发育阶段和不同组织的RNA含量都不相同，请根据具体实验情况选择合适的植物材料的用量；

2)12,000rpm离心2min；

3)将上清液转移至过滤柱CS上，12,000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头避免接触收集管中的细胞碎片；

4)加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将混合物转入吸附柱CR3中，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

5)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

6)DNaseI工作液：取10μL的DNaseI储存液和70μL的RDD溶液轻柔混匀；

7)向CR3中加入80μL的DNaseI工作液，室温静止15min；

8)静置完后，向CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

9)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(使用前加入乙醇)，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

10)重复步骤9)；

11)12,000rpm(-13,400×g)离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μL的RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm(-13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。RNA样品请在-70℃中保存。如果预期RNA得率大于30μg，可将步骤11)中离心得到的RNA溶液再加入吸附柱CR3中，室温放置2min，12,000rpm(-13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。

为预防RNase污染，注意事项：

1)经常更换新手套，因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染；

2)使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染；

3)RNA在裂解液SL中时不会被RNase降解，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿；

4)配制溶液应使用RNase-Free ddH₂O。

3.反转录

RNA的反转录方法参照采用TaKaRa的反转录试剂盒DRR037A的说明书进行，RT的反应液的配置在冰上进行，具体操作如下

反转录反应条件如下:

37℃15min(反转录反应)，

85℃5s(反转录酶的失活反应)，

500RNA反转录为cDNA，将反转录产物cDNA溶液稀释8倍作为PCR反应模板。

4.基因克隆的PCR反应体系、程序和产物检测

1)PCR反应体系

根据PrimeSTAR GXL DNA聚合酶说明书，PCR反应体系如下：

2)PCR反应程序

3)PCR产物的检测

取1μL的PCR产物，加入11μL的6×Loading Buffer，混匀，点样于1％琼脂糖凝胶，电泳检测。

5.PCR产物的胶回收

1)在紫外灯下从电泳胶上切下所需回收的条带，注意刀片需消毒，胶块应尽量小，使之易融化完全；

2)事先将一个离心管称重，然后将胶块放入后再次称重，获得胶块的重量；

3)以每100mg胶块加入300μL的量加入Binding Buffer，查看胶块是否浸在液体中；

4)56℃水浴10min以融化胶块释放DNA，期间每2-3min需取出震荡；

5)待胶块完全融化后按照每100mg胶块150μL的量加入异丙醇，充分震荡混匀；

6)将High Pure Filter Tube安装到Collection Tube上；

7)将所有eppendorf管中的液体转移到High Pure Filter Tube中去，注意不要超过700μL，若超过需分两次离心；

8)12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；

9)加入500μL的Wash Buffer后再次离心1min；

10)倒掉收集管中的液体后再次加200μL的Wash Buffer，12,000rpm离心1min；

11)小心将Filter Tube取下后装入一个新的Effendorf管上；

12)在滤芯的正中加上30μL的Elution Buffer，室温放置1min，12,000rpm离心1min。

实施例2：

重组载体连接

1.参照Vazyme公司的

II One Step Cloning Kit(C112)试剂盒：

PCR，37℃反应25min，4℃冰箱保存，后续进行转入感受态大肠杆菌实验。

2.连接产物转化大肠杆菌

1)向连接反应体系中加入100μL大肠杆菌DH5a感受态，冰浴30min；

2)42℃水浴热激45s；

3)冰浴2min；加入900μL的LB液体培养基，37℃，150rpm，孵育1h；

4)离心收菌，4000rpm，3min，弃上层上清，留约100μL混匀后涂布含氨苄抗性的LB平板；

5)37℃，恒温培养过夜。

3.阳性克隆的检测及测序

1)从转化平板上挑取白色菌落，放入含有Amp的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养8h；

2)菌落PCR验证阳性克隆，将验证正确的单克隆送到金维智生物科技有限公司测序，每个序列测3个重复。

4.阳性菌液的保存

菌液PCR验证且测序正确的菌液中加入一定量的甘油，使甘油终浓度在20％左右，-70℃保存。

实施例3：

PBI121-GhCYP94C1植物表达载体的构建

1.带有特定酶切位点的目的基因片段的获得

为了扩增基因编码区全长，并加上特定酶切位点，根据克隆到的GhCYP94C1的cDNA序列，分别在起始密码子ATG和终止密码子处设计含有适合酶切位点引物。所用酶切位点为XbaI(T/CTAGA)和SmaI(CCC/GGG)。

GhCYP94C1酶切位点引物序列如下：

上游引物F 5’-CACGGGGGACTCTAGAATGAATCATTCAATTTCAAACCT-3’(SEQ ID NO.5)；

下游引物R 5’-GACGGCCAGTGAATTCTTAAGCTTCCCTTCGTTGGACTA-3’(SEQ ID NO.6)。

将扩增获得的带有酶切位点的目的片段连接至pBI121克隆载体，转化DH5α感受态细胞，通过PCR及酶切验证和序列测定筛选出序列没有突变的中介重组子。

2.pBI121-GhCYP94C1植物表达载体的构建过程具体为：将重组子GhCYP94C1的克隆载体和pBI121质粒分别用SmaI和XbaI双酶切，电泳回收目的片段和pBI121载体的大片段产物；目的基因片段和pBI121的酶切大片段产物T₄连接酶连接过夜；连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜；挑取单克隆摇菌，测序验证序列的正确性。

实施例4：

重组载体转化感受态农杆菌

转化农杆菌

利用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，具体转化过程如下：

1)根癌农杆菌LBA4404感受态细胞100μL中加入质粒1μg，混匀后冰浴30min；液氮速冻75s，37℃热激2-6min；

2)冰浴5min，再加入600μL的LB液体培养基；

3)190rpm，28℃，培养4h后取100μL菌液涂在含有卡那霉素、链霉素和利福平的LB筛选培养基上，28℃培养大约36-48h，抗性菌落可见；

4)挑选阳性克隆，在LB液体培养基上28℃培养48h甘油终浓度在15％左右，-20℃保存备用。

实施例5：

农杆菌介导的拟南芥的转化

采用花序浸染法转化拟南芥

1)将-20℃保存的农杆菌菌液20μL接种到1mL的LB液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养过夜，取活化菌液200μL加入到50mL的LB液体培养基28℃、180rpm振荡培养；

2)待菌液OD值约为1.2时，3000转/每分离心菌液收集菌体；

3)转化介质配方为：1/2MS(大量元素减半，其他不变)、5％蔗糖，0.01μg/mL苄氨基嘌呤(BAP)，0.03％silwetL-77，20mg/L乙酰丁香酮，KOH调pH值至5.7(Steven etal.1998)；

4)用上述转化介质悬浮菌体，调OD至0.8开始浸染；

5)将拟南芥花序置于转化介质中30-50s，浸染后用保鲜膜将拟南芥包起来，暗培养一天后置于正常条件下培养；

6)种子成熟后，收货，为T0代种子。

实施例6：

转基因拟南芥植株的表型鉴定

1.将收获的种子消毒后种植在含卡那霉素的1/2MS上，后进行4℃春化3天，转移到人工气候试验箱中，10天左右会阳性植株生长正常，而阴性植株叶片变黄，不再生长。

2.将阳性拟南芥植株移栽至小花盆中种植，待生长一个月后提取DNA用PCR进行检测，检测时所用引物为：

上游引物F：5’-ATGAATCATTCAATTTCAAACCT-3’(SEQ ID NO.7)；

下游引物R：5’-TTAAGCTTCCCTTCGTTGGACTA-3’(SEQ ID NO.8)。

3.每一代的植株都要进行阳性株系的检测，直至繁殖至T3代，获得纯合转基因拟南芥株系。T3代株系做qRT-PCR检测，荧光定量验证的过程如下：

提取RNA，反转录成cDNA，分别设计GhCYP94C1和拟南芥内参基因Atactin2荧光定量的引物：

GhCYP94C1上游引物：5’-AGGGTTGTCGTCGTCGTCTTTG-3’(SEQ ID NO.9)；

下游引物：5’-GGAAGCAACCGTATCACGACCA-3’(SEQ ID NO.10)。

Atactin2上游引物：5’-AGATCCAGGACAAGGAAGGTATTC-3’(SEQ ID NO.11)；

下游引物：5’-CGCAGGACCAAGTGAAGAGTAG-3’(SEQ ID NO.12)。

冰上配制qRT-PCR反应体系，进行荧光定量PCR反应。

PCR反应体系为：

PCR反应程序：

熔解曲线分析：

95℃15s；60℃1min；95℃15s；60℃15s。

结果：

1.荧光定量验证结果证实GhCYP94C1基因在转基因Line 1、Line 2和Line 3植株中转录水平极显著高于非转基因拟南芥，如图1中的c，并且明显早萌发(图1)。春化后第2天(图1中的a)，转基因拟南芥植株萌发率达到80％左右(图1中的d)，而野生型拟南芥萌发率在20％左右(图1中的d)，并且第3天部分转基因拟南芥种子已经长出两片子叶(图1中的b)。

2.将野生型拟南芥WT和转基因株系Line 1、Line 2和Line 3种到1/2MS固体培养基上，重复试验三次，对试验进行观察并统计了根系变化(图2中的a)。结果显示转基因株系的主根长度显著长于野生型(图2中的b)。

3.将转基因T3代植株与非转基因植株同等条件下种植栽培，发现开花差异明显如下表所示。生长到25天时，转基因拟南芥提前抽薹；生长到33天时，非转基因拟南芥才开始抽薹，而转基因拟南芥已经开始结种子如图3中的a和b所示。

4.取上述生长33天的拟南芥的莲座叶，提取RNA，反转录成cDNA，对拟南芥中的早花相关的基因AtFT和AtFUL进行表达量的分析，其荧光定量的引物如下：

从荧光定量的结果可以看出，转基因拟南芥中开花相关基因的表达量极显著高于非转基因拟南芥，表明，GhCYP94C1正调控拟南芥的开花，如图4。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> GhCYP94C1基因在调控植物开花期中的应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 1

atgaatcatt caatttcaaa cct 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 2

ttaagcttcc cttcgttgga cta 23

<210> 3

<211> 1554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 3

atgaatcatt caatttcaaa cctttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttctttatgg 60

ttcaactaca catgcactat tttctccttc atcttcttca ctttcacgtt ctcattttcc 120

ctcttttcat tatcaatctt cattttaaga ttaaaactat ggtgtaaatg ttcaacttgc 180

caatcattcc tcacttcaag ttggtccaaa gatttcaata acctgtgtga ttggtatact 240

caccttcttt caaaatcgcc gacgggaaca atccatattc atatcctcgg caatatcatc 300

accgccgatc ctaaaaacgt cgaacacata ttaaaaacaa agttcgaaaa ttacccaaaa 360

ggaaaaccat tctcgattct cctcggtgat ttactcggca aaggtatatt taacgtcgat 420

ggtgattcat ggaaatttca aagaaaaatg gctagtcttg aacttggtag tgtttccatt 480

agaatgcatg cttttaatat cgttaaatcg gagattcaaa ctagacttat ccctctttta 540

aactcagttt ccggtcaggt tttagatata caggatgtgt ttagaagatt ttcttttgat 600

aatatttgta aattttcatt cgggtttgat ccttgctgcc ttgaattatc gttgccgatg 660

ccggcgtcgg agtttgcgga ggcttttgat ttggcgtcga agttatcggc acaaagaggg 720

ttgtcgtcgt cgtctttgat atggaaagtt aaaagggtat tgaatttagg gtctgaaaaa 780

gagcttaaaa gcgccattaa aatggtggat caatttgctc aacgtatgat taatcaacga 840

cgggaacttg gtttttccga caagagtgat cttttgtcga gatttatggc gacaatgatc 900

gacgacgacc agtatcttcg tgacattgtc gttagtttcc ttttggctgg tcgtgatacg 960

gttgcttccg gtctaactag tttcttctgg ttattatctc aaaacccgaa agtcgagttc 1020

gccattagag acgaactcga aaaggtcact gccgggattt cgccgagcga cgatcaagat 1080

ttcgtaatgt tcgatcaaat gcgtgaaatg cattatttgc acgcggcatt atgcgagagc 1140

ttacggttgt ttccgccggt tcaattggac tcgaagttcg ctcaacacga cgacgttttg 1200

cctgatttta cttttgtaag gaaaggtact agggtcactt accatcccta cgcgatgggt 1260

cggatggaac gggtttgggg ctccgattgt cttgaattca aaccggaaag atggttgaaa 1320

aacgctagat atgtacccga aaacccatac aagtacccgg ttttccaagc cgggttaagg 1380

gtttgtttag ggaaggaaat ggcattagtg gagatgaaat gtgtggttct agccataatc 1440

aaacggttca acattcaggt tgctgatccg aatcaagcac caacgttcgc cccgggtctc 1500

actgccaccg tgagaggcgg cttaccagtt ctagtccaac gaagggaagc ttaa 1554

<210> 4

<211> 517

<212> PRT

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 4

Met Asn His Ser Ile Ser Asn Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

1 5 10 15

Ser Ser Leu Trp Phe Asn Tyr Thr Cys Thr Ile Phe Ser Phe Ile Phe

20 25 30

Phe Thr Phe Thr Phe Ser Phe Ser Leu Phe Ser Leu Ser Ile Phe Ile

35 40 45

Leu Arg Leu Lys Leu Trp Cys Lys Cys Ser Thr Cys Gln Ser Phe Leu

50 55 60

Thr Ser Ser Trp Ser Lys Asp Phe Asn Asn Leu Cys Asp Trp Tyr Thr

65 70 75 80

His Leu Leu Ser Lys Ser Pro Thr Gly Thr Ile His Ile His Ile Leu

85 90 95

Gly Asn Ile Ile Thr Ala Asp Pro Lys Asn Val Glu His Ile Leu Lys

100 105 110

Thr Lys Phe Glu Asn Tyr Pro Lys Gly Lys Pro Phe Ser Ile Leu Leu

115 120 125

Gly Asp Leu Leu Gly Lys Gly Ile Phe Asn Val Asp Gly Asp Ser Trp

130 135 140

Lys Phe Gln Arg Lys Met Ala Ser Leu Glu Leu Gly Ser Val Ser Ile

145 150 155 160

Arg Met His Ala Phe Asn Ile Val Lys Ser Glu Ile Gln Thr Arg Leu

165 170 175

Ile Pro Leu Leu Asn Ser Val Ser Gly Gln Val Leu Asp Ile Gln Asp

180 185 190

Val Phe Arg Arg Phe Ser Phe Asp Asn Ile Cys Lys Phe Ser Phe Gly

195 200 205

Phe Asp Pro Cys Cys Leu Glu Leu Ser Leu Pro Met Pro Ala Ser Glu

210 215 220

Phe Ala Glu Ala Phe Asp Leu Ala Ser Lys Leu Ser Ala Gln Arg Gly

225 230 235 240

Leu Ser Ser Ser Ser Leu Ile Trp Lys Val Lys Arg Val Leu Asn Leu

245 250 255

Gly Ser Glu Lys Glu Leu Lys Ser Ala Ile Lys Met Val Asp Gln Phe

260 265 270

Ala Gln Arg Met Ile Asn Gln Arg Arg Glu Leu Gly Phe Ser Asp Lys

275 280 285

Ser Asp Leu Leu Ser Arg Phe Met Ala Thr Met Ile Asp Asp Asp Gln

290 295 300

Tyr Leu Arg Asp Ile Val Val Ser Phe Leu Leu Ala Gly Arg Asp Thr

305 310 315 320

Val Ala Ser Gly Leu Thr Ser Phe Phe Trp Leu Leu Ser Gln Asn Pro

325 330 335

Lys Val Glu Phe Ala Ile Arg Asp Glu Leu Glu Lys Val Thr Ala Gly

340 345 350

Ile Ser Pro Ser Asp Asp Gln Asp Phe Val Met Phe Asp Gln Met Arg

355 360 365

Glu Met His Tyr Leu His Ala Ala Leu Cys Glu Ser Leu Arg Leu Phe

370 375 380

Pro Pro Val Gln Leu Asp Ser Lys Phe Ala Gln His Asp Asp Val Leu

385 390 395 400

Pro Asp Phe Thr Phe Val Arg Lys Gly Thr Arg Val Thr Tyr His Pro

405 410 415

Tyr Ala Met Gly Arg Met Glu Arg Val Trp Gly Ser Asp Cys Leu Glu

420 425 430

Phe Lys Pro Glu Arg Trp Leu Lys Asn Ala Arg Tyr Val Pro Glu Asn

435 440 445

Pro Tyr Lys Tyr Pro Val Phe Gln Ala Gly Leu Arg Val Cys Leu Gly

450 455 460

Lys Glu Met Ala Leu Val Glu Met Lys Cys Val Val Leu Ala Ile Ile

465 470 475 480

Lys Arg Phe Asn Ile Gln Val Ala Asp Pro Asn Gln Ala Pro Thr Phe

485 490 495

Ala Pro Gly Leu Thr Ala Thr Val Arg Gly Gly Leu Pro Val Leu Val

500 505 510

Gln Arg Arg Glu Ala

515

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 5

cacgggggac tctagaatga atcattcaat ttcaaacct 39

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 6

gacggccagt gaattcttaa gcttcccttc gttggacta 39

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 7

atgaatcatt caatttcaaa cct 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 8

ttaagcttcc cttcgttgga cta 23

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 9

agggttgtcg tcgtcgtctt tg 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 10

ggaagcaacc gtatcacgac ca 22

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 11

agatccagga caaggaaggt attc 24

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 12

cgcaggacca agtgaagagt ag 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 13

caagagttga gattggtgga g 21

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 14

tacactgttt gcctgcca 18

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 15

ttgcaagatc acaacaattc gcttct 26

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 16

gagagtttgg ttccgtcaac gacgat 26

Claims

1. GhCYP94C1基因过表达在促进植物开花中的应用；

所述GhCYP94C1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述GhCYP94C1基因编码多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述植物为棉花和拟南芥。