CN106244607B

CN106244607B - 棉花细胞色素p450 cyp94c1基因在抗黄萎病中的应用

Info

Publication number: CN106244607B
Application number: CN201610858321.4A
Authority: CN
Inventors: 蔡应繁; 周克学; 龙璐; 王微娜; 孙全; 高巍; 张骁; 宋纯鹏
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2016-09-28
Filing date: 2016-09-28
Publication date: 2019-12-03
Anticipated expiration: 2036-09-28
Also published as: CN106244607A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及棉花细胞色素P450 CYP94C1基因在抗黄萎病中的应用专利申请。所述GbCYP94C1基因，与植物的黄萎病抗性相关。发明人发现在植物受到黄萎病菌侵染时，该基因表达量出现了表达量降低的明显变化，而在采用部分类型的激素处理时，该基因的表达量则又出现了表达量升高的明显变化。进一步将该基因沉默后，植物的抗黄萎病抗性得到了提升，而该基因超表达后，植物对黄萎病菌侵染时更为敏感。基于上述特性，通过培育或者筛选CYP94C1基因沉默的植株，可为获得黄萎病抗性较好植物新品种提供较好借鉴和参考，因而在植物新品种培育方面具有较好地应用价值。

Description

棉花细胞色素P450 CYP94C1基因在抗黄萎病中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及棉花细胞色素P450 CYP94C1基因在抗黄萎病中的应用专利申请。

背景技术

植物与病原菌的抗争的信号途径中，主要有两个信号途径：一个是微生物/病原相关分子模式的识别（MAMP）；另一个是植物激素信号途径的调控，主要包括水杨酸（SA）信号途径、茉莉酸（JA）信号途径和乙烯（ET）信号途径。微生物/病原相关分子模式的识别（microbe/pathogen-associated molecular patterns，MAMPs）是植物的固有免疫防御系统，且以膜锚定模式识别受体（membrane-anchored pattern recognition receptors，PRRs）为其识别受体。在植物激素信号途径调控过程中，植物防御病原微生物的入侵是通过一个复杂的网络信号通路实现的，它通过调控植物激素来实现植物的防御反应，它们通过调节局部的和系统的防御机制抵抗入侵的病原菌。不同的激素系统之间的相互作用，使植物对一个特定模式的病原体感染做出响应。

棉花黄萎病是一种通过土壤传播的真菌类维管束病害，被称为棉花中的“癌症”，是棉花中最普遍但损害又最严重的病害。棉花被黄萎病菌入侵后，导致棉花叶片松弛，萎黄和坏疽；茎部维管束褐化；花和果实减少。黄萎病菌之所以难以防治是由于病菌的休眠生物体的存活率较高且寄主范围具有广泛性。一旦真菌进入木质部后杀菌剂将很难将其消除。大丽轮枝菌和黑白轮枝菌是已发现的引起棉花黄萎病的主要的两种致病菌，其中，在主要的棉花种植区域中，大丽轮枝菌是棉花黄萎病的主要致病菌。

自从1935年棉花黄萎病病菌在中国被发现以来，国内越来越重视对黄萎病的研究。然而，传统的抗病育种策略很难筛选出大量的抗病种质资源，进展缓慢；化学方法虽有成效但是对环境破坏严重。随着生物学技术的发展，通过把一些抗病基因转入植物体内，进而获得转基因植株，从而提高植株本身的遗传抗性来抵御病菌的入侵，因而基因工程也被认为抗病育种研究中最有潜力的技术。

P450s是一个超基因大家族酶系，关于所有生物体的细胞色素P450基因的命名规则已经在蛋白序列的同源性和系统发育基础上建立起来了。根据氨基酸序列的相似性对P450s进行分类，如果氨基酸序列相似性低于20%，则属于不同的家族，命名为CYP1、CYP2、CYP3等，以CYP1为例，当氨基酸序列相似性大于40%时归为同一家族，命名为CYP1，当氨基酸序列相似性大于55%时归为同一亚家族，命名为CYP1A（A，B，C）。然而，这一命名规则还是有一些缺陷的，尤其是在植物中，因为基因的复制和重组会使一个简单的命名变得复杂，在这种情况下，则根据系统发育进行家族分配。

植物细胞色素P450命名范围是从CYP71A1到CYP99XY，以及CYP701A1和之后的基因。植物细胞色素P450初步分为两类：A-type和non-A-type。多数的P450s参与一些物质和次级代谢物的合成，且进一步发现它们均属于A-type类，而non-A-type类的P450s的功能主要是参与脂质或植物激素的代谢。

由于植物细胞色素P450基因功能的多样性和重要性，因而对其与黄萎病间的作用机制也有必要加以研究，从而为黄萎病的预防和控制提供一定的借鉴和参考。

发明内容

本发明目的在于提供棉花细胞色素P450 CYP94C1基因在抗黄萎病中的新应用，利用该新用途，可培育新的抗黄萎病的棉花新品种，从而为棉花黄萎病的预防和控制提供新的途径。

本发明所采取的技术方案详述如下。

棉花细胞色素P450 CYP94C1基因在抗黄萎病中的应用，所述棉花细胞色素P450CYP94C1基因，表示为：GbCYP94C1基因，其全长cDNA序列含1653 bp，genbank编号为kp323405，该基因与植物的黄萎病抗性相关。

进一步而言，棉花在受黄萎病菌侵染时，GbCYP94C1基因的表达量会发生降低；

棉花在受到MeJA、JA和GA处理时，GbCYP94C1基因的表达量会发生提高；而GbCYP94C1基因的表达不受ABA处理的影响；

更进一步而言，GbCYP94C1基因通过JA信号途径响应植物的伤害反应。

所述GbCYP94C1基因，与植物的黄萎病抗性相关，在将该基因沉默后，植物的黄萎病抗性有所增强，而将该基因超表达后，植物对黄萎病菌侵染更为敏感；所述植物具体为棉花或者拟南芥等。

本发明首先克隆获得了棉花P450 CYP94C1基因，并对该基因结构、所表达蛋白等相关信息进行了深入研究。在对该基因与植物的黄萎病相关性研究时，发明人发现在植物受到黄萎病菌侵染时，该基因表达量出现了表达量降低的明显变化，而在采用部分类型的激素处理时，该基因的表达量则又出现了表达量升高的明显变化。进一步将该基因沉默后，植物的抗黄萎病抗性得到了提升，而该基因超表达后，植物对黄萎病菌侵染时更为敏感。基于上述特性，通过培育或者筛选CYP94C1基因沉默的植株，可为获得黄萎病抗性较好植物新品种提供较好借鉴和参考，因而在植物新品种培育方面具有较好地应用价值。

附图说明

图1为GbCYP94C1基因的克隆和菌液PCR检测的电泳图，其中a：GbCYP94C1基因克隆的琼脂糖凝胶电泳图；b：菌液PCR检测的琼脂糖凝胶电泳图，其中M表示Marker，N表示阴性对照，P表示阳性对照，1-3表示3个单菌落；

图2为GbCYP94C1与其他同源性序列的蛋白比对结果，其中着色线部分包含有K螺旋保守结构域和血红素结合区域；

图3为GbCYP94C1蛋白的进化树分析，其中所选物种有棉花（Gb），拟南芥（At），烟草（Nt），丹参（Sm），蚕豆（Vs）和矮牵牛（Pe）；图中GenBank登录号分别为AtCYP94B1（Q9FMV7.1），AtCYP94B2（NP_566155.1），AtCYP94B3（Q9SMP5.1），AtCYP94C1（Q9ZUX1.1），AtCYP94D1（NP_174713.1），AtCYP94D2（NP_191222.1），VsCYP94A1（AF030260.1），VsCYP94A2（AF092917.1），VsCYP94A3（AF092914.1），NtCYP94A4（AF092915.1），NtCYP94A5（AF092916.1），NtCYP94A6（AF092913.1），PeCYP94A13（AAZ39645.1），SmCYP94C54（KP337727.1），SmCYP94C55（AJD25222.1），其中GbCYP94C1与SmCYP94C54的亲缘性关系最近，相似性高达56.4%；

图4为GbCYP94C1蛋白的三级结构预测分析结果；

图5为黄萎病菌诱导时GbCYP94C1基因的表达变化情况，其在棉花幼苗长出两片真叶时接种黄萎病，然后分别在不同时间点取样做GbCYP94C1基因的表达模式分析，黄萎病病菌的菌液浓度为10⁵spores/mL；

图6为GbCYP94C1基因在棉花幼苗中不同组织根、茎和叶中的表达量；

图7为激素诱导情况下GbCYP94C1基因的表达变化情况；

图8为VIGS技术干涉效率的分析鉴定，其中a：棉花基因GbCLA通过病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）使基因沉默后的表型；b：qRT-PCR和RT-PCR技术分别检测GbCYP94C1基因的表达水平；

图9为TRV:GbCYP94C1干涉植株黄萎病抗性鉴定，其中a：左侧为黄萎病菌处理10天后棉花幼苗的表型观察，右侧为病情指数的统计情况；b：发病后茎部解剖图，左侧为TRV:00，右侧为TRV:GbCYP94C1；c：黄萎病菌回复实验，左侧为TRV:00，右侧为TRV:GbCYP94C1；d：台盼蓝染色实验，上方为TRV:00，下方为TRV:GbCYP94C1；

图10 为GbCYP94C1基因通过调控JA信号途径响应黄萎病抗性；其中a：GbCYP94C1基因沉默后，SA途径的关键基因EDS1，ICS1和PAD4以及JA途径的关键基因AOS，AOC4和FAD7的表达水平的检测；b：棉花幼苗伤害处理后，JA途径的关键基因AOS和AOC4以及GbCYP94C1基因的表达水平的检测；

图11为GbCYP94C1基因转拟南芥超表达后的鉴定及表型分析，其中a：上方图为BP反应的菌液PCR检测，下方图为LR反应的菌液PCR检测，M表示Marker，N表示阴性对照，P表示阳性对照，1—12等表示单菌落；b：拟南芥中GbCYP94C1基因超表达水平的检测；c：黄萎病菌处理野生型与超表达拟南芥后的表型，黄萎病菌的菌液浓度为10⁷ spores/mL；d：野生型与超表达拟南芥经黄萎病处理后，叶绿素含量的检测；e：黄萎病处理后，发病数量的统计；f：野生型与超表达拟南芥抽苔情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，首先对下述实施例中所涉及部分生物材料及实验试剂等情况简要介绍如下。

生物材料：

棉花材料包括：陆地棉感黄萎病品种冀棉11，由中国农业科学院棉花研究所朱荷琴研究员提供；

抗黄萎病海岛棉，由中国农业科学院棉花研究所杜雄明研究员提供；

棉花材料均在河南大学植物逆境试验田露天棉花种植专区种植培养；

黄萎病菌株：棉花黄萎病强致病力菌系V991，由中国农业科学院植物保护研究所简桂良研究员提供；

拟南芥材料：野生型拟南芥种子(Columbia-0)；由河南大学植物逆境实验室提供，培养条件为21 ℃，16 h光照、8 h黑暗；

引物序列：均由华大科技合成提供；

其他生物材料包括：大肠杆菌菌种DH5α、农杆菌菌种GV3101；

TA克隆载体pMD18-T Vector，TaKaRa；

BP反应入门载体pDONOR221，

基因超表达载体PK7WG2.0，

基因亚细胞定位载体PK7FWG2.0；

VIGS干涉技术载体TRV1和TRV2；

上述载体和菌种由河南大学植物逆境实验室提供。

实验试剂：

质粒提取试剂盒、oligo(dT)18、RNAase抑制剂、dNTP、pMD18-T Vector、T4-DNA连接酶、内切酶EcoR1和Kpn1、ExTaq酶、PCR产物回收试剂盒、荧光定量PCR试剂盒等均为TaKaRa公司产品；

荧光定量PCR专用板为Labwares公司产品；

RNA提取试剂盒购自Aidlab Biotech（Beijing，China）公司；

反转录酶M-MLV为Promega公司产品；

电泳Marker 2K为TIANGEN公司产品；

所用培养基及溶液有：LB液体（固体）培养基、YEP液体（固体）培养基、0.6 MS培养基（MS 0.443 g，蔗糖3 g，水100 mL，琼脂粉0.6 g，pH 5.8~6.0）、察氏（Czapek）培养基、PDA培养基、50×TAE Buffer（Na₂EDTA∙2H₂O 37.2 g，冰乙酸57.1 mL，NaOH调pH=8.3，加水定容至1 L）等，均按本领域常规制备方法制备即可；

其他未描述的抗生素、激素类等试剂均为本领域常用试剂，不再赘述。

实施例1

棉花细胞色素P450 CYP94C1基因是本发明的基础，因而首先就该基因的克隆与获得过程简要介绍如下。

一、设计引物，进行PCR扩增

首先，棉花生长两周，长出两片子叶后，提取棉花RNA，反转录为cDNA，备用；具体为：

参考说明书，使用Aidlab公司的EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒进行样品总RNA的提取；然后进行反转录获得cDNA，20 μL反转录体系设计为：

oligo(dT)18，1 μL；

RNA，2 μL；

RNA free H₂O，10 μL；

5×buffer，4 μL；

dNTP，1 μL；

MLV，1 μL；

RNA inhibiter，1 μL；

反转录程序为：65℃、5min，4℃、1min，42℃、1 h，85℃、5 min。

然后，设计引物序列如下：

P450-F: TCCTTCTTTGAATCGCTCTTTA，

P450-R: TGTCCCCTTTGAGCCATTAGAT；

以所提取的海岛棉新海16的cDNA为模板进行PCR扩增，获得GbCYP94C1基因序列；

PCR扩增时，20μL扩增体系设计如下：

ExTaq 酶，10 μL；

P450-F，0.5 μL；

P450-R，0.5 μL；

cDNA模板，1 μL；

ddH₂O，8 μL；

PCR扩增程序， 94℃，5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min30s，35个循环；72℃，10min；

扩增产物直接进行凝胶电泳检测分析或者4℃保存备用。

二、将所克隆获得的GbCYP94C1基因与T载体连接

回收步骤一中的PCR扩增产物，纯化后，与T载体（即pMD18-T Vector）连接，然后进行菌液PCR检测，对检测阳性的质粒进一步进行测序。琼脂糖凝胶回收采用天根凝胶DNA回收试剂盒进行。

步骤一中克隆所获得的GbCYP94C1基因的电泳图如图1a所示，与T载体连接的菌液PCR检测结果如图1b所示。根据测序结果对所克隆的GbCYP94C1基因的cDNA序列进一步进行BLAST分析（http://ncbi.nlm.nih.gov），同时对其开放阅读框（ORF）进行预测分析（利用ORF Finder预测，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），利用DNAMAN软件进行了序列相似性分析，最后利用MEGA4软件进行了序列的进化分析（采用Neighbor-Joining的计算方法构建了进化树）。

具体结果表明，GbCYP94C1基因的全长cDNA序列含1653 bp (genbank：kp323405)，包含完整的开放阅读框（ORF），其ORF含1503 bp (genbank：kp323405)，编码500个氨基酸，分子量为57.233 kD。

利用DNAMAN软件，以AtCYP94C1、AtCYP94B3、NtCYP94A5和SmCYP94C54四个基因为对象，对GbCYP94C1基因进行了比对，结果表明该家族基因含有K螺旋保守结构域和血红素结合区域（比对结果如图2所示）。

利用MEGA4软件对细胞色素CYP94家族成员使用邻接法（Neighbor-Joining）构建了进化树，结果发现GbCYP94C1与SmCYP94C54的亲缘关系最近，相似性高达56%（进化树如图3所示）。

对蛋白的亚细胞定位预测分析表明（利用http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/软件分析），该蛋白定位于内质网。

该蛋白的三级结构预测图如图4所示（通过http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index软件预测）。

利用（http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!seqQueryResults?id=81605）在线查找GbCYP94C1基因的启动子序列，并通过（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）软件对启动子序列响应元件进行分析，结果表明：TC-rich repeats，ATTTTCTTCA，参与防御和应激反应的顺式作用调节元件；ARE，TGGTTT，厌氧诱导的顺式作用调节元件；Box-W1，TTGACC，真菌诱导子响应元件；CCGTCC-box，CCGTCC，与分生组织特异性激活有关的顺式作用调控元件；ERE，ATTTCAAA，乙烯反应元件； HSE，AAAAAATTTC，热应激反应中的顺式作用元件；MBS，CAACTG，参与干旱诱导的MYB结合位点；TGA-element，AACGAC，生长素反应元件。

实施例2

本实施例主要介绍一下在黄萎病菌诱导和激素诱导模式下棉花中GbCYP94C1基因表达的变化情况，相关实验过程简述如下。

黄萎病菌诱导模式下棉花中GbCYP94C1基因表达变化情况

首先，萌发棉花种子，具体为：25℃条件下，将棉花种子在培养箱中浸泡于水中8~12h，然后置于培养皿中保湿培养一天，种子萌发后移入营养土中生长（培养条件为25℃，16h光照、8 h黑暗）；棉花幼苗生长三周后，进行黄萎病病菌接种处理；

对棉花幼苗接种黄萎病病菌前四天，制备黄萎病菌感染液，具体为：将黄萎病菌在察氏液体培养基中振荡培养（25℃，150 rpm），培养四天后用纱布过滤菌液，并调节菌液浓度至1×10⁵ 个/mL；

对棉花幼苗采用伤根法接种黄萎病病菌，具体为：将棉花幼苗从盆钵中取出，放置于黄萎病菌液中浸泡1 min，然后再放回盆钵中培养；同时设置对照组作为对比（对照组以蒸馏水替代黄萎病菌感染液，其他操作相同）；

接种病菌后，分别在0 h、1 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h等时间点取样品叶片，直接进行分析或者液氮速冻后-80 ℃保存备用。

对所取样品提取RNA后，反转录出cDNA，以该cDNA为模板，采用qRT-PCR技术对GbCYP94C1基因的表达模式进行了分析。

反转录获得cDNA时，引物设计为：

RT-P450-F：GGAAGAGGGCTTTTCAGACAGAC，

RT-P450-R：ATGGCTGACTCAACTTCTGGATGC；

以Ubiquitin7 gene（UB7）基因作为内参基因，

RT-PCR的反应程序为：94 ℃、5min；94℃、30s，57℃、30s，72 ℃、30 s，28个循环；72 ℃、10 min。扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测验证。

qRT-PCR时，引物设计为：

QRT-P450-F：GGAAGAGGGCTTTTCAGACAGA，

QRT-P450-R：GGCTGACTCAACTTCTGGATGC；

Ubiquitin7 gene（UB7）基因作为内参基因，引物设计为：

UB7-F：GAAGGCATTCCACCTGACCAAC；

UB7-R：CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG；

利用ABI 7500 Real Time PCR系统（Applied Biosystems，USA），使用SYBR绿色荧光（Bio-Rad，USA），反应程序为：95℃、20 s；95℃、10s，60℃、30s，40个循环；

相对表达量数据计算使用ABI 7500 Real Time PCR系统中的SDS软件，计算方法为2^-△Ct。

结果如图5所示。从图5中可以看出，黄萎病诱导表达1 h、8 h和72h后，GbCYP94C1基因的表达量明显降低，因为黄萎病的诱导是动态的，所以出现诱导表达不连续的现象。

对根、茎和叶三个不同组织部位样品，利用qRT-PCR的荧光定量分析表明（结果如图6a所示），GbCYP94C1基因在根部的表达量最高，在茎和叶部的表达水平相对较低。

结合前述结果，由于GbCYP94C1基因在黄萎病菌诱导1 h后表达水平变化最明显，因此，将该基因在黄萎病诱导1 h后的棉花幼苗的根、茎和叶中的表达水平与未被黄萎病处理的棉花幼苗的根、茎和叶中的表达水平作对比（如图6b所示），结果显示，GbCYP94C1基因在根、茎和叶中的表达水平均表现为下降趋势。为了进一步了解GbCYP94C1基因受黄萎病诱导后在不同组织部位的变化量的差异，对图6b进行了纵向比较（图6c），发现经黄萎病诱导后，GbCYP94C1基因的表达水平在叶中的下降趋势较为突出。

激素诱导模式下棉花中GbCYP94C1基因表达变化情况

为对GbCYP94C1基因的激素调控途径有初步了解，因而有必要对激素处理处理后棉花中GbCYP94C1基因的表达变化情况进行初步分析，相关实验过程主要为：

萌发棉花种子（相关过程参考前述黄萎病菌诱导时的操作过程），在棉花生长20天后，采用喷射法，分别用100 μmol/L的茉莉酸甲酯（MeJA）、100 μmol/L的茉莉酸（JA）、100 μmol/L的脱落酸（ABA）、0.5 μmol/L的赤霉素（GA）处理生长出两片真叶的棉花幼苗；在处理后的0 h、1 h、3 h和6 h四个不同的时间点取样，样品采用液氮速冻后-80 ℃保存或者直接进行分析检测。

检测时，首先提取样品RNA，然后通过qRT-PCR技术检测GbCYP94C1基因的表达量的变化情况。结果如图7所示。

从图7中可以看出，MeJA、JA和GA处理后，GbCYP94C1基因的表达量显著提高，而ABA处理不影响GbCYP94C1基因的表达。

实施例3

为进一步研究GbCYP94C1基因与黄萎病间的关系，发明人借助VIGS技术对棉花植株内的GbCYP94C1基因进行了沉默，相关实验过程介绍如下。

一、构建含有GbCYP94C1基因的VIGS载体

引物设计如下：

P450-VIGS-F：CCGGAATTC TTAATTGAGACAAGAGCTTG，

P450-VIGS-R：CGGGGTACCTTTATCAGGAAGAGAAAGAC；

首先将TRV2空载体和实施例1中PCR扩增获得的GbCYP94C1基因序列片段分别用EcoRI和KpnI酶进行双酶切，50 μL酶切体系设计如下：

EcoRI，2 μL；

KpnI，2 μL；

10×Buffer，5 μL；

TRV2空载（或扩增片段），41 μL；

37℃酶切3 h；

双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳；并采用琼脂糖凝胶回收试剂盒（TaKaRa公司）分别回收酶切产物；

将所回收的酶切产物利用T4 DNA连接酶16℃进行过夜连接，以构建含有GbCYP94C1基因的重组载体，20 μL连接体系设计如下：

T4 DNA连接酶，1 μL；

10×Buffer，2 μL；

TRV2空载酶切产物，1 μL；

DNA片段酶切产物，3 μL；

ddH₂O，13 μL。

二、转化大肠杆菌，筛选获得构建正确的重组病毒质粒载体

将步骤一中的连接产物热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并进行抗性筛选，经PCR鉴定和测序验证后，获得构建正确的重组病毒质粒载体，具体过程为：

将步骤一中的连接产物与大肠杆菌DH5α感受态细胞（如果感受态细胞是从-80℃冰箱中取出，需在4℃环境下解冻约10min）混合均匀后，冰上放置30min，然后42℃水浴热激90s，再立即置于冰上2min；

转化完成后，在上述混合物中加入400μL液体LB，37℃、180 rpm摇床振荡培养1 h，然后将菌液均匀涂布于含有卡那抗生素（50ng/μL）的LB培养皿中，37℃倒置培养约12 h；

挑取阳性菌落置于含有卡那抗生素（50ng/μL）的LB液体培养基中扩大培养14h-16h，然后进行菌液PCR鉴定，对鉴定正确的质粒进行测序比对鉴定，对测序正确的质粒提取后保存备用。

三、转化农杆菌

对步骤二中测序验证正确的大肠杆菌，提取质粒，然后转化农杆菌GV3101，以便进行农杆菌介导的转化棉花操作，具体过程为：

将农杆菌GV3101感受态细胞50μL（如果感受态细胞是从-80℃冰箱中取出，需在4℃环境下解冻约10min）与目的质粒（即步骤二中测序验证正确的目的质粒）1μL混合均匀后，冰上放置30min；然后液氮中速冻90s，再迅速放入37℃水浴中5min，再置于冰上2min；

转化完成后加入400μL不含抗生素的液体LB，28℃、180 rpm摇床振荡培养4h，然后将菌液均匀涂布于含有卡那抗生素（50ng/μL）的LB培养皿中，28℃倒置培养约2~3天；

挑取阳性菌落置于含有卡那抗生素（50ng/μL）的LB液体培养基中扩大培养14h-16h，然后进行菌液PCR鉴定，对鉴定正确的阳性克隆菌液直接转化棉花操作，或者加甘油后-80℃保存备用。

四、转化棉花

将步骤三中的含有重组病毒载体TRV:GbCYP94C1的农杆菌菌液扩增培养，在OD₆₀₀下测菌液OD值为0.6~0.8时，进行转化操作，具体过程为：

将菌液低速离心，弃上清，然后用VIGS Buffer重悬沉淀；所述VIGS Buffer配方为：每100 mL配方为：

AS（乙酰丁香酮），100 mmol/L、200 μL；

MES（2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物），1 mol/L 、1000 μL；

MgCl₂，1 mol/L 、1000μL；

ddH₂O加至100mL。

参考步骤三的转化步骤及上述操作，分别制备含有病毒载体TRV1空载体、TRV2空载体的农杆菌菌液，并用VIGS Buffer重悬。

将重悬液TRV1分别与TRV2和TRV:GbCYP94C1等量混合，即：TRV1+TRV2、TRV1+ TRV:GbCYP94C1；混合均匀后25℃静置1h；

然后用注射器注射到生长7天，两片子叶展平的棉花幼苗子叶中，黑暗培养24 h后，正常光照（关照16 h，黑暗8 h）培养。

待棉花生长两周后取样，提取RNA，反转录获得cDNA，采用PCR检测干涉效率。

棉花基因GbCLA是一个调控叶绿素合成的基因，GbCLA基因沉默后叶片出现白化症状。将该基因转入VIGS载体中，通过注射法将TRV:GbCLA转入棉花子叶中，两周后叶片出现白化表型（图8a），说明VIGS技术能有效地干涉GbCLA基因，可作为VIGS体系的阳性对照。

RT-PCR和qRT-PCR检测表明，通过VIGS技术的处理，GbCYP94C1基因已被高效沉默掉（图8 b）。

在确认GbCYP94C1基因被高效沉默后，对棉花幼苗进行黄萎病接种处理（处理步骤参考实施例1）。

对GbCYP94C1基因沉默后棉花黄萎病疫情指数进行统计。黄萎病抗性鉴定采用棉花黄萎病统一分级标准，分为零级至四级；黄萎病病情指数计算公式为：病情指数=[Σ( 各级病株数×相应级别) /(调查总株数×4) ]×100；当感病对照品种病情指数在50左右时开始统计待测品种的病情指数；为了确保测试的准确性，以相对病情指数作为计算标准，相对病情指数等于待测品种的病情指数乘以校正系数K值，K=50/感病对照品种病情指数；

对于黄萎病病情指数鉴定评价标准，具体如下表所示：

。

观察统计表明，在将GbCYP94C1基因沉默后，黄萎病菌液处理7天左右，棉花植株开始表现出相应的黄萎病症状，但GbCYP94C1基因沉默后的棉花植株的抗性有所增强（如图9a所示），并且发病率和和病情指数都显著降低，具体发病率和和病情指数统计结果如下表所示：

。

一般而言，在棉花黄萎病发病后，维管束会出现褐化表型，因此发明人对发病后棉花茎进行解剖，从解剖面可以明显看出，基因干涉后，褐化现象明显减轻（图9 b）。

进一步地，通过病菌恢复实验可对植株的抗病表型有更为直观的指证。实验过程为：将黄萎病菌处理后棉花幼苗的茎用剪刀剪成1 cm长的片段，70%的酒精中浸泡30 s，然后移入0.1%的HgCl₂溶液中浸泡1 min，最后用无菌水冲洗5次左右；将灭菌后的茎置于PDA培养基上，25℃培养一周后观察，

结果显示，对照组七个片段中有六个再生出黄萎病病菌菌落，而干涉组中仅有两个片段再生出菌落（图9c）。

台盼蓝染色法是一种鉴定细胞活力的方法，其染色原理是当细胞受到损伤或死亡时，台盼蓝可透过细胞膜进入细胞内，与解体的DNA结合，使其着色。而活细胞及健康无损的细胞能阻止染料进入细胞内，细胞不被染色，从而可鉴定死细胞和活细胞。当棉花受到黄萎病侵害时，棉花叶片中的细胞会大量死亡，因此通过台盼蓝染色法也可鉴定棉花的发病情况。染色过程为：将样品放入容器内，加入染色液抽真空30 min，然后90℃水浴3 min，再室温放置8 h，最后用75%酒精脱色，观察实验结果。

结果如图9d所示。从图中可以看出，对照组细胞受损较为严重，而基因沉默组细胞受损程度则明显较小。

由于植物激素与植物对生物逆境和非生物逆境的响应密切相关，结合实施例1的实验结果可知，JA和SA与GbCYP94C1基因表达的变化具有一定相关性，因而有必要对GbCYP94C1基因沉默后棉花中JA和SA信号途径的变化情况进行初步分析，简要介绍如下。

以GbCYP94C1基因沉默棉花的CDNA作为模板，检测JA和SA途径中关键基因的表达量的变化。

从图10a中可以看出，在SA信号途径中，EDS1和ICS1表达变化不显著，PAD4的表达量有轻微变化；而在JA生物合成途径中，随着GbCYP94C1基因的沉默，AOS和AOC4基因表达量显著降低，仅FAD7的表达量有轻微的变化。

由于JA在伤害反应中有着非常重要的作用。因此，将棉花幼苗进行伤害处理，对参与JA合成途径的基因的表达模式进行了分析（图10b）。结果显示：JA合成途径的基因AOS和AOC4分别在伤害处理1 h和2 h后，表达水平显著提高，有趣的是GbCYP94C1基因的表达水平也在伤害处理2 h后显著上调。这说明GbCYP94C1基因通过JA信号途径响应伤害反应。

上述相关基因表达量检测时，引物序列具体设计如下：

EDS1-F：GCAGCAACAGCTCCTCTACCTCAA，

EDS1-R：GGCAGACCAAGACGCTACAGATACA；

ICS1-F：ATGGATGAATGGGTGCGAAGG，

ICS1-R：AAGAATGCCAGAGGTAAGAGGAGGA；

PAD4-F：GGATGGAAGAATGGAAAGAAATGAA，

PAD4-R：GAACTAGGAAAGCAGACTAAGGAACCA；

AOS-F：CGATGTCCCAACTTCAATCTCAAAC，

AOS-R：ATCCGACGGTGGAGAATAAACAGT；

AOC4-F：AATAGAGCATAAACCCGAAATGAAAG，

AOC4-R：CAAAAATGCCAGACCCACCAGTA；

FAD7-F：ACCCAAGCCAACAAGAATAGCAG，

FAD7-R：GTGGAACAGAAGTCCAGGAAAGAGT。

实施例4

拟南芥作为植物研究中的模式植物之一，通过对拟南芥上相关基因，或者以拟南芥作为转基因受体，可以相关基因的研究提供较好的便利和参考，因而发明人以拟南芥野生型作为受体，对GbCYP94C1基因进行了超表达，以研究GbCYP94C1基因超表达后植株的黄萎病抗性的相关变化。相关实验介绍如下。

一、构建含有GbCYP94C1基因的重组表达载体，并转化农杆菌

引物设计：

P450-attB1：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGATGGATTCACAACTTTCC，

P450-attB2：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTAAGCCTCCCTTTCTTGGAC；

通过Gateway技术将GbCYP94C1基因转入到超表达载体PK7WG2.0上，构成35S::GbCYP94C1载体。

Gateway技术中5μL的BP/LR反应体系设计如下：

TE8.0，2 μL；

pDONOR221，1 μL；

BP酶，1 μL；

PCR产物，1 μL；

5μL的LR反应体系设计如下：

TE8.0，2 μL；

PK7WG2.0载体， 1 μL；

LR酶，1 μL；

中间质粒，1 μL；

所构建的含有GbCYP94C1基因的超表达载体电泳图如图11a所示。

将反应体系混匀后25℃放置2 h以上，然后热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，PCR检测挑选阳性克隆，提取质粒进行测序鉴定。

再经农杆菌DV3101热激转化，将超表达载体转入农杆菌中。

PCR检测阳性克隆，菌液加甘油超低温冰箱保存。

进行农杆菌介导的拟南芥转化实验。

二、进行农杆菌介导的拟南芥转化

采用农杆菌介导的花浸染法进行遗传转化，转基因拟南芥经过T1代，T2代筛选获得纯系转基因植株，具体筛选过程为：

花浸染后的拟南芥收获的种子为T0代，将种子点在具有抗生素卡那霉素的1/2 MS平皿上，成功存活且正常生长的为阳性植株，收获的种子为T1代；

T1代种子再次点在具有抗生素卡那霉素的1/2 MS平皿上，成活比例为3:1的转入营养土中培养，收获T2代种子；

T2代种子如上也点在具有抗生素卡那霉素的1/2 MS平皿上，全部存活且正常生长，转入营养土培养收获T3代种子，且为纯系。

在T1代筛选过程中，对拟南芥叶片进行取样，并测定GbCYP94C1基因的表达水平，结果如图11b所示，从图中可以看出，GbCYP94C1基因的表达水平明显提高。

对所收获的纯合的转基因拟南芥种子（T3代种子）进行播种，待生长30天后用黄萎病菌液进行处理，观察表型变化（结果如图11c所示），并对黄萎病处理后的超表达株系与对照组的叶绿素含量进行测定（结果如图11d所示）。从图中可以看出，GbCYP94C1基因超表达后，在面临黄萎病菌侵袭时，拟南芥叶片中叶绿素含量比野生型叶绿素含量明显降低。

对拟南芥发病株数进行统计（如图11e所示），结果表明，GbCYP94C1基因超表达后，发病株数明显高于野生型植株。

综合上述情况可以看出，GbCYP94C1基因超表达后，拟南芥对黄萎病菌的侵染更为敏感。

Claims

1.棉花细胞色素P450 CYP94C1基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，所述CYP94C1基因，其全长cDNA序列含1653 bp，genbank编号为kp323405，该基因与植物的黄萎病抗性相关；

在受黄萎病菌侵染时，CYP94C1基因的表达量会发生降低；

而在受到MeJA、JA和GA处理时，CYP94C1基因的表达量会发生提高，同时，CYP94C1基因的表达不受ABA处理的影响。

2.如权利要求1所述棉花细胞色素P450 CYP94C1基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，在将CYP94C1基因沉默后，植物的黄萎病抗性有所增强；而将CYP94C1基因超表达后，植物对黄萎病菌侵染更为敏感。