CN113234732A - 一种长筒石蒜LlbHLH19基因及其表达的蛋白和应用 - Google Patents

一种长筒石蒜LlbHLH19基因及其表达的蛋白和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种长筒石蒜LlbHLH19基因及其表达的蛋白和应用，属于植物分子生物学领域，LlbHLH19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，LlbHLH19基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。bHLH是植物花青苷生物合成中重要的转录因子，在石蒜初蕾期表达量最高，中蕾期和大蕾期表达量逐渐降低。将石蒜的LlbHLH19基因在早花烟草中进行过表达，能使早花烟草的花色由粉红转至深红，是一种可以改变花色的转录因子。将LlbHLH19基因应用于转基因植物，可改良植物的花色从而提高其观赏性，具有实际应用价值。

Description

一种长筒石蒜LlbHLH19基因及其表达的蛋白和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种长筒石蒜LlbHLH19基因及其表达的蛋白和应用。
背景技术
长筒石蒜(Lycoris longituba)为石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属(Lycoris)，是我国的特有种，主要分布在江苏安徽两省。因其漂亮的花型、丰富的花色，被广泛应用于鲜切花、盆栽及园林景观应用中，具有很高的开发潜力和利用价值。而bHLH是植物花色素苷生物合成过程中一个重要的转录因子，目前许多花卉植物调控花色素苷生物合成转录调控的bHLH基因被克隆和功能鉴定。基因调控花青苷生物合成途径在植物中非常广泛，但是鲜少有关于长筒石蒜调控花色的相关转录因子的报道，相应的表达调控机制也知之甚少，研究长筒石蒜的bHLH基因在花色调节中的功能，可以为利用基因工程改良植物的观赏性状提供有用的分子工具。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种能够改变花色的长筒石蒜基因LlbHLH19。本发明所要解决的另一技术问题在于提供该长筒石蒜基因LlbHLH19的具体应用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种长筒石蒜LlbHLH19基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述长筒石蒜LlbHLH19基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
含有所述的长筒石蒜LlbHLH19基因的载体或重组菌。
进一步地，所述载体为pCAMBIA1300-LlbHLH19或PBI121-LlbHLH19。
进一步地，所述重组菌为农杆菌GV3101或农杆菌EHA105。
一种利用长筒石蒜LlbHLH19基因得到改变花色的植物新品种方法，包括以下步骤：
1)构建所述长筒石蒜LlbHLH19基因的载体；
2)将所构建的载体转化农杆菌得到重组菌；
3)将重组菌株转染植物或植物细胞；
4)培育筛选得到改变花色的植物新品种。
进一步地，所述农杆菌为农杆菌GV3101或农杆菌EHA105。
进一步地，所述的植物为烟草。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供的一种长筒石蒜LlbHLH19基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过克隆和荧光定量确定该基因表达模式是在石蒜蕾期表达强，而在石蒜盛花期表达弱；通过亚细胞定位和转基因鉴定该基因功能，发现其表达蛋白能使异源表达的烟草花色加深，由粉红转至浅红，表明LlbHLH19可以促进长筒石蒜花色苷的积累。作为花色苷合成过程中重要转录因子bHLH家族成员的LlbHLH19基因，可以用于基因工程改良植物花色，从而改良植物的观赏性状，具有实际应用价值。
附图说明
图1为粉色长筒石蒜不同发育时期花瓣图；S1：初蕾期；S2中蕾期；S3：盛花期；
图2为粉色长筒石蒜不同发育时期LlbHLH19表达分析结果图；S1：初蕾期；S2中蕾期；S3：盛花期；
图3为LlbHLH19在烟草叶片中的亚细胞定位情况图；35s：：GFP：携带空载体pCAMB1A1300的农杆菌GV3101注射烟草下表皮细胞的表达情况图；35s：：GFP-LlbHLH19：携带质粒pCAMBIA1300-LlbHLH19的农杆菌GV3101注射烟草下表皮细胞的表达情况图；
图4为转基因株系与野生型烟草表型比较图；A：野生型；B：转基因植株；
图5为转基因株系与野生型烟草花青素含量比较图；A：野生型；B：转基因植株；
图6为转基因株系与野生型烟草LlbHLH19表达的荧光定量分析结果图；A：野生型；B：转基因。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的方法或本领域的常规方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本申请所用材料采自南京林业大学园林植物学科石蒜种质资源库，于2019年8月，选择长筒石蒜粉色系3个发育时期(S1初蕾期、S2中蕾期、S3盛花期)花朵的花瓣(图1)，装入灭菌的离心管中，并立即放入液氮中速冻，然后置于-80℃冰箱内保存。
实施例1：LlbHLH19基因的克隆及表达分析
(1)克隆LlbHLH19基因
本实例采用TIANGEN植物RNA提取试剂盒(DP432)提取植物总RNA。采用TaKaRaPrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒将所提取到的RNA反转录成cDNA，最后得到的cDNA加水稀释20倍作为模板用于实时定量PCR及后续基因的克隆。
根据长筒石蒜转录组数据库筛选得到可能参与长筒石蒜花色苷合成的LlbHLH19基因，采用软件Oligo 7设计特异性引物，引物序列为：
F：5′-CACATTCTCAAAATAAACCCTC-3′；
R：5′-GTCGTAGCAAACAAGAAGCAC-3′。
以长筒石蒜cDNA为模板，F和R为引物，在20μL反应体系中进行PCR扩增。扩增程序为：94℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。
将该获得的PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收目的片段，此过程根据全式金公司的切胶回收试剂盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)说明书进行。连接产物转化大肠杆菌Trans 1-T1感受态，将阳性克隆的重组菌交由公司进行测序。
测序结果表明，PCR扩增得到777bp的ORF，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
(2)荧光实时定量PCR分析LlbHLH19基因表达模式
根据LlbHLH19的cDNA全长序列在非保守区设计荧光定量引物如下：
F：5′-CCAGAGCTTGATCTCACCACC-3′；
R：5′-GATTCGTCGGGAAAGTCGG-3′。
以粉色长筒石蒜花瓣3个发育阶段的cDNA为模板，选取长筒石蒜eIF基因作为内参基因。根据
Figure BDA0003078767080000041
Premix Ex TaqTM说明书，将不同组分按反应体系比列配制。反应总体系10μL，包含1μL的模板，上下游引物各0.4μL，SYBR 5μL，ROX 0.2μL，剩下的用ddH2O进行补足。扩增程序为95℃3min；95℃45s，60℃30s，95℃15s，40个循环；95℃15s。结果如图2所示，LlbHLH19的表达量在石蒜蕾期最高，随着石蒜的生长表达量逐渐减少，这与长筒石蒜花瓣的褪色规律相一致，从而推测LlbHLH19可能参与长筒石蒜花色苷的合成途径。
实施例2：LlbHLH19的载体构建及功能验证
I、LlbHLH19基因表达亚细胞定位观察
(1)目的基因LlbHLH19的克隆及测序
将LlbHLH19基因ORF序列构建于pCAMBIA1300-GFP载体两个酶切位点Sal I和KpnI之间，利用CE design设计含有酶切位点的正反引物为：
F：5′-AAGCTTCTGCAGGGGCCCGGGATGGATCCGAATTCTCTCGTCTC-3′；
R：5′-CACTAGTATTTAAATGTCGACTGTGACTCTCCCAAGAGCTCCA-3′。
以长筒石蒜cDNA为模板，F和R为引物，在20μL反应体系中进行PCR扩增。扩增程序为：94℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。得到的PCR产物使用琼脂糖电泳，并进行切胶回收及克隆测序。
(2)pCAMBIA1300-GFP质粒载体的线性化
将不同组分按反应体系比例配制。反应总体系50μL，包括1300质粒载体20μL，10×QuickCut Buffer 5μL，Sal I 1μL，Kpn I 1μL，ddH2O 23μL。体系配置完成后于37℃酶切1h，酶切产物使用1.5％琼脂糖进行凝胶电泳，并对目的条带进行切胶回收。
(3)重组反应
将切胶回收后的目的片段与酶切后的pCAMBIA1300载体进行重组反应。根据插入目的基因∶载体＝2∶1的最适比例计算需要的用量。重组反应体系如下：线性化后的1300质粒载体0.03pmol，目的基因LlbHLH19 0.06pmol，5×CE II Buffer 4μL，Exnase II 2μL，ddH2O补足到20μL。37℃孵育30min后置于冰上，然后将反应液转化大肠杆菌，挑选阳性单菌落进行检测及测序。
通过以上具体方法，将测序正确的重组质粒通过冻融法转入农杆菌GV3101中，之后将含有pCAMBIA1300-LlbHLH12重组载体、pCAMBIA1300-GFP空表达载体以及P19辅助表达载体的农杆菌分别接种于50mL含有50mg/mL Kan的LB培养基中28℃、250rpm条件下培养，培养至OD＝0.6时进行离心，弃上清保留菌体，用相同体积的缓冲液(含10mmol/L MgCl2，10mmol/L MES，150μmol/L AS，现配现用)进行重悬，最后按照最佳比例混合(VP19辅助载体∶V目的基因＝5∶7)，充分震荡混匀后于28℃活化2-3h。
将重悬菌液使用一次性注射器注入烟草背面叶片，注射过程中要注意避开叶脉部分。制片选用转化2d后的侵染区内的叶片，放置于LSM710激光共聚焦显微镜下观察荧光显示位置。荧光成像参数设置：YEP激发光477nm，接收滤镜激发光503-534nm；DAPI激发光405nm，接收滤镜激发光430-550nm。
结果如图3所示，将LlbHLH19-GFP注射到本氏烟草长出的第5-8片烟草叶中，放入培养箱中培养2d后，在激光共聚焦显微镜观察显示在本氏烟草表皮细胞细胞核、细胞膜中可以检测到GFP信号(图3)，初步证明LlbHLH12蛋白主要定位于细胞核和细胞膜中。
II、转基因烟草阳性株系的鉴定及表型分析
将LlbHLH19基因的全长编码区序列通过XbaI和SmaI酶切位点克隆到含有CaMV35S启动子的pBI121载体上，连接转化步骤同构建亚细胞定位载体中使用的具体方法，将测序正确的重组质粒通过冻融法转化农杆菌EHA105，叶盘法转化早花烟草。
转基因植株经炼苗移栽成活之后，采集转基因植株的叶片，做好标记放入液氮速冻，作为相应株系的实验材料。之后将所采集的叶片提取RNA，然后进行反转录，以野生型和转基因株系的早花烟草基因组DNA为模板，使用通用引物35S-F(5′-ACGCACAATCCCACTATCCTTC-3′)和目的基因的下游反向引物，进行PCR阳性苗检测。
提取野生型和阳性苗早花烟草的花冠RNA，进行反转录，通过实时定量检测目的基因LlbHLH19在转基因早花烟草中的异源表达情况。利用HPLC高效液相色谱法对转基因烟草株系及野生型进行总花色苷含量的提取和检测，以矢车菊素-3-0-葡萄糖苷标准品质量浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得到浓度与峰面积对应的线性方程：y＝0.022x-1278.3，R2＝0.9988。
为了验证LlbHLH19基因的功能，通过农杆菌转化法将该基因转入烟草，在所获得的阳性植株中选择转基因株系，以野生型烟草为对照，对转基因植株进行表型分析，结果如图4所示，转基因植株在蕾期花冠的颜色明显变红，并且从蕾期到盛开期花色均呈现红色，而野生型烟草蕾期花冠呈青绿色，盛开期为粉红色，花青素含量测定结果也表明转基因植株花冠中的花青素苷含量显著高于对照(图5)。
以野生型烟草植株作对照，通过荧光定量验证LlbHLH19在转基因植株中的表达。对转基因株系进行LlbHLH19表达分析，发现转基因株系对比野生型均的相对表达水平更高(图6)。以上结果表明LlbHLH19显著促进了烟草花中花青素的积累。
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 一种长筒石蒜LlbHLH19基因及其表达的蛋白和应用
<130> 100
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 777
<212> DNA
<213> Lycoris longituba
<400> 1
atggatccga attctctcgt ctctcagact ccgatacccg agatctggca gttccccttg 60
gtcggcgttc ccctgagcct caagatcaac ggccgagatt cctccgtcgc cgaatcgacg 120
gtcaccgatc acagtggcag ctcccgcggt cgccggcggc ggagggactc ggcgccgccg 180
tcagaggacg agtcgtcgaa gatcatgtcc actagcagcg gcaatgacgc gacggatagt 240
gaagccaaac gtctaaaggg aatgaaatct agagacggga atgaaaatag taagtcaaaa 300
acggaggcag aagcaagttc tggattatgt aacaagctag cagatcaaag taaccagcca 360
tcagaagctc caaagcaaga ttacatccat gtgagagcaa gaaggggtca ggcaaccgac 420
agccatagtc ttgccgagag agctaggaga gagaagataa gtgagcggat gaatattctt 480
caagatctgg tacctggatg taacaaggta attggaaaag catcagttct tgatgagatt 540
atcaattaca tccaagcact gcagcgtcag gttgagtttc tatcaatgaa gcttgaagcc 600
gtcaattccc aaatgaatcc tggaattgaa ggctttcctc caaaagattt tggagcacag 660
gcatatgaaa ctcccagttt ggcgttcagc tcgcaagccc caagggaata tgctcaagga 720
tcggcgacag attggctgca tatgcaggtt ggtggagctc ttgggagagt cacataa 777
<210> 2
<211> 258
<212> PRT
<213> Lycoris longituba
<400> 2
Met Asp Pro Asn Ser Leu Val Ser Gln Thr Pro Ile Pro Glu Ile Trp
1 5 10 15
Gln Phe Pro Leu Val Gly Val Pro Leu Ser Leu Lys Ile Asn Gly Arg
20 25 30
Asp Ser Ser Val Ala Glu Ser Thr Val Thr Asp His Ser Gly Ser Ser
35 40 45
Arg Gly Arg Arg Arg Arg Arg Asp Ser Ala Pro Pro Ser Glu Asp Glu
50 55 60
Ser Ser Lys Ile Met Ser Thr Ser Ser Gly Asn Asp Ala Thr Asp Ser
65 70 75 80
Glu Ala Lys Arg Leu Lys Gly Met Lys Ser Arg Asp Gly Asn Glu Asn
85 90 95
Ser Lys Ser Lys Thr Glu Ala Glu Ala Ser Ser Gly Leu Cys Asn Lys
100 105 110
Leu Ala Asp Gln Ser Asn Gln Pro Ser Glu Ala Pro Lys Gln Asp Tyr
115 120 125
Ile His Val Arg Ala Arg Arg Gly Gln Ala Thr Asp Ser His Ser Leu
130 135 140
Ala Glu Arg Ala Arg Arg Glu Lys Ile Ser Glu Arg Met Asn Ile Leu
145 150 155 160
Gln Asp Leu Val Pro Gly Cys Asn Lys Val Ile Gly Lys Ala Ser Val
165 170 175
Leu Asp Glu Ile Ile Asn Tyr Ile Gln Ala Leu Gln Arg Gln Val Glu
180 185 190
Phe Leu Ser Met Lys Leu Glu Ala Val Asn Ser Gln Met Asn Pro Gly
195 200 205
Ile Glu Gly Phe Pro Pro Lys Asp Phe Gly Ala Gln Ala Tyr Glu Thr
210 215 220
Pro Ser Leu Ala Phe Ser Ser Gln Ala Pro Arg Glu Tyr Ala Gln Gly
225 230 235 240
Ser Ala Thr Asp Trp Leu His Met Gln Val Gly Gly Ala Leu Gly Arg
245 250 255
Val Thr

Claims (8)

1.一种长筒石蒜LlbHLH19基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述长筒石蒜LlbHLH19基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含有权利要求1所述的长筒石蒜LlbHLH19基因的载体或重组菌。
4.根据权利要求3所述的含有长筒石蒜LlbHLH19基因的载体，其特征在于：所述载体为pCAMBIA1300-LlbHLH19或PBI121-LlbHLH19。
5.根据权利要求3所述的含有长筒石蒜LlbHLH19基因的重组菌，其特征在于：所述重组菌为农杆菌GV3101或农杆菌EHA105。
6.一种利用长筒石蒜LlbHLH19基因得到改变花色的植物新品种方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建所述长筒石蒜LlbHLH19基因的载体；
2)将所构建的载体转化农杆菌得到重组菌；
3)将重组菌株转染植物或植物细胞；
4)培育筛选得到改变花色的植物新品种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为农杆菌GV3101或农杆菌EHA105。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述的植物为烟草。
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