CN111499712B

CN111499712B - 烟草NtDREB-1BL2转录因子及其应用

Info

Publication number: CN111499712B
Application number: CN202010499447.3A
Authority: CN
Inventors: 王燃; 王宇博; 魏攀; 董臣; 金立锋; 李锋; 冯明星; 徐韶妍; 谢小东; 张剑锋
Original assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Current assignee: Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date: 2020-06-04
Filing date: 2020-06-04
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2040-06-04
Also published as: CN111499712A

Abstract

本申请属于烟草基因组解析技术领域，具体涉及烟草NtDREB类转录因子及其应用专利申请事宜。烟草NtDREB类转录因子，包括NtDREB‑1BL1、NtDREB‑1BL2、NtDREB‑1BL3三个，相应CDS碱基序列如SEQ ID No.1~3所示。对于现有其他作物中DREB类转录因子功能研究认为，这类转录因子与植物抗逆性紧密关联。而本申请中，发明人通过对烟草中三个NtDREB转录因子功能研究，发现烟草中NtDREB类基因与烟草中色素类物质含量紧密相关，通过调节NtPSY基因表达来实现烟叶中色素类物质含量的同步调整，基于此结果，可为烟草遗传定向改良和烟叶品质提升奠定良好的理论基础和技术基础。

Description

烟草NtDREB-1BL2转录因子及其应用

技术领域

本申请属于烟草基因组解析技术领域，具体涉及烟草NtDREB类转录因子及其应用专利申请事宜。

背景技术

类胡萝卜素是植物体内一类重要的萜类物质，是一类重要的香味前体物，其含量不仅与植物的品质、抗逆、产量及外观等诸多性状紧密相关，其通过降解、转化还可以形成一系列的致香物质。也因此，在烟叶中，烟叶香气质和香气量与萜类化合物的含量密切相关，例如类胡萝卜素、二萜等香气前体物的积累能够提高烟叶香气量，改善烟叶香气品质，同时也决定了烤后烟叶的外观品质。因此，通过基因工程手段提高烟叶中类胡萝卜素等萜类物质的含量、或者对烟叶中类胡萝卜素合成性状进行定向遗传改良，是从根源上提高烟叶香味前体物总量和改善烟叶品质的有效措施。

在对现有类胡萝卜素含量影响基因研究中，利用烟草脆裂病毒诱导基因沉默（VIGS）技术，通过沉默相应的目的基因，已经发现部分基因对于类胡萝卜素含量具有明显影响（烟草类胡萝卜素异构酶基因及其应用，申请号201410405272.X；烟草ε-番茄红素环化酶基因及其应用，申请号201410405714.0）。但在利用VIGS对相关功能基因进行研究时，该技术存在一些不足之处：（1）VIGS引起目标基因的沉默特征不具有遗传性，以致该技术并不能彻底揭示基因的功能；（2）如何获得目标基因的系统性整体沉默仍然是VIGS技术目前需要解决的问题；（3）沉默持续的时间问题；（4）不同的接种方式会产生不同的沉默效率，因此病毒载体如何有效地接种入植物体内，并产生较强的沉默效果，是VIGS技术开发的关键步骤。

利用过表达（OE）和RNAi技术也是研究目标基因功能的常用研究方法，专利申请《烟草番茄红素β环化酶基因及其应用》（申请号201410405713.6）中，即利用该方法对Ntβ- LCY基因在表达量变化情况下对烟草植株生长发育情况及色素含量影响情况进行了研究。但利用过表达（OE）和RNAi技术时，存在的技术缺陷主要在于：基因性质和作用机制无法充分解释，例如，上述通过OE和RNAi对基因表达量调节，并不能充分解释和证明β环化酶基因是类胡萝卜素合成通路上的基因这一基本性质，尚需结合其他实验和分析才能进一步解释番茄红素β环化酶对于类胡萝卜素含量的调节机制。

已有研究表明，八氢番茄红素合成酶基因（PSY）是类胡萝卜素合成通路上游的第一个关键基因，该基因表达量变化能够调控植物体的类胡萝卜素含量、光合效率和抗逆能力。PSY基因在植物体内受到精细的调控，而各类因素的调控要着落在具体的遗传学机制上，即转录和转录后调控，因此通过利用不同的转基因技术（VIGS、OE、RNAi等）寻找能够调控PSY的转录因子或者互作蛋白并解析其调控机制，是揭示植物胡萝卜素含量遗传调控新机制的重要方式和途径。

发明内容

通过对烟草中DREB类转录因子的初步研究和分析，本申请目的在于提供系列对烟草中类胡萝卜素含量具有调节作用的DREB类转录因子，从而为烟叶品质的改善奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

烟草NtDREB类转录因子，包括NtDREB-1BL1、NtDREB-1BL2、NtDREB-1BL3三个，三个基因相应CDS碱基序列如SEQ ID No.1~3所示，具体如下：

NtDREB-1BL1基因CDS序列，有660bp，具体为（SEQ ID No.1）：

ATGGATATCTTTAGAAGCTATTATTCGGACCCACTTGCTGAATATTCATCAATTTCTGACAGTAGTAGCAGCTCCTGTAATAGAGCTAACCATTCTGATGAGGAAGTGATGTTAGCTTCGAATAACCCCAAGAAGCGAGCAGGGAGAAAGAAGTTTAGAGAAACTCGACACCCAGTATACAGGGGAGTGAGGAAGAGGAATTCAGACAAGTGGGTTTGTGAACTCAGAGAACCAAACAAGAAATCAAGAATATGGCTGGGCACTTTCCCTTCTGCAGAAATGGCGGCTAGAGCTCATGACGTGGCGGCTATTGCATTAAGGGGCCGTTCTGCTTGCTTGAACTTTGCTGACTCTGCTTGGAAGTTGCCTATTCCAGCTTCAACCGACGCCAAGGATATTCAGAAAGCGGCGGCGGAGGCCGCGGAGGCATTCCGGTCATCGGAGGCCGAAAACATGCCGGAATACTCAGGAGAAGATACGAAGGAAGTGAACAGTACTCCTGAAAATATGTTTTATATGGATGAGGAGGCGCTATTCTTCATGCCTGGATTACTAGTGAATATGGCAGAAGGACTAATGTTACCTCCACCTCAGTGTTCACAAATTGGAGATCATATGGAAGCTGATGTTGACATGCCTTTGTGGAGTTATTCTATCTAA。

NtDREB-1BL2基因CDS序列，有657bp，具体为（SEQ ID No.2）：

ATGGATATCTTTCGTAGCTTTTACTCGGACCCACTTGCTGATTCTTCATCACTTTCTGATAGTAGCAGCTCCTGTAATAGAGCTAACCTTTCTGATGAAGAAGTTATGTTAGCTTCAAATAACCCCAAGAAGCGGGCAGGGAGGAAGAAGTTTCGAGAAACTCGACACCCAGTATACAGGGGAGTGAGAAAGAGGAATTCAGGCAAGTGGGTTTCTGAAGTCAGAGAACCAAACAAGAAATCAAGAATATGGCTTGGCACTTTCCCTTCTGCAGAAATGGCGGCTAGAGCGCATGACGTGGCGGCTATTGCATTAAGGGGCCGTTCTGCTTGCTTGAACTTCGCAGACTCTGCTTGGAAGTTGCCTATTCCTGCCTCAACCGACGCCAAGGATATTCAGAAAGCGGCGGCTGAGGCCGCGGAGGCATTCCGGTCATCGGAGGCCGAAAAAATGCCGGAATACACAGGAGAAGATTCAAAGGAAGTGAACACTACTCCTGAAAATATGTTTTATATGGATGAGGAGACGCTATTCTGCATGCCGGGATTACTAGCAAATATGGCTGAAGGATTAATGTTACCTCCACCTCAGTGTTCACAAATTGGAGATCATTTGGAAGCTGATGTTGACATGCCTTTGTGGAGTTATTCTATTTAA。

NtDREB-1BL3基因CDS序列，有654bp，具体为（SEQ ID No.3）：

ATGGAAATGTGTCGAAGCTATTATTCGGACCCACTTGCTGATTCTTCATCACTGTCTGATAGTAGCAGCTCCTGTAATAGAGCTATCCGTTCTAATGAAGAAGTTATGTTAGCTTCGAATAACCCCAAGAAGCGAGCAGGGAGGAAGAAGTTTCGAGAAACTCGACACCCAGTATACAGGGGAGTGAGAAAGAGGAATTCAGGCAAGTGGGTTTCTGAAGTCAGAGAACCAAACAAGAAATCAAGAATATGGCTTGGCACTTTCCCTTCTGCAGAAATGGCGGCTAGAGCGCATGACGTGGCGGCTATTGCATTAAGGGGCCGTTCTGCTTGCTTGAACTTCGCAGACTCTGCTTGGAAGTTGCCTGTTCCTGCTTCCTCCGACGCCAAGAATATTCAGAAGGCGGCTGCCGAGGCCGCCGAGGCTTTCCGGTCATCGGAGGCCGAAAACATGCCGGAATACACAGGAGAAGATTCAAAGGAAGTGAACACTACTCCTGAAAATATGTTTTATATGGATGAGGAGGCGCTATTCTGCATGCCGGGATTACTTGCGAATATGGCAGAAGGATTAATGTTACCTCCACCTCAGTGTTCCCAAATTGGAGATGATCATATGGAGGCTGATATGCCTTTGTGGAGTTATTCAATTTAA。

烟草NtDREB类转录因子所编码蛋白，NtDREB-1BL1、NtDREB-1BL2、NtDREB-1BL3三个转录因子基因所编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.4~6所示，具体如下：

NtDREB-1BL1基因编码的氨基酸序列（219个氨基酸，SEQ ID No.4）为：

MDIFRSYYSDPLAEYSSISDSSSSSCNRANHSDEEVMLASNNPKKRAGRKKFRETRHPVYRGVRKRNSDKWVCELREPNKKSRIWLGTFPSAEMAARAHDVAAIALRGRSACLNFADSAWKLPIPASTDAKDIQKAAAEAAEAFRSSEAENMPEYSGEDTKEVNSTPENMFYMDEEALFFMPGLLVNMAEGLMLPPPQCSQIGDHMEADVDMPLWSYSI。

NtDREB-1BL2基因编码的氨基酸序列（218个氨基酸，SEQ ID No.5）为：

MDIFRSFYSDPLADSSSLSDSSSSCNRANLSDEEVMLASNNPKKRAGRKKFRETRHPVYRGVRKRNSGKWVSEVREPNKKSRIWLGTFPSAEMAARAHDVAAIALRGRSACLNFADSAWKLPIPASTDAKDIQKAAAEAAEAFRSSEAEKMPEYTGEDSKEVNTTPENMFYMDEETLFCMPGLLANMAEGLMLPPPQCSQIGDHLEADVDMPLWSYSI。

NtDREB-1BL3基因编码的氨基酸序列（217个氨基酸，SEQ ID No.6）为：

MEMCRSYYSDPLADSSSLSDSSSSCNRAIRSNEEVMLASNNPKKRAGRKKFRETRHPVYRGVRKRNSGKWVSEVREPNKKSRIWLGTFPSAEMAARAHDVAAIALRGRSACLNFADSAWKLPVPASSDAKNIQKAAAEAAEAFRSSEAENMPEYTGEDSKEVNTTPENMFYMDEEALFCMPGLLANMAEGLMLPPPQCSQIGDDHMEADMPLWSYSI。

利用所述烟草NtDREB类转录因子所构建的重组表达载体，包括利用VISG技术构建的基因沉默载体pTRV2-DREBL1、pTRV2-DREBL2；采用超表达技术结合Sup1300-GFP载体构建的超表达重组载体Sup1300-DREBL1-OE、Sup1300-DREBL2-OE、Sup1300-DREBL3-OE；利用RNAi技术构建的RNAi-DREBL1、RNAi-DREBL2、RNAi-DREBL3；具体构建时，

构建基因沉默载体pTRV2-DREBL1、pTRV2-DREBL2时，扩增保守区域时，具体引物序列如下：

TRV-DREB1-F：5’-CGGGATCCGGACCCACTTGCTGAATATT-3’，

TRV-DREB1-R：5’- GCGGTACCTAACATTAGTCCTTCTGCCAT-3’；

扩增长度为586 bp；

TRV-DREB2-F：5’-CGGGATCCGACCCACTTGCTGATTCTTC-3’，

TRV-DREB2-R：5’-GCGGTACCGATCTCCAATTTGTGAACACT-3’；

扩增长度为585 bp；

构建超表达重组载体Sup1300-DREBL1-OE、Sup1300-DREBL2-OE、Sup1300-DREBL3-OE时，引物序列设计如下：

DREBL1-OE-F：5‘-GCTCTAGAATGGATATCTTTAGAAGCTATTATTC-3’，

DREBL1-OE-R：5‘-GGTACCGATAGAATAACTCCACAAAGGC-3’；

DREBL2-OE-F：5‘-GCTCTAGAATGGATATCTTTCGTAGCTTTTAC-3’，

DREBL2-OE-R：5‘-GGTACCAATAGAATAACTCCACAAAGGC-3’；

DREBL3-OE-F：5‘-GCTCTAGAATGGAAATGTGTCGAAGCTATTAT-3’，

DREBL3-OE-R：5‘-GGTACCAATTGAATAACTCCACAAAGGCA-3’；

构建RNAi载体RNAi-DREBL1、RNAi-DREBL2、RNAi-DREBL3时，设计RNAi载体引物序列如下：

DREBL1-RNAi-attB-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCTATTATTCGGACCCACTTGC-3’，

DREB2-RNAi-attB-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAGCTTTTACTCGGACCCACTTGC-3’，

DREB3-RiattB-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCGGACCCACTTGCTGATTCTTC-3’，

共用RNAi-attB-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGAACGGCCCCTTAATGCAAT-3’。

利用上述重组表达载体的植物新品种的培育方法，所述植物新品种的色素类物质含量有明显变化，所述色素类物质为叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素。

所述烟草NtDREB类转录因子在植物色素调节中应用，NtDREB类转录因子定位于烟草叶片细胞的细胞核内，通过与烟草内NtPSY基因上游启动子序列结合来实现对烟草内NtPSY基因表达量的调控，从而影响叶片内色素类物质含量变化；并且NtDREB类转录因子表达量与色素类含量呈现正相关关系，即，NtDREB类转录因子表达量高，色素类物质含量增加，NtDREB类转录因子表达量低，色素类物质含量减少；所述色素类物质为叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素。

对于现有其他作物中DREB类转录因子功能研究认为，这类转录因子与植物抗逆性紧密关联。而本申请中，发明人通过对烟草中三个NtDREB转录因子功能研究，发现烟草中NtDREB类基因与烟草中色素类物质含量紧密相关，通过调节NtPSY基因表达来实现烟叶中色素类物质含量的同步调整，基于此结果，可为烟草遗传定向改良和烟叶品质提升奠定良好的理论基础和技术基础。

附图说明

图1为不同物种中DREB蛋白同源性分析，其中右侧从上到下依次为水稻、拟南芥、土豆、番茄、林烟草、绒毛烟草、普通烟草和本氏烟草；

图2为普通烟草NtDREB基因家族系统进化分析；

图3为 NtDREB-1BL1、NtDREB-1BL2、NtDREB-1BL3及其同源基因结构图；

图4为NtDREB类基因在普通烟草K326中的相对表达量，其中A、B、C分别为NtDREB-1BL1、NtDREB-1BL2、NtDREB-1BL3在普通烟草K326中的相对表达量；其中：L是叶片，S是茎杆，R是须根，F是花；5th L指自下而上第5位叶片，10th L指自下而上第10位叶片，15th L指自下而上第15位叶片；

图5为普通烟草NtDREB蛋白亚细胞图；

图6 为TRV介导的本氏烟草中DREB基因沉默后植株表型；

图7为TRV介导的本氏烟草中DREB基因沉默效果；其中WT是未接种对照烟株，TRV是接种不带基因片段的空病毒载体对照烟株，DREB1-V是接种携带NtDREB-1BL1片段的病毒载体烟株，DREB2-V是接种携带NtDREB-1BL2片段的病毒载体烟株；

图8为TRV介导的本氏烟草DREB基因沉默植株中类胡萝卜素和叶绿素的含量；其中CK是接种不带基因片段的空病毒载体对照烟株，DREB1-vigs是接种携带NtDREB-1BL1片段的病毒载体烟株，DREB2-vigs是接种携带NtDREB-1BL2片段的病毒载体烟株；

图9为NtDREB过表达的T0代转基因苗DNA检测电泳图，其中，M：DNA Marker；1-4：NtDREB-1BL1转基因苗；5-8：NtDREB-1BL2转基因苗；9-12：NtDREB-1BL3转基因苗；

图10为NtDREB-RNAi 的T0代转基因苗DNA检测电泳图，其中，M：DNA Marker；1-4：NtDREB-1BL1转基因苗；5-8：NtDREB-1BL2转基因苗；9-11：NtDREB-1BL3转基因苗；

图11为转基因烟草部分鉴定及基因表达量检测结果；其中：A为转基因烟草中目标基因检测结果，其中，P：以载体质粒为模板扩增，L1-L3：以3个转基因株系烟草DNA为模板扩增；B为潮霉素抗性检测结果，其中，WT：以未转基因烟草DNA为模板扩增，L1-10、L2-2、L3-9：以3个转基因株系烟草DNA为模板扩增；C为过表达转基因植株中NtDREB基因的相对表达量，其中，K326：未转基因烟草，OEL3-9、OEL2-2、OEL1-10分别为NtDREB-1BL3、NtDREB-1BL2、NtDREB-1BL1转基因株系烟草；

图12为不同转基因植株中NtPSY相对表达量；其中，A为NtDREB过表达转基因植株中NtPSY相对表达量，其中，CON：未转基因烟草；OE1-10、OE2-2、OE3-12分别为NtDREB-1BL1、NtDREB-1BL2、NtDREB-1BL3转基因株系烟草；B为NtDREB RNAi转基因植株中NtPSY相对表达量，其中，K326：未转基因烟草；R1-7、R2-4、R3-2分别为NtDREB-1BL1、NtDREB-1BL2、NtDREB-1BL3转基因株系烟草；

图13为不同转基因植株中色素含量结果；其中A为NtDREB过表达色素含量图，B为NtDREB-RNAi色素含量图；

图14为CHIP-PCR实验结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。

实施例1

基于前期的酵母单杂交实验筛选结果基础上，发明人初步认为烟草中的NtDREB类转录因子与烟草PSY基因启动子关键区域有相互作用，据此推测认为烟草中的NtDREB类转录因子可以调控烟草八氢番茄红素合成酶基因（NtPSY）的表达，并进而可以影响烟叶中类胡萝卜素含量变化。为了进一步研究和确定，发明人首先对普通烟草中NtDREB类转录因子进行了克隆，并获得了三个NtDREB转录因子基因：NtDREB-1BL1、NtDREB-1BL2和NtDREB-1BL3。为此，本实施例首先就这三个NtDREB转录因子基因的克隆获得过程简介如下。

（一）提取烟草总RNA 并反转录为cDNA备用

参考Plant Total RNA Isolation Kit试剂盒（上海生物工程有限公司产品）说明书，提取烟草组织的总RNA，具体操作可参考如下：

取50 mg烟草叶片（普通烟草K326）组织，在液氮保护下，充分研磨后转入Eppendorf管中，加入600 µl Buffer Rlysis-P，震荡混匀；

65℃水浴5 min以使样品充分裂解，随后向裂解样品中加入60 µL的Buffer PCA，充分混匀后，4℃条件下12000 rpm离心5 min，取上清；

向上清液中加入等体积酚:氯仿（体积比为25:24，pH4.5），混匀后4℃、12000 rpm离心5 min，保留上清液；加入1/3体积无水乙醇，混匀并室温放置3 min后，再4℃、12000rpm离心5 min，小心倒掉上清；

用700 µL的75%乙醇（DEPC-treated ddH₂O配制）洗涤沉淀，4℃、12000 rpm离心3min，小心倒掉上清，重复此步骤一次；

室温静置10 min以尽可能使离心管中残留的乙醇彻底挥发；随后加入50µL 的DEPC-treated ddH₂O溶解沉淀，取样测定RNA浓度和质量以确定满足使用需要后，立即使用或者-70℃保存备用。

具体反转录时，以上述所提取的总RNA为模板反转录合成cDNA第一链，20µl反转录体系设计如下：

Total RNA，1 mg；5× Reaction Buffer，4µl；10 mM dNTP Mix，2µl；RiboLockRNase Inhibitor (20 U/µL)，1µl；

Oligo(dT)，1µl；RevertAid M-MuLV RT (200 U/µL)，1µl；ddH₂O，加至20µl；

将上述反转录体系混合均匀后，置于PCR仪中，按如下反应程序进行反应：42℃、1h，70℃、5min，4℃ pause；反应结束后，将反转录产物稀释10倍，利用分光光度计测定浓度后直接应用或者-20℃保存备用。

（二）设计引物并进行PCR扩增

通过同源比对，参考现有拟南芥、西红柿、土豆等植物中DREB基因序列，设计PCR扩增用引物序列如下：

DREBL1-F：5‘-ATGGATATCTTTAGAAGCTATTATTCG-3’，

DREBL1-R：5‘-TTAGATAGAATAACTCCACAAAGGCATG-3’；

DREBL2-F：5‘-ATGGATATCTTTCGTAGCTTTTAC-3’，

DREBL2-R：5‘-TTAAATAGAATAACTCCACAAAGGC-3’；

DREBL3-F：5‘-ATGGAAATGTGTCGAAGCTATTAT-3’，

DREBL3-R：5’-TTAAATTGAATAACTCCACAAAGGCA-3’；

以上述步骤（一）所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，50µl反应体系参考设计如下：

模板cDNA，2µl；

F引物，2µl；

R引物，2µl；

2× HiFi-PCR Master，25µl；

ddH₂O，19µl；

反应程序为：94℃、3 min，预变性；94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、90 s，35个循环；72℃、延伸10 min；扩增产物4℃保存备用。

对PCR扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶中电泳检测（电泳缓冲液为TAE，120 V电压下泳动约16 min，电泳时选用DL2000plus DNA maker，10× Loading buffer），然后紫外扫描仪下观察电泳条带。

对目的条带采用胶回收试剂盒（上海生物工程有限公司产品），回收PCR产物，具体操作参考说明书或者参考如下：

切取目的DNA条带于Eppendorf管中，称重后，加入3倍比例胶重的溶液Buffer B2，融胶至完全融化；

将融化后溶液转入紫色柱中进行上柱，8000g离心1min后弃废液；再加入500μL的Wash buffer，8000g离心1 min进行清洗后弃废液；

空管高速离心2 min，将吸附柱放于一新Eppendorf管中，在柱的中央加入30μL的Elution Buffer，室温静置1 min后离心1 min，进行DNA的洗脱；将洗脱出的DNA用于后续实验。

（三）与T载体连接后测序分析

将步骤（二）中所回收PCR产物与pEASY®-T1载体进行连接（连接体系5µL，其中PCR产物，4µL，pEASY^®-T1，1µL；室温反应5 min）；

进一步采用热激转化E. coli细胞，筛选确保重组质粒重组正确后，测序获得具体DREB基因序列。

具体热激转化及筛选过程，可参考如下操作：

将连接液放入解冻的100μL DH5α感受态中，冰上放30 min；随后42℃条件下热激90s，再冰上放置2 min；加入500μL LB液体培养基，37℃条件下低速振荡1h；吸取150 μL菌液涂布于含有氨苄青霉素（100 μg/mL）LB平板上，37℃恒温培养箱中倒置培养过夜；

挑取单菌落于含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB液体培养基，37℃摇床培养过夜，进行菌液PCR鉴定确保重组正确，随后提取鉴定正确的阳性克隆质粒送上海生物工程有限公司进行DNA序列测序。

测序结果表明，共获得了三个NtDREB转录因子基因：NtDREB-1BL1、NtDREB-1BL2和NtDREB-1BL3，相应基因的CDS碱基序列如SEQ ID No.1~3所示，具体如下：

NtDREB-1BL1基因CDS序列（660bp）：

NtDREB-1BL1基因编码的氨基酸序列：

NtDREB-1BL2基因CDS序列（657bp）：

NtDREB-1BL2基因编码的氨基酸序列：

NtDREB-1BL3基因CDS序列（654bp）：

NtDREB-1BL3基因编码的氨基酸序列：

（四）遗传进化及基因结构分析

基于现有烟草数据库中相关测序序列，以及现有水稻、番茄、土豆等作物基因组序列，发明人利用MEGA 7.0将本申请所获得的DREB基因与现有基因序列进行了比对分析，并采用最大似然法构建了进化树模型（Bootstrap Replication设为1000）。

遗传进化分析结果如图1、图2所示。分析可以看出：NtDREB-1BL1（Ntab0136830）与林烟草相似度为99.54%，这说明NtDREB-1BL1在进化上可能来源于林烟草；而NtDREB-1BL2（Ntab0217720）、NtDREB-1BL3（Ntab0217680）与绒毛烟草的相似度分别为99.09%、91.82%，这说明NtDREB-1BL2、NtDREB-1BL3在进化上可能来自绒毛烟草。而从图2的系统进化分析结果可以看出：NtDREB-1BL1、NtDREB-1BL2和NtDREB-1BL3基因聚在一个亚类，其中NtDREB-1BL2和NtDREB-1BL3基因又聚在一起，它们之间的序列相似度又高于NtDREB-1BL1。

对本申请所提供DREB基因结构分析结果如图3所示，可以看出：Ntab0136830（NtDREB-1BL1）、Ntab0217720（NtDREB-1BL2）、Ntab0217680（NtDREB-1BL3）三个基因均无内含子，gDNA（CDS）全长依次为660bp（编码219个氨基酸），657 bp和654 bp。进一步利用现有相关软件对基因所编码蛋白的分子量、等电点等物理特性分析结果表明：NtDREB-1BL1所编码蛋白分子量24.58 kDa，等电点5.35；NtDREBL2编码218个氨基酸，蛋白分子量24.25 kDa，等电点5.53；NtDREBL3编码217个氨基酸，蛋白分子量24.14 kDa，等电点6.00；三个基因氨基酸序列的相似度为95.73%，编码序列相似度为93.79%。

（五）基因组织表达情况

进一步地，以26S rRNA作为内标基因，采用SYBR Green染料法，利用BIO-RAD荧光定量PCR仪，发明人对DREB基因在烟草K326中的组织表达模式进行了检测分析。

荧光定量PCR时，引物设计如下：

DREBL1-Q-F：5‘-ACCGACGCCAAGGATATTCAG-3’，

DREBL1-Q-R：5‘-ACAAAGGCATGTCAACATCAGC-3’；

DREBL2-Q-F：5‘-CTGCTTGCTTGAACTTCGC-3’，

DREBL2-Q-R：5‘-TCAGCTTCCAAATGATCTCCAA-3’；

DREBL3-Q-F：5‘-CGGACCCACTTGCTGATTC-3’，

DREBL3-Q-R：5‘-ATTCTTGGCGTCGGAGGAAG-3’。

荧光定量PCR时，20µl反应体系设计如下：

模板cDNA，2µl；

SYBR Green，2µl；

上游引物（F引物），0.4μL（10μM）；

下游引物（R引物），0.4μL（10μM）；

ddH₂O补至20μL。

qPCR反应条件为：95℃、5 min；95℃、15 s，60℃、30 s，40个循环；4℃、10 min。实验中每个样品检测三次，取三个Cp值的平均值，用2-△△Cp法计算。

对普通烟草K326盛花期第5叶位、第10叶位、第15叶位、根、茎、花6个组织器官的转录水平的测定结果如图4所示。可以看出，NtDREB类转录因子表达部位均较为类似，在盛花期时，NtDREB类基因在叶中表达水平最高，且在低部叶片（或者说幼嫩）中表达量又高于高部叶片（或者说相对成熟叶片），而在花中表达量最低。

（六）亚细胞定位情况

由于基因功能发挥与其在细胞内定位具有紧密关联性，因此利用现有农杆菌侵染烟草叶片的蛋白瞬时表达系统，以NtDREB-1BL1基因（因为NtDREB-1BL1、NtDREB-1BL2和NtDREB-1BL3属于同源基因，因此定位应是一致的）为例，利用含重组质粒Sup1300-NtDREB-GFP（具体质粒重组方法参见实施例2）的农杆菌侵染本氏烟草（以注射Sup1300-GFP空载体的烟草植株作为对照，具体侵染操作参考如下：

采用播种栽培一个月左右烟草植株作为样品进行实验；将重组质粒载体用电转化法转入农杆菌（GV3101）并28℃培养2天后，转接至10mL的LB液体培养基中，170 rpm/min培养1 h，4000 rpm/min离心4 min去上清，以收集菌体；随后用含10 mmol/L MgCl₂（含120 μmol/L AS）悬浮液重悬菌体，调OD₆₀₀至0.6左右；挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1 mL注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注（共定位时，将Marker质粒转化农杆菌，和重组质粒载体农杆菌一起悬浮操作，在注射前按1:1比例混合，然后注射烟草叶片）。；将注射完成的烟草植株在弱光培养2天后即可观察；观察时，取标记的烟草叶片制成玻片，激光共聚焦显微镜下观察，并拍照。

结果如图5所示。前期利用PSORT软件预测结果表明，NtDREB蛋白可能定位于烟草细胞的细胞核内。而从图5的实际鉴定结果可以看出，NtDREB-GFP所散发的绿色荧光与叶片细胞核色素散发的红色荧光相间分布，绿色荧光聚集在细胞核中显现，表明NtDREB成熟蛋白定位于烟草叶片细胞的细胞核内，这与其发挥的调控作用是一致的。

实施例2

在实施例1基础上，为进一步确定NtDREB类转录因子功能，分别利用VIGS、OE超表达、RNAi技术，发明人构建了不同重组表达载体，以便进一步进行转化以对相关基因功能进行进一步研究和确定。本实施例就相关载体构建过程简介如下。

（一）基于病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术所构建的重组载体

载体构建前，首先通过将本申请NtDREB基因序列与现有本氏烟草中的NibenDREB基因序列的比对，找出保守功能区域，随后设计TRV-VIGS载体用引物，再后以实施例1中所构建的含有NtDREB基因序列的T质粒为模板，利用所设计的TRV引物扩增保守区域，并进一步构建获得重组载体。

需要说明的时，由于序列比对过程中，在本氏烟草基因组中并未比对到与NtDREB-1BL3基因高度同源的序列，所以仅针对NtDREB-1BL1、NtDREB-1BL2两个基因构建了重组载体。

扩增保守区域时，具体引物序列如下：

TRV-DREB1-F：5’-CGGGATCCGGACCCACTTGCTGAATATT-3’，（酶切位点BamHI）

TRV-DREB1-R：5’- GCGGTACCTAACATTAGTCCTTCTGCCAT-3’；（酶切位点KpnI）

扩增长度为586 bp；

TRV-DREB2-F：5’-CGGGATCCGACCCACTTGCTGATTCTTC-3’，（酶切位点BamHI）

TRV-DREB2-R：5’-GCGGTACCGATCTCCAATTTGTGAACACT-3’；（酶切位点KpnI）

扩增长度为585 bp；

PCR扩增完成后，胶回收携带VIGS酶切位点的NtDREB-1BL1目的片段，并利用限制性内切酶KpnI、BamHI进行双酶切；同时对pTRV2（pYL156）载体进行KpnI、BamHI双酶切；50µl酶切体系参考设计如下：

PCR回收产物（或pTRV2载体），2μg；

KpnI（10 U/μL），2.5 μL；

BamHI（10 U/μL），2.5 μL；

10× M Buffer，5 μL；

ddH₂O补充至50μL体系；

4℃酶切过夜后，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

随后，回收纯化酶切产物，并利用T4 DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，进一步筛选阳性质粒进行菌落PCR鉴定和双酶切（KpnI、BamHI）鉴定，对鉴定正确质粒进一步进行测序鉴定（北京擎科新业生物技术有限公司提供完成），确保质粒重组正确。将重组正确质粒载体命名为pTRV2-DREBL1、pTRV2-DREBL2，直接应用或者-20℃保存备用。

（二）OE过表达载体的构建

以包含35S强启动子的Sup1300-GFP载体为载体，重组进入NtDREB基因，从而可以实现NtDREB基因的超表达，具体过程简介如下。

首先，设计引物序列如下（以增加XbaⅠ和KpnⅠ酶切位点）：

DREBL1-OE-F：5‘-GCTCTAGAATGGATATCTTTAGAAGCTATTATTC-3’，

DREBL1-OE-R：5‘-GGTACCGATAGAATAACTCCACAAAGGC-3’；

DREBL2-OE-F：5‘-GCTCTAGAATGGATATCTTTCGTAGCTTTTAC-3’，

DREBL2-OE-R：5‘-GGTACCAATAGAATAACTCCACAAAGGC-3’；

DREBL3-OE-F：5‘-GCTCTAGAATGGAAATGTGTCGAAGCTATTAT-3’，

DREBL3-OE-R：5‘-GGTACCAATTGAATAACTCCACAAAGGCA-3’；

其次，以实施例1中含有NtDREB基因的T载体为模板，利用上述引物进行PCR扩增；

随后，对扩增产物进行电泳检测，并胶回收；

再后，利用XbaⅠ和KpnⅠ限制性内切酶切分别对PCR扩增产物和Sup1300-GFP载体进行双酶切，50µl酶切体系参考设计如下：

PCR回收产物（或sup1300-GFP），15μL；

XbaI（10 U/μL），2.5 μL；

KpnI（10 U/μL），2.5 μL；

Buffer Y，5 μL；

ddH₂O补充至50μL体系；

最后，对酶切产物进行会后后，利用T4 DNA进行连接并转化大肠杆菌感受态细胞，进一步筛选阳性质粒进行菌落PCR鉴定和双酶切（XbaⅠ、KpnⅠ）鉴定，对鉴定正确质粒进一步进行测序鉴定，确保质粒重组正确。将重组正确质粒载体命名为Sup1300-DREBL1-OE、Sup1300-DREBL2-OE、Sup1300-DREBL3-OE，直接应用或者-20℃保存备用。

（三）RNAi载体的构建

RNAi载体构建时，一般利用BP重组反应技术将200-300bp片段插入到pHellsgate2-RNAi沉默载体中，具体构建过程简介如下。

首先，根据相关序列比对，找到保守功能区域后，设计RNAi载体引物序列如下：

共用RNAi-attB-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGAACGGCCCCTTAATGCAAT-3’；

随后，以实施例1中含有NtDREB基因的T载体为模板，利用上述引物进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收扩增片段；

再后，将所回收的PCR扩增片段与pHellsgate2 vector进行BP重组反应，10µl反应体系设计如下：

PCR回收产物（50 ng/μL），3μL；

pHellsgate2 vector（150 ng/μL），1μL；

TE Buffer，4μL；

BP Clonase II enzyme mix，2μL；

25℃反应2h；

最后，将上述反应液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进一步利用含壮观霉素（Spectinomycin，Spe）的平板筛选阳性质粒进行菌落PCR鉴定和双酶切（XbaⅠ、XhoI）鉴定，对鉴定正确质粒进一步进行测序鉴定，确保质粒重组正确。将重组正确质粒载体命名为RNAi-DREBL1、RNAi-DREBL2、RNAi-DREBL3，直接应用或者-20℃保存备用。

实施例3

利用实施例2所构建的不同载体，进一步转化烟草植株，以对不同基因功能进行进一步分析，具体实验情况简介如下。

（一）农杆菌介导的VIGS载体侵染本氏烟草

八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是类胡萝卜素合成通路上一个关键基因，具有保护叶绿素免受光漂白的作用，其沉默后植物会出现光漂白现象，常被作为各种病毒VIGS体系的参照基因，来验证TRV载体的侵染效率。为此，参考实施例2中载体构建过程，发明人同步构建了pTRV2-PDS载体以作对照。

具体侵染转化烟草植株过程为：

分别挑取含有质粒pTRV1、pTRV2、pTRV2-DREBL1、pTRV2-DREBL2和pTRV2-PDS的菌落接种至5mL LB培养基（50 mg/L Kan，25 mg/L Rif）中，28℃振荡培养过夜；

随后，取0.2 mL培养过夜菌接种于20 mL的LB培养基中（含10 mM 2-N-吗啉基乙磺酸（MES）和20 μM乙酰丁香酮（AS））中，28℃培养过夜；

常温条件下5000 rpm离心收集菌体，然后重悬在LB（含10 mM MgCl₂+10 mM MES+200 mM乙酰丁香酮）中，调OD₆₀₀为1.0左右，再分别与pTRV1按1:1混合后，室温静置3h后进行注射实验。

具体实验时，空白对照组不注射，pTRV1+pTRV2（TRV），pTRV1+ pTRV2-PDS（TRV-PDS）分别作为阴性对照组和阳性对照组，pTRV1+pTRV2-DREBL1、pTRV1+pTRV2-DREBL2作为实验组；选取四片叶龄大小的本氏烟苗进行注射（每棵烟草注射三片叶子），将做过侵染的烟草按基因类别分别放置，黑暗处理一夜；

之后侵染烟草培养条件为：18 h光照，6 h黑暗，培养温度控制在22℃，湿度60%左右，30 d左右后观察表型变化情况，同时采集叶片样品，通过Real-time PCR检测DREB基因的沉默效果（具体操作参考实施例1）。

观察结果表明，TRV-PDS组农杆菌侵染10天后，新生烟叶开始出现光漂白现象，表明烟草的PDS基因被成功沉默，并且TRV载体通过转化农杆菌进而侵染烟草的效率接近100%。30天后表型结果如如图6所示。可以看出：

TRV-PDS农杆菌侵染一个月后的植株表型出现严重的光漂白现象，而该体系空病毒载体（TRV）接种烟草并不会引起烟株产生与对照烟株（WT）显著的生长发育区别；但与对照相比，侵染TRV-DREB的烟株则没有可视表型出现，说明DREB-1BL1、DREB-1BL2基因表达的抑制对烟草的生长发育没有产生不利影响。

进一步利用q-PCR对TRV介导的DREB基因的沉默效率的检测结果如图7所示。可以看出，注射TRV空载体植株的DREB基因表达量与WT未注射植株相比没有明显的下降，而在注射TRV-DREB植株中，DREB转录表达水平降低了，这说明TRV-VIGS系统沉默本氏烟草的DREB基因效果是显著的，可为进一步的功能研究奠定材料基础。

图8为TRV介导的本氏烟草DREB基因沉默植株中类胡萝卜素和叶绿素的含量；其中CK是接种不带基因片段的空病毒载体对照烟株，DREB1-vigs是接种携带NtDREB-1BL1片段的病毒载体烟株，DREB2-vigs是接种携带NtDREB-1BL2片段的病毒载体烟株；

更进一步地，发明人对不同烟草中叶绿素、类胡萝卜素含量情况进行了测定，具体测定方法参考如下：

取50 mg烟叶样品，加入装有1.5 mL预冷的80%丙酮（现配现用）的离心管中，4℃避光震荡至完全脱色；然后4℃、9000 rpm离心2 min，抽取上清液；用酶标仪分别测量A₆₆₃、A₆₄₇、A₄₇₀波长处的吸光值；叶绿素、类胡萝卜素含量计算公式如下：

叶绿素a=12.25×A₆₆₃- 2.79×A₆₄₇；

叶绿素b=21.50×A₆₄₇- 5.10×A₆₆₃；

总叶绿素=7.15×A₆₆₃+ 18.71×A₆₄₇；

类胡萝卜素=（1000×A₄₇₀- 1.82×叶绿素a - 85.02×叶绿素b）/198。

测定结果如图8所示。可以看出：在本氏烟草中，病毒诱导基因沉默后可导致代谢产物类胡萝卜素及叶绿素含量显著降低，NtDREB-1BL1和NtDREB-1BL2基因沉默的烟株中类胡萝卜素及叶绿素含量都下降得比较多，表明转基因植株中NtDREB的表达量变化影响类胡萝卜素及色素含量。

（二）农杆菌介导的过表达和RNAi载体转化

过表达和RNAi转化烟草植株时，具体过程为：首先将DREBL1-RNAi、RNAi-DREBL2、RNAi-DREBL3和Sup1300-DREBL1-OE、Sup1300-DREBL2-OE、Sup1300-DREBL3-OE质粒分别转化GV3101农杆菌中，具体而言：

在2μL质粒中加入100 μL GV3101农杆菌感受态细胞，冰上放置30 min后，液氮速冻1 min，再37℃温浴5 min；随后加入200 μL的LB液体培养基，28℃、180 rpm震荡培养3 h后，4000 rpm离心30 s，弃上清，涂板筛选。

转化农杆菌后，以烟草叶片（种子播种后生长一个月左右）作为转基因受体材料，利用携带目标基因载体的农杆菌侵染受体材料，以将T-DNA插入到基因组中，经过对应抗性的抗生素筛选后，获得独立的抗性愈伤组织，进一步分化再生获得转基因株系，也即实验流程为：烟草无菌苗培养→农杆菌侵染→筛选→分化→生根→检测获得T0代转基因阳性苗，

具体操作参考现有技术即可，不再赘述。仅就筛选、鉴定中部分事项介绍说明如下。

超表达转基因株系具有潮霉素植抗性，因此基于PCR鉴定时，设计潮霉素抗性基因引物序列如下：

Hyg-F：5’-GTGCTTTCAGCTTCGATG-3’，

Hyg-R： 5’-AACCAAGCTCTGATAGAG-3’。

另一方面，由于超表达载体中引入有GFP标签蛋白，因此基于PCR检测鉴定时，利用前述DREBL-OE-F（DREBL1-OE-F、DREBL2-OE-F、DREBL3-OE-F）和GFP-R（5’-ACGAACTCCAGCAGGACCATGTGAT-3’）进行验证。

RNAi转基因苗具有卡那霉素植物抗性，基于PCR检测鉴定时，设计卡那霉素抗性基因引物序列如下：

hptII-F：5’-TCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAAT-3’，

hptII-R：5’-GTGGAGAGGCTATTCGGC TATGACT-3’。

还需说明的是，基于qPCR分析NtDREB过表达和RNAi植株中NtPSY基因表达变化情况时，引物序列设计如下：

PSY-Q-F：5’-TGTTGGAGAAGATGCCAGAAGAG-3’，

PSY-Q-R：5’-ATAAGCAATAGGTAAGGAAATTAGCTTC-3’。

对T0代烟草NtDREB过表达、RNAi转基因烟苗的PCR验证电泳图如图9、图10所示，其中出现亮条带的为转化阳性植株。

进一步将T0代所得阳性烟株进行自花授粉，收获种子（T0代种子），在潮霉素（过表达）或卡那霉素（RNAi）培养基上筛选抗性苗培养，得到获得T1代转基因苗，一部分用于抗逆实验，一部分继续结种子。栽培过程中，无论是过表达还是RNAi转基因烟苗，没有发现明显的发育异常现象，说明NtDREB转基因没有影响到植物正常生长发育。

对T1代转基因苗进行PCR验证，部分结果如图11所示。其中GFP基因片段与质粒对照中扩增片段大小相当（图11 A），而转基因株系中也均能扩增出特异的潮霉素抗性基因条带，但野生型烟草中则未扩增出来（图11B），表明转基因株系构建是成功的。

进一步利用qPCR技术对转基因株系中基因表达情况分析结果表明，过表达转基因植株中NtDREB基因转录表达量显著提高（图11C）。而在NtDREB过量表达转基因烟株中，NtPSY基因表达量均出现了显著提高（图12A），说明NtDREB的过量表达刺激了NtPSY基因的表达。而在NtDREB RNAi转基因烟株中（图12B），NtPSY基因表达量都有一定的下降，说明NtDREB的沉默影响了NtPSY基因的表达量。这些结果证实了NtDREB对NtPSY基因具有正向调控作用。

进一步对转基因植株中类胡萝卜素和叶绿素含量检测结果如图13所示。可以看出：NtDREB过表达的转基因烟草中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量都有增加（图13A）；而NtDREB基因沉默导致代谢产物类胡萝卜素及叶绿素含量降低，其中NtDREB1BL1-RNAi烟株（R1-7）中类胡萝卜素及叶绿素含量显著下降（图13B）。这表明在NtDREB转基因烟草中，该基因表达量的变化影响类胡萝卜素及色素的含量。

实施例4

ChIP（Chromatin immunoprecipitation）染色质免疫共沉淀技术能够检测特定转录因子与已知基因启动子区域的结合情况，在已知启动子范围内寻找特定转录因子的结合位点。而ChIP-qPCR结合了ChIP技术和实时定量PCR技术，其中ChIP技术利用了抗体特异性富集与特定转录因子/组蛋白修饰结合的DNA片段；qPCR技术则使用SYBR荧光染料，非特异性的掺入DNA双链，发射荧光，保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，最后利用Ct值进行定量分析。因此ChIP-qPCR能够专一、灵敏、快速、高重复地定量生物样品中特定转录因子/组蛋白修饰与已知基因启动子的结合。也因此，发明人进一步进行了CHIP-qPCR实验，以对NtDREB的作用机理进行初步探讨。

基于对PSY基因上游启动子区域（分成了8个区段）顺式作用元件的初步分析，发明人通过设计荧光定量PCR引物及qPCR实验进行了初步研究，实验过程包括：交联-解交联-超声打碎-免疫沉淀-洗涤-DNA纯化-PCR检测等，具体步骤简介如下：

（1）样品准备：将含重组质粒（DREBL1-OE过表达载体）的农杆菌侵染本氏烟草，以WT和注射Sup1300过表达空载体的烟草植株作为对照；两周后收集侵染的叶片，用甲醛溶液处理并真空渗透组织进行交联反应；

（2）制备染色质溶液：先将结合在DNA上的蛋白用共价形式交联在所结合的位点上，避免在之后的操作步骤中脱离丢失，再通过解交联后将染色质颗粒悬浮在含蛋白酶抑制剂的混合物中形成染色质溶液；

（3）超声打碎：使用超声水浴锅，在冰上对染色质溶液进行超声波处理，以将长链的DNA打碎成200-1000 bp的DNA片段；超声后细胞悬液变得澄清透明，离心后可取5μL超声细胞裂解液进行琼脂糖凝胶分析；

（4）蛋白免疫沉淀：稀释后，将超声产物分成两份，一份为Input DNA，另一份转移到与抗体结合的Strip well中，进行纯化；

（5）DNA纯化：将洗脱的产物用DNA纯化试剂盒纯化，得到50μL纯化产物，用于检测ChIP结果。

结果如图14所示。分析表明：第二区段相对表达量显著比其他区段高，该区段中分布的启动子有CAAT-box、O2-site和MYB，其中CAAT-box为启动子和增强子区域中常见的组成型元件，O2-site则参与玉米醇溶蛋白的代谢调节，而MYB结合位点是参与干旱诱导的重要元件，这与DREB转录因子的功能相吻合。综合而言，NtDREB类转录因子都能结合并调控PSY基因的启动子区域，可以调控烟草NtPSY基因的表达，但其中又以NtDREB-1BL1转录因子结合更为典型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 烟草NtDREB-1BL2转录因子及其应用

<130> none

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 660

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atggatatct ttagaagcta ttattcggac ccacttgctg aatattcatc aatttctgac 60

agtagtagca gctcctgtaa tagagctaac cattctgatg aggaagtgat gttagcttcg 120

aataacccca agaagcgagc agggagaaag aagtttagag aaactcgaca cccagtatac 180

aggggagtga ggaagaggaa ttcagacaag tgggtttgtg aactcagaga accaaacaag 240

aaatcaagaa tatggctggg cactttccct tctgcagaaa tggcggctag agctcatgac 300

gtggcggcta ttgcattaag gggccgttct gcttgcttga actttgctga ctctgcttgg 360

aagttgccta ttccagcttc aaccgacgcc aaggatattc agaaagcggc ggcggaggcc 420

gcggaggcat tccggtcatc ggaggccgaa aacatgccgg aatactcagg agaagatacg 480

aaggaagtga acagtactcc tgaaaatatg ttttatatgg atgaggaggc gctattcttc 540

atgcctggat tactagtgaa tatggcagaa ggactaatgt tacctccacc tcagtgttca 600

caaattggag atcatatgga agctgatgtt gacatgcctt tgtggagtta ttctatctaa 660

<210> 2

<211> 657

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

atggatatct ttcgtagctt ttactcggac ccacttgctg attcttcatc actttctgat 60

agtagcagct cctgtaatag agctaacctt tctgatgaag aagttatgtt agcttcaaat 120

aaccccaaga agcgggcagg gaggaagaag tttcgagaaa ctcgacaccc agtatacagg 180

ggagtgagaa agaggaattc aggcaagtgg gtttctgaag tcagagaacc aaacaagaaa 240

tcaagaatat ggcttggcac tttcccttct gcagaaatgg cggctagagc gcatgacgtg 300

gcggctattg cattaagggg ccgttctgct tgcttgaact tcgcagactc tgcttggaag 360

ttgcctattc ctgcctcaac cgacgccaag gatattcaga aagcggcggc tgaggccgcg 420

gaggcattcc ggtcatcgga ggccgaaaaa atgccggaat acacaggaga agattcaaag 480

gaagtgaaca ctactcctga aaatatgttt tatatggatg aggagacgct attctgcatg 540

ccgggattac tagcaaatat ggctgaagga ttaatgttac ctccacctca gtgttcacaa 600

attggagatc atttggaagc tgatgttgac atgcctttgt ggagttattc tatttaa 657

<210> 3

<211> 654

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 3

atggaaatgt gtcgaagcta ttattcggac ccacttgctg attcttcatc actgtctgat 60

agtagcagct cctgtaatag agctatccgt tctaatgaag aagttatgtt agcttcgaat 120

aaccccaaga agcgagcagg gaggaagaag tttcgagaaa ctcgacaccc agtatacagg 180

ggagtgagaa agaggaattc aggcaagtgg gtttctgaag tcagagaacc aaacaagaaa 240

tcaagaatat ggcttggcac tttcccttct gcagaaatgg cggctagagc gcatgacgtg 300

gcggctattg cattaagggg ccgttctgct tgcttgaact tcgcagactc tgcttggaag 360

ttgcctgttc ctgcttcctc cgacgccaag aatattcaga aggcggctgc cgaggccgcc 420

gaggctttcc ggtcatcgga ggccgaaaac atgccggaat acacaggaga agattcaaag 480

gaagtgaaca ctactcctga aaatatgttt tatatggatg aggaggcgct attctgcatg 540

ccgggattac ttgcgaatat ggcagaagga ttaatgttac ctccacctca gtgttcccaa 600

attggagatg atcatatgga ggctgatatg cctttgtgga gttattcaat ttaa 654

<210> 4

<211> 219

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 4

Met Asp Ile Phe Arg Ser Tyr Tyr Ser Asp Pro Leu Ala Glu Tyr Ser

1 5 10 15

Ser Ile Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Cys Asn Arg Ala Asn His Ser

20 25 30

Asp Glu Glu Val Met Leu Ala Ser Asn Asn Pro Lys Lys Arg Ala Gly

35 40 45

Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Val Tyr Arg Gly Val Arg

50 55 60

Lys Arg Asn Ser Asp Lys Trp Val Cys Glu Leu Arg Glu Pro Asn Lys

65 70 75 80

Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro Ser Ala Glu Met Ala Ala

85 90 95

Arg Ala His Asp Val Ala Ala Ile Ala Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys

100 105 110

Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Lys Leu Pro Ile Pro Ala Ser Thr

115 120 125

Asp Ala Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Glu Ala Phe

130 135 140

Arg Ser Ser Glu Ala Glu Asn Met Pro Glu Tyr Ser Gly Glu Asp Thr

145 150 155 160

Lys Glu Val Asn Ser Thr Pro Glu Asn Met Phe Tyr Met Asp Glu Glu

165 170 175

Ala Leu Phe Phe Met Pro Gly Leu Leu Val Asn Met Ala Glu Gly Leu

180 185 190

Met Leu Pro Pro Pro Gln Cys Ser Gln Ile Gly Asp His Met Glu Ala

195 200 205

Asp Val Asp Met Pro Leu Trp Ser Tyr Ser Ile

210 215

<210> 5

<211> 218

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 5

Met Asp Ile Phe Arg Ser Phe Tyr Ser Asp Pro Leu Ala Asp Ser Ser

1 5 10 15

Ser Leu Ser Asp Ser Ser Ser Ser Cys Asn Arg Ala Asn Leu Ser Asp

20 25 30

Glu Glu Val Met Leu Ala Ser Asn Asn Pro Lys Lys Arg Ala Gly Arg

35 40 45

Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Val Tyr Arg Gly Val Arg Lys

50 55 60

Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Ser Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys Lys

65 70 75 80

Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro Ser Ala Glu Met Ala Ala Arg

85 90 95

Ala His Asp Val Ala Ala Ile Ala Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu

100 105 110

Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Lys Leu Pro Ile Pro Ala Ser Thr Asp

115 120 125

Ala Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Glu Ala Phe Arg

130 135 140

Ser Ser Glu Ala Glu Lys Met Pro Glu Tyr Thr Gly Glu Asp Ser Lys

145 150 155 160

Glu Val Asn Thr Thr Pro Glu Asn Met Phe Tyr Met Asp Glu Glu Thr

165 170 175

Leu Phe Cys Met Pro Gly Leu Leu Ala Asn Met Ala Glu Gly Leu Met

180 185 190

Leu Pro Pro Pro Gln Cys Ser Gln Ile Gly Asp His Leu Glu Ala Asp

195 200 205

Val Asp Met Pro Leu Trp Ser Tyr Ser Ile

210 215

<210> 6

<211> 217

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 6

Met Glu Met Cys Arg Ser Tyr Tyr Ser Asp Pro Leu Ala Asp Ser Ser

1 5 10 15

Ser Leu Ser Asp Ser Ser Ser Ser Cys Asn Arg Ala Ile Arg Ser Asn

20 25 30

Glu Glu Val Met Leu Ala Ser Asn Asn Pro Lys Lys Arg Ala Gly Arg

35 40 45

Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Val Tyr Arg Gly Val Arg Lys

50 55 60

Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Ser Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys Lys

65 70 75 80

Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro Ser Ala Glu Met Ala Ala Arg

85 90 95

Ala His Asp Val Ala Ala Ile Ala Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu

100 105 110

Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Lys Leu Pro Val Pro Ala Ser Ser Asp

115 120 125

Ala Lys Asn Ile Gln Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Glu Ala Phe Arg

130 135 140

Ser Ser Glu Ala Glu Asn Met Pro Glu Tyr Thr Gly Glu Asp Ser Lys

145 150 155 160

Glu Val Asn Thr Thr Pro Glu Asn Met Phe Tyr Met Asp Glu Glu Ala

165 170 175

Leu Phe Cys Met Pro Gly Leu Leu Ala Asn Met Ala Glu Gly Leu Met

180 185 190

Leu Pro Pro Pro Gln Cys Ser Gln Ile Gly Asp Asp His Met Glu Ala

195 200 205

Asp Met Pro Leu Trp Ser Tyr Ser Ile

210 215

Claims

1.烟草NtDREB-1BL2转录因子在烟草色素调节中的应用，其特征在于，该转录因子定位于烟草叶片细胞的细胞核内，通过与烟草内NtPSY基因上游启动子序列结合来实现对烟草内NtPSY基因表达量的调控，从而影响叶片内色素类物质含量变化；并且所述烟草NtDREB-1BL2转录因子表达量与色素类物质含量呈现正相关关系；

所述色素类物质为叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素；

所述烟草NtDREB-1BL2转录因子的CDS碱基序列如SEQ ID No.2所示。

2.利用烟草NtDREB-1BL2转录因子的烟草新品种的培育方法，其特征在于，通过构建重组载体，并转化烟草后，筛选获得色素类物质含量明显变化的烟草新品种；

所述烟草NtDREB-1BL2转录因子表达量与色素类物质含量呈现正相关关系；

所述烟草NtDREB-1BL2转录因子的CDS碱基序列如SEQ ID No.2所示；

所述重组载体包括：利用VIGS技术构建的基因沉默载体pTRV2-DREBL2；采用超表达技术结合Sup1300-GFP载体构建的超表达重组载体Sup1300-DREBL2-OE；利用RNAi技术构建的RNAi-DREBL2；具体构建时，

构建基因沉默载体pTRV2-DREBL2，扩增保守区域时，具体引物序列如下：

TRV-DREB2-F：5’-CGGGATCCGACCCACTTGCTGATTCTTC-3’，

TRV-DREB2-R：5’-GCGGTACCGATCTCCAATTTGTGAACACT-3’；

构建超表达重组载体Sup1300-DREBL2-OE时，引物序列设计如下：

DREBL2-OE-F：5‘-GCTCTAGAATGGATATCTTTCGTAGCTTTTAC-3’，

DREBL2-OE-R：5‘-GGTACCAATAGAATAACTCCACAAAGGC-3’；

构建RNAi载体RNAi-DREBL2时，设计RNAi载体引物序列如下：

DREB2-RNAi-attB-F：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAGCTTTTACTCGGACCCACTTGC-3’，

共用RNAi-attB-R：

5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGAACGGCCCCTTAATGCAAT-3’。