CN102373224A - 一种水稻生长素运输蛋白基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻生长素运输蛋白基因及其应用。其目的是提供水稻的一种生长素运输蛋白基因及其编码蛋白以及利用此基因提高植物抗旱性能的方法。本发明所提供的水稻的一种生长素运输蛋白基因，其核苷酸序列是序列表中序列1中的DNA序列；其所编码的氨基酸序列是序列表中序列2氨基酸残基序列。实验证明，将上述基因在水稻中过量表达，能够促进水稻侧根及不定根的发育，在干旱胁迫下能够提高水稻的抗旱性能。本发明可在利用分子育种提高水稻抗旱、抗非生物逆境方面有重要应用。

Description

一种水稻生长素运输蛋白基因及其应用

技术领域

本发明涉及水稻中一个编码生长素运输蛋白的基因，该基因通过调控水稻体内生长素运输来调节水稻生长发育及抗旱，属于基因工程技术领域。

背景技术

植物生长素作为一种重要的植物激素，对于调节植物的各种生长发育过程和环境应答具有十分重要的意义。细胞内生长素的相对含量与植物细胞生长发育的命运直接相关，而极性运输是维持生长素浓度梯度的主要因素。植物体内生长素的运输是一个需要能量的主动运输过程，它的极性运输机制比较复杂，在植物体的不同部位其运输方式也不同，在胚芽鞘和茎尖生长素是向下运输，在根部是向根尖运输，然后倒转向上回运，形成“倒伞”的结构。植物生长素的极性运输是由于生长素的输入和输出载体在细胞的顶部和基部不均等分配造成的，极性运输所需的能量是由跨膜质子电位提供的。

从拟南芥、烟草、油菜、番茄等植物中分离到的生长素输出载体蛋白都有相似的结构：两个分别含有几个跨膜域的高度疏水区，中间由一个亲水区连接。这些蛋白都与细菌中的转运体有一定的同源性。它们编码基因的突变缺失造成的表型都可以用生长素转运抑制剂处理来模拟。近年来有关拟南芥、烟草、玉米等植物的生长素运输蛋白基因的功能研究及生长素极性运输的调控有很多报道，从不同角度和不同层次说明了生长素运输蛋白在植物生长发育过程中的重要作用。如Scarpella等(2006)发现生长素的极性运输影响叶脉的发育；Petráek等(2006)的研究表明，拟南芥中参与生长素极性运输的基因AtPIN1、AtPIN4和AtPIN7在早期胚胎中有规律地表达；Geldner等(2004)发现拟南芥的GNOM蛋白可以通过促进PIN1的循环来调节生长素的运输；Xu等(2005)发现水稻生长素输出载体OsPIN1基因突变后，植株不定根发育延迟、植株分蘖增多。Chen等(2011)报道在水稻中过表达OsPIN2能使分蘖增多、叶角度增大、植株变矮。目前在水稻中有关生长素运输蛋白基因OsPIN3t的功能研究及其提高水稻耐旱功能的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻生长素运输蛋白基因，该基因通过调节生长素运输，影响水稻的生长发育，过表达该基因能促使水稻根系发育，增加水稻须根和侧根的数目，进而提高水稻的耐旱功能。

实现本发明采取的技术方案如下：本发明利用本申请人前期在构建水稻突变体库相关研究时，获得了一个与T-DNA插入共分离的水稻突变体，本申请人使用inverse-PCR获得了该突变体T-DNA插入位点的旁侧序列，进而利用RT-PCR技术克隆出了水稻生长素运输蛋白基因OsPIN3t相应的编码序列。将此基因在水稻中进行过量表达，发现在正常生长条件下及干旱迫条件下，水稻根系发达，大大提高了转基因水稻植株的抗旱能力；而该基因突变以后，此基因在水稻中表达下调，则会引起植株侧根和不定根减少且变短，降低了水稻的耐旱能力。本发明为通过基因工程手段进行分子育种提高水稻抗旱性能，进而提高农作物产量提供了可能。

本发明给出的水稻生长素运输蛋白基因的核苷酸序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。该基因的获得、制备过程以及应用实验由下面的实施例给出。

本发明取得的有益效果是：本发明通过对转基因水稻植株生长素运输能力的检测表明，OsPIN3t编码一生长素运输蛋白，能够完成生长素的输出功能，利用GFP亚细胞定位表明该蛋白被定位在细胞膜上，与生物信息学对该基因的预测一致。将此基因在水稻中过量表达发现转基因水稻植株根系发达，不定根和侧根增多且变长；抗旱能力增强。在利用基因工程手段提高农作物抗旱性能，进而提高作物产量方面具有潜在的利用价值。

附图说明

图1：野生型、突变体和过表达转基因水稻植株生长素运输的比较。其中A为在黑暗处生长的野生型、突变体和过表达转基因水稻植株(1为野生型；2，3，4为三个独立的RNAi干涉株系；5，6，7为三个独立的OsPIN3t过表达株系；8为T-DNA插入的突变体)；B为在黑暗处生长的水稻胚芽鞘对生长素运输能力的比较，标准差表示±SE(n＝5)(1为野生型；2为RNA干涉OsPIN3t基因的转基因植株；3为过表达OsPIN3t基因的转基因植株)，说明在水稻中超表达OsPIN3t基因能够提高生长素自上向下的运输水平；C为DR5::GUS在野生型植株及T-DNA插入突变体背景下的表达情况(YS4为DR5::GUS在野生型水稻根的表达情况；YS4-142和YS2-142为DR5::GUS在T-DNA插入突变体背景下的表达情况，说明突变体中生长素运输能力降低。

图2：OsPIN3t的亚细胞定位研究。1为OsPIN3t_Pro::GFP在转基因水稻根细胞中GFP荧光的分布，表明GFP荧光主要分布于细胞膜和细胞核内。2为OsPIN3t-GFP融合蛋白在转基因水稻植株根细胞中的分布，该融合蛋白主要分布于细胞膜上。3为OsPIN3t_Pro::GFP在烟草叶片的表皮细胞瞬时表达的结果，GFP荧光主要分布于细胞膜和细胞核内，与1的结果一致。4为OsPIN3t-GFP融合蛋白的荧光在烟草叶片的表皮细胞瞬时表达的结果，该融合蛋白的荧光主要定位在细胞膜上，与2的结果一致。

图3：野生型、过表达植株和干涉植株在20％PEG胁迫条件下的生长情况(图3.1)及相关基因的转录本检测(图3.2)。图3.1中A为水稻幼苗在含20％PEG的MS培养基上生长情况(1为野生型植株；2为RNA干涉OsPIN3t基因的水稻植株；3为过表达OsPIN3t植株)；B、C和D为幼苗在MS基本培养基上的生长情况。图3.2中A为幼苗在20％PEG胁迫6天后植株生长情况(1为过表达OsPIN3t水稻植株；2为野生型植株；3为RNA干涉OsPIN3t基因的植株)；B为20％PEG胁迫6天后各株系的成活率(WT为野生型；OE8和OE12为过表达OsPIN3t基因的独立转化株系；R3和R9为RNA干涉OsPIN3t基因的独立转化株系)；C为20％PEG处理10天的幼苗2小时的OsPIN3t基因和OsDREB2A基因的转录本半定量检测(1为野生型；2，3为RNAi干涉OsPIN3t基因的植株；4为过表达OsPIN3t基因的植株)。结果表明，在水稻中过表达OsPIN3t基因能够增强植株对20％PEG模拟的干旱胁迫的耐受能力；而且在过表达植株中，水稻耐干旱胁迫的OsDREB2A基因的表达也增强。

图4：OsPIN3t在水稻生长发育过程中的表达情况。转OsPIN3t_Pro::GUS的转基因水稻植株的GUS染色结果表明OsPIN3t主要在水稻生长发育比较旺盛的部位及维管组织细胞中表达，这些均符合生长素运输蛋白的表达特性。

图5：OsPIN3t过表达株系、野生型及突变体植株株型及根系的比较。1为野生型；2为过表达OsPIN3t植株；3为RNA干涉OsPIN3t基因的植株。说明在正常生理条件下，过表达植株OsPIN3t基因的植株，根系非常发达，为进一步提高水稻的耐旱、抗逆功能提供了基础。

图6：转基因水稻植株的分子生物学检测。图A为转基因水稻植株的半定量RT-PCR检测，R2，R5，R8，R10，R11为RNA干涉OsPIN3t基因的转基因水稻植株中OsPIN3t基因的转录水平；OE3，OE8，OE9，OE11，OE12为过表达OsPIN3t基因的转基因水稻植株中OsPIN3t基因的转录水平，说明转基因干涉植株中的OsPIN3t基因转录本有明显下降，而过表达植株株OsPIN3t基因转录本大大增加。图B为定量RT-PCR检测(1为野生型，2，3，4为干涉植株；5，6，7为过表达植株)，结果与半定量结果一致。

具体实施方式

1、基因的获得

此生长素运输蛋白是本申请人在进行T-DNA插入水稻突变体库构建与研究时，获得的一个T-DNA插入的水稻突变体，T-DNA插入位点的旁侧序列表明，该基因编码一个水稻中推测的生长素运输蛋白，蛋白Accession No为gi|75109754，其基因序列号为AK063976。为了获得该基因，申请人提取了野生型水稻(Oryza sativa)日本晴的RNA，利用引物5’-TCTAGAATGATATCCGGGCACGACT-3’和5’-GAGCTCTCATAGTCCAAGAAGGATGTAGT-3’进行RT-PCR扩增，反应体系如下：超纯水31ul，10×GC Buffer II 5ul，dNTP Mixture 4ul，上下游引物各4ul，LA DNA Taq Polymerase 0.2ul，cDNA 2ul。PCR程序为：94℃5分钟，94℃30秒，58℃50秒，72℃120秒，第二到第四步循环25次，72℃10分钟。PCR产物进行电泳，胶回收，连接到T载体上，通过测序得到编码OsPIN3t的全长核苷酸序列(序列1)。根据NCBI数据库显示，该基因在水稻中有两种剪接方式，形成分别含有618个氨基酸和598个氨基酸的两种有功能的氨基酸肽链，经过测序研究表明，本研究通过RT-PCR获得的cDNA长度为1857bp，编码的氨基酸肽链长度为618aa，即本研究所显示的是该基因所产生的618个氨基酸剪接体蛋白所具备的功能。

2、OsPIN3t在水稻中进行生长素运输功能的实验

把构建好的过表达载体35S promoter::OsPIN3t::NOS转化中花11野生型水稻，获得OsPIN3t基因过表达的转基因植株，通过进一步筛选种植获得纯合的过表达转基因植株。用在黑暗处萌发生长5天的胚芽鞘片段进行生长素蛋白运输功能的检测。在1/2MS(pH 5.8)液体培养基内对胚芽鞘片段进行预培养2h，以释放胚芽鞘内的生长素(IAA)。然后把胚芽鞘的基部或顶端分别浸泡在含有0.35％phytogel，500nM ³H-IAA，500nM游离的IAA的1/2MS(pH 5.8)液体培养基中，用于测定生长素的向上或向下运输反应，没有浸泡在培养液中的胚芽鞘片段的一端用羊膜脂包裹好；这一反应在黑暗和室温条件下于1.5-ml Eppendorf管里进行。3h后，从没有被浸泡的胚芽鞘一端取5mm片段，并用1/2MS(pH 5.8)洗涤两次；在2ml的液体培养基中孵育18h后，用1450MicroBeta TriLux(Perkin-Elmer)检测放射性强度，并统计，结果如图1B。生长素运输蛋白运输能力检测实验参照Fasano等的方法，并对其反应参数进行适当优化。

3、OsPIN3t的亚细胞定位

利用引物5’-TCTAGAATGATATCCGGGCACGACT-3’和5’-GAGCTCTCATAGTCCAAGAAGGATGTAGT-3’扩增OsPIN3t基因，把扩增片段连接到PMD18的T载体上，测序正确后，通过KpnI和XbaI进行酶切，把酶切得到的片段连接到pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS载体上，得到pCAMBIA2300-35S-OsPIN3t-GFP-OCS载体。测序正确后用农杆菌浸染法分别将质粒转入烟草表皮细胞和水稻成熟胚愈伤组织。检测在烟草表皮细胞中瞬时表达OsPIN3t-GFP融合蛋白及在转基因水稻的根细胞中OsPIN3t-GFP融合蛋白的表达情况。通过激光共聚焦显微镜观察GFP荧光定位情况，结果发现OsPIN3t-GFP融合蛋白被定位在细胞膜上(图2)，而由OsPIN3t_pro驱动的GFP蛋白在细胞核及核膜上均有分布。(1为OsPIN3t_pro驱动的GFP蛋白在转基因水稻植株根细胞中的分布，结果显示在细胞核及核膜上均能看到绿色荧光；2为OsPIN3t-GFP融合蛋白在转基因水稻植株根细胞中的分布，结果显示绿色荧光分布于细胞膜上；3为OsPIN3t_pro驱动的GFP蛋白在烟草表皮细胞中的瞬时表达情况，结果与1一致；4为OsPIN3t-GFP融合蛋白在烟草表皮细胞中的瞬时表达情况，结果与2一致)。

4、OsPIN3t的过表达增强了转基因水稻植株的抗旱性能

把萌发三天的T2代过表达OsPIN3t转基因植株的幼苗及RNA干涉OsPIN3t基因的T2幼苗和野生型水稻幼苗，一部分转入含有20％PEG的MS培养基上进行培养，另一部分转入不含PEG的MS培养基上进行培养，7天后观察植株的生长情况(图3.1)，结果表明过表达OsPIN3t基因能够大大提高转基因植株对PEG干旱胁迫的耐受力。对生长10天的转基因水稻幼苗用20％PEG处理2小时，取其地上部分为材料，用RNArose Reagent提取RNA(步骤参考其说明书)，采用购买自Takara公司的PrimeScript^TM RT reagent Kit(Perfect Real Time)进行反转录，利用半定量RT-PCR检测OsPIN3t的表达，同时检测水稻OsDREB2A基因的表达，用水稻OsACTIN1基因表达水平做内参。结果发现OsPIN3t的过表达能促进OsDREB2A基因的表达，而且过表达植株的耐旱能力明显增强(图3.2)。

5、OsPIN3t在水稻生长发育过程中的表达

利用引物5’-AAGCTTAAAACTATATCAATGTGAAAAT-3’和5’-TCTAGACTCCTCAGCCTATCTCAAT-3’扩增OsPIN3t基因ATG上游1.8Kb的基因组片段(该片段为OsPIN3t基因的启动子)，测序正确后，构建了Promoter_OsPIN3t：：GUS表达载体，把Promoter_OsPIN3t：：GUS质粒导入农杆菌EHA105，通过转化获得转基因水稻植株，对转基因植株不同部位的GUS染色结果表明，OsPIN3t基因在茎尖和维管束等部位表达较多(图4)，说明该基因编码的蛋白可能参与了某种物质的运输。

6、OsPIN3t转基因株系的分子鉴定

semiquantitative RT-PCR：提取转基因植株的RNA并进行反转录，用得到的cDNA为模板进行半定量PCR，用水稻ACTIN1基因表达水平做内参。如图6所示，在过表达植株中OsPIN3t表达水平大大上调，而在RNAi和突变体植株中OsPIN3t表达水平被下调。

同时还对转基因植株进行了定量RT-PCR检测，用Trizol Reagent提取RNA(步骤参考其说明书)，采用购买自Takara公司的PrimeScript^TM RT reagentKit(Perfect Real Time)进行反转录，利用

Premix Ex Taq^TM(Perfect RealTime)试剂，在荧光定量PCR仪ABI PRISM 7000上进行实时定量荧光PCR检测OsPIN3t的表达，用水稻ACTIN1基因表达水平做内参。定量检测结果与半定量结果一致。实验证明，将本发明的基因在水稻中过量表达，能够促进水稻侧根及不定根的发育，在干旱胁迫下能够提高水稻的抗旱性能，可用于水稻抗旱品种的培育。

Claims (3)

1.一种水稻生长素运输蛋白基因，其特征是参与编码调控水稻体内生长素的运输，该基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列如下：

核苷酸序列：

atgatatccg ggcacgactt ctacacggtg atggcggcgg tggtgccgct gtacgtggcg atgttcctgg

cgtacgggtc ggtgcggtgg tggggcatct tcacgccgga ccagtgcccc ggcatcaacc gcttcgtcgc

catcttcgcc gtgccgctcc tgtccttccg cttcatctcc accaacgacc cgtacgccat gaacctccgc

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cgcggaccgg cgcgccgcgg ctggactggt ccatcacgct cttctccctc tccacgctgc ccaacacgct

cgtcatgggg atcccgctgc tgatcgccat gtacgggcca tactccggct cgctcatgtc cgtccagatc

gtcgtgctcc agtgcatcat ctggtacacg ctgatgctct tcctcttcga gttccgcgcc gcgcggatgc

tgatcgccga ccagtcggac acggcggcgt ccatcgtgtc cctgcacgtc gacccggacg tggtgtcgct

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tcctcggtgt cgcggcggtc gctgctggtc acaccgcggc cgtcgaacct gacgggagcg gagatctact

cgcttagctc gtcgcgggac ccaaccccgc ggggctccaa cttcaaccac gccgacttct tcgccatggt

cggcggcggg ccaccgcccc cgacgcccgc tgcggtgcgc ggctcgagct tcggcgcctc cgagctctac

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aaccaccggc aacgaccacg ggggcactca accacgatgc caaggagctc cacatgttcg tgtggagctc

gagcgcgtct cccgtctcag aagtcagcgg cctgcctgtg ttcagtggcg gcggcggcgg cggcgctctc

gacgtcggcg ccaaggaaat ccacatggtc atccccgccg acctgccgca gaacaacggc tcaggcaaag

agcacgagga gtacggcgca gtggcattgg gtggcggcgg cggcggagag aacttcagct tcggaggcgg

caagacggtg gacggcgccg aggcagtaga cgaggaggcg gccttgcctg acgggctgac gaagatgggg

tcgagctcga cggcggagct gcacccgaag gtcgtcgacg tcgacggacc gaacgccggc ggcggcgccg

cgggcgcggg gcagtaccaa atgccgccgg cgagcgtgat gacacgcctc atcctcataa tggtgtggcg

caagctcatc cgcaacccca acactttctc cagcctcctc ggcctcgcct ggtccctcgt cgccttccgg

tggcacgtct ccatgccagc aatcgtcgag aagtccatct ccattctctc ggacgcaggc ctggggatgg

ccatgtttag cctgggattg ttcatggcgc tgcagcccag catcatcgcg tgtggcaaat cagccgccgt

cgtctccatg gccgtccgct tcctcgcggg ccctgccgtc atggccgccg cgtcaatcgc catcggactc

cgcgggacgc tcctgcacgt cgccattgtt caggcggctc taccacaagg gattgtgcct tttgtttttg

caaaagaata caatgtccac ccggccatcc tgagcacagc ggtaattttt ggcatgctaa tagctcttcc

aatcacattg ctgtactaca tccttcttgg actatga 

氨基酸序列：

MISGHDFYTV MAAVVPLYVA MFLAYGSVRW WGIFTPDQCP GINRFVAIFA VPLLSFRFIS TNDPYAMNLR

FLAADTLQKL LVLAGLAAWS RLPSRTGAPR LDWSITLFSL STLPNTLVMG IPLLIAMYGP YSGSLMVQIV

VLQCIIWYTL MLFLFEFRAA RMLIADQFPD TAASIVSLHV DPDVVSLEGG HAETEAEVAA DGRLHVTVRR

SSVSRRSLLV TPRPSNLTGA EIYSLSSSRD PTPRGSNFNH ADFFAMVGGG PPPPTPAAVR GSSFGASELY

SLQSSRGPTP RQSNFDEHSA RPPKPPATTT GALNHDAKEL HMFVWSSSAS PVSEVSGLPV FSGGGGGGAL

DVGAKEIHMV IPADLPQNNG SGKEHEEYGA VALGGGGGGE NFSFGGGKTV DGAEAVDEEA ALPDGLTKMG

SSSTAELHPK VVDVDGPNAG GGAAGAGQYQ MPPASVMTRL ILIMVWRKLI RNPNTFSSLL GLAWSLVAFR

WHVSMPAIVE KSISILSDAG LGMAMFSLGL FMALQPSIIA CGKSAAVVSM AVRFLAGPAV MAAASIAIGL

RGTLLHVAIV QAALPQGIVP FVFAKEYNVH PAILSTAVIF GMLIALPITL LYYILLGL。

2.根据权利要求1所述的水稻生长素运输蛋白基因，其特征是从水稻细胞中分离得到的水稻生长素运输蛋白基因。

3.如权利要求1所述的水稻生长素运输蛋白基因的应用，其特征是用于水稻抗旱品种的培育。 

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