CN103249836A - 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了核酸和编码的VIM1-样多肽、VTC2-样多肽、ARF6-样多肽或DUF1685多肽。提供了通过调节编码VIM1-样多肽、VTC2-样多肽、ARF6-样多肽或DUF1685多肽的核酸的表达来增强植物中产量相关性状的方法。具有调节的编码VIM1-样多肽、VTC2-样多肽、ARF6-样多肽或DUF1685多肽的核酸的表达的植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。
Description
本发明一般涉及分子生物学领域，并且涉及增强植物产量相关性状的方法，所述方法通过调节在植物中编码VIM1(甲基化变体1(Variant inMethylation1))-样多肽或VTC2-样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽或DUF1685多肽或ARF6-样(生长素应答因子)多肽的表达。本发明还涉及具有调节的编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸表达的植物，所述植物相对于相应的野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供了在本发明方法中有用的构建体。
持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关提高农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特征的植物。但是，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源的遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递的受欢迎性状。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后导入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
具有特殊经济意义的性状是提高的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势(earlyvigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对提高作物产量有贡献。
种子产量是特别重要的性状，因为许多植物的种子对人与动物营养是重要的。作物如玉米、稻、小麦、卡诺拉油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用许多类型代谢物的来源。种子含有胚(新枝条和新根的起源)和胚乳(萌发期间及籽苗早期生长期间用于胚生长的营养来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。
对于许多作物的另一个重要性状是早期萌发势。改进早期萌发势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固定是重要的。在稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的枝条与萌发势相关。在实施条播(drill-seeding)的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好出幼苗是重要的。将早期萌发势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)在欧洲大西洋地区引种玉蜀黍(Zea mayes L.)杂种。
又一个重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50％(Wang等、Planta218，1-14，2003)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民而言是巨大经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。
作物产量因而可以通过优化前述因素之一而提高。
取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其它产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，种子参数的提高可能是特别希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。多种机制可以对提高种子产量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是提高的种子数目。
现在发现通过在植物中调节植物中编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸的表达来改善植物的多种产量相关性状。
背景
VIM1(甲基化变体1)-样多肽
VIM1(甲基化变体1)编码645个氨基酸的甲基胞嘧啶结合蛋白，具有PHD结构域、2个RING指结构域和参与着丝粒异染色质化的SRA结构域。该蛋白质在体外作为E3泛素连接酶发挥功能。该蛋白质已显示通过其SRA结构域结合CG、CNG和CNN基序的甲基化胞嘧啶，但偏爱前者。它在细胞分裂过程中的染色质结构建立/维持中发挥作用，定位在细胞核中。过表达VIM1/ORTH2的植物表现出根生长的抑制和开花延迟。同时过表达GFP：ORTH2和缺失ORTH2/VIM1导致减少的DNA甲基化水平。GFP：ORTH2过表达子还具有增加的FWA转录物水平。
VTC2-样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽
编码GDP-L-半乳糖磷酸化酶的VTC2是维生素C(抗坏血酸)合成中的主要控制点之一。它的表达与抗坏血酸在叶中的积累相关(Dowdle等人，Plant J.52：673-89(2007)，Bulley等人，J.Exp.Bot.60：765-78(2009))。基因的过表达增加转基因植物的叶中的抗坏血酸含量(Laing等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104：9534-9(2007))。抗坏血酸可以作为光系统II的替代电子供体(Tóth等人，Plant Physiol.149：1568-78(2009))。植物中增加的抗坏血酸含量可以保护植物抵抗光系统的光氧化破坏，尤其是在热胁迫后(Bulley等人，J.Exp.Bot.60：765-78(2009))。
ARF6-样(生长素应答因子)多肽
生长素应答因子(ARF)是特异性结合含有TGTCTC的生长素应答元件(AuxRE)的转录因子(Guilfoyle等人，1998，Cellular and MolecularLife Sciences，第54卷，第619页)，所述元件可见于主要/早期生长素应答基因的启动子，介导对植物激素生长素的应答。现有技术中已经描述了ARF受Aux/IAA蛋白的负调控。反过来，生长素促进Aux/IAA蛋白质的降解，所述蛋白质阻止ARF家族的转录因子调控应答生长素的靶基因(Weijers D.等人，2005，EMBO J.Vol.24，pages1874-1885)。在拟南芥中，有29种含有4个保守结构域的Aux/IAA蛋白(Parry和Estelle，2006，Curr Opin Cell Biol.Apr；18(2)：152-156)。结构域I负责抑制(Tiwari等人，2004，Plant Cell.Feb；16(2)：533-543.)。结构域II含有负责Aux/IAA蛋白快速降解的13个氨基酸的降解决定子基序(Worley等人，2000，PlantJ.2000Mar；21(6)：553-562.；Ramos等人，2001，Plant Cell.Oct；13(10)：2349-2360.)。结构域III和IV介导Aux/IAA蛋白之间，以及Aux/IAA和ARF之间的同二聚化和异二聚化(Kim等人，1997，Proc NatlAcad Sci.，Oct28；94(22)：11786-11791；Ulmasov等人，1997，Science.Jun20；276(5320)：1865-1868；Ulmasov等人，1997，Plant Cell.1997Nov；9(11)：1963-1971)。Aux/IAA蛋白经由通过结构域III和IV与ARF相互作用，作为转录抑制子发挥作用(Tiwari等人，2001，Plant Cell.Dec；13(12)：2809-2822；Tiwari等人，2004，Plant Cell.Feb；16(2)：533-543.)。Hughes等人在2008年已显示(Plant Biotechnol.J.，Oct；6(8)：pages758-769)：在arf2-9突变花的萼片和花瓣中靶向表达野生型ARF2重建了开花，并急剧的增加了结实籽。重建的植物同时保留了扩大的珠被和增加的种子大小，加强了之前关于arf2突变通过作用于珠被而增加种子重量的证据。
概述
1.VIM1(甲基化变体1)样多肽
令人惊讶的是，目前已经发现调节编码本文定义的VIM1-样多肽的核酸的表达使植物相比对照植物具有增强的产量相关性状，特别是增加的植物高度和增加的种子产量。
根据一个实施方案，提供了相比对照植物，用于在植物中改善本文提供的产量相关性状的方法，包括调节编码本文定义的VIM1-样多肽的核酸在植物中的表达。
在本说明书中，章节的标题和小标题仅是出于方便和参考目的，不应以任何方式影响本说明书的含义或理解。
2.VTC2-样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽
令人惊讶的是，目前已经发现调节编码本文定义的VTC2-样多肽的核酸的表达使植物相比对照植物具有增强的产量相关性状，特别是增加的种子产量。
根据一个实施方案，提供了相比对照植物，用于在植物中改善本文提供的产量相关性状的方法，包括调节编码本文定义的VTC2-样多肽的核酸在植物中的表达。
在本说明书中，章节的标题和小标题仅是出于方便和参考目的，不应以任何方式影响本说明书的含义或理解。
3.DUF1685多肽
令人惊讶的是，目前已经发现调节编码本文定义的DUF1685多肽的核酸的表达使植物相比对照植物具有增强的产量相关性状，特别是增加的产量，更特别是增加的种子产量。
根据一个实施方案，提供了相比对照植物，用于在植物中改善本文提供的产量相关性状的方法，包括调节编码本文定义的DUF1685多肽的核酸在植物中的表达。
在本说明书中，章节的标题和小标题仅是出于方便和参考目的，不应以任何方式影响本说明书的含义或理解。
4.ARF6-样(生长素应答因子)多肽
令人惊讶的是，目前已经发现调节编码本文定义的ARF6-样多肽的核酸的表达使植物相比对照植物具有增强的产量相关性状，特别是增加的产量、增加的生长速率和生物量。
根据一个实施方案，提供了相比对照植物，用于在植物中改善本文提供的产量相关性状的方法，包括调节编码本文定义的ARF6-样多肽的核酸在植物中的表达。
在本说明书中，章节的标题和小标题仅是出于方便和参考目的，不应以任何方式影响本说明书的含义或理解。
定义
下述定义将用于整个说明书。
多肽/蛋白质
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指通过肽键连接在一起的处于任意长度的氨基酸聚合形式。
多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用并且指任意长度聚合无分支形式的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者组合。
同源物
蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的所讨论蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并且与其所源自的非修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入。插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基端融合或羧基端融合小，约1-10个残基的级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的例子包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、
-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
取代指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向)的其它氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束，并且可以在1-10个氨基酸的范围内；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸取代优选地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本领域众所周知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman和Company(编著)和下表1)。
表1：保守性氨基酸取代的例子
| 残基 | 保守性取代 | 残基 | 保守性取代 |
| Ala | Ser | Leu | Ile；Val |
| Arg | Lys | Lys | Arg；Gln |
| Asn | Gln；His | Met | Leu；Ile |
| Asp | Glu | Phe | Met；Leu；Tyr |
| Gln | Asn | Ser | Thr；Gly |
| Cys | Ser | Thr | Ser；Val |
| Glu | Asp | Trp | Tyr |
| Gly | Pro | Tyr | Trp；Phe |
| His | Asn；Gln | Val | Ile；Leu |
| Ile | Leu，Val |
氨基酸取代、缺失和/或插入可以使用本领域众所周知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而容易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生取代突变的技术是本领域技术人员众所周知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Clevelaand，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的位点定向诱变或其它位点定向诱变法(参见Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989，年更新))。
衍生物
“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式的蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的取代或非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的经改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)的氨基酸残基或非天然的经改变的氨基酸残基。与衍生物所来源的氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加(例如报道分子或其它配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，和与天然存在的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”还包括天然存在形式蛋白质与标签肽(如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白)的融合体(标签肽的综述参阅Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)。
直向同源物/旁系同源物
直向同源物和旁系同源物包含用来描述基因先祖关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因；直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因，并且也来源于共同的先祖基因。
结构域，基序/共有序列/特征序列
术语“结构域”指依据进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其它位置处的氨基酸可以在同源物之间变动，然而在特定位置处的高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。结构域因通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定任意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。
术语“基序”或“共有序列”或“特征序列”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
存在用于鉴定结构域的专门数据库，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic AcidsRes30，242-244)，InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)，Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntaxfor biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation.(In)ISMB-94；Proceedings2nd International Conferenceon Intelligent Systems for Molecular Biology.Altman R.，Brutlag D.，KarpP.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAI Press，Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004)或者Pfam(Bateman等，NucleicAcids Research30(1)：276-280(2002))。用于计算机分析蛋白质序列的一组工具可获得自ExPASy蛋白组服务器(Swiss Institute of Bioinformatics(Gasteiger等，ExPASy：the proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis，Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。还可以使用常规技术(如通过序列比对)来鉴定结构域或基序。
比对序列以进行比较的方法为本领域所众所周知，这些方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP利用Needleman和Wunsch((1970)J Mol Biol48：443-453)的算法来寻找两序列间使匹配数最高并使空位数最少的全局比对(即在完整序列上)。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol215：403-10)在两序列间计算百分比序列同一性并进行相似性的统计学分析。用于进行BLAST分析的软件在国家生物技术信息中心(National Centre for Biotechnology Information(NCBI))向公众提供。可以使用例如默认配对比对参数的ClustalW多重序列比对算法(1.83版)(采用默认配对比对参数)和百分比评分法来容易地鉴定同源物。也可以使用MatGAT软件包(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003Jul10；4：29.MatGAT：an application that generates similarity/identitymatrices using protein or DNA sequence)中提供的方法之一来确定全局的相似性和同一性百分比。本领域技术人员会意识到，可以进行少量手动编辑以优化保守性基序之间的比对。此外，还可以使用特定的结构域代替使用全长序列来鉴定同源物。序列同一性值可以是采用上述程序使用默认参数在完整的核酸或氨基酸序列上或在所选择的结构域或保守的基序上测定的。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol147(1)；195-7)。
交互BLAST
通常，这包括以查询序列(例如，利用实施例章节表中所列的任一序列)针对任何序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST的首次BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次BLAST)。然后比较首次和二次BLAST的结果。如果首次BLAST中的高排名命中来自查询序列来源的相同物种，然后反向BLAST理想地导致查询序列处于最高命中之列，则鉴定出旁系同源物；如果首次BLAST中高排名命中不来自查询序列来源的相同物种，且优选地在反向BLAST时导致查询序列在最高命中之列，则鉴定出直向同源物。
高排名的命中是那些E值低的命中。E值越低，分值越具有显著性(或者换句话说，偶然发现此命中的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比评分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在大家族的情况下可以使用ClustalW，继之以邻接树来辅助相关基因的聚类可视化，和鉴定直向同源物和旁系同源物。
杂交
如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖(Sepharose)珠或任何其它树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其它二级结构。
术语“严格性”指在其中发生杂交的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成影响。通常，将低严格性条件选择为在确定的离子强度及pH时低于特定序列热解链温度(Tm)约30℃。中等严格性条件是此时温度低于Tm约20℃，高严格性条件是此时温度低于Tm约10℃。高严格性杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上有所偏差但因遗传密码子的简并性而依旧编码基本上相同的多肽。因而有时候可能需要中等严格性杂交条件来鉴定此类核酸分子。
Tm是在确定的离子强度及pH下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。从低于Tm约16℃直至32℃获得最大杂交速率。一价阳离子在杂交溶液中的存在降低了两条核酸链间的静电排斥，因而促进杂交分子形成；这种作用对于高达0.4M的钠浓度是明显的(对于更高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分比甲酰胺降低0.6至0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许在30至45℃进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说，每％碱基错配Tm下降约1℃。取决于杂交分子的类型，Tm可以使用下列等式计算：
1)DNA-DNA杂交分子(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm81.5℃+16.6xlog10[Na+]a+0.41x％[G/Cb]-500x[Lc]-1-0.61x％甲酰胺
2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交分子：
Tm＝79.8℃+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
3)oligo-DNA或oligo-RNAd杂交分子：
对于＜20个核苷酸：Tm＝2(ln)
对于20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)
a或对于其它一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内是精确的。
b仅对于％GC在30％至75％范围内是精确的。
cL＝双链体的长度(以碱基对计)。
doligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
可以使用众多已知技术的任何一种来控制非特异性结合，如例如用含蛋白质的溶液封闭薄膜、添加异源性RNA、异源性DNA及SDS至杂交缓冲液并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，一系列杂交可以通过改变以下条件之一进行：
(i)逐渐降低退火温度(例如从68℃至42℃)或
(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。
技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。
除杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度及温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格性条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。
例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的常见高严格性杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的中等严格性杂交条件的例子包括在50℃于4×SSC中或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交分子的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交分子长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)MolecularCloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，CSH，New York或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989和每年更新版本)。
剪接变体
如本文中所用的术语“剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本上保留了蛋白质的生物活性的变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能性片段而实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域众所周知的(见例如Foissac和Schiex，(2005)BMC Bioinformatics.6：25)。
等位变体
等位基因或等位变体是给定基因，位于相同染色体位置内的替代形式。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)，以及小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在的多态性株系中序列变体的最大集合。
内源基因
本文中提及的“内源”基因不仅仅指如在植物中发现的以其天然形式(即没有任何人类干预)存在的所讨论基因，还指处于分离形式随后(再)引入植物中的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)(转基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遇到转基因表达大幅降低和/或内源基因表达的大幅降低。分离的基因可从生物体分离，或可人工制造(例如通过化学合成)。
基因改组/定向进化
基因改组或定向进化由如下构成：反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有修饰的生物学活性的蛋白质之核酸或其部分的变体(Castle等，(2004)Science304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
构建体
人工DNA(例如但不限于质粒或病毒DNA)能够在宿主细胞中复制，并且用于将目的DNA序列引入宿主细胞或宿主生物。本发明的宿主细胞可以是任何选自下述的细胞：细菌细胞，例如大肠杆菌或农杆菌属物种细胞、酵母细胞、真菌、藻类或蓝细菌细胞或植物细胞。技术人员熟知为了成功转化、选择和繁殖包含目的序列的宿主细胞而必需存在于遗传构建体上的遗传元件。目的序列与如本文所述的一个或多个控制序列(至少与启动子)有效连接。其它调节元件可包括转录及翻译增强子。本领域技术人员会了解适于在实施本发明中使用的终止子和增强子序列。如在定义部分所述，也可将内含子序列添加至5′非翻译区(UTR)或编码序列上，以增加在细胞质内积累的成熟信息的量。其它控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。本领域技术人员会知道或可以容易地获得此类序列。
本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制需要的复制起点序列。一个例子是当需要将遗传构建体在细菌细胞中作为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)维持时。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸序列的转基因植物，使用标记基因(或报告基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包含可选择标记基因。可选择标记在本文“定义”部分中有更详细的描述。一旦不再需要，可以从转基因细胞中去除或切除标记基因。用于去除标记基因的技术是本领域已知的，有用的技术在上文“定义”部分中描述。
调节元件/控制序列/启动子
术语“调节元件”、“控制序列”和“启动子”均在本文中可互换使用，并且在广义上意指能够影响与之连接的序列表达的调节性核酸序列。术语“启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别及结合RNA聚合酶和其它蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸控制序列。前述术语包括从典型的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA盒，具有或没有CCAAT盒序列)中衍生的转录调节序列和应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调节元件(如，上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括典型的原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成的融合分子或衍生物。
“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不一定是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达及在本文中描述的核酸序列所转化的植物。这也适用于其它“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列的启动子上游可以由一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失而受到修饰，但不干扰启动子、开放阅读框(ORF)或3′调节区(如终止子)或远离ORF的其它3′调节区的功能性或活性。启动子的活性还有可能因修饰该启动子的序列或由更具活性的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换该启动子而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效连接至合适的启动子或包含合适的启动子，其中所述的启动子在正确时间点上并以所需要的空间表达模式表达基因。
为了鉴定功能等价启动子，可以分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式，例如通过将该启动子与报告基因有效连接并测定该报告基因在多种植物组织中的表达水平和模式。合适的公知报告基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性来测定启动子活性。接着可以将启动子强度和/或表达模式与参考启动子(如用于本发明方法中的)进行比较。备选地，可以通过定量mRNA水平或者将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18SrRNA)的mRNA水平进行比较来测定启动子强度，其中使用本领域众所周知的技术，如通过放射自显影的光密度测定分析进行的Northern印迹、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996Genome Methods6：986-994)。通常，“弱启动子”指驱动编码序列低水平表达的启动子。“低水平”指每个细胞中约1/10,000的转录物至约1/100,000的转录物至约1/500,0000的转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列高水平表达，或者每个细胞中约1/10的转录物至约1/100的转录物至约1/1000的转录物的水平。通常，“中等强度启动子”指此类启动子，其驱动编码序列以低于强启动子的水平表达，特别是在所有情况下以低于35S CaMV启动子控制时获得的水平表达。
有效连接
如本文中所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间功能性地连接，以至于启动子序列能够启动目的基因转录。
组成型启动子
“组成型启动子”指在至少一种细胞、组织或器官中在其大多数(但不一定是全部)生长和发育阶段并在大多数环境条件下有转录活性的启动子。下表2a给出了组成型启动子的例子。
表2a：组成型启动子的例子
遍在启动子
遍在启动子在生物的基本上全部组织或细胞中有活性。
发育调节性启动子
发育调节性启动子在某些发育期期间或在经历发育变化的植物部分内有活性。
诱导型启动子
诱导型启动子在应答于化学品(综述见Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动，或可以是“胁迫诱导型”，即当植物暴露于多种胁迫条件时受到激活，或是“病原体诱导型”，即当植物暴露于多种病原体时受到激活。
器官特异性/组织特异性启动子
器官特异性或组织特异性启动子是能够优先在某些器官或组织如叶、根、种子组织等内启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异性”。
根特异性启动子的例子列于下表2b中：
表2b：根特异性启动子的例子
种子特异性启动子主要在种子组织中有转录活性，但不一定仅在种子组织中有(泄漏表达的情况)。种子特异性启动子可在种子发育和/或萌发过程中有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉/胚特异性的。种子特异性启动子的实例(胚乳/糊粉/胚特异性的)在下表2c至表2f中显示。种子特异性启动子的其它实例在Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2，113-125，2004)中给出，其公开内容通过引用整体并入本文作为参考。
表2c：种子特异性启动子的例子
表2d：胚乳特异性启动子的例子
表2e：胚特异性启动子的例子：
| 基因来源 | 参考文献 |
| 稻OSH1 | Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8117-8122，1996 |
| KNOX | Postma-Haarsma等，Plant Mol.Biol.39：257-71，1999 |
| PRO0151 | WO2004/070039 |
| PRO0175 | WO2004/070039 |
| PRO005 | WO2004/070039 |
| PRO0095 | WO2004/070039 |
表2f：糊粉特异性启动子的例子：
如本文中所定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。
可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的例子在下表2g中显示。
表2g：绿色组织特异性启动的例子
组织特异性启动子的另一个例子是分生组织特异性启动子，其主要在分生性组织中具有转录活性，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。可用于实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的例子示于下列的表2h。
表2h：分生组织特异性启动子的例子
终止子
术语“终止子”包括这样的控制序列，其是在转录单元末端的DNA序列，发出对初级转录物进行3’加工并多聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以来自天然基因、来自多种其它植物基因或来自T-DNA。待添加的终止子可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或者来自另一植物基因或较不优选地来自任何其它真核基因。
选择标记(基因)/报告基因
“选择标记”、“选择标记基因”或“报告基因”包括向细胞赋予表型的任何基因，其中在所述的细胞内表达所述基因以促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体所转染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同原理鉴定核酸分子的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素抗性或除草剂抗性、引入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择标记基因的例子包括赋予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin，G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA或利用木糖的木糖异构酶或抗营养标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。视觉标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。
已知当核酸稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并选择这些整合子，通常将编码选择标记(如上文所述的那些)的基因连同目的基因一起引入宿主细胞。这些标记可以例如在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择标记的核酸分子可以引入宿主细胞中，与编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用引入的核酸稳定转染的细胞可以例如通过选择进行鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其它细胞死亡)。
因为一旦已经成功引入了核酸，则转基因宿主细胞中就不再需要或不希望有标记基因，尤其抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，因此用于引入核酸的本发明方法有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种如此方法称作共转化法。共转化法使用同时用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸而另一种载体携带标记基因。高比例的转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼有T-DNA的序列，它通常代表表达盒。标记基因随后可以通过进行杂交而从转化的植物中去掉。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与想要的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶来源植物杂交或转化体与导致转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定地转化。在一些情况下(大约10％)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细胞的基因组并丢失。在其它更多情况下，转座子跳至不同位置。在这些情况下，标记基因必须通过进行杂交而去除。在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。又一个有利的方法依赖于已知的重组系统；此方法的优势在于不必通过杂交去除。该类型的最知名系统称作Cre/lox系统。Cre1是去掉位于loxP序列之间序列的重组酶。若标记基因整合于loxP序列之间，则在已经成功发生转化时，通过重组酶表达去除标记基因。其它重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用至微生物如酵母、真菌或细菌。
转基因的/转基因/重组
为本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”就例如核酸序列而言意指包含此核酸序列的表达盒、基因构建体或载体或用本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，所有那些构建均通过重组方法产生，其中
(a)编码可用于本发明方法中的蛋白质的核酸序列，或
(b)与本发明核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或
(c)a)和b)
不处于其天然遗传环境中或已经通过重组方法修饰，修饰有可能采用例如取代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中或存在于基因组文库中的天然基因组基因座或染色体基因座。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地得到保留，至少部分地得以保留。该环境分布在核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。天然存在的表达盒——例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用多肽的对应核酸序列的天然存在的组合，如上文所定义——在这种表达盒通过非天然的合成(“人工”)方法(如例如诱变处理)修饰后，变成转基因表达盒。合适方法例如在US5,565,350或WO00/15815中描述。
为本发明目的，转基因植物因此如上理解为意指本发明方法中所用的核酸不存在于或不来源于所述植物的基因组，或存在于所述植物的基因组但是不位于所述植物基因组中该核酸的天然基因座内，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸或在本发明方法中所用核酸处于植物基因组中该核酸的天然位置内，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经受到修饰。转基因优选地理解为意指本发明核酸在基因组中的非天然基因座内表达，即发生核酸的同源表达或优选异源表达。在本文中提到了优选的转基因植物。
还应当注意到在本发明的背景中，术语“分离的核酸”或“分离的多肽”在一些情形中可以分别被考虑为“重组核酸”或“重组多肽”的同义词，并且是指不位于其天然遗传环境中的核酸或多肽，和/或已经被重组方法修饰的核酸或多肽。
调节
术语“调节”就表达或基因表达而言意指这样的过程，其中表达水平与对照植物相比因所述基因的表达而改变，表达水平可以是增加或降低。原先未受调节的表达可以是结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何类型表达，随后是翻译。出于本发明的目的，原始未调节的表达也可以是没有任何表达。术语“调节活性”应当意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何变化，这导致植物增加的产量和/或增加的生长。表达可以从零(没有或不可测的表达)增加至某一量，或可以从某一量减少至不可测的小量或零。
表达
术语“表达”或“基因表达”指转录一个或多个特定基因或特定的遗传构建体。特别地，术语“表达”或“基因表达”指将一个或多个基因或遗传构建体转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，包括或者不包括后者随后翻译成蛋白质。该过程包括转录DNA和加工所得的mRNA产物。
增加的表达/过表达
如本文中所用的术语“增加的表达”或“过表达”意指对于原有野生型表达水平是额外的任何形式表达。出于本发明的目的，原始野生型表达水平也可能是零，即没有表达或不可测量的表达。
在本领域内详细记载了用于增加基因或基因产物表达的方法并且它们包括例如，由适宜启动子驱动的过表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般是上游)内引入作为启动子或增强子元件的分离核酸，以便上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或取代而在体内改变(见Kmiec，US5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的正确方向及距离引入植物细胞，以便控制基因表达。
如果期望表达多肽，一般期望在多核苷酸编码区的3’末端包含多腺苷酸化区。多腺苷酸化区可来自该天然基因，来自多种其它植物基因，或者来自T-DNA。待被加入的3’末端序列可来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或者来自另一植物基因，或者较不优选地来自任何其它真核基因。
内含子序列也可添加至5′非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上，以增加在细胞质内积累的成熟信息的量。已经显示可剪接内含子在植物表达构建体和动物表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Gens Dev1：1183-1200)。基因表达的此类内含子增强作用一般在位于转录单元5′端附近时最强烈。使用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子是本领域已知的。对于一般信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。
降低的表达
本文中提及的“降低的表达”或者“减少或基本去除”的表达意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的降低。与对照植物相比，减少或基本去除以递增优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％、96％、97％、98％、99％或更多的降低。
为了减少或基本去除内源基因在植物中的表达，需要核酸序列的足够长度的基本上连续的核苷酸。为了开展基因沉默，这个长度可以是少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸，或者该长度可以多至整个基因(包括5’和/或3’UTR，部分或全体)。基本上连续的核苷酸片段可以来自编码目的蛋白质的核酸(靶基因)或来自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上连续的核苷酸片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸片段以递增优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所讨论用于减少或基本去除内源基因表达的多种方法所需的。
表达的这种减少或基本去除可以使用常规工具和技术完成。用于减少或基本去除内源基因表达的优选方法是通过在植物中引入和表达遗传构建体，将被间隔物(非编码DNA)分隔的核酸作为反向重复序列(部分地或完全地)克隆入此构建体中(在此情况下该核酸是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码任何目的蛋白质之一的直向同源物、旁系同源物或同源物)。
在这样的优选方法中，通过RNA介导的沉默减少或基本去除内源基因表达，其中使用核酸或其部分的反向重复序列(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物)，优选能够形成发夹结构。反向重复序列克隆在含有控制序列的表达载体中。非编码DNA核酸序列(间隔物，例如基质结合区片段(MAR)、内含子、聚合接头等等)位于形成反向重复序列的两个反向核酸之间。在反向重复序列转录后，形成带有自身互补结构(部分或完全的)的嵌合RNA。这个双链RNA结构被称为发夹RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工成siRNA，其整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。RISC进一步切割mRNA转录本，由此大量减少将被翻译成多肽的mRNA转录本的数量。对于更多一般性细节见例如，Grierson等(1998)WO98/53083；Waterhouse等(1999)WO99/53050)。
本发明方法的实施不依赖于在植物中引入和表达遗传构建体(核酸作为反向重复序列克隆至该构建体中)，也可使用数个众所周知的“基因沉默”方法中的任何一个或多个达到相同效果。
用于减少内源基因表达的一个此类方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。在此情况下，沉默由植物中的双链RNA序列(dsRNA)引发，该双链RNA序列与内源靶基因基本相似。这个dsRNA由植物进一步加工成约20至约26个核苷酸，被称为短干扰RNA(siRNA)。siRNA整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，该复合物切割内源靶基因的mRNA转录本，由此大量减少将被翻译成多肽的mRNA转录本的数量。优选地，双链RNA序列对应于靶基因。
RNA沉默方法的另一个例子包括以有义方向引入核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物)至植物内。“有义方向”指与其mRNA转录本同源的DNA序列。因此引入植物的将至少是核酸序列的一个拷贝。附加的核酸序列将减少内源基因的表达，引起通常所说的共抑制现象。因为高转录本水平和共抑制的引发之间正相关，如果数个附加拷贝的核酸序列引入植物中，基因表达的减少将更显著。
RNA沉默方法的另一个例子包括使用反义核酸序列。“反义”核酸序列包含与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补的核苷酸序列，也就是，与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA转录本序列互补。反义核酸序列优选与将被沉默的内源基因互补。互补性可位于基因的“编码区”和/或“非编码区”。术语“编码区”指含有翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。术语“非编码区”指位于编码区侧翼的5′和3′序列，其将被转录却不被翻译成氨基酸(也称为5′和3′非翻译区)。
反义核酸序列可根据Watson和Crick碱基配对的规则进行设计。反义核酸序列可以与整个核酸序列互补(在这种情况下，基本上连续的核苷酸片段可以来自目的基因，或来自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸)，也可以是寡核苷酸，其仅与核酸序列(包括mRNA5’和3’UTR)的一部分是反义的。例如，反义寡核苷酸序列可以与编码多肽的mRNA转录本的翻译起始位点周围的区域互补。适合的反义寡核苷酸序列长度在本领域是已知的，可从约50、45、40、35、30、25、20、15或10核苷酸长度或更少起始。本发明的反义核酸序列可使用化学合成以及酶连接反应通过本领域已知的方法构建。例如，反义核酸序列(例如，反义寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸(为增加分子的生物稳定性或增加反义和有义核酸序列之间形成的双螺旋的物理稳定性而设计)进行化学合成，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。本领域众所周知可用于产生反义核酸序列的修饰的核苷酸实例。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和‘帽’和一个或多个天然存在核苷酸用类似物如肌苷取代。核苷酸的其它修饰是本领域众所周知的。
可使用表达载体生物学产生反义核酸序列，其中核酸序列以反义方向亚克隆进入该表达载体(即，转录自插入核酸的RNA与目的靶核酸是反义方向的)。优选地，植物中反义核酸序列通过稳定整合的核酸构建体(包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子)产生。
本发明方法中用于沉默的核酸分子(无论引入植物或在原位产生)与mRNA转录本和/或编码多肽的基因组DNA杂交或结合，由此抑制蛋白质的表达，例如，通过抑制转录和/或翻译。杂交可以通过常规的核苷酸互补形成稳定的双螺旋，或例如，就结合至DNA双螺旋的反义核酸序列而言，通过双螺旋大沟中的特异性相互作用。反义核酸序列可通过转化或在特异组织位点直接注射引入植物中。备选地，可修饰反义核酸序列以靶向被选细胞，随后全身性施用。例如，对于全身施用，可修饰反义核酸序列，使它们与表达于被选细胞表面上的受体或抗原特异性结合，例如通过将反义核酸序列连接至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。也可使用本文所述的载体将反义核酸序列输送至细胞。
另一方面，反义核酸序列是一种a-异头物核酸序列。a-异头物核酸序列与互补的RNA形成特异性双链杂交，其中(与常见的b-单位相反)链相互之间平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res15：6625-6641)。反义核酸序列也可包含2′-o-甲基核糖核苷(Inoue等(1987)Nucl Ac Res15，6131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215，327-330)。
内源基因表达的减少或基本消除也可使用核酶实施。核酶是有核糖核酸酶活性的催化RNA分子，能切割单链的核酸序列，如mRNA，它们与切割的单链核酸序列具有互补区。因此，核酶(例如，锤头核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature334，585-591中描述)可用于催化切割编码多肽的mRNA转录本，由此实质上减少将要被翻译成多肽的mRNA转录本的数量。可以设计对核酸序列具有特异性的核酶(见例如：Cech等美国专利号4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。备选地，对应于核酸序列的mRNA转录本可用于从RNA分子库中选择具有特定核糖核酸酶活性的催化RNA(Bartel和Szostak(1993)Science261，1411-1418)。使用核酶用于植物中基因沉默是本领域已知的。(例如，Atkins等(1994)WO94/00012；Lenne等(1995)WO95/03404；Lutziger等(2000)WO00/00619；Prinsen等(1997)WO97/13865和Scott等(1997)WO97/38116)。
基因沉默也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J.20(3)：357-62)、(Amplicon VIGSWO98/36083)或Baulcombe(WO99/15682)及其它人描述的策略而实现。
如果内源基因上有突变，和/或在随后引入植物中的分离的基因/核酸上有突变，也可以发生基因沉默。降低或基本上消除可由非功能性多肽引起。例如，多肽可结合至多种相互作用的蛋白质；因此一个或多个突变和/或截断可提供一种多肽，该多肽仍能结合至相互作用的蛋白质(如受体蛋白质)，但不可显示其正常功能(如信号配体)。
基因沉默的另一种方法是通过靶向与基因调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列以形成三重螺旋结构，该结构防止基因在靶细胞中转录。见Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-361992和Maher，L.J.Bioassays14，807-15，1992。
其它方法，如使用针对内源性多肽的抗体以抑制此多肽在植物中的功能，或干扰所述多肽参与的信号途径，对于技术人员将是众所周知的。特别地，可预见人造分子可用于抑制靶多肽的生物学功能或用于干扰靶多肽参与的信号通路。
备选地，可以设立筛选程序以鉴定植物群体中基因的天然变体，该变体编码具有减少活性的多肽。此类天然变体也可用于例如实施同源重组。
人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源性miRNA是通常19-24个核苷酸长度的单链小RNA。它们的主要功能是调节基因表达和/或mRNA翻译。大多数植物微RNA(miRNA)与它们的靶序列具有完全或近乎完全的互补性。然而，有的天然靶标具有可多达五个错配。它们通过Dicer家族双链特异性核糖核酸酶从更长的非编码RNA(带有特征性折回结构)加工。加工后，通过结合到其主要组分(Argonaute蛋白质)将它们整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。由于它们与细胞质中的靶核酸(主要是mRNA)进行碱基配对，MiRNA用作RISC的特异性组分。随后的调节事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。因此，miRNA过表达的影响常常反映在靶基因降低的mRNA水平中。
通常21个核苷酸长度的人工微RNA(amiRNA)可以遗传改造以特异性地负调节单个或多个目的基因的基因表达。植物微RNA靶的选择的决定因素是本领域众所周知的。用于靶识别的经验参数已经确定并且可以用来辅助设计特定的amiRNA(Schwab等，Dev.Cell8：517-527，2005)。用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab等，Plant Cell18：1121-1133，2006)。
为优化性能，用于减少内源基因在植物中表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列以转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列以转化双子叶植物。优选地，将来自任何给定植物物种的核酸序列引入同一个物种内。例如，将来自稻的核酸序列转化至稻植物。然而，并非绝对要求待引入的核酸序列起源于与该核酸序列将要引入的植物相同的植物物种。只要内源性靶基因与待引入的核酸之间存在相当大的同源性就足够了。
上文描述的是用于减少或基本去除内源基因在植物中表达的多种方法的例子。本领域技术人员会轻易地能够调整前述用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而实现在整株植物或在其部分中减少内源基因的表达。
转化
如本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括将外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚胎发生)的植物组织可以用本发明的遗传构建体转化并且可以从中再生整株植物。选择的具体组织将取决于可用于并且最适于正进行转化的具体物种的克隆性增殖系统。示例性组织靶包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、已有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。或者，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化植物。
外来基因转移至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因引入合适的祖先细胞。用于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物所述的方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微注射。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature296，72-74；NegrutiuI等(1987)Plant Mol Biol8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等(1985)Bio/Technol3，1099-1102)；对植物材料的显微注射(Crossway A等，(1986)Mol.Gen Genet202：179-185)；包被有DNA或RNA的粒子轰击法(Klein TM等，(1987)Nature327：70)、(非整合性)病毒感染法等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选地通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是在植物中(in planta)的转化法。为此目的，例如有可能使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物的分生组织。根据本发明已经证明使转化的农杆菌混悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。植物随后继续培育直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的公知方法，如在任一以下文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol Biol22(3)：491-506，1993)，Hiei等(Plant J6(2)：271-282，1994)，其公开内容在本文中引入作为参考，如同完全给出那样。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容在本文中如充分所述那样引入作为参考。所述方法通过举例方式进一步由B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)128-143及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体中，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥(拟南芥属于本发明的范围，不视为作物植物)或作物植物如，例如烟草植物，例如通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适的培养基内培育。植物通过根癌农杆菌的转化例如由
和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，Vectors for GeneTransfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中获知。
除了转化体细胞(其随后必须再生成完整植物)之外，还有可能转化植物分生组织的细胞及特别转化发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中获得种子，其中一定比例的所述植物受到转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)Mol GenGenet.208：1-9；Feldmann K(1992)。在：编者C Koncz，N-H Chua和JShell，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。替代性方法基于反复去掉花序并使莲座中心中的切除部位与转化的农杆菌孵育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994).Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法是改进的真空渗入法，如“花浸染”法。在拟南芥真空渗入法的情况下，完整植物在减压下用农杆菌混悬液处理[Bechthold，N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“花浸染”法的情况下，正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂孵育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)The Plant J.16，735-743]。在两种情况下收获了一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母体方式遗传，减少或消除了转基因经花粉流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过已在Klaus等，2004[Nature Biotechnology22(2)，225-229]中示例性加以展示的方法实现。简而言之，待转化的序列连同选择标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源的侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系内。已经对众多不同植物物种描述了质体转化并且综述可以出自Bock(2001)在基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic plastids in basicresearch and plant biotechnology).J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progress towardscommercialization of plastid transformation technology).TrendsBiotechnol.21，20-28。进一步生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式作了报道，所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等，2004，Nature Biotechnology22(2)，225-229)。
遗传修饰的植物细胞能够通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者
和Willmitzer的出版物。
通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，继之将转化的材料再生成整个植物。为选择转化的植物，通常将在转化过程中获得的植物材料置于选择性条件下，从而可将转化的植物与非转化植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长期之后，通过喷雾对其进行合适的选择。另一可能方案是使用合适的选择剂，将种子(适当时在灭菌之后)种在琼脂板上，从而仅转化的种子能够长成植物。备选地，针对转化的植物筛选选择标记(如上文所述标记)的存在。
DNA转移和再生之后，还可评价推定转化的植物，例如用Southern分析，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。备选地或额外地，可用Northern和/或Western分析监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员所众所周知的。
产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如所有细胞经转化含有表达盒)；转化和非转化组织的嫁接体(例如在植物中，转化的根状茎嫁接到非转化的接穗上)。
T-DNA激活标签化
T-DNA激活标签化(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因组区域内或基因编码区上游或下游10kb处以如此结构插入T-DNA(通常含有启动子，也可以是翻译增强子或内含子)，使得启动子指导被靶定基因的表达。通常，由靶定基因的天然启动子对所述靶定基因表达的调节作用遭到破坏并且该基因处在新引入的启动子控制下。启动子一般嵌入在T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如通过农杆菌感染，并导致在所插入T-DNA附近的基因的经修饰的表达。因靠近所引入启动子的基因的经修饰的表达，产生的转基因植物表现显性表型。
TILTING
术语“TILLING”是“基因组内定向诱导的局部损伤”的缩写，指用于产生和/或鉴定核酸的诱变技术，其中所述的核酸编码具有修饰的表达和/或活性的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以显示在强度方面或在位置方面或在时间方面经修饰的表达(例如若突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比由处于其天然形式的基因所显出活性更高的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法组合。一般在TILLING中遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和KonczC(1992)在Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，SchellJ编辑，Singapore，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville CR编辑，Arabidopsis.ColdSpring Harb或Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)在J Martinez-Zapater，J Salinas编者，Methods on Molecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的DNA制备和汇集；(c)PCR扩增目的区；(d)变性和退火以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中将异源双链体在汇集物中的存在检测为色谱图之一额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域众所周知的(McCallum等，(2000)Nat Biotechnol18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet5(2)：145-50)。
同源重组
同源重组允许选择的核酸在基因组中于确定的所选择位置内引入。同源重组是在生物科学中常规地用于低等生物如酵母或苔藓剑叶藓(Physcomitrella)的标准技术。用于在植物中开展同源重组的方法已经不仅对模式植物(Offringa等，(1990)EMBO J9(10)：3077-84)而且对作物植物例如稻(Terada等，(2002)Nat Biotech20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech15(2)：132-8)进行了描述，并且不论何种目标生物，都存在一般可用的方法(Miller等，Nature Biotechnol.25，778-785，2007)。
产量相关性状
产量相关性状是与植物产量相关的性状或特征。产量相关性状可以包含一种或多种的下列非限制性的特征列表：早期开花时间、产量、生物量、种子产量、早期萌发势、绿度指数、增加的生长速率、改善的农艺学性状，例如增加的对浸没的耐受性(导致稻中增加的产量)如改善的水利用效率(WUE)、改善的氮利用效率(NUE)等。
产量
术语“产量”通常指的是经济价值的可测量结果，通常与特定的作物、与面积并且与时间段有关。基于个体植物部分的数目、大小和/或重量，个体植物部分直接对产量作出贡献，或实际产量是作物一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的产量和评估的产量)除以种植的平方米而确定。
术语植物的“产量”和“植物产量”在本文中可互换地使用，并指的是营养体生物量如根和/或枝条生物量，指的是繁殖器官，和/或指的是繁殖体，如该植物的种子。
玉米中的花是单性的；雄花序(雄花穗)来自顶生茎，而雌花序(穗)产生自腋芽顶点。雌花序在中心轴(穗轴)表面上产生成对的小穗。每一雌性小穗包裹两朵可育的小花，一旦受精后，它们中的一朵通常将成熟为玉米核。因此玉米中产量的增加可以表现为以下一项或多项：每平方米已建立的植物数目增加、每株植物的穗数增加、行数、每行核粒数、核粒重、千粒重、穗长度/直径的增加、种子饱满率(其为饱满的小花(即，含有种子的小花)数除以小花总数并乘以100)增加，及其他。
稻植物中的花序被命名为圆锥花序。圆锥花序具有小穗，其是圆锥花序的基本单元，并且由花梗和小花组成。小花生在花梗上并且包括由两片保护性颖片：较大的颖片(外稃)和较短的颖片(内稃)所覆盖的花。因此，以稻为实例，产量增加可以表现为以下一项或多项的增加：每平方米植物数、每株植物的圆锥花序数、圆锥花序长度、每个圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(或小花)数；种子饱满率(其为饱满的小花(即，含有种子的小花)数除以小花总数并乘以100)增加，千粒重增加等。
早期开花时间
如本文所用的具有“早期开花时间”的植物是比对照植物更早开始开花的植物。因而，该术语指显示较早开始开花的植物。植物的开花时间可以通过计数播种与第一圆锥花序出现之间的日数(“至开花的时间”)进行评估。可以例如使用如WO2007/093444中所述的方法确定植物的“开花时间”。
早期萌发势
“早期萌发势”指活跃、健康、充分平衡的生长，尤其是植物生长早期阶段期间，并且可以因植物适应性增加而产生，其原因在于例如植物更好地适应其环境(即优化能源的使用和苗与根之间的分配)。具有早期萌发势的植物也显示增加的幼苗存活和更好的作物建立，这往往导致高度均匀的田块(作物整齐地生长，即大多数植物在基本上相同的时间上达到发育的各阶段)和往往更好及更高的产量。因而，早期萌发势可以通过多种因子如千粒重、萌发百分比、出苗百分比、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根及枝条生物量和众多其它因素而确定。
增加的生长速率
增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以视为意指从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如发芽的速度、早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期之一或多个阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期期间增加的生长速率可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得)。若生长速率充分地增加，可以允许再播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其它稻植物，全部均在一个常规生长时段内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许再播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其它合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每平方米的年生物量产量的增加(因任何特定植物可以生长并收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物而言在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由栽种时节(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)和T-90(植物达到其90％最大尺寸所花费的时间)，等等。
胁迫抗性
与对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下或无论植物暴露于多种胁迫，发生产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而应答暴露于胁迫。在严重胁迫的情况下，植物甚至可能完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何胁迫，其不导致植物完全停止生长，但同时不能恢复生长。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻度胁迫在本发明的意义下导致受胁迫植物的生长减少小于40％、35％、30％或25％、更优选地小于20％或15％。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，栽培的作物植物中并不经常遭遇严重胁迫。因此，由轻度胁迫引起的受损生长往往是对农业而言不受欢迎的特征。“轻度胁迫”是植物所暴露的日常生物胁迫和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或水过量、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。
“生物胁迫”一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。
“非生物胁迫”可以是因水胁迫(尤其归因于干旱)、盐胁迫或冷冻胁迫引起的渗透胁迫。非生物性胁迫也可以是氧化胁迫或寒冷胁迫。“冷冻胁迫”意指归因于冰冻温度(即，可用水冷冻并变成冰的温度)的胁迫。“寒冷胁迫”，也称作“低温胁迫”意指寒冷温度，例如，10°以下或优选地5℃以下的温度，但是在所述温度上水分子不冻结。如Wang等人(Planta(2003)218：1-14)中所报道，非生物性胁迫导致一系列不利影响植物生长及生产力的形态学、生理学、生物化学和分子变化。干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的，并且可以通过相似的机制引起生长损害及细胞损害。Rabbani等人(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间特别高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。氧化胁迫，其经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫，可以造成功能蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长抑制。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚给定地点的正常土壤条件和气候条件。伴有最佳生长条件(在非胁迫条件下培育)的植物一般以递增的优选顺序产生该植物在给定环境中至少97％、95％、92％、90％、87％、85％、83％、80％、77％或75％的平均产量。平均产量可以基于收获量和/或季节计算。本领域技术人员清楚作物的平均生产产量。
尤其，本发明的方法可以在非胁迫条件下实施。在一个实例中，本发明的方法可以在非胁迫条件如轻度干旱下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。
在另一个实施方案中，本发明的方法可以在胁迫条件下实施。
在一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如干旱下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。
在另一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如养分缺乏下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。
养分缺乏可以因缺少养分如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁和硼及其他元素所致。
在又一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如盐胁迫下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。术语“盐胁迫”不限于普通盐(NaCl)，不过可以是NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等的任意一种或多种。
在又一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如寒冷胁迫或冷冻胁迫下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。
增加/改善/增强
术语“增加”、“改善”或“增强”是可互换的并且在本申请的含义下应当指与如本文中定义的对照植物相比至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选地至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生长。
种子产量
增加的种子产量可以本身表现为以下一项或多项：
(a)种子生物量(种子总重量)的增加，这可以基于单粒种子和/或每株植物和/或每平方米；
(b)每株植物增加的花数；
(c)增加的种子数；
(d)增加的种子饱满率(其表示为饱满小花数除以小花总数之间的比率)；
(e)增加的收获指数，其表示为可收获部分(如种子)的产量除以地上的植物部分生物量的比率；和
(f)增加的千粒重(TKW)，其从计数的种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以由增加的种子尺寸和/或种子重量导致，并且也可以由胚尺寸和/或胚乳尺寸增加导致。
可认为术语“饱满小花”和“饱满种子”是同义词。
种子产量的增加也可以表现为种子尺寸和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加也可以自身表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。
绿度指数
如本文所用的“绿度指数”根据植物的数字图像计算。对于图像中属于植物目标的每一个像素，计算绿色值相对于红色值(在用于编码颜色的RGB模型中)之比。绿度指数表达为绿红比超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下、在盐胁迫生长条件下、及在养分利用度减少的生长条件下，测量开花前末次成像时的植物绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，测量干旱后首次成像时的植物绿度指数。
生物量
如本文中所用的术语“生物量”意图指植物的总重量。在生物量的定义中，在植物的一个或多个部分的生物量之间可以进行区分，所述植物的一个或多个部分可以包括下述的一种或多种：
-地上部分，例如但不限于枝条生物量、种子生物量、叶生物量等等；
-地上可收获部分，例如但不限于枝条生物量、种子生物量、叶生物量等等；
-地下部分，例如但不限于根生物量、块茎、鳞茎等等；
-地下可收获部分，例如但不限于根生物量、块茎、鳞茎等等；
-部分低于地面的可收获部分，例如但不限于甜菜根(beet)和植物的其他下胚轴面积、根状茎、匍匐茎或蔓延的根茎；
-营养体生物量例如根生物量、枝条生物量等等；
-繁殖器官，和
-繁殖体，例如种子。
标记辅助的育种
这种育种程序有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物作诱变处理而引入等位基因变异；备选地，该程序可以从非故意引起的所谓“自然”起源的等位变体集合开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是用于选择所讨论序列的优选等位变体且其导致增加的产量的步骤。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施选择。可以在温室中或田间监测生长性能。其它任选步骤包括将鉴定到有优选等位变体的植物与另一种植物杂交。这可以用来例如产生目标表型特征的组合。
探针在(遗传作图)中的用途
编码目的蛋白质的核酸用于遗传和物理作图，该基因仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。这些核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(SambrookJ，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A LaboratoryManual)可以用编码目的蛋白质的核酸序列来探测。产生的条带图谱随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸序列可以用来探测含有经限制性内切核酸酶处理的一组个体的基因组DNA的Southern印迹，其中所述的一组个体代表具有确定的遗传杂交的亲代和后代。DNA多态性的分离被标出并用来计算编码目的蛋白质的核酸在使用这个群体先前所获得的遗传图中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter4：37-41中描述了植物基因衍生的探针的产生和其在遗传作图中的用途。众多出版物描述了使用以上所提及的方法学或其改进方法对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、近等基因系和其它个体的组可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员众所周知的。
所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大型克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的改进可以允许使用更短探针进行FISH作图。
用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸序列扩增的方法可以使用所述核酸序列而实施。例子包括等位基因特异的扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。对于这些方法，使用核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。在使用基于PCR遗传作图的方法中，可能必须鉴定在对应于当前核酸序列的整个区域内作图亲代间的DNA序列差异。然而，这对于作图法而言通常不是必需的。
植物
如本文中所用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖先及后代和植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织及器官，其中每种所提及对象包含目的基因/核酸。术语“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种提及的对象包含目的基因/核酸。
特别有用于本发明方法中的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agavesisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostisstolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida))、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属物种(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasahispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapassp.)[卡诺拉油菜(canola)、油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadabafarinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabissativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、天麻苔草(Carex elata)、番木瓜(Caricapapaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceibapentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧桐属物种(Colaspp.)、黄麻属物种(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynaraspp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyrosspp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeisguineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、Eragrostistef、蔗茅属物种(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属物种(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficuscarica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属物种(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属物种(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeumspp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄属物种(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersicon esculentum)、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersiconpyriforme)、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkarazapota)、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordicaspp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotianaspp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属物种(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryzalatifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetumsp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、芹菜(Petroselinum crispum)、虉草(Phalarisarundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidiumspp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheumrhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salixsp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属物种(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、Tripsacum dactyloides、Triticosecale rimpaui、小麦属物种(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)、一粒小麦(Triticum monococcum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vacciniumspp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Violaodorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、Zizania palustris、枣属物种(Ziziphus spp.)等等。
对照植物
合适的对照植物的选择是实验设计的例行部分，并且可以包括相应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物种类或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子(或失效对照植物)是通过分离而丢失转基因的个体。此外，对照植物在与本发明植物的生长条件等同的生长条件下(即在本发明植物的附近，并与本发明植物同时)生长。如本文中所用的“对照植物”不仅指整个植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
发明详述
令人惊讶的是，目前已经发现调节编码VIM1多肽、或VTC2-样多肽、或DUF1685多肽、或ARF6-样多肽的核酸在植物中的表达使植物相比对照植物具有增强的产量相关性状。
根据第一个实施方案，本发明提供了相比对照植物，用于在植物中增强产量相关性状的方法，包括调节编码VIM1多肽、或VTC2-样多肽的核酸在植物中的表达，和任选的选择具有增强的产量相关性状的植物。根据另一个实施方案，本发明提供了相比对照植物，用于产生具有增强的产量相关性状的植物的方法，其中所述方法包括调节编码本文描述的生长相关多肽的核酸在所述植物中的表达，和任选的选择具有增强的产量相关性状的植物的步骤。
根据另一个实施方案，本发明提供了相比对照植物，用于在植物中增强产量相关性状的方法，包括调节编码本文定义的DUF1685多肽、或ARF6-样多肽的核酸在植物中的表达，和任选的选择具有增强的产量相关性状的植物。在另一个实施方案中，本发明提供了相比对照植物，用于生产具有增强的产量相关性状的植物的方法，其中所述方法包括调节编码本文定义的DUF1685多肽、或ARF6-样多肽的核酸在所述植物中的表达，和任选的选择具有增强的产量相关性状的植物的步骤。
用于调节、优选增加编码VIM1多肽、或VTC2-样多肽、或DUF1685多肽、或ARF6-样多肽的核酸表达的优选方法，是通过在植物中导入和表达编码VIM1多肽、或VTC2-样多肽、或DUF1685多肽、或ARF6-样多肽的核酸。
对于VIM1-样多肽，下文中任何关于“可用于本发明方法中的蛋白质”的指代都意味着本文定义的VIM1-样多肽。下文中任何关于“可用于本发明方法中的核酸”的指代都意味着能够编码这类VIM1-样多肽的核酸。待导入到植物中的核酸(并且因此可用于实施本发明的方法)是编码目前将描述的蛋白质类型的任何核酸，在下文中也被称为“VIM1-样核酸”或“VIM1-样基因”。
术语“VIM1-样”或“VIM1-样多肽”在本文中也意味着包括在“VIM1-样多肽”下定义的同源物。
本文定义的“VIM1-样多肽”指任何这样的多肽，所述多肽包含Interpro登录号IPR019787，对应于PFAM登录号SM00249(植物同源异形域(PHD)结构域)；Interpro登录号IPR018957，对应于PFAM登录号PF00097(really interesting new gene(RING)结构域)和Interpro登录号IPR003105，对应于PFAM登录号PF02182(Set Ring Associated(SRA)结构域)。
在优选的实施方案中，VIM1-样多肽包含一个或多个下列基序：
(i)基序1：RQWGAH[LF]PHVAGIAGQS[TA][YHV]GAQSVALSGGY[IED]DD EDHGEWFLYTGSGGRDL(SEQ ID NO：53)，
(ii)基序2：F[DE][KN][ML]N[EA]ALR[LV]SC[LK]KGYPVRVVRSHKEKRS[AS]YAPE[TES]GV(SEQ ID NO：54)，
(iii)基序3：A[YF]TTERAK[KR][AT]GKANA[CSA]SG[KQ]IFVT[VI][AP]PDHFGPI[PL]AENDP[ET]RN[MQ]GVLVG[ED][IST]W(SEQ ID NO：55)。
基序1至3是使用MEME算法推算的(Bailey和Elkan，Proceedingsof the Second International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology，第28-36页，AAAI Press，Menlo Park，California，1994)。在MEME基序内的每个位置上，显示的残基是在序列查询组中以高于0.2的频率出现的残基。方括号内的残基表示替代物。
更优选的，VIM1-样多肽按递增的优先度包含至少2个，或所有3个基序。
额外的或可选的，VIM1-样蛋白的同源物按递增的优先度与SEQ IDNO：2表示的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％整体序列同一性，只要所述同源蛋白包含任何一个或多个上述所述的保守基序。使用全局比对算法，确定整体序列同一性，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优先使用默认参数，且优选使用成熟蛋白质序列(即，不考虑分泌信号或转运肽)。相比整体序列同一性，当仅考虑保守结构域或基序时，序列同一性一般更高。优选的，VIM1-样多肽中的基序按递增的优先度与SEQ IDNO：53至SEQ ID NO：55(基序1至3)表示的任何一个或多个基序具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
换言之，在另一个实施方案中，提供了这样的方法，其中所述VIM1-样多肽包含与SEQ ID NO：2的氨基酸坐标265至415、135至173、508至564和/或10至57的保守结构域具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
对于VTC2-样多肽，下文中任何关于“可用于本发明方法中的蛋白质”的指代都意味着本文定义的VTC2-样多肽。下文中任何关于“可用于本发明方法中的核酸”的指代都意味着能够编码这类VTC2-样多肽的核酸。待导入到植物中的核酸(并且因此可用于实施本发明的方法)是编码目前将描述的蛋白质类型的任何核酸，在下文中也被称为“VTC2-样核酸”或“VTC2-样基因”。
本文中定义的“VTC2-样多肽”指任何具有GDP-L-半乳糖磷酸化酶活性的多肽(酶分类EC2.7.7.，Laing等人(2007))。酶催化下列反应：
GDP-L-半乳糖+磷酸
α-L-半乳糖1-磷酸+GDP
优选的，VTC2-样还包含HMMPanther PTHR20884：SF3和/或PTHR20884结构域。额外的或可选的，VTC2-样还包含一个或多个下列基序：
基序4(SEQ ID NO：168)：WEDR[MFV][QA]RGLFRYDVTACETKVIPG[KE][LY]GF[IV]AQLNEGRHLKKRPTEFRVD[KRQ]V
基序5(SEQ ID NO：169)：[DE][CR]LPQ[QR]ID[HPR][EKD]S[FL]LLA[VL][HYQ]MAAEA[GA][NS]PYFR[LV]GYNSLGAFATINHLHFQAYYL
基序6(SEQ ID NO：170)：D[CS]G[KR][QR][IV]F[VL][LMF]PQCYAEKQALGEVS[PQ][DE][VL]L[DE]TQVNPAVWEISGH[MI]VLKR[KR][ETK]D[FY]。
在优选的实施方案中，VTC2-样还包含一个或多个下列基序：
基序7(SEQ ID NO：171)：WEDR[FVM][QA]RGLFRYDVTACETKVIPG[KE][YLH]GF[IV]AQLNEGRHLKKRPTEFRVD[RK]V
基序8(SEQ ID NO：172)：[DE][CR]LPQ[QR]ID[HPR][KE]S[FL]LLA[VL][HY]MAAEA[AG][NS]PYFRLGYNSLGAFATINHLHFQAYYL
基序9(SEQ ID NO：173)：QCYAEKQALGEVS[QP]ELLDTQVNPAVWEISGH[MI]VLKR[KR][KTE]D[FY][ED][EG]ASE[EDA][SN]AWR。
在更优选的实施方案中，VTC2-样优选包含一个或多个下列基序：
基序10(SEQ ID NO：174)：D[RC]LPQ[QR][IV]D[PQ]ESFLLA[LM][YHQ][MV]A[AR]EA[AR][SN]P[YF]FR[LV]GYNSLG[AG]FATINHLHFQAYYL
基序11(SEQ ID NO：175)：W[ED]DR[KVM][AT]RGLF[RH][YH]D[VI][TS][AS]CETKV[IL]PG[EN][LH][GN]FVA[QT]L[NI]EGR[HD][LQ]KKRPTEF[RG][VM][DN][RQ]V
基序12(SEQ ID NO：176)：PQCYAEKQALG[EK][VA]SQ[DE][LF]LD[TM][QR][VI]NPAVWE[IL]SGH[IL]VLKRR[TK]D[FY][ED]EASE[AT][ST][AI][WC]
基序13(SEQ ID NO：177)：WEDR[FM]QRGLFRYDVTACETKVIPG[KE]YGF[IV]AQLNEGRHLKKRPTEFRVDKV
基序14(SEQ ID NO：178)：CLPQRID[HR][EDK]S[FL]LLA[VL][HY]MAAEA[GA][NS]PYFRLGYNSLGAFATINHLHFQAYYLA
基序15(SEQ ID NO：179)：QCYAEKQALGEVS[PAQS]E[VL]L[ED]TQVNPAVWEISGH[MI]VLKRK[EK]DYE[EG]ASE[DE]NAWR。
术语“VTC2-样”或“VTC2-样多肽”在本文中使用时也意味着包括在“VTC2-样多肽”下定义的同源物。
基序4至15是使用MEME算法推算的(Bailey和Elkan，Proceedingsof the Second International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology，第28-36页，AAAI Press，Menlo Park，California，1994)。在MEME基序内的每个位置上，显示的残基是在序列查询组中以高于0.2的频率出现的残基。方括号内的残基表示替代物。
更优选的，VTC2-样多肽按递增的优先度包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或所有12个基序。
额外的或可选的，VTC2-样蛋白的同源物按递增的优先度与SEQ IDNO：61表示的氨基酸序列具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％整体序列同一性，只要所述同源蛋白包含任何一个或多个上述所述的保守基序。使用全局比对算法，确定整体序列同一性，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优先使用默认参数，且优选使用成熟蛋白质序列(即，不考虑分泌信号或转运肽)。相比整体序列同一性，当仅考虑保守结构域或基序时，序列同一性一般更高。优选的，VTC2-样多肽中的基序按递增的优先度与SEQ ID NO：168至SEQ ID NO：179(基序4至15)表示的任何一个或多个基序具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
换言之，在另一个实施方案中，提供了这样的方法，其中所述VTC2-样多肽包含这样的保守结构域(或基序)，所述保守结构域与跨SEQ ID NO：61的第2至442位氨基酸或SEQ ID NO：63的第5至426位氨基酸的保守PTHR20884：SF3或PTHR20884结构域具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性(参见图6)。
对于DUF1685多肽，下文中任何关于“可用于本发明方法中的蛋白质”的指代都意味着本文定义的DUF1685多肽。下文中任何关于“可用于本发明方法中的核酸”的指代都意味着能够编码这类DUF1685多肽的核酸。待导入到植物中的核酸(并且因此可用于实施本发明的方法)是编码目前将描述的蛋白质类型的任何核酸，在下文中也被称为“DUF1685核酸”或“DUF1685基因”。
本文中定义的“DUF1685多肽”指任何属于HOMO00944基因家族的多肽(使用PLAZA确定的：用于研究植物中的基因和基因组进化的比较基因组学资源，参见The Plant Cell21：3718-3731)。该家族包括若干亚家族，包括下列亚家族：ORTHO008516；ORTHO003703；ORTHO011913；ORTHO016869；ORTHO017066；和ORTHO020539。在优选的实施方案中，本文定义的DUF1685多肽属于ORTHO008516亚家族。
在另一个实施方案中，本文提供的DUF1685多肽包含与SEQ ID NO：188的氨基酸坐标46至144位表示的DUF1685结构域具有至少50％氨基酸序列同一性的保守结构域。例如，本文提供的DUF1685多肽包含与SEQID NO：188的氨基酸坐标46至144位的保守结构域(DUF1685结构域)具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的保守结构域。换句话说，本文提供的DUF1685多肽包含与SEQ ID NO：256表示的DUF1685结构域具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的保守结构域。
术语“DUF1685”或“DUF1685多肽”在本文中使用时也意味着包括在“DUF1685多肽”下定义的同源物。
额外的或可选的，DUF1685多肽的同源物按递增的优先度与SEQ IDNO：188表示的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％整体序列同一性，只要所述同源蛋白包含上述保守的DUF1685基序。使用全局比对算法，确定整体序列同一性，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选使用默认参数，且优选使用成熟蛋白质序列(即，不考虑分泌信号或转运肽)。相比整体序列同一性，当仅考虑保守结构域或基序时，序列同一性一般更高。优选的，DUF1685多肽中的保守结构域按递增的优先度与SEQ ID NO：256表示的结构域具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在优选的实施方案中，所述DUF1685多肽包含由DLTDEDLHELKGCIELGFGF(SEQ ID NO：258)表示的基序16，和/或由LTNTLPALDLYFAV(SEQ ID NO：259)表示的基序17。
对于ARF6-样多肽，下文中任何关于“可用于本发明方法中的蛋白质”的指代都意味着本文定义的ARF6-样多肽。下文中任何关于“可用于本发明方法中的核酸”的指代都意味着能够编码这类ARF6-样多肽的核酸。待导入到植物中的核酸(并且因此可用于实施本发明的方法)是编码目前将描述的蛋白质类型的任何核酸，在下文中也被称为“ARF6-样核酸”或“ARF6-样基因”。
本文中定义的“ARF6-样多肽”指任何包含B3DNA结合结构域、Q-rich结构域、生长素-应答结构域III和Aux/IAA家族结构域IV的ARF样多肽。
在优选的实施方案中，B3DNA结合结构域对应于Pfam PF02362。在另一优选的实施方案中，生长素-应答结构域III对应于Pfam PF06507。在另一优选的实施方案中，Aux/IAA家族结构域对应于PF02309。
在特别优选的实施方案中，ARF6-样多肽包含一个或两个下列定义章节中定义的基序或其同源物：
基序18：VYFPQGHSEQVAAST(SEQ ID NO：304)或其同源物。
基序19：ATFVKVYK(SEQ ID NO：305)或其同源物。
基序20：FCKTLTASDTSTHGGFSVPRRAAEKVFPPLDFTQQPPAQELMAKDLHGNEWKFRHIFRGQPKRHLLTTGWSVFVSAKRLVAGDSVLFIWNDSNQLLLGIRRA(SEQ ID NO：306)。
基序21：AAHAASTNSRFTIFYNPRASPSEFVIPLAKYVKAVYHTRISV(SEQ ID NO：307)。
基序22：QNTGFQSLNFGGLGMSPWMQPRLDSSLLGLQPDMYQTIAAAAALQNTTKQVSPAMLQFQQPQNIVGRSSLLSSQILQQAQPQFQQMYHQNINGNSIQGHSQPEYLQQPLQHCQSFNEQKPQLQPQQQQQESHQQQPQHQQMQQQKHLSNFQTVPNALSVFSQLSSTPQSTPSTLQTVSPFSQQ(SEQ ID NO：308)。
基序23：QVKRPHATFVKVYKSGTVGRLLDITRFSSYHELRSEVGRLFGLEGQLEDPLRSGVVQLVFVDREDDVLLVGDDPWQEFVNSVSCIKILSPQEVQQMG(SEQ ID NO：309).
术语“ARF6-样”或“ARF6-样多肽”在本文使用时中也意味着包括在“ARF6-样多肽”下定义的同源物。
更优选的，ARF6-样多肽按递增的优先度包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或所有6个基序。
额外的或可选的，ARF6-样蛋白的同源物按递增的优先度与SEQ IDNO：261表示的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％整体序列同一性，只要所述同源蛋白包含任何一个或多个上述所述的保守基序。使用全局比对算法，确定整体序列同一性，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优先使用默认参数，且优选使用成熟蛋白质序列(即，不考虑分泌信号或转运肽)。相比整体序列同一性，当仅考虑保守结构域或基序时，序列同一性一般更高。优选的，ARF6-样多肽中的基序按递增的优先度与SEQ ID NO：304至SEQ ID NO：309(基序18至23)表示的任何一个或多个基序具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
换言之，在另一个实施方案中，提供了这样的方法，其中所述ARF6-样多肽包含这样的保守结构域(基序)，所述保守结构域与SEQ ID NO：261中起自第134位氨基酸至第236位氨基酸的保守结构域具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在另一个实施方案中，提供了这样的方法，其中所述ARF6-样多肽包含这样的保守结构域(基序)，所述保守结构域与SEQ ID NO：261中起自第260位氨基酸至第343位氨基酸的保守结构域具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在另一个实施方案中，提供了这样的方法，其中所述ARF6-样多肽包含这样的保守结构域(基序)，所述保守结构域与SEQ ID NO：261中起自第729位氨基酸至第868位氨基酸的保守结构域具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
术语“结构域”、“标签”和“基序”定义在本文的“定义”章节下。
关于VIM1-样多肽，用于构建系统发生树(例如如图3中所述)时，多肽序列优选与包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的VIM1-样多肽的组聚簇，而不与任何其他组聚簇。
此外，VIM1-样多肽(至少其天然形式)通常具有E3连接酶活性。测量E3连接酶活性的工具和技术是本领域普遍已知的，例如描述在Kraft等人，The Plant Journal(2008)56，704-715中。
此外，当在根据实施例章节所述的本发明方法的转基因稻植物中表达时，VIM1-样多肽使植物具有增加的产量相关性状，特别是Gravity YMax(其为叶生物质重心的高度)和HeightMax(其为植物最高顶点的高度)；并且对于种子产量，包括种子总重量、饱满种子数、饱满率和收获指数。
关于VTC2-样多肽，用于构建系统发生树(例如如图8中所述)时，多肽序列优选与包含SEQ ID NO：61(At4g26850)或SEQ ID NO：63(普通小麦(Triticum aestivum)TC292154)所示氨基酸序列的单子叶或双子叶VTC2-样多肽的组聚簇，而不与任何其他的组聚簇。
此外，VTC2-样多肽(至少其天然形式)通常具有GDP-L-半乳糖磷酸化酶活性。测量GDP-L-半乳糖磷酸化酶活性的工具和技术是本领域普遍已知的(Linster等人，J.Biol.Chem.282：18879-85(2007))。实施例章节中提供了其他细节。
此外，当根据实施例章节所述的本发明方法在转基因植物例如稻中表达时，VTC2-样多肽使植物具有增加的产量相关性状，特别是一个或多个的种子总重量、饱满率、收获指数、饱满种子数或千粒重。
关于DUF1685多肽，在一个实施方案中，本文提供的DUF1685多肽具有这样的序列，所述序列与包含SEQ ID NO：188所示氨基酸序列的DUF1685多肽的组聚簇，而不与任何其他组聚簇。在优选的实施方案中，本文提供的DUF1685多肽选自SEQ ID NO：188、192、216、222、236、246和250。
此外，当根据实施例章节所述的本发明方法在转基因植物例如稻中表达时，DUF1685多肽使植物相比对照植物具有增加的产量相关性状，特别是增加的种子产量，以及例如增加的种子总重量、增加的饱满率、增加的千粒重和增加的收获指数。
此外，关于ARF6-样多肽，ARF6-样多肽(至少其天然形式)通常具有转录因子活性。测量转录因子活性的工具和技术是本领域普遍已知的，还可以商业获得(参见例如可获得自Clontech的“Transfactor UniversalKits”)。在优选的实施方案中，ARF6-样多肽激活转录。
此外，当根据实施例章节所述的本发明方法在稻中表达时，ARF6-样多肽使得植物具有增加的产量相关性状，特别是增强的生长、增加的生长速率、增加的生物量、增加的叶生物量、增加的根生物量、增加的分蘖和增加的产量。
关于VIM1-样多肽，通过SEQ ID NO：1所示的核酸序列(编码SEQ IDNO：2的多肽序列)转化植物，示例本发明。然而，本发明的性能不限于这些序列；本发明的方法可以使用本文定义的任何VIM1-样-编码核酸或VIM1-样多肽有利的实施。
本文的实施例章节中的表A1中给出了编码VIM1-样多肽的核酸的例子。这类核酸可用于实施本发明的方法。实施例章节中的表A1中给出的氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示VIM1-样多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。通过实施定义章节中描述的所谓的相互BLAST检索，可以方便的鉴别其他直向同源物和旁系同源物；其中查询序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，第二BLAST(反向-BLAST)将针对杨树序列。
本发明还提供了迄今未知的可用于在植物中赋予相对于对照植物增强的产量相关性状的VIM1-样-编码核酸和VIM1-样多肽。
根据本发明的其他实施方案，因此提供了分离的核酸分子，选自：
(i)SEQ ID NO：1所示的核酸；
(ii)SEQ ID NO：1所示的核酸的互补体；
(iii)编码VIM1-样多肽的核酸，所述多肽按递增的优先度与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，且额外的或可选的包含一个或多个按递增的优先度与SEQ ID NO：53至SEQ ID NO：55中给出的任何一个或多个基序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的基序，并且更优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(iv)在高度严格杂交条件下，与(i)至(iii)的核酸分子杂交的且优选相对于对照植物产生增强的产量相关性状。
根据本发明的其他实施方案，还提供了分离的多肽，选自：
(i)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其按递增的优先度与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的，且额外的或可选的包含一个或多个按递增的优先度与SEQ ID NO：53至SEQ ID NO：55中给出的任何一个或多个基序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的基序，更优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(iii)上述(i)或(ii)中给出的任何氨基酸序列的衍生物。
关于VTC2-样多肽，通过SEQ ID NO：60所示的核酸序列(编码SEQID NO：61的多肽序列)转化植物，示例本发明。然而，本发明的性能不限于这些序列；本发明的方法可以使用本文定义的任何VTC2-样-编码核酸或VTC2-样多肽有利的实施。
本文的实施例章节中的表A2中给出了编码VTC2-样多肽的核酸的例子。这类核酸可用于实施本发明的方法。实施例章节中的表A2中给出的氨基酸序列是SEQ ID NO：61所示VTC2-样多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。通过实施定义章节中描述的所谓的相互BLAST检索，可以方便的鉴别其他直向同源物和旁系同源物；其中查询序列是SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61，第二BLAST(反向-BLAST)将针对拟南芥(Arabidopsis thaliana)序列，其中查询序列是SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：63，第二BLAST(反向-BLAST)将针对普通小麦序列。
关于DUF1685多肽，通过SEQ ID NO：187所示的核酸序列(编码SEQID NO：188的多肽序列)转化植物，示例本发明。然而，本发明的性能不限于这些序列；本发明的方法可以使用本文定义的任何DUF1685-编码核酸或DUF1685多肽有利的实施。
本文的实施例章节中的表A3中给出了编码DUF1685多肽的核酸的例子。这类核酸可用于实施本发明的方法。实施例章节中的表A3中给出的氨基酸序列是SEQ ID NO：188所示DUF1685多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。通过实施定义章节中描述的所谓的相互BLAST检索，可以方便的鉴别其他直向同源物和旁系同源物；其中查询序列是SEQ ID NO：187或SEQ ID NO：188，第二BLAST(反向-BLAST)将针对杨树序列。
关于ARF6-样多肽，通过SEQ ID NO：260所示的核酸序列(编码SEQID NO：261的多肽序列)转化植物，示例本发明。然而，本发明的性能不限于这些序列；本发明的方法可以使用本文定义的任何ARF6-样-编码核酸或ARF6-样多肽有利的实施。
本文的实施例章节中的表A4中给出了编码ARF6-样多肽的核酸的例子。这类核酸可用于实施本发明的方法。实施例章节中的表A4中给出的氨基酸序列是SEQ ID NO：261所示ARF6-样多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。通过实施定义章节中描述的所谓的相互BLAST检索，可以方便的鉴别其他直向同源物和旁系同源物；其中查询序列是SEQ ID NO：260或SEQ ID NO：261，第二BLAST(反向-BLAST)将针对稻序列。
本发明还提供了迄今未知的ARF6-样-编码核酸和ARF6-样多肽，所述核酸和多肽可用于在植物中产生相对于对照植物增强的产量相关性状。
根据本发明的另一实施方案，因此提供了分离的核酸分子，选自：
(i)SEQ ID NO：260(的任一项)所示的核酸；
(ii)SEQ ID NO：260(的任一项)所示的核酸的互补体；
(iii)编码由SEQ ID NO：261(的任一项)所示的多肽的核酸，优选由于遗传密码简并性的结果，所述分离的核酸可以源自由SEQ ID NO：261(的任一项)所示的多肽序列，并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(iv)核酸，其按递增的优先度与表A4的任意核酸序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(v)核酸分子，其在高度严格杂交条件下，与(i)至(iv)的核酸分子杂交，并还优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(vi)编码ARF6-样多肽的核酸，所述多肽按递增的优先度与SEQ ID NO：261(的任一项)所示的氨基酸序列和表A4中的任何其他氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
根据本发明的其他实施方案，还提供了分离的多肽，选自：
(i)SEQ ID NO：261(的任一项)所示的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其按递增的优先度与SEQ ID NO：261(的任一项)所示的氨基酸序列和表A4中的任何其他氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(iii)上述(i)或(ii)中给出的任何氨基酸序列的衍生物。
核酸变体也可用于实践本发明的方法。这类变体的例子包括编码实施例章节的表A1至A4中给出的任一条氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”是本文定义的。还可用于本发明方法的是编码实施例章节的表A1至A4中给出的任一条氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。可用于本发明方法的同源物和衍生物与其来源的未修饰的蛋白质具有基本相同的生物学和功能活性。可用于实践本发明方法的其他变体是密码子优化的变体，或其中的miRNA靶位点被去除了的变体。
可用于实践本发明方法的其他核酸变体包括编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸的一部分，与编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸杂交的核酸，编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸的剪接变体，编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸的等位变体，和通过基因改组获得的编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸的变体。术语语杂交序列、剪接变体、等位变体和基因改组如本文所述。
编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸不需要是全长核酸，因为实施本发明的方法不依赖于使用全长核酸序列。根据本发明，提供了在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中导入和表达实施例章节的表A1至A4中给出的任一条核酸序列的一部分，或编码实施例章节的表A1至A4中给出的任一条氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。
例如，可以通过使核酸产生一个或多个缺失，来制备核酸的一部分。可以按分离的形式使用一部分，或者该一部分可以与其他的编码(或非编码)序列融合，从而产生例如组合了若干活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，在翻译时生产获得的多肽可以大于预测的蛋白质部分。
关于VIM1-样多肽，可用于本发明方法中的部分编码本文定义的VIM1-样多肽，并具有与实施例章节的表A1给出的氨基酸序列基本相同的生物学活性。优选的，部分是实施例章节的表A1给出的任一条核酸的一部分，或者是编码实施例章节的表A1给出的任一条氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选的，部分是长度为至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400个连续的核苷酸，连续的核苷酸是实施例章节的表A1给出的任一条核酸序列的连续的核苷酸，或者是编码实施例章节的表A1给出的任一条氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的连续的核苷酸。最优选的，部分是SEQ ID NO：1的核酸的一部分。
优选的，部分编码这样的氨基酸片段，当用于构建系统发生树(例如如图3所示的)时，所述片段与包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的VIM1-样多肽的组聚簇，而不与任何其他组聚簇，和/或包含至少一个基序1至3和/或具有E3连接酶活性。
在可选的优选实施方案中，VIM1-样核酸按递增的优先度与表A1的任何核酸序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并还优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
关于VTC2-样多肽，可用于本发明方法中的部分编码本文定义的VTC2-样多肽，并具有与实施例章节的表A2给出的氨基酸序列基本相同的生物学活性。优选的，部分是实施例章节的表A2给出的任一条核酸的一部分，或者是编码实施例章节的表A2给出的任一条氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选的，部分是长度为至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700个连续的核苷酸，连续的核苷酸是实施例章节的表A2给出的任一条核酸序列的连续的核苷酸，或者是编码实施例章节的表A2给出的任一条氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的连续的核苷酸。最优选的，部分是SEQ ID NO：60的核酸的一部分。优选的，部分编码这样的氨基酸片段，当用于构建系统发生树(例如如图8所示的)时，所述片段与包含SEQID NO：61或63所示氨基酸序列的单子叶或双子叶VTC2-样多肽的组聚簇，而不与任何其他组聚簇；和/或包含任何一个或多个基序4至15和/或具有GDP-L-半乳糖磷酸化酶活性。
关于DUF1685多肽，可用于本发明方法中的部分编码本文定义的DUF1685多肽，并具有与实施例章节的表A3给出的氨基酸序列基本相同的生物学活性。优选的，部分是实施例章节的表A3给出的任一条核酸的一部分，或者是编码实施例章节的表A3给出的任一条氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选的，部分是长度为至少300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800个连续的核苷酸，连续的核苷酸是实施例章节的表A3给出的任一条核酸序列的连续的核苷酸，或者是编码实施例章节的表A3给出的任一条氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的连续的核苷酸。最优选的，部分是SEQ ID NO：187的核酸的一部分。
在另一个优选的实施方案中，部分编码具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有一个或多个下列特征：
-与包含SEQ ID NO：188所示氨基酸序列的DUF1685多肽的组聚簇，而不与任何其他组聚簇；
-包含上述基序16和/或17；
-包含与SEQ ID NO：256所示DUF1685结构域具有至少50％、
优选至少70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性的结构域。
关于ARF6-样多肽，可用于本发明方法中的部分编码本文定义的ARF6-样多肽，并具有与实施例章节的表A4给出的氨基酸序列基本相同的生物学活性。优选的，部分是实施例章节的表A4给出的任一条核酸的一部分，或者是编码实施例章节的表A4给出的任一条氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选的，部分是长度为至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1500、1750、2000、2100、2500、2750、2900个连续的核苷酸，连续的核苷酸是实施例章节的表A4给出的任一条核酸序列的连续的核苷酸，或者是编码实施例章节的表A4给出的任一条氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的连续的核苷酸。最优选的，部分是SEQ ID NO：260的核酸的一部分。
可用于本发明方法的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下，优选在严格条件下，与本文定义的编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸，或与本文定义的部分杂交的核酸。
根据本发明，提供了用于在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中导入和表达能够与实施例章节表A1至A4给出的任一条核酸杂交的核酸，或者包括在植物中导入和表达能够与编码实施例章节表A1至A4给出的任何核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交的核酸。
可用于本发明方法中的杂交序列编码本文定义的VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽，与实施例章节表A1至A4给出的氨基酸序列具有基本相同的生物学活性。优选的，杂交序列能够与实施例章节表A1至A4给出的任一条核酸的互补序列杂交，或与任何这些序列的一部分杂交，所述部分是上文定义的，或者杂交序列能够与编码实施例章节表A1至A4给出的任一条氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的互补序列杂交。最优选的，杂交序列能够与SEQ ID NO：1所示核酸的互补序列或与其部分杂交，与SEQ ID NO：60所示核酸的互补序列或与其部分杂交，与SEQ ID NO：187所示核酸的互补序列或与其部分杂交，与SEQ ID NO：260所示核酸的互补序列或与其部分杂交。
关于VIM1-样多肽，杂交序列优选编码具有这样的氨基酸序列的多肽，当所述序列是全长并用于构建系统发生树(例如如图3所示的)时，与包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的VIM1-样多肽的组聚簇(例如Kraft等人，The Plant Journal(2008)56；704-715所述)，而不与任何其他组聚簇，和/或包含至少一个基序1至3，和/或具有E3连接酶活性。
关于VTC2-样多肽，杂交序列优选编码具有这样的氨基酸序列的多肽，当所述序列是全长并构建系统发生树(例如如图8所示的)时，与包含SEQID NO：61或SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的单子叶植物或双子叶植物VTC2-样多肽的组聚簇，而不与任何其他组聚簇；和/或包含任何一个或多个基序4至15，和/或具有GDP-L-半乳糖磷酸化酶活性。
关于DUF1685多肽，杂交序列优选编码具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有一个或多个下列特征：
-与包含SEQ ID NO：188所示氨基酸序列的DUF1685多肽的组聚簇，而不与任何其他组聚簇；
-包含上述基序16和/或17；
-包含与SEQ ID NO：256所示DUF1685结构域具有至少50％、优选至少70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性的结构域。
可用于本发明方法的另一种核酸变体是编码上文定义的VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的剪接变体，剪接变体是本文定义的。
根据本发明，提供了用于在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中导入和表达实施例章节表A1至A4给出的任一条核酸序列的剪接变体，或者编码实施例章节表A1至A4给出的任一条氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。
关于VIM1-样多肽，优选的剪接变体是SEQ ID NO：1所示核酸的剪接变体，或编码SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选的，当剪接变体编码的氨基酸序列用于构建系统发生树(例如如图3所示的)时，与包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的VIM1-样多肽的组聚簇(例如Kraft等人，The Plant Journal(2008)56；704-715所述)，而不与任何其他组聚簇，和/或包含至少一个基序1至3，和/或具有E3连接酶活性。
关于VTC2-样多肽，优选的剪接变体是SEQ ID NO：60所示核酸的剪接变体，或编码SEQ ID NO：61的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选的，当剪接变体编码的氨基酸序列构建系统发生树(例如如图8所示的)时，与包含SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的单子叶植物或双子叶植物VTC2-样多肽的组聚簇，而不与任何其他组聚簇；和/或包含任何一个或多个基序4至15，和/或具有GDP-L-半乳糖磷酸化酶活性。
关于DUF1685多肽，优选的剪接变体是SEQ ID NO：187所示核酸的剪接变体，或编码SEQ ID NO：188的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选的，剪接变体编码的氨基酸序列具有一个或多个下列特征：
-与包含SEQ ID NO：188所示氨基酸序列的DUF1685多肽的组聚簇，而不与任何其他组聚簇；
-包含上述基序16和/或17；
-包含与SEQ ID NO：256所示DUF1685结构域具有至少50％、优选至少70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性的结构域。
关于ARF6-样多肽，优选的剪接变体是SEQ ID NO：260所示核酸的剪接变体，或编码SEQ ID NO：261的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。
可用于实施本发明方法的另一种核酸变体是编码上文定义的VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸的等位变体，等位变体是本文定义的。
根据本发明，提供了用于在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中导入和表达实施例章节表A1至A4给出的任一条核酸的等位变体，或者包括在植物中导入和表达编码实施例章节表A1至A4给出的任何氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位变体。
关于VIM1-样多肽，可用于本发明方法的等位变体编码的多肽与SEQID NO：2的VIM1-样多肽和实施例章节的表A1所示任何氨基酸(序列)具有基本相同的生物学活性。等位变体天然存在，涵盖在本发明方法中的是这些天然等位基因的使用。优选的，等位变体是SEQ ID NO：1的等位变体，或编码SEQ ID NO：2的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选的，当等位变体编码的氨基酸序列用于构建系统发生树(例如如图3所示的)时，与包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的VIM1-样多肽的组聚簇(例如Kraft等人，The Plant Journal(2008)56；704-715所述)，而不与任何其他组聚簇，和/或包含至少一个基序1至3，和/或具有E3连接酶活性。
关于VTC2-样多肽，可用于本发明方法的等位变体编码的多肽与SEQID NO：61的VTC2-样多肽和实施例章节的表A2所示任何氨基酸(序列)具有基本相同的生物学活性。等位变体天然存在，涵盖在本发明方法中的是这些天然等位基因的使用。优选的，等位变体是SEQ ID NO：60的等位变体，或编码SEQ ID NO：61的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选的，当等位变体编码的氨基酸序列构建系统发生树(例如如图8所示的)时，与包含SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的单子叶植物或双子叶植物VTC2-样多肽的组聚簇，而不与任何其他组聚簇；和/或包含任何一个或多个基序4至15，和/或具有GDP-L-半乳糖磷酸化酶活性。
关于DUF1685多肽，可用于本发明方法的等位变体编码的多肽与SEQ ID NO：188的DUF1685多肽和实施例章节的表A3所示任何氨基酸(序列)具有基本相同的生物学活性。等位变体天然存在，涵盖在本发明方法中的是这些天然等位基因的使用。优选的，等位变体是SEQ ID NO：187的等位变体，或编码SEQ ID NO：188的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选的，等位变体编码的氨基酸序列具有一个或多个下列特征：
-与包含SEQ ID NO：188所示氨基酸序列的DUF1685多肽的组聚簇，而不与任何其他组聚簇；
-包含上述基序16和/或17；
-包含与SEQ ID NO：256所示DUF1685结构域具有至少50％、优选至少70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性的结构域。
关于ARF6-样多肽，可用于本发明方法的等位变体编码的多肽与SEQID NO：261的ARF6-样多肽和实施例章节的表A4所示任何氨基酸(序列)具有基本相同的生物学活性。等位变体天然存在，涵盖在本发明方法中的是这些天然等位基因的使用。优选的，等位变体是SEQ ID NO：260的等位变体，或编码SEQ ID NO：261的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。
基因改组或直接进化也可用于产生编码上文定义的VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸变体；术语“基因改组”是本文定义的。
根据本发明，提供了用于在植物中增强产量相关性状的方法，包括在植物中导入和表达实施例章节表A1至A4给出的任一条核酸序列的变体，或者包括在植物中导入和表达编码实施例章节表A1至A4给出的任何氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的变体，所述变体核酸是通过基因改组获得的。
关于VIM1-样多肽，当由基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列用于构建系统发生树(例如如图3所示的)时，优选与包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的VIM1-样多肽的组聚簇(例如Kraft等人，The PlantJournal(2008)56；704-715所述)，而不与任何其他组聚簇，和/或包含至少一个基序1至3，和/或具有E3连接酶活性。
关于VTC2-样多肽，当由基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列用于构建系统发生树(例如如图8所示的)时，优选与包含SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的单子叶植物或双子叶植物VTC2-样多肽的组聚簇，而不与任何其他组聚簇；和/或包含任何一个或多个基序4至15，和/或具有GDP-L-半乳糖磷酸化酶活性。
关于DUF1685多肽，由基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列优选具有一个或多个下列特征：
-与包含SEQ ID NO：188所示氨基酸序列的DUF1685多肽的组聚簇，而不与任何其他组聚簇；
-包含上述基序16和/或17；
-包含与SEQ ID NO：256所示DUF1685结构域具有至少50％、优选至少70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性的结构域。
此外，还可以通过定点诱变获得核酸变体。一些方法可用于实现定点诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in MolecularBiology.Wiley编著)。
关于VIM1-样多肽，编码VIM1-样多肽的核酸可源自任何天然的或人工的来源。核酸可以是通过特意的人为操作，从组合物和/或基因组环境中的天然形式修饰而来的。优选的，VIM1-样多肽-编码核酸来自植物，还优选来自双子叶植物，更优选来自杨柳科(Salicaceae)，更优选来自杨属(Populus)，最优选来自毛果杨(Populus trichocarpa)。
关于VTC2-样多肽，编码VTC2-样多肽的核酸可源自任何天然的或人工的来源。核酸可以是通过特意的人为操作，从组合物和/或基因组环境中的天然形式修饰而来的。优选的，VTC2-样多肽-编码核酸来自植物，还优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科(Poaceae)，最优选的，核酸来自普通小麦(Triticum aestivum)。在另一个实施方案中，VTC2-样多肽-编码核酸来自双子叶植物，更优选来自十字花科(Brassicaceae)，最优选的，核酸来自拟南芥。
关于DUF1685多肽，编码DUF1685多肽的核酸可源自任何天然的或人工的来源。核酸可以是通过特意的人为操作，从组合物和/或基因组环境中的天然形式修饰而来的。优选的，DUF1685多肽-编码核酸来自植物，特别是来自属于植物界(Viridiplantae)的植物，特别是单子叶和双子叶植物。在实施方案中，编码DUF1685多肽的核酸来自双子叶植物，更优选来自杨柳科，最优选来自杨属。在实例中，核酸来自毛果杨。在另一个实施方案中，编码DUF1685多肽的核酸源自单子叶植物。
关于ARF6-样多肽，编码ARF6-样多肽的核酸可源自任何天然的或人工的来源。核酸可以是通过特意的人为操作，从组合物和/或基因组环境中的天然形式修饰而来的。优选的，ARF6-样多肽-编码核酸来自植物，还优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科(Poaceae)，最优选的，核酸来自稻(Oryza sativa)。
实施本发明的方法使植物具有增强的产量相关性状。特别是实施本发明的方法使植物相对于对照植物具有增加的产量，尤其是增加的种子产量。本文中的“定义”章节中更详细的描述了术语“产量”和“种子产量”。
本文中对于增强的产量相关性状的指代意味着一个或多个植物部分增加的早期萌发势和/或生物量(重量)，所述植物部分可包括(i)地上部分和优选的地上可收获的部分，和/或(ii)地下部分和优选的地下可收获的部分。特别的是，这类可收获的部分是种子，实施本发明的方法导致植物相对于对照植物的种子产量具有增加的种子产量。
关于VIM1-样多肽，本发明提供了用于相对于对照植物，增加植物的产量相关性状，特别是产量，尤其是植物高度和种子产量的方法，方法包括调节编码本文定义的VIM1-样多肽的核酸在植物中的表达。
关于VTC2-样多肽，本发明提供了用于相对于对照植物，增加植物的产量相关性状，特别是产量，尤其是种子产量的方法，方法包括调节编码本文定义的VTC2-样多肽的核酸在植物中的表达。
关于DUF1685多肽，本发明提供了用于相对于对照植物，增加产量相关性状，尤其是用于增加植物的种子产量的方法，方法包括调节编码本文定义的DUF1685多肽的核酸在植物中的表达。
关于ARF6-样多肽，本发明提供了用于相对于对照植物，增加植物的产量相关性状，尤其是生长、生长速率、生物量、叶生物量、根生物量、分蘖和产量的方法，方法包括调节编码本文定义的编码ARF6-样多肽的核酸在植物中的表达。
根据本发明的优选的特征，实施本发明的方法使植物相对于对照植物具有增加的生长速率。因此，根据本发明，提供了用于增加植物的生长速率的方法，方法包括调节编码本文定义的VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸在植物中的表达。
实施本发明的方法使生长在非胁迫条件或中等干旱条件下的植物相对于生长在可比较条件下的对照植物具有增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在非胁迫条件或中等干旱条件下的植物的产量的方法，方法包括调节编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸在植物中的表达。
实施本发明的方法可以使生长在干旱条件下的植物相对于生长在可比较条件下的对照植物具有增加的本文提供的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在胁迫条件下，特别是干旱条件下的植物的产量相关性状的方法，方法包括调节编码本文定义的DUF1685多肽的核酸在植物中的表达。
实施本发明的方法可以使生长在养分缺乏条件下，特别是氮缺乏条件下的植物相对于生长在可比较条件下的对照植物具有增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在养分缺乏条件下的植物的产量的方法，方法包括调节编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸在植物中的表达。
实施本发明的方法可以使生长在盐胁迫条件下的植物相对于生长在可比较条件下的对照植物具有增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在盐胁迫条件下的植物的产量的方法，方法包括调节编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸在植物中的表达。
本发明还提供了遗传构建体和载体，用于促进编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸在植物中的导入和/或表达。基因构建体可以插入到可商购的载体中，所述载体适合转化到植物中，并适合在转化细胞中表达目的基因。本发明还提供了本文定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
更具体而言，本发明提供了构建体，包含：
(a)编码上文定义的VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸；
(b)一个或多个能够驱动(a)的核酸序列表达的控制序列；和
任选的
(c)转录终止序列。
优选的，编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸如上文定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文定义。
本发明进一步提供了用上述构建体转化的植物。特别的是，本发明提供了用上述构建体转化的植物，所述植物具有本文所述的增加的产量相关性状。
用包含上述任意核酸的载体转化植物。本领域技术人员普遍了解为了成功的转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞，而必须存在于载体中的遗传元件。目的序列与一个或多个控制序列(至少与启动子)有效的连接。
有利的，任何类型的启动子，不论是天然的或合成的，都可用于驱动核酸序列的表达，但优选的是植物来源的启动子。组成型启动子尤其可用于所述方法。优选的，组成型启动子是中等强度的泛素组成型启动子。参见本文中的“定义”章节关于各种启动子类型的定义。
关于VIM1-样多肽，应该明确本发明的适用性不限于由SEQ ID NO：1所示的VIM1-样多肽-编码核酸，本发明的适用性也不限于由组成型启动子驱动的VIM1-样多肽-编码核酸的表达。
组成型启动子优选的是中等强度的启动子。更优选的，是植物来源的启动子，如GOS2启动子，或强度基本相同并具有基本相同的表达模式的启动子(功能上等价的启动子)，更优选的启动子是来自稻的GOS2启动子。还优选的组成型启动子由与SEQ ID NO：57基本相似的核酸序列所示，最优选的组成型启动子是由SEQ ID NO：57所示的。参见本文中的“定义”章节关于组成型启动子的其他例子。
任选的，一个或多个终止子序列可用于导入植物中的构建体。优选的，构建体包含这样的表达盒，所述表达盒包含与SEQ ID NO：57基本相似的GOS2启动子和编码VIM1-样多肽的核酸。更优选的，表达盒包含由SEQID NO：56所示的序列(pGOS2::VIM1-样::t-玉米醇溶蛋白序列)。此外，一个或多个编码选择标记的序列可以存在于导入植物中的构建体上。
关于VTC2-样多肽，应该明确本发明的适用性不限于由SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62所示的VTC2-样多肽-编码核酸，本发明的适用性也不限于由组成型启动子驱动或根特异性启动子驱动时的VTC2-样多肽-编码核酸的表达。
组成型启动子优选的是中等强度的启动子。更优选的，是植物来源的启动子，如GOS2启动子，或强度基本相同并具有基本相同的表达模式的启动子(功能上等价的启动子)，更优选的启动子是来自稻的GOS2启动子。还优选的组成型启动子由与SEQ ID NO：180基本相似的核酸序列所示，最优选的组成型启动子由SEQ ID NO：180所示。参见本文中的“定义”章节关于组成型启动子的其他例子。
任选的，一个或多个终止子序列可用于导入植物中的构建体。优选的，构建体包含这样的表达盒，所述表达盒包含与SEQ ID NO：180基本相似的稻GOS2启动子和编码VTC2-样多肽的核酸。更优选的，表达盒包含由SEQ ID NO：181(包含SEQ ID NO：60的pGOS2::AtVTC2::t-玉米醇溶蛋白盒)或SEQ ID NO：182(包含SEQ ID NO：62的pGOS2::TaVTC2::t-玉米醇溶蛋白盒)所示的序列。此外，一个或多个编码选择标记的序列可以存在于导入植物中的构建体上。
关于DUF1685多肽，应该明确本发明的适用性不限于由SEQ ID NO：187所示的DUF1685多肽-编码核酸，本发明的适用性也不限于由组成型启动子驱动的DUF1685多肽-编码核酸的表达。
组成型启动子优选的是中等强度的启动子。在另一个优选的实施方案中，所述控制序列是植物启动子。在另一个实施方案中，所述控制序列是来自单子叶植物或双子叶植物的启动子。更优选的，是植物来源的GOS2启动子，或强度基本相同并具有基本相同的表达模式的启动子(功能上等价的启动子)。优选的启动子是来自稻的GOS2启动子。还优选的组成型启动子由与SEQ ID NO：255基本相似的核酸序列所示，最优选的，组成型启动子是由SEQ ID NO：255所示的。参见本文中的“定义”章节关于组成型启动子的其他例子。
任选的，一个或多个终止子序列可用于导入植物的构建体中。在优选的实施方案中，提供了包含这样的表达盒的构建体，所述表达盒包含与SEQ ID NO：255基本相似的GOS2启动子、编码DUF1685多肽的核酸和终止子序列。在优选的实施方案中，所述终止子序列包含与t-rbcs(rubisco酶的小亚基)终止子对应的核酸序列，所述核酸序列与对应于t-玉米醇溶蛋白终止子的核酸序列融合。优选的，表达盒包含由SEQ ID NO：257所示的序列(pGOS2::DUF::t-rbcs-t-玉米醇溶蛋白终止子序列)。此外，一个或多个编码选择标记的序列可以存在于导入植物中的构建体上。
关于ARF6-样多肽，应该明确的是本发明的适用性不限于由SEQ IDNO：260所示的ARF6-样多肽-编码核酸，本发明的适用性也不限于由组成型启动子驱动的ARF6-样多肽-编码核酸的表达。
组成型启动子优选的是中等强度的启动子。更优选的，是植物来源的启动子，如GOS2启动子，或强度基本相同并具有基本相同的表达模式的启动子(功能上等价的启动子)，更优选的启动子是来自稻的GOS2启动子。还优选的组成型启动子由与SEQ ID NO：310基本相似的核酸序列所示，最优选的，组成型启动子是由SEQ ID NO：310所示的。参见本文中的“定义”章节关于组成型启动子的其他例子。
任选的，一个或多个终止子序列可用于导入植物的构建体中。优选的，构建体包含这样的表达盒，所述表达盒包含与SEQ ID NO：310基本相似的GOS2启动子，所述启动子与编码ARF6-样多肽的核酸有效连接。此外，一个或多个编码选择标记的序列可以存在于导入植物中的构建体上。
根据本发明的优选的特征，受调节的表达是增加的表达。用于增加核酸或基因或基因产物的表达的方法是本领域普遍记载的，例子提供在定义章节中。
如上所述，用于调节编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸表达的优选方法是通过在植物中导入和表编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸；然而，实施方法的效果，即增强产量相关性状，可以使用其他普遍已知的技术实现，包括但不限于T-DNA激活标签化、TILLING、同源重组。定义章节中提供了这些技术的描述。
本发明还提供了用于生产相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，包括在植物中导入和表达编码上文定义的编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的任何核酸。
更具体而言，本发明提供了用于生产具有增强的产量相关性状，特别是增加的产量和增加的种子产量的转基因植物的方法，方法包括：
(i)在植物或植物细胞中导入和表达编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸，或包含编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸的遗传构建体；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞可以包括或不包括再生和/或生长至成熟。
(i)的核酸可以是任何能够编码本文定义的VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸。
可以将核酸直接导入到植物细胞或植物本身中(包括导入到组织、器官或任何其他植物部分中)。根据本发明优选的特征，核酸优选通过转化导入到植物中。本文的“定义”章节中更详细的描述了术语“转化”。
本发明明确的延伸至通过本文所述任何方法生产的任何植物细胞或植物，及其所有的植物部分和繁殖体。本发明涵盖了通过本发明的方法可获得的植物或其部分(包括种子)。植物或其部分包含编码上文定义的VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸转基因。本发明还延伸至涵盖了通过任何上述方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的后代，唯一的要求是后代表现出与本发明方法中的亲代所产生的相同的一个或多个基因型和/或表型特征。
本发明还包括含有编码上文定义的VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的分离的核酸的宿主细胞。根据本发明的优选的宿主细胞是植物细胞。用于本发明方法中的核酸或载体、表达盒、构建体或载体的宿主植物原则上有利的是所有能够合成用于本发明方法中的多肽的植物。
在另一个特定的实施方案中，本发明的植物细胞是非繁殖性的或不可再生的细胞，即，使用本领域已知的细胞培养技术不能再生为植物的细胞；例如细胞不被用于使用标准的细胞培养技术从该细胞总体上再生完整植物，所述标准培养技术表示排除了体外核、细胞器或染色体转移方法的细胞培养方法。虽然植物细胞一般具有全能性的特征，但一些植物细胞不能用于从所述细胞再生或增殖为完整的植物。在本发明的一个实施方案中，本发明的植物细胞是上述细胞。在另一个实施方案中，本发明的植物细胞是不能通过光合作用，从无机物(如水、二氧化碳和矿物质)合成碳水化合物和蛋白质(即，以自养方式)，来维持自身的植物细胞，这类植物细胞被视为表示非植物品种。
本发明的方法有利的可用于任何植物，特别是任何本文定义的植物。特别可用于本发明方法的植物包括所有属于植物界(Viridiplantae)的植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括饲料或饲料豆类(forage legumes)植物、观赏植物、食物作物、树或灌木。
根据本发明的实施方案，植物是作物植物。作物植物的例子包括但不限于菊苣(chicory)、胡萝卜(carrot)、木薯(cassava)、车轴草(trefoil)、大豆(soybean)、甜菜(beet)、糖萝卜(sugar beet)、向日葵(sunflower)、卡诺拉油菜(canola)、苜蓿(alfalfa)、油菜(rapeseed)、亚麻(linseed)、棉花(cotton)、番茄(tomato)、马铃薯(potato)和烟草(tobacco)。
根据本发明的另一个实施方案，植物是单子叶植物。单子叶植物的例子包括甘蔗(sugarcane)。
根据本发明的另一个实施方案，植物是谷类。谷类的例子包括稻(rice)、玉米(maize)、小麦(wheat)、大麦(barley)、黍(millet)、黑麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱(sorghum)、二粒小麦(emmer)、斯佩耳特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、买罗高粱(milo)或燕麦(oat)。
本发明还延伸至植物的可收获部分，例如但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和鳞茎(bulb)，所述可收获部分包含编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的重组核酸。本发明还涉及源自，优选直接源自这类植物的可收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白质。
本发明还涵盖了编码本文所述VIM1-样多肽的核酸的用途，和这些VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的用途，用于在植物中增强任何上述产量相关性状。例如，编码本文所述的VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸，或VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽本身，可用于这样的育种程序，在所述程序中，鉴别出与编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的基因遗传关联的DNA标记。核酸/基因或VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽本身可用于定义分子标记。然后，该DNA或蛋白质标记可用于育种程序，选择在本发明方法中具有上文定义的增强的产量相关性状的植物。此外，编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸/基因的等位变体可用于标记辅助的育种程序中。编码VIM1多肽或VTC2-样多肽或DUF1685多肽或ARF6-样多肽的核酸也可用作探针，以便对基因进行遗传作图和物理作图，所述探针作为所述基因的一部分，及用作与那些基因关联的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以便开发具有想要表型的株系。
实施方案
本发明的特征特别是一个或多个下列实施方案：
1、包括调节编码VIM1-样多肽的核酸在植物中的表达，其中所述VIM1-样多肽包含Interpro登录号IPR019787，对应于PFAM登录号SM00249，植物同源异形域(PHD)结构域；Interpro登录号IPR018957，对应于PFAM登录号PF00097，really interesting new gene(RING)结构域和Interpro登录号IPR003105，对应于PFAM登录号PF02182，Set RingAssociated(SRA)结构域。
2、根据实施方案1的方法，其中所述调节的表达通过在植物中导入和表达所述编码所述VIM1-样多肽的核酸来实现。
3、根据实施方案1或2的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，和优选的包括相对于对照植物增加的植物高度和/或增加的种子产量。
4、根据实施方案1至3的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
5、根据实施方案1至3的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏的条件下获得的。
6、根据实施方案1至5的任一项的方法，其中所述VIM1-样多肽包含一个或多个下列基序：
(i)基序1：RQWGAH[LF]PHVAGIAGQS[TA][YHV]GAQSVALSGGY[IED]DDEDHGEWFLYTGSGGRDL(SEQ ID NO：53)，
(ii)基序2：F[DE][KN][ML]N[EA]ALR[LV]SC[LK]KGYPVRVVRSHKEKRS[AS]YAPE[TES]GV(SEQ ID NO：54)，
(iii)基序3：A[YF]TTERAK[KR][AT]GKANA[CSA]SG[KQ]IFVT[VI][AP]PDHFGPI[PL]AENDP[ET]RN[MQ]GVLVG[ED][IST]W(SEQ ID NO：55)。
7、根据实施方案1至6的任一项的方法，其中所述编码VIM1-样多肽的核酸是植物来源的，优选的来自双子叶植物，还优选的来自杨柳科(Salicaceae)，更优选来自杨属(Populus)，最优选来自毛果杨(Populustrichocarpa)。
8、根据实施方案1至7的任一项的方法，其中所述编码VIM1-样多肽的核酸编码表A1列出的任一条多肽，或者是这类核酸的一部分，或者是能够与这类核酸杂交的核酸。
9、根据实施方案1至8的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A1给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。
10、根据实施方案1至9的任一项的方法，其中所述核酸编码与SEQID NO：2对应的VIM1-样多肽。
11、根据实施方案1至10的任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选与中等强度的组成型启动子，优选与植物启动子，更优选与GOS2启动子，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
12、能够通过根据实施方案1至11的任一项的方法获得的植物、其植物部分或植物细胞，所述植物部分包括种子，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码实施方案1和6至10的任一项定义的VIM1-样多肽的重组核酸。
13、分离的核酸分子，其选自：
(i)SEQ ID NO：1所示的核酸；
(ii)SEQ ID NO：1所示的核酸的互补体；
(iii)编码VIM1-样多肽的核酸，所述多肽按递增的优先度与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且额外的或可选的，包含按递增的优先度与SEQ ID NO：53至SEQ ID NO：55中给出的任何一个或多个基序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的一个或多个基序，并更优选的赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(iv)在高度严格杂交条件下与(i)至(iii)的核酸分子杂交，并赋予优选相对于对照植物增强的产量相关性状的核酸分子。
14、分离的多肽，其选自：
(i)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其按递增的优先度与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，额外的或可选的，包含按递增的优先度与SEQ ID NO：53至SEQ ID NO：55中给出的任何一个或多个基序具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的一个或多个基序，并更优选的赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(iii)上述(i)或(ii)给出的任意氨基酸序列的衍生物。
15、构建体，其包含：
(i)编码实施方案1和6至10和13的任一项定义的VIM1-样多肽的核酸；
(ii)一个或多个能够驱动(i)的核酸序列表达的控制序列；和
任选的
(iii)转录终止序列。
16、根据实施方案15的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选中等强度的组成型启动子，优选植物启动子，更优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
17、根据实施方案15或16的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的植物高度。
18、用根据实施方案15或16的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
19、用于生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的植物高度，所述方法包括：
(i)在植物细胞或植物中导入和表达编码实施方案1至12的任一项定义的VIM1-样多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下，培养所述植物细胞或植物。
20、转基因植物，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选增加的种子产量和/或增加的植物高度，由编码实施方案1至12的任一项定义的VIM1-样多肽的核酸受调节的表达产生。
21、根据实施方案12、18或20的转基因植物，或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜(beet)、糖萝卜(sugarbeet)或苜蓿(alfalfa)；或单子叶植物如甘蔗(sugarcane)；或谷类，如稻(rice)、玉米(maize)、小麦(wheat)、大麦(barley)、黍(millet)、黑麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱(sorghum)、二粒小麦(emmer)、斯佩耳特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、买罗高粱(milo)或燕麦(oat)。
22、根据实施方案21的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。
23、源自根据实施方案21的植物和/或源自根据实施方案22的植物的可收获部分的产品。
24、编码实施方案1至12的任一项定义的VIM1-样多肽的核酸的用途，其用于相对于对照植物，增强植物的产量相关性状，优选用于增加产量，并且更优选用于相对于对照植物，在植物中增加种子产量和/或增加植物高度。
25、相对于对照植物，增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节编码VTC2-样多肽的核酸在植物中的表达，其中所述VTC2-样多肽包含HMMPanther PTHR20884结构域。
26、根据实施方案25的方法，其中所述调节的表达通过在植物中导入和表达所述编码所述VTC2-样多肽的核酸来实现。
27、根据实施方案25或26的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，并优选包括相对于对照植物增加的种子产量。
28、根据实施方案25至27的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
29、根据实施方案25至28的任一项的方法，其中所述VTC2-样多肽包含一个或多个下列基序：
(i)基序4：WEDR[MFV][QA]RGLFRYDVTACETKVIPG[KE][LY]GF[IV]AQLNEGRHLKKRPTEFRVD[KRQ]V(SEQ ID NO：168)，
(ii)基序5：[DE][CR]LPQ[QR]ID[HPR][EKD]S[FL]LLA[VL][HYQ]MAAEA[GA][NS]PYFR[LV]GYNSLGAFATINHLHFQAYYL(SEQ ID NO：169)，
(iii)基序6：D[CS]G[KR][QR][IV]F[VL][LMF]PQCYAEKQALGEVS[PQ][DE][VL]L[DE]TQVNPAVWEISGH[MI]VLKR[KR][ETK]D[FY](SEQ ID NO：170)。
30、根据实施方案25至29的任一项的方法，其中所述编码VTC2-样的核酸是植物来源的，优选来自单子叶植物或双子叶植物。
31、根据实施方案25至30的任一项的方法，其中所述编码VTC2-样的核酸编码表A2列举的任一条多肽，或者是这类核酸的一部分或能够与这类核酸杂交的核酸。
32、根据实施方案25至31的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A2给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。
33、根据实施方案25至32的任一项的方法，其中所述编码所述VTC2-样多肽的核酸对应于SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62。
34、根据实施方案25至33的任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选中等强度的组成型启动子，优选植物启动子，更优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子有效连接。
35、能够通过根据实施方案25至34的任一项的方法获得的植物、其植物部分或植物细胞，所述植物部分包括种子，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码实施方案25和29至33的任一项定义的VTC2-样多肽的重组核酸。
36、构建体，其包含：
(i)编码实施方案25和29至33的任一项定义的VTC2-样多肽的核酸；
(ii)一个或多个能够驱动(i)的核酸序列表达的控制序列；和任选的
(iii)转录终止序列。
37、根据实施方案36的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选中等强度的组成型启动子，优选植物启动子，更优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
38、根据实施方案36或37的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量。
39、用根据实施方案36或37的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
40、用于生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量，所述方法包括：
(i)在植物细胞或植物中导入和表达编码实施方案25和29至33的任一项定义的VTC2-样多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下，培养所述植物细胞或植物。
41、转基因植物，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选增加的种子产量，由编码实施方案25和29至33的任一项定义的VTC2-样多肽的核酸受调节的表达产生。
42、根据实施方案35、39或41的转基因植物，或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜(beet)、糖萝卜(sugarbeet)或苜蓿(alfalfa)；或单子叶植物如甘蔗(sugarcane)；或谷类，如稻(rice)、玉米(maize)、小麦(wheat)、大麦(barley)、黍(millet)、黑麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱(sorghum)、二粒小麦(emmer)、斯佩耳特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、买罗高粱(milo)或燕麦(oat)。
43、根据实施方案42的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是种子。
44、源自根据实施方案42的植物和/或源自根据实施方案43的植物的可收获部分的产品。
45、编码实施方案25和29至33的任一项定义的VTC2-样多肽的核酸的用途，其用于相对于对照植物，增强植物的产量相关性状，优选用于增加产量，并且更优选用于相对于对照植物，在植物中增加种子产量。
46、相对于对照植物，增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节编码DUF1685多肽的核酸在植物中的表达，其中所述DUF1685多肽包含与SEQ ID NO：188的氨基酸坐标46至144位所示的DUF1685结构域(SEQ ID NO：256)具有至少50％序列同一性的保守结构域。
47、根据实施方案46的方法，其中所述调节的表达通过在植物中导入和表达所述编码所述DUF1685多肽的核酸来实现。
48、根据实施方案46或47的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，并优选包括相对于对照植物增加的种子产量。
49、根据实施方案46至48的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
50、根据实施方案46至48的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏的条件下获得的。
51、根据实施方案46至50的任一项的方法，其中所述DUF1685多肽包含DLTDEDLHELKGCIELGFGF(SEQ ID NO：258)所示的基序16，和/或LTNTLPALDLYFAV(SEQ ID NO：259)所示的基序17。
52、根据实施方案46至51的任一项的方法，其中所述编码DUF1685多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，还优选来自杨柳科(Salicaceae)，更优选来自杨属(Populus)，最优选来自毛果杨(Populustrichocarpa)。
53、根据实施方案46至52的任一项的方法，其中所述编码DUF1685多肽的核酸编码表A3列举的任一条多肽，或者是这类核酸的一部分或能够与这类核酸杂交的核酸。
54、根据实施方案46至53的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A3给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。
55、根据实施方案46至54的任一项的方法，其中所述核酸编码SEQID NO：188所示的DUF1685多肽。
56、根据实施方案46至55的任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选中等强度的组成型启动子，更优选植物启动子，最优选GOS2启动子有效连接。
57、能够通过根据实施方案46至56的任一项的方法获得的植物、其植物部分或植物细胞，所述植物部分包括种子，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码实施方案46和51至55的任一项定义的DUF1685多肽的重组核酸。
58、构建体，其包含：
(i)编码实施方案46和51至55的任一项定义的DUF1685多肽的核酸；
(ii)一个或多个能够驱动(i)的核酸序列表达的控制序列；和任选的
(iii)转录终止序列。
59、根据实施方案58的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选中等强度的组成型启动子，更优选植物启动子，最优选GOS2启动子。
60、根据实施方案58或59的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量。
61、用根据实施方案58或59的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
62、用于生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的生物量，所述方法包括：
(i)在植物细胞或植物中导入和表达编码实施方案46和51至55的任一项定义的DUF1685多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下，培养所述植物细胞或植物。
63、转基因植物，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选增加的种子产量，由编码实施方案46和51至55的任一项定义的DUF1685多肽的核酸受调节的表达产生。
64、根据实施方案57、61或63的转基因植物，或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜(beet)、糖萝卜(sugarbeet)或苜蓿(alfalfa)；或单子叶植物如甘蔗(sugarcane)；或谷类，如稻(rice)、玉米(maize)、小麦(wheat)、大麦(barley)、黍(millet)、黑麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱(sorghum)、二粒小麦(emmer)、斯佩耳特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、买罗高粱(milo)或燕麦(oat)。
65、根据实施方案64的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。
66、源自根据实施方案64的植物和/或源自根据实施方案65的植物的可收获部分的产品。
67、编码实施方案46和51至55的任一项定义的DUF1685多肽的核酸的用途，其用于相对于对照植物，增强植物的产量相关性状，优选用于相对于对照植物增加产量，并且更优选用于相对于对照植物，在植物中增加种子产量。
68、相对于对照植物，增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节编码ARF6-样多肽的核酸在植物中的表达，其中所述ARF6-样多肽包含B3DNA结合结构域、Q rich结构域、生长素应答结构域和Aux/IAA家族结构域。
69、根据实施方案68的方法，其中所述调节的表达通过在植物中导入和表达所述编码所述ARF6-样多肽的核酸来实现。
70、根据实施方案68或69的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，并且优选包括相对于对照植物增加的生物量和/或增加的种子产量。
71、根据实施方案68至70的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
72、根据实施方案68至70的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏的条件下获得的。
73、根据实施方案68至72的任一项的方法，其中所述ARF6-样多肽包含一个或两个下列基序：
(i)基序18：VYFPQGHSEQVAAST(SEQ ID NO：304)，
(ii)基序19：ATFVKVYK(SEQ ID NO：305)。
74、根据实施方案68至73的任一项的方法，其中所述编码ARF6-样的核酸是植物来源的，优选来自单子叶植物，还优选来自禾本科(Poaceae)，更优选来自稻属(Oryza)，最优选来自稻(Oryza sativa)。
75、根据实施方案68至74的任一项的方法，其中所述编码ARF6-样的核酸编码编码表A4列举的任一条多肽，或者是这类核酸的一部分或能够与这类核酸杂交的核酸。
76、根据实施方案68至75的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A4给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。
77、根据实施方案68至76的任一项的方法，其中所述核酸编码SEQID NO：261所示的多肽。
78、根据实施方案68至77的任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选中等强度的组成型启动子，优选植物启动子，更优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子有效连接。
79、能够通过根据实施方案68至78的任一项的方法获得的植物、其植物部分或植物细胞，所述植物部分包括种子，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码实施方案68和73至77的任一项定义的ARF6-样多肽的重组核酸。
80、构建体，其包含：
(i)编码实施方案68和73至77的任一项定义的ARF6-样多肽的核酸；
(ii)一个或多个能够驱动(i)的核酸序列表达的控制序列；和任选的
(iii)转录终止序列。
81、根据实施方案80的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选中等强度的组成型启动子，优选植物启动子，更优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
82、根据实施方案80或81的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的生物量。
83、用根据实施方案80或81的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
84、用于生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的生物量，所述方法包括：
(i)在植物细胞或植物中导入和表达编码实施方案68和73至77的任一项定义的ARF6-样多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下，培养所述植物细胞或植物。
85、转基因植物，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选增加的种子产量和/或增加的生物量，由编码实施方案68和73至77的任一项定义的ARF6-样多肽的核酸受调节的表达产生。
86、根据实施方案69、83或85的转基因植物，或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜(beet)、糖萝卜(sugarbeet)或苜蓿(alfalfa)；或单子叶植物如甘蔗(sugarcane)；或谷类，如稻(rice)、玉米(maize)、小麦(wheat)、大麦(barley)、黍(millet)、黑麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱(sorghum)、二粒小麦(emmer)、斯佩耳特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、买罗高粱(milo)或燕麦(oat)。
87、根据实施方案86的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。
88、源自根据实施方案86的植物和/或源自根据实施方案87的植物的可收获部分的产品。
89、编码实施方案68和73至77的任一项定义的ARF6-样多肽的核酸的用途，其用于相对于对照植物，增强植物的产量相关性状，优选用于增加产量，并且更优选相对于对照植物，在植物中用于增加种子产量和/或用于增加生物量。
附图描述
下面将参考下列附图描述本发明，其中：
图1展示了SEQ ID NO：2的结构域结构，其具有保守基序1至3。
图2展示了多种VIM1-样多肽的多重比对。当使用保守氨基酸时，这些比对可用于定义其他基序。
图3显示了VIM1-样多肽的系统发生树、VIM1-样相关蛋白的系统发生关系。使用MAFFT比对蛋白质(Katoh和Toh(2008).Briefings inBioinformatics9：286-298.)。
图4显示了MATGAT表(实施例3)。
图5展示了用于增加处于稻GOS2启动子(pGOS2)控制下的VIM1-样-编码核酸在稻中的表达的二元载体。
图6展示了SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：63的比对，以粗体指示PTHR20884结构域。
图7展示了多种单子叶和双子叶VTC2-样多肽的多重比对。星号指示在各种蛋白质序列之间的相同氨基酸，冒号表示高保守的氨基酸取代，并且点代表较不保守的氨基酸取代；在其他位置上没有序列保守性。当使用保守氨基酸时，这些比对可用于定义其他基序。
图8显示了VTC2-样多肽的系统发生树。
图9显示了MATGAT表(实施例3)。
图10展示了用于增加处于稻GOS2启动子(pGOS2)控制下的VTC2-样-编码核酸在稻中的表达的二元载体。
图11展示了SEQ ID NO：188的结构域结构，其具有保守DUF1685结构域(下划线)。
图12展示了多种DUF1685多肽的多重比对。星号指示在各种蛋白质序列之间的相同氨基酸，冒号表示高保守的氨基酸取代，点代表较不保守的氨基酸取代；在其他位置上没有序列保守性。当使用保守氨基酸时，这些比对可用于定义其他基序。
图13显示了MATGAT表(实施例3)
图14展示了用于增加处于稻GOS2启动子(pGOS2)控制下的DUF1685-编码核酸在稻中的表达的二元载体。
图15展示了具有保守基序或结构域的SEQ ID NO：261的结构域结构。
图16展示了用于增加处于稻GOS2启动子(pGOS2)控制下的ARF6-样-编码核酸在稻中的表达的二元载体。
图17显示了ARF6-样多肽的系统发生树。
实施例
现将参考以下仅用于说明的实施例来描述本发明。以下实施例不旨在限定本发明的范围。
DNA操作：除非另有说明，根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等(1994)，Current Protocols in MolecularBiology，Current Protocols第1卷和第2卷中所述标准方案进行重组DNA技术。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的由R.D.D Croy编著的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中。
实施例1：鉴定与本发明方法中使用的核酸序列相关的序列。
VIM1(甲基化变体1)-样多肽
使用数据库序列检索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库所维护的那些序列内鉴定到与SEQ ID NO：1以及SEQ ID NO：2相关的序列(全长cDNA、EST或基因组)。该程序用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。例如，SEQ ID NO：1的核酸所编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置并关闭忽略低复杂度序列的过滤。分析的结果通过配对性比较显示，并根据概率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分比进行记分。同一性百分比指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些例子中，可以调整缺省参数以修改检索的严格性。例如可以提高E值以显示较低严格性的匹配。这样，可以鉴定短的近似精确的匹配。
表A1提供了与SEQ ID NO：1和2相关的核酸序列和多肽序列的列表。
表A1：VIM1-样核酸和多肽的实例：
2.VTC2-样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽
使用数据库序列检索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库所维护的那些序列内鉴定到与SEQ ID NO：60以及SEQ ID NO：61相关的序列(全长cDNA、EST或基因组)。该程序用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。例如，SEQ ID NO：60的核酸所编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置并关闭忽略低复杂度序列的过滤。分析的结果通过配对性比较显示，并根据概率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分比进行记分。同一性百分比指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些例子中，可以调整缺省参数以修改检索的严格性。例如可以提高E值以显示较低严格性的匹配。这样，可以鉴定短的近似精确的匹配。
表A2提供了与SEQ ID NO：60和61相关的核酸序列和多肽序列的列表。
表A2：VTC2-样核酸和多肽的实例：
3.DUF1685多肽
使用数据库序列检索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库所维护的那些序列内鉴定到与SEQ ID NO：187以及SEQ ID NO：188相关的序列(全长cDNA、EST或基因组)。该程序用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。例如，SEQ ID NO：187的核酸所编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置并关闭忽略低复杂度序列的过滤。分析的结果通过配对性比较显示，并根据概率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分比进行记分。同一性百分比指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些例子中，可以调整缺省参数以修改检索的严格性。例如可以提高E值以显示较低严格性的匹配。这样，可以鉴定短的近似精确的匹配。
表A3提供了与SEQ ID NO：187和188相关的核酸序列和多肽序列的列表。
表A3：DUF1685核酸和多肽的实例：
4.ARF6-样(生长素应答因子)多肽
使用数据库序列检索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库所维护的那些序列内鉴定到与SEQ ID NO：260以及SEQ ID NO：261相关的序列(全长cDNA、EST或基因组)。该程序用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。例如，SEQ ID NO：260的核酸所编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置并关闭忽略低复杂度序列的过滤。分析的结果通过配对性比较显示，并根据概率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分比进行记分。同一性百分比指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些例子中，可以调整缺省参数以修改检索的严格性。例如可以提高E值以显示较低严格性的匹配。这样，可以鉴定短的近似精确的匹配。
表A4提供了与SEQ ID NO：260和261相关的核酸序列和多肽序列的列表。
表A4：ARF6-样核酸和多肽的实例：
序列已经由研究协会例如基因组研究协会(TIGR；以TA开头)暂时组装并对公众公开。例如，可以使用真核基因直向同源物(EGO)数据库鉴定这类相关序列，用目的核酸或多肽序列进行关键词搜索或通过使用BLAST算法进行。针对具体的生物(例如对于某些真核生物)已经创建了具体的核酸序列数据库，例如由联合基因组协会(Joint Genome Institute)创建的那些。另外，使用专利数据库允许鉴定新的核酸和多肽序列。
实施例2：在本发明方法中使用的多肽序列的序列比对
1.VIM1(甲基化变体1)-样多肽
在图2中显示的比对使用MAFFT(Katoh和Toh(2008)-Briefings inBioinformatics9：286-298)来产生。图3中显示的系统发生树使用Dendroscope(Huson等人(2007)，BMC Bioinformatics8(1)：460)来绘制。就主要分支指出100引导程序重复的置信。
2.VTC2-样(GDP-L半乳糖磷酸化酶)多肽
使用逐步比对的ClustalW2.0算法(Thompson等人(1997)NucleicAcids Res25：4876-4882；Chenna等(2003).Nucleic Acids Res31：3497-3500)实施多肽序列的比对，采用标准设定(慢比对，相似矩阵：Gonnet，空位开放罚分10，空位延伸罚分0.2)。进行少量人工编辑以进一步优化比对。在图7中比对了VTC2-样多肽。
使用MAFFT(Katoh和Toh(2008)-Briefings in Bioinformatics9：286-298)，通过比对VTC2-样序列，构建VTC2-样多肽的系统发生树(图8)。使用Quick-Tree(Howe等人(2002)，Bioinformatics18(11)：1546-7)，100引导程序重复(bootstrap repetitions)，计算邻接树。使用Dendroscope(Huson等人(2007)，BMC Bioinformatics8(1)：460)绘制聚类图。就主要分支指出100引导程序重复的置信水平。
3.DUF1685多肽
使用逐步比对的ClustalW(1.81)算法(Thompson等人(1997)NucleicAcids Res25：4876-4882；Chenna等(2003).Nucleic Acids Res31：3497-3500)实施多肽序列的比对，采用标准设定(慢比对，相似矩阵：Gonnet，空位开放罚分10，空位延伸罚分0.2)。进行少量人工编辑以进一步优化比对。在图13中表示了DUF1685多肽的比对。
4.ARF6-样(生长素应答因子)多肽
使用逐步比对的ClustalW2.0算法(Thompson等人(1997)NucleicAcids Res25：4876-4882；Chenna等(2003).Nucleic Acids Res31：3497-3500)实施多肽序列的比对，采用标准设定(慢比对，相似矩阵：Gonnet，空位开放罚分10，空位延伸罚分0.2)。进行少量人工编辑以进一步优化比对。
使用MAFFT(Katoh和Toh(2008)-Briefings in Bioinformatics9：286-298)，通过比对ARF6-样序列，构建ARF6-样多肽的系统发生树(图17)。使用Quick-Tree(Howe等人(2002)，Bioinformatics18(11)：1546-7)，100引导程序重复(bootstrap repetitions)，计算邻接树。使用Dendroscope(Huson等人(2007)，BMC Bioinformatics8(1)：460)绘制聚类图。就主要分支指出100引导程序重复的置信水平。
实施例3：计算用于实施本发明方法的多肽序列之间的全局百分比同一性
使用本领域可获得的方法之一MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：an application that generatessimilarity/identity matrices using protein or DNA sequences.CampanellaJJ，Bitincka L，Smalley J；软件由Ledion Bitincka提供)确定用于实施本发明方法的全长多肽序列之间全局相似性百分比和同一性百分比。MatGAT软件为DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需数据的预比对。该程序使用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列逐对比对，使用例如Blosum62(对于多肽)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。
1.VIM1(甲基化变体1)样多肽
在图4中显示了多肽序列的全长范围上的全局相似性和同一性的软件分析结果。序列相似性在分界线下半部分显示，并且序列同一性在对角分界线的上半部分显示。比较中使用的参数是：评分矩阵：Blosum62，第一空位：12，延伸空位：2。与SEQ ID NO：2相比，在用于实施本发明方法的VIM1-样多肽序列之间的序列同一性(以％计)可低至36.2％(通常高于36.2％)。
表B1：图4中的蛋白质描述
| 1.Poptr_VIM1 |
| 2.A.lyrata_315436 |
| 3.A.lyrata_338526 |
| 4.A.lyrata_908083 |
| 5.A.lyrata_908084 |
| 6.A.thaliana_AT1G57800.1 |
| 7.A.thaliana_AT1G57820.1 |
| 8.A.thaliana_AT1G66040.1 |
| 9.A.thaliana_AT1G66050.1 |
| 10.A.thaliana_AT5G39550.1 |
| 11.G.max_Glyma02g47920.1 |
| 12.G.max_Glyma12g00330.1 |
| 13.G.max_Glyma14g00670.1 |
| 14.M.truncatula_AC152919_52.5 |
| 15.O.sativa_LOC_Os04g22240.1 |
| 16.O.sativa_LOC_Os05g01230.1 |
| 17.OS_C3HGroup26 |
| 18.P.patens_123970 |
| 19.P.patens_152968 |
| 20.P.trichocarpa_817505 |
| 21.S.bicolor_Sb09g000320.1 |
| 22.S.moellendorffii_109372 |
| 23.V.vinifera_GSVIVT00006203001 |
| 24.Z.mays_TC464062 |
| 25.Zea_mays_GRMZM2G162211_T01 |
| 26.Zea_mays_GRMZM2G339151_T01 |
2.VTC2-样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽
在图9中显示了单子叶植物和双子叶植物VTC2-样蛋白质的多肽序列的全长范围上的全局相似性和同一性的软件分析结果。序列相似性在分界线下半部分显示，并且序列同一性在对角分界线的上半部分显示。比较中使用的参数是：评分矩阵：Blosum62，第一空位：12，延伸空位：2。与SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：63相比，在用于实施本发明方法的VTC2-样多肽序列之间的序列同一性(以％计)可低至43％。
3.DUF1685多肽
在图13中显示了多肽序列的全长范围上的全局相似性和同一性的软件分析结果。序列相似性在分界线下半部分显示，并且序列同一性在对角分界线的上半部分显示。比较中使用的参数是：评分矩阵：Blosum62，第一空位：12，延伸空位：2。与SEQ ID NO：188相比，在用于实施本发明方法的DUF1685多肽序列之间的序列同一性(以％计)通常高于25％。
在表2中展示了对于多肽亚组的多肽序列全长范围上的全局相似性和同一性的软件分析结果。示例性的DUF1685多肽都属于HOMO00944(使用PLAZA，The Plant Cell21：3718-3731确定的)基因家族，和ORTHO008516亚家族。
表B2
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |
| 1.PT00G11895 | 63，4 | 68，4 | 40，4 | 73，2 | 39，6 | 67，8 | |
| 2.AT1G08790 | 73，2 | 59，3 | 41，2 | 58，8 | 40，4 | 63，3 | |
| 3.CP01244G00020 | 79，3 | 72，7 | 44，5 | 60 | 41，7 | 66，3 | |
| 4.OS04G21340 | 51，1 | 54，4 | 53，2 | 41，4 | 66 | 44，1 | |
| 5.PT13G03890 | 76，3 | 66，3 | 67，5 | 48，9 | 37，8 | 61，9 | |
| 6.SB06G005440 | 53，1 | 51，5 | 54 | 75，3 | 48，5 | 42，9 | |
| 7.VV00G03890 | 78，8 | 73，6 | 77，2 | 53，2 | 69，5 | 53，6 |
实施例4：鉴定在用于实施本发明方法的多肽序列中包含的结构域
蛋白质家族、结构域和位点集成资源(Integrated Resouce of ProteinFamilies，domain and Site，InterPro)数据库是基于文本和序列的检索的通常所用特征序列数据库的集成界面。InterPro数据库组合了这些数据库，所述的数据库使用不同方法学和不同程度的有关已充分表征蛋白质的生物学信息以得到蛋白质特征序列。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的，多重序列比对和隐藏的马尔可夫模型(hidden Markov models)的大集合。Pfam由大不列颠联合王国的Sanger研究所的服务器上提供。Interpro由大不列颠联合王国的欧洲生物信息研究所提供。
1.VIM1(甲基化变体1)-样多肽
由SEQ ID NO：2所示的多肽序列的InterPro scan(InterPro数据库，release26.0)的结果显示在表C1中。
表C1：由SEQ ID NO：2所示的多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)。
| 数据库 | 登录号 | 登录名 | 在SEQ ID NO2上的氨基酸坐标： |
| HMMPfam | PF02182 | YDG_SRA | 265-415 |
| HMMPfam | PF00097 | C3HC4RING-type | 135-173 |
| HMMPfam | PF00097 | C3HC4RING-type | 508-564 |
| HMMSmart | SM00249 | PHD-finger | 10-57 |
在一个实施方案中，VIM1-样多肽包含保守结构域(或基序)，其与SEQ ID NO：2的氨基酸坐标265至415、135至173、508至564和/或10至57的保守结构域具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
2.VTC2-样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽
由SEQ ID NO：61所示的多肽序列的InterPro扫描(InterPro数据库，release28.0)的结果显示在表C2中。
表C2：由SEQ ID NO：61所示的多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)。
在一个实施方案中，VTC2-样多肽包含保守结构域(或基序)，其与具有SEQ ID NO：61中的氨基酸坐标2至442或SEQ ID NO：63中的氨基酸坐标5至426的保守结构域具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
3.DUF1685多肽
由SEQ ID NO：188所示的多肽序列的InterPro scan(InterPro数据库，release28.0)的结果显示在表C3中。
表C3：由SEQ ID NO：188所示的多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)。
| 数据库 | 编号 | 名称 | 开始 | 终止 | p-值 | 登录 |
| Pfam(版本24.0) | PF07939 | DUF1685 | 46 | 144 | 1，10E-42 | IPR012881 |
4.ARF6-样(生长素应答因子)多肽
由SEQ ID NO：261所示的多肽序列的InterPro扫描(InterPro数据库，http://www.ebi.ac.uk/interpro/)结果显示在表C4中。
表C4：由SEQ ID NO：261所示的多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)。
| 数据库 | 登录号 | 登录名 | 在SEQ ID NO261上的氨基酸坐标 |
| IPR003340 | PF02326 | 134至236 | |
| IPR010525 | PF06507 | 260至343 | |
| IPR003311 | PF02309 | 729至868 |
实施例5：在实施本发明方法中有用的多肽序列的拓扑学预测
TargetP1.1预测真核蛋白质的亚细胞定位。位置分配是基于经预测存在的任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)。最终预测所依据的评分并非真的是概率，并且它们未必加起来等于一。然而，具有最高评分的位置根据TargetP是最有可能的，并且评分之间的关系(可靠性类别)可以是预测的肯定性的一个指标。可靠性类别(RC)范围从1至5，其中1表示最强预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
对于预测含有氨基端前序列的序列，也可以预测潜在的切割位点。
选择了众多参数，如生物组(非植物或植物)、临界设置(cutoff set)(无、临界的预定义设置或临界的用户指定设置)和对切割位点预测的计算(是或否)。
众多其它算法可以用来执行此类分析，包括：
·在丹麦技术大学服务器上提供的ChloroP1.1；
·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生物科学研究所(Institute forMolecular Bioscience，University of Queensland，Brisbane，Australia)的服务器上提供的蛋白质Prowler亚细胞定位预测程序(Protein ProwlerSubcellular Localisation Predictor)第1.2版；
·在加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学(University ofAlberta，Edmonton，Alberta，Canada)的服务器上提供的PENCE ProteomeAnalyst PA-GOSUB2.5；
·在丹麦技术大学服务器上提供的TMHMM；
·PSORT(URL：psort.org)。
·PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。
1.VTC2-样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽
在表D1和D2中呈现如SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：63表示的多肽序列的TargetP1.1分析结果。已经选择“植物”生物组，没有限定截断(cutoff)，并且要求转运肽的预测的长度。如SEQ ID NO：61和SEQ IDNO：63表示的多肽序列的亚细胞定位可以是细胞质或细胞核，没有预测到转运肽。
表D1：如SEQ ID NO：61表示的多肽序列的TargetP1.1分析。缩写：Len，长度；cTP，叶绿体转运肽；mTP，线粒体转运肽，SP，分泌途径信号肽，other，其他亚细胞靶定，Loc，预测的位置；RC，可靠性类别；TPlen，预测的转运肽长度。
表D2：如SEQ ID NO：63表示的多肽序列的TargetP1.1分析。缩写：Len，长度；cTP，叶绿体转运肽；mTP，线粒体转运肽，SP，分泌途径信号肽，other，其他亚细胞靶定，Loc，预测的位置；RC，可靠性类别；TPlen，预测的转运肽长度。
实施例6：与用于实施本发明方法的多肽序列相关的测定
1.VIM1(甲基化变体1)-样多肽
VIM1-样蛋白质调节DNA甲基化并且是功能性泛素E3连接酶，如Kraft等人，The Plant Journal(2008)56，704-715所述。
2.VTC2-样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽
通过Linster等人，(2007)所述测量VTC2活性：通过测量孵育后的GDP形成来测定纯化的重组拟南芥VTC2的磷酸化酶活性，所述孵育用在反应混合物中的多种GDP-己糖，所述反应混合物为pH7.5，包含50mMTris-HCl、5mM磷酸钠、2mM MgCl2、10mM NaCl和1mM二硫苏糖醇。反应(26℃)用酶起始并且在5-60分钟后通过98℃加热3分钟来终止。在通过离心移除沉淀的蛋白质后，通过阴离子交换HPLC分析上清液，所述HPLC在Partisil SAX柱上(10μm珠尺寸，4.6x250mm；AlltechAssociates，Deerfield，IL)，使用Hewlett Packard Series II1090液体层析。使用0.01-0.5M NH4H2PO4的梯度，pH3.7，流速为2ml/min。通过在254nm的吸光度，使用参照波长450nm来检测核苷酸。GMP、GDP-己糖和GDP分别在大概13、17和24min洗脱。为了测定反向(己糖1-磷酸+GDP→GDP-己糖+Pi)的酶活性，通过阴离子交换HPLC方法在用多种己糖1-磷酸和如上所述的5mM GDP(除了省略了磷酸钠和MgCL2)孵育VTC2后测量GDP-己糖浓度。通过比较整合的峰面积和那些标准的GDP或GDP-D-Man溶液，计算GDP和GDP-己糖浓度。GDP-L-半乳糖和GDP-D-葡萄糖已经被鉴定为用于测定VTC2活性的良好底物(Linster等人，2007)。
3.ARF6-样(生长素应答因子)多肽
在Ulmasov等人，1997，卷9，第1963-1971页中描述了测量ARF6-样的功能性活性的测定。
实施例7：用于本发明方法中的的核酸序列的克隆
1.VIM1(甲基化变体1)-样多肽
通过PCR，使用定制的毛果杨幼苗cDNA文库作为模板括增核酸序列。在标准条件中使用Hifi Taq DNA聚合酶，使用在50μlPCR混合物中的200ng模板实施PCR。所用的引物为prm15909(SEQ ID NO：58；正义)：
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggaactcccgtgcg-3’和prm15910(SEQ ID NO：59；反义，互补)：
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgctccagcatacgttattgac-3’，其包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”，pVIM1-样。质粒pDONR201作为
技术的部分从Invitrogen购买。
含有SEQ ID NO：1的进入克隆随后在LR反应中与一种用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物可选择标记；可筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆内的目的核酸序列用于LR体内重组的Gateway盒。用于组成型特异表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：57)位于这种Gateway盒的上游。
LR重组步骤之后，将获得的表达载体pGOS2::VIM1-样(图5)根据本领域众所周知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
2.VTC2-样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽
通过PCR，使用定制的拟南芥幼苗cDNA文库(用于SEQ ID NO：60)和定制的普通小麦幼苗cDNA文库(用于SEQ ID NO：62)作为模板扩增核酸序列。在标准条件中使用Hifi Taq DNA聚合酶，使用在50μlPCR混合物中的200ng模板实施PCR。用于克隆SEQ ID NO：60的引物是prm15125(SEQ ID NO：183；正义)：
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgttgaaaatcaaaagagtt-3’和prm15126(SEQ ID NO：184；反义，互补)：
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatacatacaaaccaccaa gtc-3’。对于克隆SEQID NO：62，使用下列PCR引物：
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggagatgaagctgacgatt-3’
(prm15127，SEQ ID NO：185)和prm15128(SEQ ID NO：186；反义，互补)：
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctggg tcgaacctagcgatctgaaaga-3’，其全部包括用于Gateway重组的AttB位点。
还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”，pVTC2-样，其包含SEQ IDNO：60或SEQ ID NO：62。质粒pDONR201作为
技术的部分从Invitrogen购买。
含有SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62的进入克隆随后在LR反应中与一种用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物可选择标记；可筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆内的目的核酸序列用于LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：180)位于这种Gateway盒的上游。
LR重组步骤之后，将获得的表达载体pGOS2::VTC2-样(包含SEQID NO：60或SEQ ID NO：62，图10)根据本领域众所周知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
3.DUF1685多肽
通过PCR，使用定制的毛果杨幼苗cDNA文库作为模板括增本实施例的核酸序列。在标准条件中使用Hifi Taq DNA聚合酶，使用在50μl PCR混合物中的200ng模板实施PCR。所用的引物为
prm16186(SEQ ID NO：253；正义，起始密码子为黑体)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgaagaactgtcatgagcct-3’和prm16187(SEQ ID NO：254；反义，互补)：
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtagctctgtacaatctatcccg-3’，其包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”，pDUF。质粒pDONR201作为
技术的部分从Invitrogen购买。
含有SEQ ID NO：187的进入克隆随后在LR反应中与一种用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物可选择标记；可筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆内的目的核酸序列用于LR体内重组的Gateway盒。用于组成型特异表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：255)位于这种Gateway盒的上游。
LR重组步骤之后，将获得的表达载体pGOS2::DUF(图14)根据本领域众所周知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
4.ARF6-样(生长素应答因子)多肽
通过PCR，使用定制的稻幼苗cDNA文库作为模板括增核酸序列。在标准条件中使用可商购的proofreading Taq DNA聚合酶，使用在50μlPCR混合物中的200ng模板实施PCR。
所用的引物为
prm09655(SEQ ID NO：311；正义，起始密码子为黑体)：
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgaagctctcgccgtc-3’和prm09656(SEQ ID NO：312；反义，互补)：
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttgctatgagctccctatttct-3’，其包括用于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”。质粒pDONR201作为
技术的部分从Invitrogen购买。
含有SEQ ID NO：260的进入克隆随后在LR反应中与一种用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物可选择标记；可筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆内的目的核酸序列用于LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：310)位于这种Gateway盒的上游。
LR重组步骤之后，将获得的表达载体pGOS2::ARF6-样(图16)根据本领域众所周知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
实施例8：植物转化
稻转化
含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将稻的日本(japonica)栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育一分钟，随后在0.2％HgCl2中30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟而实施消毒。消毒的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上发芽。在黑暗中孵育4周后，将胚胎发生的，来自小盾片的愈伤组织切下并在同一种培养基上增殖。2周后，愈伤组织通过在同一种培养基上继代培养另外2周而繁殖或增殖。胚发生性愈伤组织片在新鲜培养基上继代培养3日，之后共培育(以强化细胞分裂活性)。
含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并重悬在液体共培育培养基中至密度(OD600)约1。将混悬液随后转移至培养皿并将愈伤组织在该混悬液内浸泡15分钟。愈伤组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃孵育3日。共培育的愈伤组织在黑暗中于28℃在选择剂存在下于含有2，4-D的培养基上培育4周。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再生培养基并在光照下培育后，胚发生潜力释放并且芽在随后4至5周发育。将芽(shoot)从愈伤组织中切下并且在含有生长素的培养基上培育2至3周，将芽从所述的培养基上转移至土壤。硬化的芽在高湿度和短日照下于温室中培育。
对一个构建体而言产生约35至90个独立的T0稻转化体。原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留表现选择剂耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3至5月收获。本方法以超过50％的比率产生单一基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。
实施例9：其他作物的转化
玉米转化
玉米(玉蜀黍)的转化根据Ishida等(1996.Nature Biotech14(6)：745-50)描述方法的改进方法进行。在玉米中的转化是基因型依赖的并且仅特定的基因型可适用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，但是其它基因型也可以成功地使用。在授粉后(DAP)大约11日从玉米植物中收获玉米穗，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而回收。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养板在25℃于光照下培养2-3周，或直至芽发育。将绿色芽从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的芽移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
小麦转化
小麦的转化用Ishida等(1996)Nature Biotech14(6)：745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(可从墨西哥CIMMYT获得的)栽培品种Bobwhite。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而回收。在与农杆菌孵育后，胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至芽发育。将绿色芽从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的芽移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
大豆转化
根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改进方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生节。将这些腋生节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的芽切下并置于芽伸长培养基上。将长度不超过1cm的芽置于生根培养基上直至根发育。将生根的芽移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
油菜/卡诺拉油菜(rapeseed/canola)转化
使用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培育的外植体并且根据Babic等(1998，Plant Cell Rep17：183-188)转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。对卡诺拉油菜种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种(含有表达载体的)农杆菌。外植体随后在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基上在23℃，16小时光照下培养2天。在与农杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有的3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上持续7日，并且随后在含头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至芽再生。当芽具有5-10mm长度时，将芽切下并转移至芽伸长培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的芽转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的芽移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
苜蓿转化
紫苜蓿(Medicago sativa)的再生性克隆使用(McKersie等，1999PlantPhysiol119：839-847)的方法加以转化。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW与A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture4：111-112)描述的任何其它商业苜蓿品种。备选地，RA3品种(威斯康星大学(University of Wisconsin))已经被选择用于组织培养中(Walker等，1978Am J Bot65：654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等，1999Plant Physiol119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑暗中在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3天。外植体在半强度(half-strength)Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并平板接种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和合适抗生素以抑止农杆菌生长的相同SH诱导培养基上。在数周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半强度Murashige-Skoog培养基上发芽。将生根的幼苗移植至花盆内并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
棉花转化
根据US5,159,135中所述的方法使用根癌农杆菌转化棉花。将棉花种子在3％次氯酸钠溶液中表面灭菌20分钟，并以含有500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水洗涤。接着将种子转移至含有50μg/ml苯菌灵的SH培养基中进行发芽。取下4至6日龄幼苗的下胚轴，剪成0.5cm的片并置于0.8％琼脂上。用农杆菌悬液(约108个细胞/ml，从转化有目的基因和适当选择标记的过夜培养物稀释而成)接种下胚轴外植体。室温光照3天后，将组织转移至固体培养基(1.6g/l Gelrite)，其带有包含B5维生素的Murashige和Skoog盐(Gamborg等，Exp.Cell Res.50：151-158(1968))，0.1mg/l2，4-D，0.1mg/l6-糠胺嘌呤和750μg/ml MgCL2，并含有50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素以杀死残余细菌。2至3个月(每4至6周继代培养)后分离单个细胞系，并在选择培养基上进一步培养进行组织扩增(30℃，16小时光周期)。接着在非选择培养基上将转化组织再培养2至3个月，以产生体细胞胚。将至少4mm长的表观健康的胚转移至管中，其中含有细蛭石中的SH培养基，并补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6糠胺嘌呤和赤霉酸。以16小时光周期在30℃下培养胚，并将2至3叶期的小植株转移至含有蛭石和养分的盆中。植物变硬并接着移至温室中进一步培养。
实施例10：表型评价方法
10.1评价建立
产生大约35个至90个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室以种植并收获T1种子。保留6个事件，其中所述事件的T1后代以3∶1对所述转基因的存在/不存在分离。对于这些事件中的每一个，通过监测可视标记表达选择大约9或10株含有该转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约9或10株缺少该转基因的T1幼苗(失效合子)。以随机位置并排种植转基因植物和相应的失效合子。温室条件是短日照(12小时光照)，光照下28℃和黑暗下22℃，和70％相对湿度。以规律的间隔期对在非胁迫条件下生长的植物浇水，以确保水和养分不是限制性的并且满足植物完成生长和发育的需要。
使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
可根据如用于T1代的相同评价方法，例如利用较少的事件和/或每个事件较多的个体在T2代中进一步评价T1事件。
干旱筛选
在盆栽土壤中在正常条件下种植T1或T2植物直至它们达到抽穗期。然后将它们转移至“干燥”段，其中不予灌溉。将土壤湿度探针插入随机选择的盆内，以监测土壤含水量(SWC)。当SWC低于某些阈值时，自动对所述植物连续再浇水直至再次达到正常水平。然后将植物再次转移至正常条件。剩余的培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下生长的植物相同。如对正常条件下生长所详述的记录生长和产量参数。
氮使用效率筛选
在除营养液之外的正常条件下在盆栽土壤中种植T1或T2植物。从移植至成熟期间用含有降低的、通常减少了7至8倍之间的N氮(N)含量的特定营养液浇灌所述盆。剩余的培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫下生长的植物相同。如对正常条件下生长所详述的记录生长和产量参数。
盐胁迫筛选
T1或T2植物种植在椰子纤维和烘烤粘土颗粒(Argex)(3∶1比例)组成的基质上。在将小植物移植到温室中后，在头两周期间使用正常营养液。在头两周后，添加25mM盐(NaCl)至所述营养液，直至收获植物。如对正常条件下的生长所详述的记录生长和产量参数。
10.2统计分析：F-检验
将两因子ANOVA(方差分析)用作总体评价植物表型特征的统计模型。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部测量参数进行F检验。实施F检验以检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体效应(又称作总体基因效应)。对于F检验，将真实总体基因效应的显著性的阈值设在5％概率水平上。显著性F检验值指出基因效应，这意味不是仅基因的存在或位置才引起表型上的差异。
10.3测量的参数
使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。如WO2010/031780中描述的在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。这些测量用于确定不同参数。
生物量相关的参数测量
植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数来自地上的植物部分的数字图像上与背景区别的像素总数而确定。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正换算成以平方mm表述的物理表面值(physical surface value)。实验显示以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物已经实现其最大叶生物量的时间点上所测量的面积。
根生物量的增加表述为根总生物量增加(度量为在植物生命期间观察到的最大根生物量)；或表述为根/苗指数增加，度量为根和苗的活跃生长时期中根质量与苗质量之间的比例。换言之，该根/苗指数定义为根和苗活跃生长期中根生长速度与苗生长速度的比例。根生物量可使用如WO2006/029987中描述的方法进行测定。
与发育时间相关的参数
早期萌发势是萌发后3周的植物地上部分面积。通过计数来自地上植物部分中与背景区别的像素总数确定早期萌发势。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正换算成以平方mm表述的物理表面值(physical surface value)。
早期幼苗萌发势是当小植株大约4cm高时的幼苗地上面积。
AreaEmer指示快速的早期发育，当与对照植物相比时该值降低。其为植物需要产生30％的最终生物量的时间和植物需要产生90％最终生物量的时间之间的比例(以％表述)。
植物的“开花时间”或“开花时间”可使用如WO2007/093444中描述的方法进行测定。
种子相关的参数测量值
将成熟的主要圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37℃干燥3日。随后将所述圆锥花序脱粒，并且收集和计数全部种子。种子一般被干燥的外罩(外壳)所覆盖。使用鼓风装置，将饱满粒(filled husk)(本文中也命名为饱满小花)与空粒分开。弃去空粒并且再次计数剩余部分。饱满粒在分析天平上称重。
通过计数分离步骤后仍留下的饱满粒数目确定种子总数。通过称量从植物收获的全部饱满粒测得种子总重量。
通过计数从植物收获的籽粒(无论饱满与否)的数目确定每株植物的小花总数。
从计数的种子数及它们的总重量外推出千粒重(TKW)。
本发明中的收获指数(HI)定义为种子总重量与地上部分面积(mm2)之间的比率，乘以系数106。
如本发明中定义的每一圆锥花序花的总数是种子总数与成熟主要圆锥花序数之间的比例。
如本发明中定义的“种子饱满率”是饱满小花(即含有种子的小花)数对小花总数的比例(表示为％)。换言之，种子饱满率是填充了种子的小花的百分比。
实施例11：转基因植物的表型评价结果
1.VIM1(甲基化变体1)-样多肽
在T1代中的且在非胁迫条件下表达编码SEQ ID NO：2的VIM1-样多肽的核酸的转基因稻植物的评价结果呈现于下文表E1中。当在非胁迫条件下生长时，观察到对于GravityYMax(其为叶生物质重心的高度)和HeightMax(其为植物最高顶点的高度)；并且对于种子产量，包括种子总重量、饱满种子数、饱满率和收获指数至少5％的增加。
表E1：转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示总体百分比增加，对于每个参数，p-值是＜0.05。
| 参数 | 总体增加 |
| 种子总重量 | 19.2 |
| 饱满率 | 30.6 |
| 收获指数 | 20.9 |
| 饱满种子数 | 16.7 |
| HeightMax | 6.8 |
| GravityYMax | 6.1 |
2.VTC2-样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽
转化了SEQ ID NO：60并且在非胁迫条件下生长的稻植物的评价结果呈现于表E2中。观察到对于种子总重量、饱满率、收获指数和千粒重(TKW)超过5％的增加。
表E2：在非胁迫条件下生长的转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示总体百分比增加，并且对于每个参数，p-值是＜0.05。
| 参数 | 总体增加 |
| 种子总重量(totalwgseeds) | 8.9 |
| 收获指数 | 8.8 |
| 饱满率 | 6.7 |
| TKW | 4.0 |
此外，观察到转化了杨树VTC2-样基因(P.trichocarpa_scaff_I.2538)的稻植物，在稻GOS2启动子的控制下，还显示出增加的种子产量：6个测试品系中的两个具有一个或多个增加的饱满率、增加的收获指数和增加的千粒重。
转化了SEQ ID NO：62并且在非胁迫条件下生长的稻植物的评价结果呈现于表E3中。观察到对于种子总重量、饱满率、收获指数和饱满种子数超过5％的增加。
表E3：在非胁迫条件下生长的转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示总体百分比增加，并且对于每个参数，p-值是＜0.05。
| 参数 | 总体增加 |
| 种子总重量(totalwgseeds) | 18.2％ |
| 收获指数 | 15.6％ |
| 饱满率 | 11.1 |
| 饱满种子数 | 14.6 |
3.DUF1685多肽
在T2代中的且在非胁迫条件下表达编码SEQ ID NO：188的DUF1685多肽的核酸的转基因稻植物的评价结果呈现于下文表E4中。当在非胁迫条件下生长时，观察到对于种子产量，包括种子总重量、饱满率、千粒重和收获指数至少5％的增加。
表E4：转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示总体百分比增加用于确认(T2代)，对于每个参数，p-值是＜0.05。
| 参数 | 总体增加 |
| 种子总重量(totalwgseeds) | 17.1 |
| 饱满率 | 8.9 |
| 收获指数 | 13.8 |
| 千粒重(TKW) | 5.1 |
4.ARF6-样(生长素应答因子)多肽
在T2代中的且在非胁迫条件下表达包含SEQ ID NO：260中的最长开放阅读框的核酸的转基因稻植物的评价结果呈现如下。对于转基因植物的代详见前文实施例。在非胁迫条件下的转基因稻植物的评价结果显示如下。对于总根生物量(RootMax)、地上生物量(AreaMax)、种子数、种子饱满率、每个圆锥花序的花数观察到超过5％的增加。
在T2代中的且在非胁迫条件下表达编码SEQ ID NO：261的ARF6多肽的核酸的转基因稻植物的评价结果呈现于下文表E5中。当在非胁迫条件下生长时，观察到对于地上生物量(AreaMax)、根生物量(RootMax和RootThickMax)，并且对于种子产量(包括种子总重量、种子数、饱满率和收获指数)至少5％的增加。此外，表达ARF6核酸的植物显示了在播种和植物达到90％的其最终生物量之日之间所需的最快的生长速率(更短的时间(以天))(AreaCycle)和最早的开始开花(开花时间：在播种和出现第一圆锥花序之间的时间(以天))。
表E5：转基因稻植物的数据总结；对于每个参数，显示总体百分比增加用于确认(T2代)，对于每个参数，p-值是＜0.05。
| 参数 | 总体改变 |
| AreaMax | 7.9 |
| RootShInd | -5.7 |
| 种子总重量(totalwgseeds) | -15.0 |
| 种子总数(nrtotalseed) | 12.2 |
| 饱满率(fillrate) | -20.3 |
| 收获指数(harvestindex) | -19.4 |
| 第一圆锥花序(firstpan) | 16.8 |
| 饱满种子数(nrfilledseed) | -13.5 |
Claims (87)
1.相对于对照植物，增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节编码VIM1-样多肽的核酸在植物中的表达，其中所述VIM1-样多肽包含Interpro登录号IPR019787，对应于PFAM登录号SM00249，植物同源异形域(PHD)结构域；Interpro登录号IPR018957，对应于PFAM登录号PF00097，really interesting new gene(RING)结构域和Interpro登录号IPR003105，对应于PFAM登录号PF02182，Set Ring Associated(SRA)结构域。
2.根据权利要求1的方法，其中所述调节的表达通过在植物中导入和表达所述编码所述VIM1-样多肽的核酸来实现。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，和优选的包括相对于对照植物增加的植物高度和/或增加的种子产量。
4.根据权利要求1至3的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
5.根据权利要求1至3的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏的条件下获得的。
6.根据权利要求1至5的任一项的方法，其中所述VIM1-样多肽包含一个或多个下列基序：
(i)基序1：RQWGAH[LF]PHVAGIAGQS[TA][YHV]GAQSVALSGGY[IED]DDEDHGEWFLYTGSGGRDL(SEQ ID NO：53)，
(ii)基序2：F[DE][KN][ML]N[EA]ALR[LV]SC[LK]KGYPVRVVRSHKEKRS[AS]YAPE[TES]GV(SEQ ID NO：54)，
(iii)基序3：A[YF]TTERAK[KR][AT]GKANA[CSA]SG[KQ]IFVT[VI][AP]PDHFGPI[PL]AENDP[ET]RN[MQ]GVLVG[ED][IST]W(SEQ ID NO：55)。
7.根据权利要求1至6的任一项的方法，其中所述编码VIM1-样多肽的核酸是植物来源的，优选的来自双子叶植物，还优选的来自杨柳科(Salicaceae)，更优选来自杨属(Populus)，最优选来自毛果杨(Populustrichocarpa)。
8.根据权利要求1至7的任一项的方法，其中所述编码VIM1-样多肽的核酸编码表A1列出的任一条多肽，或者是这类核酸的一部分，或者是能够与这类核酸杂交的核酸。
9.根据权利要求1至8的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A1给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。
10.根据权利要求1至9的任一项的方法，其中所述核酸编码与SEQID NO：2对应的VIM1-样多肽。
11.根据权利要求1至10的任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选与中等强度的组成型启动子，优选与植物启动子，更优选与GOS2启动子，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
12.能够通过根据权利要求1至11的任一项的方法获得的植物、其植物部分或植物细胞，所述植物部分包括种子，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码权利要求1和6至10的任一项定义的VIM1-样多肽的重组核酸。
13.构建体，其包含：
(i)编码权利要求1和6至10的任一项定义的VIM1-样多肽的核酸；
(ii)一个或多个能够驱动(i)的核酸序列表达的控制序列；和任选的
(iii)转录终止序列。
14.根据权利要求13的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选中等强度的组成型启动子，优选植物启动子，更优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
15.根据权利要求13或14的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的植物高度。
16.用根据权利要求13或14的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
17.用于生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的植物高度，所述方法包括：
(i)在植物细胞或植物中导入和表达编码权利要求1和6至10的任一项定义的VIM1-样多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下，培养所述植物细胞或植物。
18.转基因植物，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选增加的种子产量和/或增加的植物高度，由编码权利要求1和6至10的任一项定义的VIM1-样多肽的核酸受调节的表达产生。
19.根据权利要求12、16或18的转基因植物，或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜(beet)、糖萝卜(sugarbeet)或苜蓿(alfalfa)；或单子叶植物如甘蔗(sugarcane)；或谷类，如稻(rice)、玉米(maize)、小麦(wheat)、大麦(barley)、黍(millet)、黑麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱(sorghum)、二粒小麦(emmer)、斯佩耳特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、买罗高粱(milo)或燕麦(oat)。
20.根据权利要求19的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。
21.源自根据权利要求19的植物和/或源自根据权利要求20的植物的可收获部分的产品。
22.编码权利要求1和5至9和13的任一项定义的VIM1-样多肽的核酸的用途，其用于相对于对照植物，增强植物的产量相关性状，优选用于增加产量，并且更优选用于相对于对照植物，在植物中增加种子产量和/或增加植物高度。
23.相对于对照植物，增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节编码VTC2-样多肽的核酸在植物中的表达，其中所述VTC2-样多肽包含HMMPanther PTHR20884结构域。
24.根据权利要求23的方法，其中所述调节的表达通过在植物中导入和表达所述编码所述VTC2-样多肽的核酸来实现。
25.根据权利要求23或24的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，并优选包括相对于对照植物增加的种子产量。
26.根据权利要求23至25的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
27.根据权利要求23至26的任一项的方法，其中所述VTC2-样多肽包含一个或多个下列基序：
(i)基序4：WEDR[MFV][QA]RGLFRYDVTACETKVIPG[KE][LY]GF[IV]AQLNEGRHLKKRPTEFRVD[KRQ]V(SEQ ID NO：168)，
(ii)基序5：[DE][CR]LPQ[QR]ID[HPR][EKD]S[FL]LLA[VL][HYQ]MAAEA[GA][NS]PYFR[LV]GYNSLGAFATINHLHFQAYYL(SEQ ID NO：169)，
(iii)基序6：D[CS]G[KR][QR][IV]F[VL][LMF]PQCYAEKQALGEVS[PQ][DE][VL]L[DE]TQVNPAVWEISGH[MI]VLKR[KR][ETK]D[FY](SEQ ID NO：170)。
28.根据权利要求23至27的任一项的方法，其中所述编码VTC2-样的核酸是植物来源的，优选来自单子叶植物或双子叶植物。
29.根据权利要求23至28的任一项的方法，其中所述编码VTC2-样的核酸编码表A2列举的任一条多肽，或者是这类核酸的一部分或能够与这类核酸杂交的核酸。
30.根据权利要求23至29的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A2给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。
31.根据权利要求23至30的任一项的方法，其中所述编码所述VTC2-样多肽的核酸对应于SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62。
32.根据权利要求23至31的任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选中等强度的组成型启动子，优选植物启动子，更优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子有效连接。
33.能够通过根据权利要求23至32的任一项的方法获得的植物、其植物部分或植物细胞，所述植物部分包括种子，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码权利要求23和27至31的任一项定义的VTC2-样多肽的重组核酸。
34.构建体，其包含：
(i)编码权利要求23和27至31的任一项定义的VTC2-样多肽的核酸；
(ii)一个或多个能够驱动(i)的核酸序列表达的控制序列；和任选的
(iii)转录终止序列。
35.根据权利要求34的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选中等强度的组成型启动子，优选植物启动子，更优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
36.根据权利要求34或35的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量。
37.用根据权利要求34或35的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
38.用于生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量，所述方法包括：
(i)在植物细胞或植物中导入和表达编码权利要求23和27至31的任一项定义的VTC2-样多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下，培养所述植物细胞或植物。
39.转基因植物，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选增加的种子产量，由编码权利要求23和27至31的任一项定义的VTC2-样多肽的核酸受调节的表达产生。
40.根据权利要求33、37或39的转基因植物，或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜(beet)、糖萝卜(sugarbeet)或苜蓿(alfalfa)；或单子叶植物如甘蔗(sugarcane)；或谷类，如稻(rice)、玉米(maize)、小麦(wheat)、大麦(barley)、黍(millet)、黑麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱(sorghum)、二粒小麦(emmer)、斯佩耳特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、买罗高粱(milo)或燕麦(oat)。
41.根据权利要求40的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是种子。
42.源自根据权利要求40的植物和/或源自根据权利要求41的植物的可收获部分的产品。
43.编码权利要求23和27至31的任一项定义的VTC2-样多肽的核酸的用途，其用于相对于对照植物，增强植物的产量相关性状，优选用于增加产量，并且更优选用于相对于对照植物，在植物中增加种子产量。
44.相对于对照植物，增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节编码DUF1685多肽的核酸在植物中的表达，其中所述DUF1685多肽包含与SEQ ID NO：188的氨基酸坐标46至144位所示的DUF1685结构域具有至少50％序列同一性的保守结构域。
45.根据权利要求44的方法，其中所述调节的表达通过在植物中导入和表达所述编码所述DUF1685多肽的核酸来实现。
46.根据权利要求44或45的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，并优选包括相对于对照植物增加的种子产量。
47.根据权利要求44至46的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
48.根据权利要求44至46的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏的条件下获得的。
49.根据权利要求44至48的任一项的方法，其中所述DUF1685多肽包含DLTDEDLHELKGCIELGFGF(SEQ ID NO：258)所示的基序16，和/或LTNTLPALDLYFAV(SEQ ID NO：259)所示的基序17。
50.根据权利要求44至49的任一项的方法，其中所述编码DUF1685多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，还优选来自杨柳科(Salicaceae)，更优选来自杨属(Populus)，最优选来自毛果杨(Populustrichocarpa)。
51.根据权利要求44至50的任一项的方法，其中所述编码DUF1685多肽的核酸编码表A3列举的任一条多肽，或者是这类核酸的一部分或能够与这类核酸杂交的核酸。
52.根据权利要求44至51的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A3给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。
53.根据权利要求44至52的任一项的方法，其中所述核酸编码SEQID NO：188所示的DUF1685多肽。
54.根据权利要求44至53的任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选中等强度的组成型启动子，更优选植物启动子，最优选GOS2启动子有效连接。
55.能够通过根据权利要求44至54的任一项的方法获得的植物、其植物部分或植物细胞，所述植物部分包括种子，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码权利要求44和49至53的任一项定义的DUF1685多肽的重组核酸。
56.构建体，其包含：
(i)编码权利要求44和49至53的任一项定义的DUF1685多肽的核酸；
(ii)一个或多个能够驱动(i)的核酸序列表达的控制序列；和任选的
(iii)转录终止序列。
57.根据权利要求56的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选中等强度的组成型启动子，更优选植物启动子，最优选GOS2启动子。
58.根据权利要求56或57的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量。
59.用根据权利要求56或57的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
60.用于生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的生物量，所述方法包括：
(i)在植物细胞或植物中导入和表达编码权利要求44和49至53的任一项定义的DUF1685多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下，培养所述植物细胞或植物。
61.转基因植物，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选增加的种子产量，由编码权利要求44和49至53的任一项定义的DUF1685多肽的核酸受调节的表达产生。
62.根据权利要求55、59或61的转基因植物，或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜(beet)、糖萝卜(sugarbeet)或苜蓿(alfalfa)；或单子叶植物如甘蔗(sugarcane)；或谷类，如稻(rice)、玉米(maize)、小麦(wheat)、大麦(barley)、黍(millet)、黑麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱(sorghum)、二粒小麦(emmer)、斯佩耳特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、买罗高粱(milo)或燕麦(oat)。
63.根据权利要求62的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。
64.源自根据权利要求62的植物和/或源自根据权利要求63的植物的可收获部分的产品。
65.编码权利要求44和49至53的任一项定义的DUF1685多肽的核酸的用途，其用于相对于对照植物，增强植物的产量相关性状，优选用于相对于对照植物增加产量，并且更优选用于相对于对照植物，在植物中增加种子产量。
66.相对于对照植物，增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节编码ARF6-样多肽的核酸在植物中的表达，其中所述ARF6-样多肽包含B3DNA结合结构域、Q rich结构域、生长素应答结构域和Aux/IAA家族结构域。
67.根据权利要求66的方法，其中所述调节的表达通过在植物中导入和表达所述编码所述ARF6-样多肽的核酸来实现。
68.根据权利要求66或67的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，并且优选包括相对于对照植物增加的生物量和/或增加的种子产量。
69.根据权利要求66至68的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
70.根据权利要求66至68的任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏的条件下获得的。
71.根据权利要求66至70的任一项的方法，其中所述ARF6-样多肽包含一个或两个下列基序：
(i)基序18：VYFPQGHSEQVAAST(SEQ ID NO：304)，
(ii)基序19：ATFVKVYK(SEQ ID NO：305)。
72.根据权利要求66至71的任一项的方法，其中所述编码ARF6-样的核酸是植物来源的，优选来自单子叶植物，还优选来自禾本科(Poaceae)，更优选来自稻属(Oryza)，最优选来自稻(Oryza sativa)。
73.根据权利要求66至72的任一项的方法，其中所述编码ARF6-样的核酸编码编码表A4列举的任一条多肽，或者是这类核酸的一部分或能够与这类核酸杂交的核酸。
74.根据权利要求66至73的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A4给出的任意多肽的直向同源物或旁系同源物。
75.根据权利要求66至74的任一项的方法，其中所述核酸编码SEQID NO：261所示的多肽。
76.根据权利要求66至75的任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选中等强度的组成型启动子，优选植物启动子，更优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子有效连接。
77.能够通过根据权利要求66至76的任一项的方法获得的植物、其植物部分或植物细胞，所述植物部分包括种子，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码权利要求66和71至75的任一项定义的ARF6-样多肽的重组核酸。
78.构建体，其包含：
(i)编码权利要求66和71至75的任一项定义的ARF6-样多肽的核酸；
(ii)一个或多个能够驱动(i)的核酸序列表达的控制序列；和任选的
(iii)转录终止序列。
79.根据权利要求78的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选中等强度的组成型启动子，优选植物启动子，更优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
80.根据权利要求78或79的构建体在方法中的用途，所述方法用于制备植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的生物量。
81.用根据权利要求78或79的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
82.用于生产转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的生物量，所述方法包括：
(i)在植物细胞或植物中导入和表达编码权利要求66和71至75的任一项定义的ARF6-样多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下，培养所述植物细胞或植物。
83.转基因植物，或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，并且更优选增加的种子产量和/或增加的生物量，由编码权利要求66和71至75的任一项定义的ARF6-样多肽的核酸受调节的表达产生。
84.根据权利要求77、81或83的转基因植物，或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜(beet)、糖萝卜(sugarbeet)或苜蓿(alfalfa)；或单子叶植物如甘蔗(sugarcane)；或谷类，如稻(rice)、玉米(maize)、小麦(wheat)、大麦(barley)、黍(millet)、黑麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱(sorghum)、二粒小麦(emmer)、斯佩耳特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、买罗高粱(milo)或燕麦(oat)。
85.根据权利要求84的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。
86.源自根据权利要求84的植物和/或源自根据权利要求85的植物的可收获部分的产品。
87.编码权利要求66和71至75的任一项定义的ARF6-样多肽的核酸的用途，其用于相对于对照植物，增强植物的产量相关性状，优选用于增加产量，并且更优选相对于对照植物，在植物中用于增加种子产量和/或用于增加生物量。
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