CN101627125B

CN101627125B - 具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法

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Publication number: CN101627125B
Application number: CN2008800035361A
Authority: CN
Inventors: V·弗兰卡德
Original assignee: CropDesign NV
Current assignee: CropDesign NV
Priority date: 2007-01-30
Filing date: 2008-01-30
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2028-01-30
Also published as: US8461413B2; CN101627125A; CA2674740A1; US20100011464A1; MX2009007246A; AU2008209729A1; AR065100A1; WO2008092910A1; AU2008209729B2; BRPI0807425A2; EP2548963A1; EP2109677A1

Abstract

本发明一般地涉及分子生物学领域并涉及用于增强植物中多种经济上重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及通过在植物中增加Dwarf1(DWF1)多肽的编码核酸序列的表达而增加植物中种子产量的方法。本发明还涉及具有DWF1多肽编码核酸序列增加的表达的植物，其中所述植物相对于对照植物具有增加的种子产量。本发明还提供用于实施本发明方法的构建体。

Description

具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法

持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生经常含有异源性遗传组分的植物，所述异源性遗传组分可能不总是导致所希望性状从亲代植物中传递。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后将该遗传物质导入植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。

具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物结构(例如枝条的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对增加作物产量有贡献。

种子产量是尤其重要的性状，因为许多植物的种子对于人类和动物的营养非常重要。作物如谷物、稻、小麦、卡诺拉油菜(canola)和大豆占人类总卡路里摄取量的一半以上，不论是通过种子本身的直接消费，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消费。它们也是工业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的芽和根的来源)和胚乳(萌发以及幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，吸收糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存高分子，以使谷粒饱满。

增加植物产量的能力将在诸如农业等领域中具有许多应用，包括观赏植物的生产、树木栽培、园艺和森林业。增加的产量也可以用于在生物反应器中使用的藻类生产(用于诸如药物、抗体或疫苗等物质的生物技术生产，或用于有机废物的生物转化)及其他这类领域。

背景技术

本发明涉及相对于对照植物增加植物中种子产量的方法，其通过增加植物中编码Dwarf1(DWF1)多肽的核酸序列的表达。

油菜素类固醇(BR)是一类植物激素，其对于促进植物的生长、分化和发育是重要的。术语BR总体上指四十多种天然发生的多羟基固醇衍生物，其与动物(基本是胆固醇)和真菌(基本是麦角固醇)固醇激素具有结构相似性。在植物BR中，油菜素内酯显示出最强的生物活性(综述参见Clouse(2002)Brassinosteroids，The Arabidopsis Book：1-23)。

BR生物合成途径已使用生物化学和诱变分析阐明。BR从相同的初始前体环阿屯醇通过至少两条分支的生物化学途径合成(Klahre等，(1998)Plant Cell 10：1677-1690)。拟南芥(Arabidopsis)Dwarf1蛋白质(DWF1；对于Diminuto也称作DIM，或对于甘蓝(Cabbage)1也称作CBB1)涉及使用黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅因子，将BR的早期前体24-亚甲基胆固醇(24-methylenecholesterol)转化为菜油固醇，以及将异岩藻甾醇(isofucosterol)转化为谷固醇。此转化以两个连续的步骤进行：异构化步骤(Δ²⁴⁽²⁸⁾键异构化为Δ²⁴⁽²⁵⁾键)和随后新双键的还原步骤。

过量表达DWF1的转基因拟南芥植物不显示出任何清楚可见的表型(Klahre等，(1998)，见上)。制备了组成型过量表达稻DWF1直向同源物的转基因稻，该转基因稻一般显示出增加的植物高度、增加的节间长度和增加的每圆锥花序小穗数(Hong等，(2005)Plant Cell 17：2243-2254)。日本专利申请JP1999290082描述了编码稻DWF1直向同源物的核酸序列和该核酸序列通过降低其的表达产生矮化的植物的可能的用途。

令人惊讶的是，现已发现在植物中增加编码DWF1多肽的核酸序列的表达产生对照植物具有增加的种子产量的植物。

定义

多肽/蛋白质

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合形式中的氨基酸。

多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列

术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者的组合。

对照植物

选择合适的对照植物是实验设置的惯用部分并且可以包括对应的野生型植物或无目的基因的对应植物。对照植物一般是与待评估植物相同的植物物种或甚至是相同的变种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。如本文中所用的“对照植物”不仅指整株植物，还指植物部分，包括种子及种子部分。

同源物

蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的上述蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且与所述肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶来源的非修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性。

缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。

插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入。插入可以包含单个或多个氨基酸的N端融合和/或C端融合以及序列内插入。通常，在多肽序列内部的插入会比N端融合或C端融合小约1-10个残基级别。N端或C端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、

-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。

取代指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-片层结构的倾向)的其他氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸取代优选地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本领域众所周知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company和下表1)。

表1：保守性氨基酸取代的实例

残基	保守性取代	残基	保守性取代
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu，Val

氨基酸取代、缺失和/或插入可以使用本领域众所周知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而轻易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生取代突变的技术是本领域技术人员众所周知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Clevelaand，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。

衍生物

“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然发生形式的蛋白质(如SEQ ID NO：2所示的)的多肽序列相比，它们包含以非天然发生的氨基酸残基对氨基酸的取代或非天然发生的氨基酸残基的添加。蛋白质“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与多肽的天然发生形式的氨基酸序列相比，它们包含天然发生的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸盐化等)氨基酸残基或非天然的改变氨基酸残基。与衍生物所来源的多肽序列相比，该衍生物可以也包含与所述多肽序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加(例如报道分子或其他配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，和与天然发生的蛋白质的多肽序列相对比的非天然发生的氨基酸残基。

直向同源物/旁系同源物

直向同源物和旁系同源物包含用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因，而直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因。

结构域

术语”结构域″指沿进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间变动，然而在特定位置处的高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或活性方面可能是必需的氨基酸。结构域因通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定任意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。

基序/共有序列/标签

术语”基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。

杂交

如本文中所定义的术语”杂交″是其中基本上同源的互补核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸序列均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸序列之一固定到基质如磁珠、琼脂糖(Sepharose)珠或任何其他树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸序列之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸分子的发夹或其他二级结构。

术语”严格性”指在其中发生杂交的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成影响。通常，将低严格性条件选择为在确定的离子强度及pH时低于特定序列热解链温度(T_m)约30℃。中等严格性条件是此时温度低于T_m约20℃并且高严格性条件是此时温度低于T_m约10℃。高严格性杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸序列可以在序列上偏离并且因遗传密码子的简并性而依旧编码基本上相同的多肽。因而有时候可能需要中等严格性杂交条件以鉴定此类核酸分子。

T_m是在确定的离子强度及pH时的温度，在所述温度下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交。T_m取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。从低于T_m约16℃直至32℃获得最大杂交速率。一价阳离子在杂交溶液中的存在降低了两条核酸链间的静电排斥，因而促进杂交体形成；这种作用对于高达0.4M的钠浓度是明显的(对于更高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6-0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许在30-45℃进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说，每％碱基错配T_m下降约1℃。取决于杂交体的类型，T_m可以使用下列等式计算：

1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：

T_m＝81.5℃+16.6xlog₁₀[Na⁺]^a+0.41x％[G/C^b]-500x[L^c]^-1-0.61x％甲酰胺

2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交体：

T_m＝79.8+18.5(log₁₀[Na⁺]^a)+0.58(％G/C^bb)+11.8(％G/C^b)²-820/L^c

3)寡DNA或寡RNA^d杂交体：

对于＜20个核苷酸：T_m＝2(ln)

对于20-35个核苷酸：T_m＝22+1.46(ln)

^a或对于其他一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内是精确的。

^b仅对于％GC在30％-75％范围内是精确的。

^cL＝双链体的长度(以碱基对计)。

^dOligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。

可以以众多已知技术的任何一种控制非特异性结合，例如用含蛋白质的溶液封闭薄膜、添加异源性RNA、异源性DNA及SDS至杂交缓冲液并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，一系列杂交可以通过改变以下条件之一进行：(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。本领域技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。

除杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度及温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格性条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。

例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的典型高严格性杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格性杂交条件的实例包括在50℃于4×SSC中或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸序列的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交体长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。

为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)MolecularCloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，CSH，New York或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989和每年更新版本)。

剪接变体

如本文中所用的术语”剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本上保留了蛋白质的生物学活性的变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能性片段而实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制备。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域众所周知的(见例如Foissac和Schiex，BMC Bioinformatics.20056：25)。

等位变体

等位基因或等位变体是给定基因的替代形式，其位于相同染色体位置内。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然发生性多态性株系中序列变体的最大集合。

基因改组/定向进化

基因改组或定向进化的组成为：反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸序列或其部分的变体(Castle等，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。

调节元件/调控序列/启动子

术语“调节元件”、“调控序列”和“启动子”均在本文中可互换使用并且在广义上意指能够实现与之连接的序列表达的调节性核酸序列。术语”启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别及结合RNA聚合酶和其他蛋白质，因而指导有效连接的核酸序列转录的核酸调控序列。前述术语包括从典型的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA框，具有或没有CCAAT框序列)中衍生的转录调节序列和应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调节元件(如，上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括典型的原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括-35框序列和/或-10框转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸序列在细胞、组织或器官中表达的合成的融合分子或衍生物。

“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不需要是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达及在本文中描述的核酸序列所转化的植物。这也适用于其他“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列上游的启动子可以由一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失而受到修饰，但不干扰启动子、可读框(ORF)或3′调节区如终止子或远离ORF的其他3′调节区的功能性或活性。启动子的活性还有可能因该启动子的修饰，或由更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换该启动子而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸序列必须有效连接至或包含合适的启动子，其中所述的启动子在正确时间点上并以所需要的空间表达模式表达基因。

有效连接

如本文中所用的术语”有效连接”指启动子序列与目的基因之间功能性地连接，以至于启动子序列能够启动目的基因转录。

组成型启动子

“组成型启动子”指在生长和发育的大部分、但不必全部阶段期间和在大部分环境条件下在至少一个细胞、组织或器官内有转录活性的启动子。

下表2给出组成型启动子的实例。

表2：组成型启动子的实例

基因来源	表达模式	参考文献
			肌动蛋白	组成型	McElroy等，Plant Cell，2：163-171，1990
CAMV 35S	组成型	Odell等，Nature，313：810-812，1985
			CaMV 19S	组成型	Nilsson等，Physiol.Plant.100：456-462，1997
GOS2	组成型	de Pater等，Plant J Nov；2(6)：837-44，1992
			遍在蛋白	组成型	Christensen等，Plant Mol.Biol.18：675-689，1992
稻亲环蛋白	组成型	Buchholz等，Plant Mol Biol.25(5)：837-43，1994
			玉米H3组蛋白	组成型	Lepetit等，Mol.Gen.Genet.231：276-285，1992
肌动蛋白2	组成型	An等，Plant J.10(1)；107-121，1996

遍在启动子

遍在启动子在生物基本上所有组织或细胞内有活性。

发育调节性启动子

发育调节性启动子在某个发育期期间或在经历发育变化的植物部分内有活性。

诱导性启动子

诱导性启动子在应答化学品(综述见Gatz 1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动，或可以是“胁迫诱导性的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时受到激活，或是“病原体诱导性的”，即当植物暴露于多种病原体时受到激活。

器官特异性/组织特异性启动子

器官特异性或组织特异性启动子是能够优先在某些器官或组织如叶、根、种子组织等内启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任何其他部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其他部分内允许任何泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异的”。

终止子

术语“终止子”包括这样的调控序列，其是在转录单位端的DNA序列，发出对初级转录物进行3’加工并聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以衍生自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的终止子可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自其他植物基因或较不优选地来自任何其他真核基因。

选择性标记(基因)/报道基因

“选择性标记”、“选择性标记基因”或“报道基因”包括向细胞赋予表型的任何基因，其中在所述的细胞内表达所述基因以促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体所转染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同原理鉴定核酸序列的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素耐药性或除草剂抗性、引入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择性标记基因的实例包括赋予抗生素耐药性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供

抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA或利用木糖的木糖异构酶或抗营养标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。目视标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这个名单仅代表少数的可能标记。本领域技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。

转基因的/转基因/重组

为本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”就核酸序列而言意指包含此核酸序列的表达盒、基因构建体或载体或用本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，这些构建均通过重组方法产生，其中

(a)编码用于本发明方法中的蛋白质的核酸序列，或

(b)与本发明核酸序列有效连接的遗传调控序列，例如启动子，或

(c)a)和b)。

不处于其天然遗传环境中或已经通过重组方法修饰，修饰有可能采用例如取代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中的或在基因组文库中存在的天然基因组基因座或染色体基因座。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地得到保留，至少部分地得以保留。该环境分布在核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。天然发生的表达盒——例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用多肽的对应核酸序列的天然发生的组合，如上文所定义-在这种表达盒通过非天然的合成(“人工”)方法(如诱变处理)而受到修饰时，变成转基因表达盒。合适方法例如在US 5,565,350或WO00/15815中描述。

为本发明目的，转基因植物因此如上理解为意指本发明方法中所用的核酸序列不位于所述植物基因组中(该核酸序列)的天然基因座内，所述核酸序列有可能同源或异源地表达。然而如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸序列或在本发明方法中所用核酸序列处于植物基因组中该核酸序列的天然位置内，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经受到修饰。转基因优选地理解为意指本发明核酸序列在基因组中的非天然基因座内表达，即发生核酸序列的同源表达或优选异源表达。在本文中提到了优选的转基因植物。

转化

如本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚胎发生)的植物组织可以用本发明的遗传构建体转化并且可以从中再生整株植物。选择的具体组织将取决于可用于并且最适于正进行转化的具体物种的克隆性增殖系统。示例性组织靶包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、胼胝体组织、现存分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。备选地，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化植物。

外来基因转化至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因引入合适的祖先细胞。用于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物的方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微投射法(microprojection)。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature 296，72-74；Negrutiu I等(1987)Plant Mol Biol 8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(Crossway A等，(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击法(Klein TM等，(1987)Nature 327：70)、(非整合性)病毒感染法等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选地通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是在植物中(in planta)的转化法。为此目的，例如有可能使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物的分生组织。根据本发明已经证明使转化的农杆菌混悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。植物随后继续培育直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的公知方法，如在任一以下文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP 1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta 199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol Biol 22(3)：491-506，1993)，Hiei等(Plant J 6(2)：271-282，1994)，其公开内容在本文中引入作为参考，如同完全给出那样。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol 14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol 129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容在本文中如充分所述那样引入作为参考。所述方法通过举例方式进一步由Jenes等，Techniques for Gene Transfer，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143及在Potrykus Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸序列或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥(拟南芥属于本发明的范围，不视为作物植物)或作物植物，例如烟草植物，通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适的培养基内培育。植物通过根癌农杆菌的转化例如由和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress，1993，第15-38页中获知。

除了转化体细胞(其随后必须再生成完整植物)之外，还有可能转化植物分生组织的细胞及特别转化发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中获得种子，其中一定比例的所述植物受到转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)Mol GenGenet 208：274-289；Feldmann K(1992)。在：编者C Koncz，N-H Chua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。替代性方法基于反复去掉花序并使莲座叶丛中心中的切除部位与转化的农杆菌温育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994)Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法是改良的真空渗入法，如“花浸染”法。在拟南芥真空渗入法的情况下，完整植物在减压下用农杆菌混悬液处理[Bechthold，N(1993)。C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“花浸染法”的情况下，正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂温育[Clough，SJ und Bent，AF(1998).The Plant J.16，735-743]。在两种情况下收获了一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母体方式遗传，降低或消除了转基因经花粉流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过已在Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229]中示例性加以展示的方法实现。简而言之，待转化的序列连同选择性标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源的侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系内。已经对众多不同植物物种描述了质体转化并且综述可以出自Bock(2001)在基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenicplastids in basic research and plant biotechnology).J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progress towards commercialization of plastid transformationtechnology).Trends Biotechnol.21，20-28。进一步生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式作了报道，所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等，2004，Nature Biotechnology 22(2)，225-229)。

TILLING

TILLING(基因组内定向诱导的局部损伤)意指用于产生和/或鉴定核酸序列诱变技术，其中所述的核酸编码具有修饰表达和/或活性的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以显示在强度方面或在位置方面或在时间方面改良的表达(例如若突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比由处于其天然形式的基因所显出活性更高的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法组合。一般在TILLING中遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)在Methods inArabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J，Singapore编著，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville CR编著，Arabidopsis.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)在J Martinez-Zapater，J Salinas编者，Methods onMolecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的DNA制备和汇集；(c)PCR扩增目的区；(d)变性和复性以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中将异源双链体是否在汇集物中的存在检测为色谱图中的一个额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域众所周知的(McCallum等，(2000)NatBiotechnol 18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2)：145-50)。

同源重组

同源重组允许选择的核酸序列于确定的选择位置上引入基因组中。同源重组是在生物科学中常规地用于低等生物如酵母或苔藓剑叶藓(Physcomitrella)的标准技术。用于在植物中开展同源重组的方法已经不仅对模式植物(Offringa等(1990)EMBO J 9(10)：3077-84)而且对作物植物例如稻(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：132-8)进行了描述。

产量

术语”产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与指定作物、与面积并与时间段有关。单个植物部分基于它们的数目、大小和/或重量而直接对产量有贡献，或实际产量是对于某作物和一年的每英亩产量，这通过总产量(包括收获的和评估的产量)除以种植的英亩数而确定。

增加/改善/增强

术语“增加”，”改善”或“增强”是可互换的并且应当在本申请含义上指与如本文中定义的对照植物相比至少5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生长。

种子产量

增加的种子产量本身可以表现为下列一种或多种指标：a)种子生物量(种子总重量)增加，这可以基于单粒种子和/或每株植物和/或每公顷或英亩；b)每株植物增加的花数；c)增加的(饱满)种子数；d)增加的种子饱满率(其表述为饱满种子数与种子总数之间的比率)；e)增加的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)产量与总生物量的比率；和f)增加的千粒重(TKW)，这从计数的饱满种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以因增加的种子大小和/或种子重量所致，并且也可以因胚和/或胚乳尺寸的增加所致。

种子产量的增加也可以表现为种子大小和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加本身也可以自我表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。增加的产量也可以产生改良的结构，或可以因改良的结构而出现。

植物

如本文中所用的术语”植物”包含整株植物、植物的祖先及后代和植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织及器官，其中每种所提及对象包含目的基因/核酸序列。术语”植物”也包含植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种提及的对象包含目的基因/核酸序列。

特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agavesisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostisstolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida)、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasahispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapassp.)[卡诺拉油菜、油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadabafarinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabissativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceibapentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrulluslanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧桐属物种(Colaspp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属(Cynara spp.物种)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyrosspp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeisguineensis)、美洲油棕Elaeis(oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、蔗茅属(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagusspp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthusannuus))、长管萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoeabatatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄属(Lycopersicon spp.)(例如番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammeaamericana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntiaspp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、芹菜(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleumpratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populusspp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheumrhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salixsp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanumlycopersicum))、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifoliumspp.)、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolumminus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍、Zizania palustris、枣属物种(Ziziphus spp.)等等。

发明详述

根据第一个实施方案，本发明提供相对于对照植物增加植物中种子产量的方法，其包括增加植物中编码DWF1多肽的核酸序列的表达。

增加编码DWF1多肽的核酸序列表达的优选的方法是通过在植物中引入和表达编码DWF1多肽的核酸序列。

在此之后“用于本发明方法的蛋白质”的任何引用意指如本文定义的DWF1多肽。在此之后“用于本发明方法的核酸序列”的任何引用意指能够编码此类DWF1多肽的核酸序列。待引入植物(并且因而用于实施本发明方法)的核酸序列是编码文中将要描述的此类蛋白质的任意核酸序列，在此之后又称作“DWF1核酸序列”或“DWF1基因”。

如本文定义“DWF1多肽”指任意此类多肽，所述多肽从N端到C端包含：(i)跨膜结构域；(ii)FAD-结合结构域；和(iii)底物结合结构域，其按照递增的优选顺序，与SEQ ID NO：29所示的底物结合结构域具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高序列同一性。

备选地或此外，本文定义的“DWF1多肽”指这样的任意多肽，其按照递增的优选顺序，与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：34所示的DWF1多肽，或文中表A给出的任意多肽序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高序列同一性。

备选地或此外，本文定义的“DWF1多肽”指这样的任意多肽序列，当其用于构建系统树(例如图5所示的)时，聚簇于包含SEQ ID NO：2所示的多肽序列的(植物来源)DWF1多肽分化支，而不是聚簇于任何其他(非植物来源)DWF1分化支。

另外，DWF1多肽(至少在天然形式)催化24-亚甲基胆固醇至菜油固醇的转化(也催化异岩藻甾醇至谷固醇的转化)，其由异构化步骤(Δ²⁴⁽²⁸⁾键异构化为Δ²⁴⁽²⁵⁾键)和随后新双键的还原步骤组成。测定植物内源固醇和底物饲喂实验的代谢物的工具和技术是本领域公知的。缺乏WF1活性的突变植物的互补测试可也用于鉴定可用于实施本发明方法的DWF1多肽。此类方法也是本领域公知的(更多细节参见实施例6)。

术语“结构域”和“基序”在文中的“定义”部分定义。存在用于鉴定结构域的专业数据库，如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.美国95，5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax for biomolecular sequencesmotifs and its function in automatic sequence interpretation(用于生物分子序列基序的广义图谱语法及其在自动化序列判读中的功能)，(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，KarpP.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAI印制，Menlo Park；Hulo等，(2004)Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，)或Pfam(Bateman等，(2002)Nucleic Acids Research 30(1)：276-280)。用于计算机芯片上分析蛋白质序列的一组工具可在ExPASY蛋白质组学服务器上获得(由瑞士生物信息学研究所托管(Gasteiger等，(2003)ExPASy：the proteomics serverfor in-depth protein knowledge and analysis(用于深入认识和分析蛋白质的蛋白组学服务器)，Nucleic Acids Res.31：3784-3788)。结构域也可以使用常规技术如通过序列比对而鉴定。

多肽序列SEQ ID NO：2的分析示于下面的实施例2和4。多种酶使用黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅因子(其行使电子转移的功能)，这些酶大部分是氧依赖性氧化还原酶。可用于实施本发明方法的DWF1多肽的FAD-结合结构域以登录号IPR006094出现在InterPro数据库中，以登录号PF01565出现在Pfam数据库中，以登录号SSF56176出现在Superfamily数据库中。FAD-结合结构域包含结合焦磷酸盐、ADP、异咯嗪和腺嘌呤的亚结构域(Fraaije等，(1998)Trends Biochem Sci 23：206-207；Choe等，(1999)Plant Physiol 119：897-907)。这些亚结构域在图4中框出。

底物结合结构域(例如包含于DWF1多肽SEQ ID NO：2中的SEQID NO：29)定义为位于FAD-结合结构域(以Superfamily登录号SSF56176在DWF1多肽SEQ ID NO：2上鉴定)下游(从N-端到C-端)的结构域。DWF1多肽的底物是24-亚甲基胆固醇或异岩藻甾醇，其分别转化为菜油固醇和谷固醇。此转化分两步进行：Δ²⁴⁽²⁸⁾键异构化为Δ²⁴⁽²⁵⁾键并随后还原新的双键(Khlare等(1998)Plant Cell 10：1677-1690)。此DWF1多肽中的底物结合结构域可通过与SEQ ID NO：2所示的DWF1多肽或用SEQ IDNO：29所示的底物结合结构域比对而鉴定。

用于比对序列用于比较的方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个完整序列的全局性(即覆盖完整序列的)比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol 215：403-10)计算序列同一性百分数并执行对两个序列间相似性的统计分析。用于执行BLAST分析的软件是公众通过国家生物技术信息中心(NCBI)可获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)以默认配对比对参数和评分方法(以百分数计)而轻易地鉴定。相似性和同一性的全局百分数也可以使用在MatGAT软件包中可获得的方法之一而确定(Campanella等，BMCBioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：用蛋白质或DNA序列而产生相似性/同一性矩阵的应用)。可以进行细微手工编著以优化保守基序之间的比对，如本领域技术人员显而易见。此外除了使用全长序列以鉴定同源物，也可以使用特定结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，针对整个核酸序列或多肽序列(文中的表B)和/或针对选择的结构域(例如SEQ ID NO：29所示的底物结合结构域，文中的表B)或保守基序测定了序列同一性值，该值在实施例3中给出(以百分比计)。

本发明通过用由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：33代表的编码多肽序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：34的核酸序列转化的植物加以说明，然而，本发明的实施不限于这些序列。本发明方法可以使用如文中定义的任意DWF1-编码核酸序列或DWF1多肽有利地进行。

编码植物DWF1多肽的核酸序列的实例在文中实施例1的表A中给出。这类核酸可用于实施本发明的方法。实施例1的表A中给出的多肽序列是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：34所示的DWF1多肽的直向同源物和旁系同源物的实例，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如文中所定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索而容易地鉴定。这通常涉及第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括用查询序列(例如使用实施例1的表A中列出的任意序列)BLAST搜索任意序列数据库(如公众可用的NCBI数据库)。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，可以使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。任选地可以筛选BLAST结果。随后提交筛选结果和非筛选结果的全长序列以针对来自生物的序列进行反向BLAST(第二BLAST)，其中查询序列来自所述的生物(其中在查询序列是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34的情况下)，或者第二BLAST因而将针对甘蔗(Saccharum)序列)。随后比较第一和第二BLAST搜索的结果。若来自第一BLAST的高阶位命中源自与查询序列从其中衍生的物种相同的物种，反向BLAST随后理想地在最高命中的查询序列中产生，则鉴定到旁系同源物；若第一blast的中的高阶位命中不源自与查询序列从其中衍生的物种相同的物种，并且优选地在反向BLAST时产生属于最高命中之列的查询序列，则鉴定到直向同源物。

高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，此命中因偶然而发生的几率越低)。E-值的计算是本领域众所周知的。除了E-值外，比较结果还由同一性百分数记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法以便帮助显示相关基因的聚簇和以便鉴定直向同源物和旁系同源物(参见图5)。

蛋白质亚细胞定位预测的工作是很重要的，并已充分研究。蛋白质定位实验方法的范围从免疫定位到使用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白质。这些方法很准确，但与计算机方法相比需要大量劳动。从序列数据对蛋白质定位进行计算机预测近来已取得很大进展。本领域技术人员熟知的算法在Swiss Institute for Bioinformatics提供的ExPASy蛋白组学工具可获得，例如PSort、TargetP、ChloroP、Predotar、LipoP、MITOPROT、PATS、PTS1、SignalP等。

对于跨膜蛋白质，使用基于隐蔽马尔科夫模型(HMM)的TMHMM2.0算法进行α螺旋的定位和方向预测。例如，对于SEQ ID NO：2所示的DWF1多肽进行的分析显示其仅包含一个跨膜结构域，蛋白质的主要部分面对胞质，而N-端锚定于细胞膜，和诸如内质网(ER)、高尔基体和线粒体的内膜系统极其类似(参见实施例5，以及文中的图2和3)。

核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类核酸序列变体的实例包括编码实施例1的表A中给出的任一多肽序列的同源物和衍生物的核酸序列，术语“同源物”和“衍生物”如文中所定义。也可用于本发明方法中的是编码实施例1的表A中给出的任一多肽序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸序列。用于本发明方法中的同源物和衍生物与它们衍生自的未修饰的蛋白质具有基本相同的生物活性和功能活性。

用于实施本发明方法的其他核酸变体包括编码DWF1多肽的核酸序列的部分、与编码DWF1多肽的核酸序列杂交的核酸序列、编码DWF1多肽的核酸序列的剪接变体、编码DWF1多肽的核酸序列的等位变体，以及通过基因改组获得的编码DWF1多肽的核酸序列的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位变体和基因改组如文中所述。

编码DWF1多肽的核酸序列不需要是全长核酸序列，因为本发明方法的实施不依赖使用全长核酸序列的使用。本发明提供在植物中增加种子产量的方法，其包括在植物中引入和表达实施例1的表A中给出的核酸序列中任一个的部分，或实施例1的表A中给出的任意多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸序列的部分。

核酸序列的部分可以例如通过对该核酸序列产生一个或多个缺失而制备。所述的部分可以以分离的形式加以使用或它们可以与其他编码性(或非编码性)序列融合，以便例如产生组合几种活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，翻译时产生的所得多肽可以比对该蛋白质部分所预测的多肽更大。

用于本发明方法中的部分编码文中定义的DWF1多肽，其具有与实施例1的表A中给出的多肽序列基本相同的生物学活性。优选地，此部分是在实施例1的表A中给出的核酸序列中任一个的部分，或实施例1的表A中给出的多肽序列中任一个的直向同源物或旁系同源物的编码核酸序列的部分。此部分的长度优选为至少400、500或600个连续核苷酸(按照递增的优选顺序)，其中所述的连续核苷酸是实施例1的表A中给出的任何一种核酸序列，或是实施例1的表A中给出的多肽序列中任一个的直向同源物或旁系同源物的编码核酸序列。最优选地，此部分是核酸序列SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：33的部分。优选地，部分编码多肽序列，所述多肽序列包含文中定义的任一个或多个结构域或基序。优选地，部分编码多肽序列，当其用于构建系统树(例如图5所示的)时，聚簇于包含SEQ ID NO：2所示的多肽序列的(植物来源)DWF1多肽分化支，而不是聚簇于任何其他(非植物来源)DWF1分化支。

用于本发明方法中的另一核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与编码如文中所定义的DWF1多肽的核酸序列杂交，或与如文中所定义的部分杂交的核酸序列。

本发明提供用于在植物中增加种子产量的方法，其包括在植物中引入并表达能够与实施例1的表A中给出的任何一种核酸序列杂交的核酸序列，或包括在植物中引入并表达如此核酸序列，其能够与实施例1的表A中给出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸序列杂交的核酸序列。

用于本发明方法中的杂交序列编码文中定义的DWF1多肽，其具有与实施例1的表A中给出的多肽序列基本相同的生物学活性。优选地，杂交序列能够与实施例1的表A中给出的任一核酸序列杂交或与任一这些序列的部分杂交，其中所述的部分如上文所定义，或者其中杂交序列能够与实施例1的表A中给出的任一多肽序列的直向同源物或旁系同源物的编码核酸序列杂交。最优选地，杂交序列能够与如SEQ ID NO：1所代表的核酸序列或与其部分杂交，或如SEQ ID NO：33所代表的核酸序列或与其部分杂交。优选地，杂交序列编码多肽序列，所述多肽序列包含文中定义的任一个或多个基序或结构域。优选地，杂交序列编码多肽序列，当其用于构建系统树(例如图5所示的)时，聚簇于包含SEQ ID NO：2所示的多肽序列的(植物来源)DWF1多肽分化支，而不是聚簇于任何其他(非植物来源)DWF1分化支。

用于本发明方法中的另一种核酸变体是编码如上文所定义的DWF1多肽的剪接变体，剪接变体如文中所定义。

本发明提供用于在植物中增加种子产量的方法，其包括在植物中引入并表达实施例1的表A中给出的任何一种核酸序列的剪接变体，或实施例1的表A中给出的任意多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸序列的剪接变体。

用于本发明方法中的剪接变体具有与DWF1多肽SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：34，以及实施例1的表A中所示的任意多肽序列基本相同的生物学活性。优选地，剪接变体编码多肽序列，所述多肽序列包含文中定义的任一个或多个基序或结构域。优选地，剪接变体编码多肽序列，当所述多肽序列用于构建系统树(例如图5所示的)时，聚簇于包含SEQ ID NO：2所示的多肽序列的(植物来源)DWF1多肽分化支，而不是聚簇于任何其他(非植物来源)DWF1分化支。

用于实施本发明方法的另一种核酸变体是编码如上文所定义的DWF1多肽的核酸序列的等位变体，等位变体如文中所定义。

本发明提供用于在植物中增加种子产量的方法，其包括在植物中引入并表达实施例1的表A中给出的任何一种核酸序列的等位变体，或包括在植物中引入并表达实施例1的表A中给出的任意多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的编码核酸序列的等位变体。

用于本发明方法中的等位变体具有与DWF1多肽SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：34，以及实施例1的表A中所示的任意多肽序列基本相同的生物学活性。等位变体天然存在，且包含在本发明方法中的是这些天然等位基因的用途。优选地，等位变体是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：33的等位变体，或编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：34的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的等位变体。优选地，等位变体编码多肽序列，所述多肽序列包含文中定义的任一个或多个基序或结构域。优选地，等位变体编码多肽序列，当所述多肽序列用于构建系统树(例如图5所示的)时，聚簇于包含SEQ ID NO：2所示的多肽序列的(植物来源)DWF1多肽分化支，而不是聚簇于任何其他(非植物来源)DWF1分化支。

基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的DWF1多肽的核酸序列的变体；术语“基因改组”如文中所定义。

本发明提供用于在植物中增加种子产量的方法，其包括在植物中引入并表达实施例1的表A中给出的任何一种核酸序列的变体，或包括在植物中引入并表达如此核酸序列的变体，其中所述的核酸序列编码实施例1的表A中给出的任意多肽序列的直向同源物、旁系同源物或同源物，所述变体核酸序列通过基因改组获得。

用于本发明方法中的通过基因改组获得的变体核酸序列具有与DWF1多肽SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：34，以及实施例1的表A中所示的任意多肽序列基本相同的生物学活性。优选地，通过基因改组获得的变体核酸序列编码多肽序列，所述多肽序列包含文中定义的任一个或多个基序或结构域。优选地，通过基因改组获得的变体核酸序列编码多肽序列，当所述多肽序列用于构建系统树(例如图5所示的)时，聚簇于包含SEQ ID NO：2所示的多肽序列的(植物来源)DWF1多肽分化支，而不是聚簇于任何其他(非植物来源)DWF1分化支。

另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编著)。

编码DWF1多肽的核酸序列可以来自任何自然来源或人工来源。核酸序列可以从其天然形式就组成和/或基因组环境方面通过人类有意操作而加以修饰。编码DWF1多肽的核酸序列优选地来自植物，还优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科(poaceae)，更优选来自甘蔗属，最优选来自甘蔗。

本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的种子产量的植物。在本文中的“定义”部分中更详细地描述了术语“种子产量”。

在本文中对增强的产量相关性状的参考意指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。尤其，此类可收获部分是种子，并且本发明方法的实施产生相对于对照植物的种子产量具有增加的种子产量的植物。

以玉米为例，产量增加可以表现为下列一种或多种指标：每公顷或英亩生长的(establish)植物数的增加、每株植物穗数的增加、行数的增加、每行粒数、粒重、千粒重、玉米穗长度/直径、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)及其他。以稻为例，产量增加本身可以表现为下列一种或多种指标的增加：每公顷或英亩植物数、每株植物圆锥花序数、每圆锥花序小穗数、每圆锥花序花(小花)数(其表达为饱满种子数对原圆锥花序数之比)、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)、千粒重的增加及其他。

本发明提供相对于对照植物，增加植物种子产量的方法，所述方法包括在植物中增加编码如文中所定义的DWF1多肽的核酸序列的表达。优先地，增加的种子产量是增加的千粒重(TKW)或增加的每株植物总种子重量之一或其两者。

由于本发明的转基因植物具有增加的种子产量，因而相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期中的对应阶段上表现增加的生长速率(在其生活周期的至少部分期间)。

增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以视为意指从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期中的一个或多个阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期期间增加的生长速率可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得)。若生长速率充分地增加，可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部过程均在一个常规生长时段内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每英亩的年生物量产量的增加(因任何特定植物可以生长并收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由栽种时节(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)和T-90(植物达到其90％最大尺寸所花费的时间)等。

根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的生长速率的植物。因而根据本发明，提供增加植物生长速率的方法，所述方法包括增加本文中所定义的编码DWF1多肽的核酸序列在植物中的表达。

与生长于相当条件下的对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下还是植物暴露于多种胁迫下，都发生产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而对暴露于胁迫作出应答。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻微胁迫在本文中定义为植物暴露的任何胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长而没有恢复生长的能力。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻微胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物生长降低小于40％、35％或30％，优选小于25％、20％或15％，更优选小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)上的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻微胁迫诱导的受损生长往往是农业上不希望的特征。轻微胁迫是植物暴露的常见生物胁迫和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过多的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、冷或冰冷温度所致。非生物胁迫可以是由水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、线虫、真菌和昆虫引起的那些胁迫。本文中所用的术语”非胁迫”条件是允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。

本发明方法的实施相对于在相当条件下生长的对照植物，赋予在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下生长的植物增加的种子产量。因而根据本发明，提供用于在非胁迫条件下或在轻微干旱条件下生长的植物中增加种子产量的方法，所述方法包括增加编码如上定义的DWF1多肽的核酸序列在植物中表达。

本发明方法的实施相对于在相当条件下生长的对照植物，赋予在非生物胁迫条件下生长的植物增加的种子产量。如在Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、增量调节抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。由于不同的环境胁迫激活相同的通路，所以例如示例性的干旱胁迫不应当视为局限于干旱胁迫，而应当视为指示相对于在相当的胁迫条件下，一般在非生物胁迫条件下生长的对照植物，上文定义的DWF1多肽在增加种子产量中的参与程度(involvement)的筛选。

文中定义的术语“非生物胁迫”用于指水胁迫(由于干旱或过多的水引起的)、缺氧胁迫(anaerobic stress)胁迫、盐胁迫、温度胁迫(由于热、冷或冰冷温度引起的)、化学毒性胁迫和氧化胁迫中的任一种或多种胁迫。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透胁迫，选自水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选，水胁迫是干旱胁迫。术语盐胁迫不限于普通的盐(NaCl)，还可以是NaCl、KCl、LiCl、MgCl₂、CaCl₂等中的任一种或多种导致的任意胁迫。

本发明方法的实施产生相对于在相当胁迫下生长的对照植物，在非生物胁迫条件下生长的具有增加的种子产量的植物。因而本发明提供用于在非生物胁迫条件下生长的植物中增加种子产量的方法，所述方法包括增加编码DWF1多肽的核酸序列在植物中的表达。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透胁迫，选自水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫中的一种或多种。

非生物环境胁迫的另一实例是植物生长和发育的同化所需的一种或多种养分可用性的降低。由于养分利用效率对植物产量和产品质量有显著影响，因此在田间倾倒了大量肥料来优化植物生长和质量。植物的生产力一般受限于三种主要养分：磷、钾和氮，在这三者中，氮通常是植物生长的限速元素。因此，植物生长所需的主要营养元素是氮(N)。这是可见于活细胞中的多种重要化合物的组分，所述化合物包括氨基酸、蛋白质(酶)、核酸和叶绿素。植物干物质的1.5％至2％以及总植物蛋白质的约16％是氮。因此，氮的可用性是作物植物生长和生产的主要限制因素(Frink等(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96(4)：1175-1180)，并也对蛋白质积累和氨基酸组成有重大影响。因此，在氮有限条件下培养时具有提高的产量相关性状(例如种子产量)的作物植物是很有意义的。

本发明方法的实施产生相对于在相当条件下生长的对照植物，在降低的养分可用性条件下、尤其在降低的氮可用性条件下生长的具有增加的种子产量的植物。因而本发明提供用于在降低的养分可用性条件下，尤其在降低的氮可用性条件下生长的植物中增加种子产量的方法，所述方法包括增加编码DWF1多肽的核酸序列在植物中的表达。降低的养分可用性可以因营养物的缺乏或过盛所致，所述营养物例如是氮、磷酸盐及其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等。优选地，降低的养分可用性是降低的氮可用性。

本发明包括通过本发明的方法获得的植物或其部分(包括种子)。所述植物、植物部分或植物细胞包含编码如上文所定义的DWF1多肽的核酸转基因。

本发明还提供遗传构建体和载体以促进在植物中引入和/或表达编码DWF1多肽的核酸序列。该基因构建体可以插入适于转化至植物内并适于在转化的细胞中表达目的基因的市售载体。本发明也提供如文中所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。

更具体地，本发明提供构建体，其包含

(a)编码如上文定义的DWF1多肽的核酸序列；

(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地

(c)转录终止序列。

术语“调控序列”和“终止序列”如上文所定义。

植物用包含如上所述的任意核酸序列的载体转化。本领域技术人员非常了解为成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞而必须于载体上存在的遗传元件。目的序列与一种或多种调控序列(至少与启动子)有效连接。

有利地，任何类型的天然启动子可以用来驱动核酸序列的表达。组成型启动子在本发明方法中特别有用。应该清楚的是，本发明的应用不局限于如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：33所示的编码DWF1多肽的核酸序列，本发明的应用也不局限于由组成型启动子驱动的、编码DWF1多肽的核酸序列的表达。

组成型启动子优选是GOS2启动子，优选是来自稻的GOS2启动子，更优选是SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：39所示的GOS2启动子。组成型启动子的其他实例参见文中“定义”部分的表2。

为鉴定功能等同的启动子，可以对候选启动子的启动子强度和/或表达模式进行分析，例如将启动子有效连接于报道基因，并测定报道基因在植物多种组织中的表达水平和模式。适宜的众所周知的报道基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶促活性来测定启动子活性。然后可以将启动子强度和/或表达模式与参照启动子(如本发明方法中所用的启动子)进行比较。可选地，可以利用本领域公知的方法如Northern印迹结合放射自显影图的密度定量分析、定量实时PCR或RT-PCR，通过定量mRNA水平或者通过将本发明方法中所用核酸序列的mRNA水平与持家基因如18S rRNA的mRNA水平进行比较，来测定启动子长度(Heid等，1996 Genome Methods 6：986-994)。通常，“弱启动子”意指驱动编码序列低水平表达的启动子。“弱启动子”意指每个细胞大约1/10,000个转录物至大约1/100,000个转录物，至大约1/500,0000个转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列高水平表达，或者每个细胞大约1/10个转录物至大约1/100个转录物，至大约1/1,000个转录物的水平。

任选地，一种或多种终止子序列可以在引入植物的构建体中使用。额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员会知道可以在实施本发明中适用的终止子序列和增强子序列。本领域技术人员会知道或可以轻易地获得此类序列。

内含子序列也可以添加至5′非翻译区(UTR)或编码序列上，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量。已经证实可剪接内含子在植物表达构建体和动物表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000倍(Buchman和Berg Mol.Cell Biol.8：4395-4405(1988)；Callis等，Gens Dev 1：1183-1200(1987))。基因表达的此类内含子增强作用一般在位于转录单位5′端附近时最强烈。使用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子是本领域已知的。对于一般信息，见：The Maiza Hand，第116章，Freeling和Walbot编著，Springer，N.Y.(1994)。

其他调控序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。本领域技术人员会知道或可以轻易地获得此类序列。

本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是当需要将遗传构建体在细菌细胞中维持为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)时。优选的复制起点包括，但不限于f1-ori和colE1。

为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸序列的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包含选择性标记基因。文中的“定义”部分更加详细的描述了选择性标记。

已知核酸序列稳定或瞬时整合进植物细胞时，仅少数细胞摄入外来DNA，并整合进其基因组(如果期望的话)，这取决于所用的表达载体和所用的转染技术。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(如上文所述那些)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。例如，这些标记可在突变体中使用，所述突变体中原有的这些基因没有功能，例如通过常规方法而缺失。此外，编码可选择标记的核酸序列与编码本发明多肽或本发明方法所用的序列可以在同一个载体中引入宿主细胞，或者在单独的载体中。由所引入的核酸序列稳定转染的细胞可以例如通过选择(例如，整合有可选择标记的细胞存活而其他细胞死去)予以鉴定。

一旦成功引入核酸序列，将不再需要或不期望转基因宿主细胞中存在标记基因，特别是抗生素和除草剂抗性基因，所以根据本发明引入核酸序列的方法有利地采用能够除去或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法是称为共转化的方法。共转化法采用两个载体同时进行转化，一个载体携带根据本发明的核酸序列，而第二载体携带标记基因。较大比例的转化体接收或者对于植物而言含有(高达40％或以上的转化体)两个载体。对于农杆菌转化，转化体通常只接收载体的一部分，即为T-DNA所侧接的序列，其通常指表达盒。随后可通过杂交从转化植物中除去标记基因。在另一种方法中，利用整合进转座子的标记基因与期望的核酸序列一起进行转化(称为Ac/Ds技术)。转化体可与转座酶来源杂交，或者用赋予转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定转化转化体。在有些情况下(约10％)，一旦成功进行了转化，转座子跳出宿主细胞基因组并丢失。在其他一些情况下，转座子跳至不同的位置。在这些情况下，必须通过杂交消除标记基因。在微生物学领域，研发了有可能或便于检测此类事件的技术。另一有利的方法有赖于称为重组系统的方法，其优势在于可以免除杂交消除步骤。最著名的这类系统称为Cre/lox系统。Cre1为重组酶，其切除位于loxP序列之间的序列。如果标记基因整合在loxP序列之间，一旦成功进行了转化，由于该重组酶的表达，其得以切除。其他重组系统有HIN/HIX、FLP/FRT及REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。根据本发明的核酸序列有可能位点特异性地整合进植物基因组。这些方法自然也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。

本发明还提供了相对于对照植物，产生具有增加的种子产量的转基因植物的方法，其包括在植物中引入和表达如上文所定义的DWF1多肽的任意编码核酸序列。

更具体地，本发明提供用于产生具有增加的种子生物量的转基因植物的方法，所述方法包括：

(i)在植物或植物细胞中引入和表达DWF1多肽的编码核酸序列；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。

核酸序列可以直接引入植物细胞或引入植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸序列优选地通过转化引入植物。文中的“定义”部分更加详细的描述了术语“转化”。

遗传修饰的植物细胞可通过本领域技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或

和Willmitzer的上述出版物。

通常在转化后，选择一种或多种标记存在的植物细胞或细胞群体，其中所述的标记由与目的基因一起共转移的植物可表达的基因编码，随后将转化的材料再生成整株植物。为了选择转化的植物，在转化中获得的植物材料原则上接受选择条件处理，以至于转化的植物可以与未转化的植物区分。例如，以上文所述方式获得的种子可以播种，在初始培育时期后，通过喷雾进行合适的选择。另一种可能性包括在使用合适选择剂的琼脂平板上生长种子(根据需要在消毒之后)，使得仅转化的种子可以生长成植物。或者，转化的植物通过上述那些选择性标记的存在筛选。

在DNA转移和再生后，推测的转化植物可以例如使用Southern分析或定量PCR对目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选或额外地，新引入DNA的表达水平可以使用Northern和/或Western分析进行监测，这两种技术是本领域技术人员众所周知的。

产生的转化植物可以通过多种方法加以增殖，如通过克隆增殖法或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以进行自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，并且T2植物通过经典育种技术进一步增殖。

产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如被转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和未转化组织的移植体(例如在植物中，与未转化嫩枝嫁接的转化的根状茎)。

本发明明确地扩展至通过文中所述的任意方法产生的任何植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明进一步扩展至包含已经通过任意前述方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一要求是后代表现与通过本发明方法中的亲代所产生的那些后代相同的一种或多种基因型特征和/或表型特征。

本发明也包括宿主细胞，其含有编码如上文所定义的DWF1多肽的分离的核酸序列。本发明优选的宿主细胞是植物细胞。宿主植物对于本发明方法中所用核酸序列或载体、表达盒或构建体或载体而言原则上有利地是能够合成本发明方法中所用多肽的全部植物。

本发明方法有利地适用于任何植物。

特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界超家族的全部植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。

本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根状茎、块茎和球茎。本发明进一步涉及来自自、优选直接来自此类植物的可收获部分中的产物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白质。

在本领域内详细记载了用于增加核酸序列或基因、或基因产物表达的方法并且它们包括例如，由适宜启动子驱动的超量表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般是上游)内引入作为启动子或增强子元件的分离核酸序列，以便上调表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或取代而在体内改变(见Kmiec，美国专利第5,565,350号；Zarling等，PCT/US93/03868)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的正确方向及距离引入植物细胞，以便控制基因表达。

若需要多肽表达，通常希望在多核苷酸编码区的3’端包括聚腺苷化区。聚腺苷化区可以来自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的3’端序列可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一植物基因或更不优选来自任何其他真核基因。

如上文所述，用于增加DWF1多肽的编码核酸序列的表达的优选方法是在植物中引入和表达DWF1多肽的编码核酸序列；然而，实现本方法的效果即增加种子产量也可以使用其他公知技术来实现。以下将是一些此类技术的描述。

一种此类技术是T-DNA激活标注(Hayashi等，Science(1992)1350-1353)，其涉及在目的基因的基因组区域内或基因编码区上游或下游10kb处以如此结构插入T-DNA(通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子))，使得启动子指导被靶定基因的表达。通常，由靶定基因的天然启动子对所述靶定基因表达的调节作用遭到破坏并且该基因处在新引入的启动子控制下。启动子一般嵌入在T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如通过农杆菌感染，并导致在所插入T-DNA附近的基因的改良表达。因靠近所引入启动子的基因的改良表达，产生的转基因植物表现显性表型。

本发明的效果也可以使用TILLING(基因组内定向诱导的局部损伤)技术产生，该技术的描述参见“定义”部分。

本发明的效果也可以使用同源重组产生，该技术的描述参见“定义”部分。

本发明还包括文中所述DWF1多肽的编码核酸序列以及这些DWF1多肽在相对于对照植物增加植物种子产量中的用途。优选地，增加的种子产量是增加的TKW或增加的每株植物总种子重量之一或其两者。

编码文中所述DWF1多肽的核酸序列或DWF1多肽本身可以用于育种程序中，其中鉴定到可以遗传地与编码DWF1多肽的基因连接的DNA标记。所述的基因/核酸序列或DWF1多肽本身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来选择具有本发明方法中如上文所定义的增加的种子产量的植物。

编码DWF1多肽的基因/核酸序列的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。这种育种程序有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物进行诱变处理而引入等位基因变体；备选地，该程序可以从非人为引起的所谓“自然”起源的一组等位变体开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是用于选择所讨论及导致增加种子产量的序列的优异等位变体的步骤。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施选择。可以在温室中或田间监测生长性能。其他任选步骤包括将鉴定了优异等位变体的植物与另一种植物杂交。这可以用来例如产生目标表型特征的组合。

编码DWF1多肽的核酸序列也可以用作探针以便对基因进行遗传作图或物理作图，所述探针作为所述基因的一部分及与这些基因关联的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以便开发具有想要表型的株系。编码DWF1多肽的核酸序列的这种用途仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。编码DWF1多肽的核酸序列可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(SambrookJ，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A LaboratoryManual)可以用DWF1多肽的编码核酸序列探测。产生的结合图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸序列可以用来探测含有经限制性内切核酸酶处理的一组个体的基因组DNA的Southern印迹，其中所述的一组个体代表具有确定的遗传杂交的亲代和后代。DNA多态性的分离被标出并用来计算编码DWF1多肽的核酸序列在使用这个群体先前所获得的遗传图中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。

在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因衍生的探针的产生和其在遗传作图中的用途。众多出版物描述了使用以上所提及的方法学或其改良方法对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员众所周知的。

所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。

在另一实施方案中，核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大型克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。

用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸序列而实施。实例可见于文中的“定义”部分。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等，(1993)Genomics 16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等，(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等，(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook，(1989)Nucleic

Acid Res.17：6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。使用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图的亲本之间DNA序列的差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。

本发明方法产生具有如前文所述的，相对于对照植物，增加的种子产量的植物。此性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增加性状，对其他非生物胁迫和生物性胁迫的耐受性，调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。

附图描述

本发明现参考以下附图描述，其中：

图1显示分支的油菜素类固醇生物合成途径(来自Klahre等，(1998)Plant Cell 10：1677-1690)。在拟南芥中，DWF1/DIM多肽是双功能蛋白质，其催化24-亚甲基胆固醇至菜油固醇的转化，该转化通过将Δ²⁴⁽²⁸⁾键异构化为Δ²⁴⁽²⁵⁾键并随后还原双键(参见黑色的箭头)进行。菜油固醇最终转化为油菜素内酯(活性类固醇)。通过Δ²⁴⁽²⁵⁾谷固醇将异岩藻甾醇转化为谷固醇的类似反应被催化。指出了通过BR生物合成的其他酶催化的反应。示出DWF4(Aziproz等，1998；Choe等，1998Down)、DET2(Li等，1996Down；Fujioka等，1997Down)和CPD(Szekere等，1996Down)。

图2显示使用由瑞士生物信息学研究所托管的EMBNet上的TMpred算法(Hofmann和Stoffel(2003)Biol.Chem.Hoppe-Seyler 374，166)对SEQ ID NO：2所示的DWF1多肽的亲水性的预测。N-端疏水序列可清楚的辨别，其可能锚定在内膜胞质面蛋白质上。

图3显示使用TMHMM2.0算法(由丹麦技术大学服务器托管)，对SEQ ID NO：2所示的DWF1多肽跨膜蛋白质的α螺旋的定位和方向预测结果。该多肽仅包含一个跨膜结构域，蛋白质的主要部分面对胞质，而N-端锚定于细胞膜，和诸如内质网(ER)、高尔基体和线粒体的内膜系统极其类似。

图4显示来自多种来源物种的DWF1多肽的CLUSTAL W(1；83)多序列比对。框出了TMHMM2.0鉴定的信号肽和单跨膜结构域。SuperFamily登录号SSF56176预测的FAD-结合结构域以X示出、InterPro登录号IPR006094预测的FAD-结合结构域以Y示出，且由Choe等((1999)Plant Physiol 119：897-907)预测的FAD-结合结构域以Z示出。在FAD-结合结构域中，框出了结合焦磷酸盐、ADP、异咯嗪和腺嘌呤的亚结构域(根据Fraaije等(1998)Trends Biochem Sci 23：206-207；Choe等(1999)Plant Physiol 119：897-907)。例如包含于SEQ ID NO：2中的SEQID NO：29所示的底物结合结构域用粗的黑线划出。

图5显示包含DWF1多肽序列的系统树。聚簇在序列SEQ ID NO：2处的序列(植物多肽)可用于实施本发明的方法。

图6显示用于在稻中增加GOS2启动子控制下的DWF1多肽的编码甘蔗核酸序列的表达的双元载体。

图7详述用于实施本发明方法的序列的实例。

实施例

本发明现将参考仅作为说明的下列实施例加以描述。下列实施例不意图彻底定义或限制本发明范围。

实施例1：鉴定SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2相关的序列

使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中所维护的那些序列内鉴定到与SEQ ID NO：1相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列和/或与SEQ ID NO：2相关的蛋白质序列。该程序用来通过核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局部相似性的区域。对SEQ ID NO：1所编码的多肽使用TBLASTN算法，采用默认设置和过滤以忽略低复杂性序列抵消。分析的结果通过配对性比较显示，并根据几率评分(E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分数进行记分。同一性百分数指两个所比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索法的严格性。

表A提供与SEQ ID NO：1所示的核酸序列和SEQ ID NO：2所示的多肽序列相关的核酸和多肽序列的列表。

表A：编码DWF1多肽的核酸序列和DWF1多肽

名称	来源生物	数据库登录号	核酸序列SEQ ID NO：	多肽序列SEQ ID NO：
					Sacof_DWF1	甘蔗	CA272246.1CA178977.1CA147398.1	1	2
Arath_DWF1	拟南芥	AK226335	3	4
					Brara_DWF1	芜青	AC189427	5	6
Glyma_DWF1	大豆	CA783178.1CA801748.1CX548424.1	7	8
					Goshi_DWF1	陆地棉	AF513859	9	10
Lyces_DWF1	番茄(Lycopersiconexculentum)	AY584532	11	12
					Orysa_DWF1	稻	Os10g0397400	13	14
Pissa_DWF1	豌豆	AF325121	15	16
					Poptr_DWF1	美洲山杨	CK091640.1CK101745.1CN549251.1DT491786.1	17	18
Triae_DWF1	普通小麦	CK217814	19	20
					Zeama_DWF1	玉蜀黍	AY523572	21	22
Zinel_DWF1	百日菊	AB231156	23	24
					Homsa_DWF1	人	AF261758	25	26
Danre_dhcr24	斑马鱼(Danio rerio)	NM_001008645	27	28
					Sacof_DWF1variant I	甘蔗	n.a.	33	34

Sorbi_DWF1	两色蜀黍	CD462169BI075936.1AW923039CN136146.1	35	36
					Vitvi_DWF1	葡萄	AM470510	37	38

实施例2：DWF1多肽序列的比对

使用来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序(其基于普遍使用的渐进比对的聚类算法(Clustal algorithm)(Thompson等，(1997)NucleicAcids Res 25：4876-4882；Chenna等，(2003)Nucleic Acids Res31：3497-3500))进行序列的比对。空位开放罚分的缺省值为10，空位延伸罚分的缺省值为0.1，选择的权重矩阵是Blosum 62(如果比对多肽))。图4中的结果显示DWF1多肽共有高度序列保守的区域。这些特征中重要的是：(i)信号肽(由TMHMM2.0鉴定，实施例5)；(ii)单跨膜结构域(由TMHMM2.0鉴定，实施例5)；(iii)FAD-结合结构域，其Superfamily登录号为SSF56176，InterPro登录号为IPR006094，且根据Choe等，((1999)Plant Physiol 119：897-907)；在FAD-结合结构域中框出结合焦磷酸盐、ADP、异咯嗪和腺嘌呤的亚结构域(根据Fraaije等，(1998)TrendsBiochem Sci 23：206-207；Choe等，(1999)Plant Physiol 119：897-907)；和(iv)底物-结合结构域，例如SEQ ID NO：2中包含的如SEQ ID NO：29所示的底物-结合结构域。

DWF1多肽的系统树使用邻接聚类算法构建，所述邻接聚类算法由Kyoto大学生物信息中心托管的服务器上用于多序列比对的ClustalW算法提供。图5显示来自植物的DWF1多肽如何聚类于SEQ ID NO：2，而非植物的DWF1多肽形成单独的分化支。

实施例3：用于实施本发明方法的多肽序列之间全局同一性百分比(global percentage identity)的计算

用于实施本发明方法的全长多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比利用MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：an application that generates similarity/identity matrices usingprotein or DNA sequences.Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；由Ledion Bitincka托管的软件)来确定。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半部。

比较所用的参数有：

记分矩阵：Blosum 62

首个空位：12

延伸空位：2

多肽序列全长范围(将部分多肽序列排除在外)的全局相似性和同一性的软件分析结果示于表B。对角线上方给出同一性百分比，而对角线下方给出相似性百分比。

SEQ ID NO：2与用于实施本发明方法的植物来源多肽序列之间的同一性百分比可低于75％氨基酸同一性。植物来源的多肽序列和非植物来源的多肽序列(例如来自人和斑马鱼)之间的同一性百分比可降低至低于40％同一性。

表B：全长DWF1多肽序列范围的全局相似性和同一性的MatGAT结果。

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
															1.Arath_DWF1		87	38.4	84.5	82.8	37.6	78	80	80.8	83.5	79.7	79.5	79	79.6
2.Brara_DWF1	94.5		37.7	84.9	83.2	36.9	78.2	79.7	82.4	82.6	79.9	78.6	78.6	79.9
															3.Danre_dhcr24	57.4	57		38.3	39	79.5	37.4	38.3	38	38.5	38.3	38.4	37.8	37.5
4.Glyma_DWF1	90.1	91.5	58		88.4	38.6	83.8	81.9	90.3	89.1	81.5	81.3	81	84.3
															5.Goshi_DWF1	91.1	90.9	57.9	93.3		39.7	84.2	86.3	85.9	88.8	84.2	84.6	84.2	83.3
6.Homsa_DWF1	55.1	55.1	90.7	57.1	57		38.2	38.8	37.7	38.4	38.6	38.6	38	38.7
															7.Lyces_DWF1	88.6	89.1	56.7	92.1	91.2	56		80.6	83.5	84.5	80.6	79.4	80.1	82
8.Orysa_DWF1	89.7	89.7	57.6	89.9	92.2	56	87.9		80.3	84.8	95.2	92	95.4	81.9
															9.Pissa_DWF1	89.6	90.8	55.7	96.6	91.9	55	92.4	88		86.8	80.3	78.9	80.5	82.9
10.Poptr_DWF1	92.2	93.1	56.8	94.9	94.1	56	91.2	91.3	93.8		84.4	83.3	83.9	86.7
															11.Sacof_DWF1	89.5	89.8	57.6	89.4	91.1	55.6	87.9	98	88.2	91.3		91.6	97.9	81.5
12.Triae_DWF1	88.9	88.6	57.6	89.1	91.3	56.7	87.7	95.9	87.8	90.9	96.3		90.9	79.2
															13.Zeama_DWF1	89	89	57.8	89.2	91.5	55.2	87.5	97.9	88.2	90.9	98.2	95.7		80.7
14.Zinel_DWF1	90.1	91.1	56.3	92.6	91.8	55.8	89.4	89.3	91.9	93.1	89.2	88.3	88.6

DWF1多肽的底物-结合结构域，例如SEQ ID NO：2中的SEQ ID NO：29所示的底物-结合结构域，之间的同一性百分比示于表B1。植物DWF1多肽的底物-结合结构域之间的同一性百分比大于75％氨基酸同一性。非植物DWF1多肽的底物-结合结构域之间的同一性百分比也大于75％氨基酸同一性。但是，植物DWF1多肽的底物-结合结构域和非植物DWF1多肽的底物-结合结构域之间的同一性百分比低于40％。

表B1：DWF1多肽序列的底物-结合结构域之间的全局相似性和同一性的MatGAT结果。

实施例4：鉴定用于实施本发明方法的多肽序列中包含的结构域

蛋白质家族、结构域和位点整合资源(Integrated Resource of ProteinFamilies，Domains and Sites(InterPro))数据库是进行基于文本以及序列的搜索常用的标签数据库的整合界面。InterPro数据库将这些数据库结合起来，它们利用不同的方法学和有关充分表征的蛋白质的不同程度的生物信息，以获得蛋白质标签。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Interpro由位于英国的欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)托管。

SEQ ID NO：2所示多肽序列的InterPro扫描结果示于表C和图4。表C：SEQ ID NO：2所示多肽序列的InterPro扫描结果(主要的登录号)

数据库	登录号	登录名称	SEQ ID NO 2上的氨基酸位置
				InterPro	IPR006094	FAD连接的氧化酶，N-端	110-200
Pfam	PF01565	FAD_结合_4	110-200
				Panther	PTHR10801	DIMINUTO-相关的细胞伸长蛋白质(CELLELONGATION PROTEINDIMINUTO-RELATED)	1-558
SuperFamily	SSF56176	FAD-结合结构域	52-233

多种使用FAD作为辅因子的酶中的大部分是氧-依赖性氧化还原酶，其或者共价结合FAD基团，或者通过可解离的键结合FAD基团，该酶在本案中似乎是DWF1多肽。

FAD-结合结构域包含结合焦磷酸盐、ADP、异咯嗪和腺嘌呤的亚结构域(Fraaije等(1998)Trends Biochem Sci 23：206-207；Choe等(1999)PlantPhysiol 119：897-907)。这些亚结构域在图4中框出。

FAD-结合结构域的下游(DWF1多肽的C-端)是底物结合结构域(例如包含于DWF1多肽SEQ ID NO：2中的SEQ ID NO：29)，其参与24-亚甲基胆固醇至菜油固醇的两步转化，该转化通过将Δ²⁴⁽²⁸⁾键异构化为Δ²⁴⁽²⁵⁾键并随后还原双键进行(Khlare等(1998)Plant Cell 10：1677-1690)。

实施例5：用于实施本发明方法的多肽序列的拓扑预测(亚细胞定位、跨膜...)

使用TMpred程序预测跨膜区域及其方向。该算法基于对TMbase(天然发生的跨膜蛋白质的数据库)的统计学分析。该预测使用几种用于记分的权重矩阵的组合进行(Hofmann和Stoffel(2003)Biol.Chem.Hoppe-Seyler 374，166)。该算法可见于瑞士生物信息学研究所托管的EMBNet。当使用此算法分析SEQ ID NO：2时，N-端疏水序列可清楚的辨别，其可能锚定在内膜胞质面蛋白质上(图2)。

使用基于隐蔽马尔科夫模型(HMM)的TMHMM2.0算法(丹麦科技大学托管的服务器)进行跨膜蛋白质中α螺旋的定位和方向的预测。对SEQID NO：2所示多肽进行的分析的结果示于下表D且图示于图3。该多肽仅包含一个跨膜结构域，蛋白质的主要部分面对胞质，而N-端锚定于细胞膜，和诸如内质网(ER)、高尔基体和线粒体的内膜系统极其类似。

表D：多肽序列SEQ ID NO：2的TMHMM2.0计算结果

质膜相关的位置	SEQ ID NO：2从N-端到C-端的氨基酸	多肽序列SEQ ID NO：2上对应的结构域
			细胞内的序列	1-20	疏水N-端
跨膜螺旋	21-43	跨膜结构域
			细胞外的序列	44-561	包含FAD-结合结构域和底物-结合结构域

进行亚细胞定位分析的算法包括：

●TargetP 1.1，由丹麦技术大学服务器维护；

●ChloroP 1.1，由丹麦技术大学服务器托管；

●蛋白质寻觅亚细胞定位预测软件(Protein Prowler SubcellularLocalisation Predictor)，1.2版，由澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生物科学研究所(Institute for Molecular Bioscience，University ofQueensland，Brisbane，Australia)的服务器托管；

●PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5，由加拿大大阿尔贝塔埃德蒙顿阿尔贝塔大学(University of Alberta，Edmonton，Alberta，Canada)的服务器托管。

实施例6：用于实施本发明方法的多肽序列的测定

内源固醇和外源加入的、氘-标记的24-亚甲基胆固醇的代谢物(底物饲喂实验(substrate feeding experiments))的测量是本领域众所周知的，且在例如Fujioka等(2002)Plant Physiol 130：930-939；He等(2003)Plant Physiol 131：1258-1269；或Hong等(2005)Plant Cell 17：2243-2254中充分阐述。

互补测试可也用于鉴定用于实施本发明方法的DWF1多肽。特征在于缺乏DWF1活性的植物突变体是本领域众所周知的，例如拟南芥中的dim和dwf1突变体(Klahre等(1998)Plant Cell 10：1677-1690；Choe等(1999)Plant Physiol 119：897-907)，以及稻中的brd2突变体(Hong等(2005)PlantCell 17：2243-2254)。通过在此类突变植物中引入和表达编码上文定义的DWF1多肽的核酸序列，可恢复正常植物表型。

实施例7：克隆SEQ ID NO：33所示的核酸序列

除非另外声明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)MolecularCloning：a laboratory manual，第三版Cold Spring Harbor LaboratoryPress，CSH，New York)中或Ausubel等(1994)，Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols第1和2卷中描述的标准方法进行。用于植物分子工作的标准材料和方法在由BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。

甘蔗DWF1基因通过PCR，使用从提取自混合的植物材料的mRNA合成的甘蔗cDNA作为模板而扩增。PCR扩增使用引物(SEQ ID NO：30，有义：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGCGGACGTGCATGAACC-3’和SEQ ID NO：31，反义：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTT AGGCCTCGTCCGCGTAGG-3’)，其包括用于Gateway重组的AttB位点。在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。扩增预期长度的PCR片段(包括AttB1位点)，并也使用标准方法予以纯化。随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”。质粒pDONR201作为技术的部分从Invitrogen购买。

实施例8：使用如SEQ ID NO：33所示的核酸序列构建表达载体

包含SEQ ID NO：33的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物选择性标记；可筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆内的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：39)位于这种Gateway盒的上游。

在LR重组步骤后，产生的表达载体pGOS2::DWF1(图6)根据本领域众所周知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。

实施例9：植物转化

稻转化

含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将稻的日本栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％醇中温育一分钟，随后在2％HgCl2中30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟而实施消毒。消毒的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中温育4周后，将盾片衍生的胚发生性愈伤组织切下并在同一种培养基上增殖。2周后，愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周而繁殖或增殖。胚发生性愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，之后共培育(以增强细胞分裂活性)。

含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并重悬在液体共培育培养基中至密度(OD600)约1。将混悬液随后转移至培养皿并将愈伤组织在该混悬液内浸泡15分钟。愈伤组织组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃温育3日。共培育的愈伤组织在黑暗中于28℃在选择剂存在下于含有2，4-D的培养基上培育4周。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再生培养基并在光线下温育后，胚发生潜力释放并且苗在随后4-5周发育。将苗从愈伤组织中切下并且在含有植物生长素的培养基上温育2-3周，其中将苗从所述的培养基上转移至土壤。硬化的苗在高湿度和短日照下于温室中培育。

一个构建体产生大约35个独立T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留表现选择剂耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3-5月收获。本方法以超过50％的比率产生单一基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。

实施例10：表型评价方法

10.1评价准备

产生大约35个独立的T0稻转化体。原代转化体从组织培养箱转移至温室用于生长和收获T1种子。留下7个事件，其中所述事件的T1后代对转基因的存在/不存在以3∶1比例分离。对于这些事件中的每一事件，通过监测目视标记表达而选择含有转基因的大约10株T1幼苗(杂合子和纯合子)和缺少转基因的大约10株T1幼苗(失效合子)。转基因植物和对应的失效合子在随机位置上并排培育。温室条件是短日照(12小时光照)，在光线下28℃和在黑暗中22℃以及相对湿度70％。

按照T1代相同的评估方法(但是每个事件具有更多的个体)对4个T1事件的T2代进行进一步的评估。从播种期到成熟期，植物多次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。

10.2统计分析：F检验

利用双因素ANOVA(方差分析)作为统计模型，对植物表型特征进行全面评估。对用本发明基因转化的所有植株的所有事件的所有测量参数进行F检验。进行F检验以检查基因对所有转化事件的效应，并检验基因的总体效应，亦称为“整体基因效应”。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F检验的5％概率水平。如果显著性F检验值指向某基因效应，这意味着不仅仅是基因的存在或定位引起表型上的差异。

10.3测量的参数

生物量相关参数的测量

从播种期到成熟期，植物多次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。

植物地上面积(或者说叶生物量)通过计数区别于背景的地上植物部分数码图像的像素总数而确定。此值取同一时间点从不同的角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转换为以平方毫米表示的物理表面值(physicalsurface value)。实验表明通过这种方法测量的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关。地上面积在植物达到其最大叶生物量的时间点测量的面积。早期萌发势是萌发后三周的植物(幼苗)地上面积估测。根生物量的增加表达为根总生物量(测量为植物生活周期中观察到的最大根生物量)的增加；或者表达为根/冠比(root/shoot index)(测量为根和茎活跃生长期时根质量与茎质量的比率)的增加。

种子相关参数的测量

收获成熟的初级圆锥花序、计数、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37℃干燥三天。随后将圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。使用鼓风装置将饱满谷壳和空壳分开。弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。通过计数在分离步骤之后剩下的饱满谷壳数确定饱满种子的数目。通过称量所有从一株植物收获的饱满谷壳来测量每株植物的种子总重量。通过计数从植物收获的谷壳的数目测量每株植物的种子总数。从计数的饱满种子数目和它们的总重推断得出千粒重(TKW)。收获指数在本发明中定义为种子总产量和地上面积(mm²)之间的比值，再乘以因子10⁶。每个圆锥花序的花总数在本发明中定义为种子总数与成熟初级圆锥花序数之间的比率。种子饱满率在本发明中定义为饱满种子数占种子总数的比例(以％表示)。

实施例11：转基因稻植物的表型评价结果

表达DWF1核酸序列的转基因稻植物的评价结果如下。

与对应的失效合子(对照)相比，转基因(植物)的每株植物的种子总重量和千粒重显著增加。

	T1世代中三个最佳表现事件的平均增加％	T2世代中三个最佳表现事件的平均增加％
			每株植物的种子总重量	18％	16％
TKW	4％	3％

实施例12：其他作物转化的实例

玉米转化

玉米的转化根据对Ishida等(1996.Nature Biotech 14745-50)描述方法的改良方法进行。在玉米中的转化是基因型依赖的并且仅特定的基因型可操作用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，但是其他基因型也可以成功地使用。玉米穗从玉米植物中在授粉后大约11日(DAP)收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

小麦转化

小麦的转化用Ishida等Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(可从墨西哥CIMMYT获得的)栽培品种Bobwhite。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。在与农杆菌温育后，胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

大豆转化

根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生节。将这些腋生节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌温育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的苗切下并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

油菜/卡诺拉油菜转化

使用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但是也可以使用其他品种。对卡诺拉油菜种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并以(含有表达载体的)农杆菌通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种。外植体随后在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基上在23℃，16小时光照下培养2天。在与农杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有的3mg/lBAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上持续7日，并且随后在含头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗具有5-10mm长度时，将苗切下并转移至苗伸长培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

苜蓿转化

苜蓿的再生性克隆使用(McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847)的方法加以转化。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW与AAtanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture 4：111-112)描述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，RA3品种(威斯康星大学)已经被选择用于组织培养中(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999 Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑暗中在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K₂SO₄和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3天.外植体在半浓缩Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并平板接种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和合适抗生素以抑止农杆菌生长的相同SH诱导培养基上。在数周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半浓缩Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

棉花转化

棉花(陆地棉)的转化使用根瘤农杆菌，在下胚轴外植体上进行。市售品种，例如Coker 130或Coker 312(SeedCo，Lubbock，TX)是用于转化的标准变种，但是也可以使用其他变种。表面消毒种子并在黑暗中萌发。从长约1-1.5厘米的萌发幼苗上切下下胚轴外植体。下胚轴外植体浸没在包含表达载体的根瘤农杆菌接种物中5分钟，然后在黑暗中，于24℃下在MS+1.8mg/l KNO₃+2％葡萄糖上共培育约48小时。外植体转移到含有合适细菌和植物选择性标记的相同培养基中(更新几次)，直到可以看见胚性胼胝体(embryogenic calli)。分离胼胝体并再培养直至出现体细胞胚。源自体细胞胚的小植株在生根培养基上成熟至根发育。生根的幼苗转移到温室中的花钵土壤中。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。

实施例13：非生物胁迫筛选的实例

干旱筛选

在正常条件下在花盆土中培养来自所选择数目的事件的植物，直到进入抽穗期。然后将其转移到“干燥”区域，停止灌溉。向随机选择的花盆中插入湿度探测仪，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC低于一定的阈值时，自动向植物持续补水，直到再次达到正常水平。然后将植物再次重新转移到正常条件下。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。详细记录正常条件下培养的生长和产量参数。

盐胁迫筛选

在由椰子纤维和argex(3比1的比例)制成的基质上培养植物。在将幼苗移植至温室后的前两周使用正常的营养液。前两周过后，向营养液中添加25mM的盐(NaCl)，直到收获植物为止。详细记录正常条件下培养的生长和产量参数。

减少的养分(氮)可用性筛选

在除营养液以外正常的条件下在花盆土中培养来自6个事件的植物(T2种子)。从植物移植到成熟一直用特定的营养液对花盆浇水，所述营养液的氮(N)含量降低，通常低7到8倍。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。详细记录正常条件下培养的生长和产量参数。