DE112008003316T5

DE112008003316T5 - Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zur Herstellung derselben

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Publication number: DE112008003316T5
Application number: DE112008003316T
Authority: DE
Inventors: Christophe Reuzeau; Valerie Frankard; Yves Hatzfeld; Ana Isabel Sanz Molinero
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2007-12-20
Filing date: 2008-12-22
Publication date: 2011-05-05
Also published as: CN101969759A; WO2009080802A2; CA2708506A1; US20140096283A1; AU2008339968A1; WO2009080802A3; US20100269219A1; EP2240009A2; AR072133A1; US8575421B2

Abstract

Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression von Nukleinsäure, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
a) einer Nukleinsäure, codierend ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid, in einer Pflanze,
b) einer Nukleinsäure, codierend ein Epsin-like-Polypeptid, wobei das Epsin-like-Polypeptid eine ENTH-Domäne umfasst, in einer Pflanze,
c) einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein tRNA-delta(2)-Isopentenylpyrophosphat-Transferase(IPPT)-Polypeptid, wobei das IPPT-Polypeptid (i) eine tRNA-Isopentenyltransferase-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR002627; und (ii) ein N-terminales ATP/GTP-Bindungsstellen-Motiv A (P-loop) umfasst, in den Samen einer Pflanze, und gegebenenfalls Selektieren von Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, und
d) einer Nukleinsäure, codierend ein SHR-Polypeptid, in Pflanzen, die unter Bedingungen mit sub-optimaler Nährstoffverfügbarkeit kultiviert werden.

Description

Diese Anmeldung beansprucht den Prioritäts-Vorteil der folgenden Patentanmeldungen: EP 07123820.8 , eingereicht am 20. Dezember 2007; US 61/027,513, eingereicht am 11. Februar 2008; EP 07124011.3 , eingereicht am 21. Dezember 2007; US 61/027,105, eingereicht am 08. Februar 2008; EP 07124036.0 , eingereicht am 21. Dezember 2007; US 61/027,155, eingereicht am 08. Februar 2008; EP 07125090.7 , eingereicht am 24. Dezember 2007; und US 61/027,499, eingereicht am 11. Februar 2008; wobei der gesamte Inhalt von jeder davon hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung verschiedener ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die einen TCP1- oder einen TCP2-Transkriptionsfaktor codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer, ein TCP1- oder TCP2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstums-Charakteristika durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein Epsin-ähnliches bzw. ”Epsin-like”-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer ein Epsin-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstumscharakteristika im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
In noch einer anderen Ausführungsform beschäftigt sich die vorliegende Erfindung mit einem Verfahren zur Erhöhung verschiedener den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein tRNA-delta(2)-Isopentenyl-pyrophosphat-Transferase(IPPT)-Polypeptid codiert, in den Samen einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer ein IPPT-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in den Samen, wobei die Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung betrifft außerdem Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Pflanzen, welche die Nukleinsäuresequenzen enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen, die unter Bedingungen mit suboptimaler Nährstoffverfügbarkeit kultiviert werden, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein SHORT-ROOT(SHR)-Polypeptid codiert. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Erhöhung des Tausendkerngewichts (TKW) in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein SHR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, die unter nicht-nährstofflimitierenden Bedingungen kultiviert wird. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer modulierten Expression einer ein SHR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt außerdem Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
Die stetig anwachsende Weltbevölkerung und die schwindende Reserve an anbaufähigem Land, das für die Landwirtschaft zur Verfügung steht, treibt die Forschung hin zur Erhöhung der Effizienz der Landwirtschaft. Herkömmliche Methoden für Verbesserungen bei Nutzpflanzen und Gartenpflanzen wenden selektive Züchtungstechniken zum Identifizieren von Pflanzen mit wünschenwerten Merkmalen an. Allerdings weisen derartige selektive Züchtungstechniken mehrere Nachteile dahingehend auf, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, welche häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, welche nicht immer dazu führen können, dass die erwünschte Eigenschaft von Elternpflanzen weitergegeben wird. Die Fortschritte in der Molekularbiologie haben es der Menschheit erlaubt, das Keimplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die gentechnische Manipulation von Pflanzen beinhaltet die Isolierung und Manipulierung von genetischem Material (typischerweise in der Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einbringung dieses genetischen Materials in eine Pflanze. Diese Technologie weist das Vermögen auf, Nutzpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, landwirtschaftlichen oder gärtnerischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.
Eine Eigenschaft von besonderem wirtschaftlichen Interesse ist ein erhöhter Ertrag. Der Ertrag ist normalerweise als der messbare Gewinn von ökonomischem Wert aus einer Nutzpflanze definiert. Dies kann in Bezug auf die Quantitiät und/oder Qualität definiert sein. Der Ertrag ist direkt von mehreren Faktoren, wie zum Beispiel der Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (z. B. der Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blatt-Seneszenz und sonstigem, abhängig. Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Früh-Wuchskraft können ebenfalls bedeutende Faktoren bei der Bestimmung des Ertrags sein. Das Optimieren der oben erwähnten Faktoren kann daher zu einer Erhöhung des Nutzpflanzenertrags beitragen.
Der Samenertrag ist ein besonders wichtiges Merkmal, da die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Nutzpflanzen, wie Mais, Reis, Weizen, Canola und Sojabohne machen über die Hälfte der gesamten menschlichen Kalorienaufnahme aus, ob durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch Verzehr von Fleischprodukten, welche auf Grundlage verarbeiteter Samen erzeugt wurden. Sie stellen ebenfalls eine Quelle für Zucker, Öle und viele Arten von Metaboliten, die in industriellen Verfahren verwendet werden, dar. Samen enthalten einen Embryo (die Quelle von neuen Sprossen und Wurzeln) sowie ein Endosperm (die Quelle von Nährstoffen für das Embryowachstum während der Keimung und während des frühen Wachstums der Setzlinge). Die Entwicklung eines Samens beteiligt zahlreiche Gene und erfordert den Transfer von Metaboliten aus den Wurzeln, Blättern und Stengeln in den wachsenden Samen. Das Endosperm assimiliert im Besonderen die Stoffwechselvorläufer von Kohlehydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert sie zu Speichermakromolekülen, um das Korn auszufüllen.
Die Pflanzenbiomasse ist der Ertrag für Futterpflanzen, wie Alfalfa, Silomais und Heu. Bei Getreidepflanzen hat man zahlreiche Vertreter für den Ertrag verwendet. Am bedeutendsten unter diesen sind Schätzungen der Pflanzengröße. Die Pflanzengröße kann auf vielen Wegen gemessen werden, abhängig von der Spezies und der Entwicklungsstufe, beinhaltet jedoch das Gesamtpflanzen-Trockengewicht, das oberirdische Trockengewicht, das oberirdische Frischgewicht, die Blattfläche, das Stengelvolumen, die Pflanzenhöhe, den Rosettendurchmesser, die Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, die Triebzahl und die Blattzahl. Viele Spezies halten ein konservatives Verhältnis zwischen der Größe der verschiedenen Teile der Pflanze bei einer gegebenen Entwicklungsstufe ein. Diese allometrischen Beziehungen werden verwendet, um aus einem dieser Größenmaße auf ein anderes zu schließen (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Die Pflanzengröße bei einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße später in der Entwicklung korrelieren. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann in der Regel mehr Licht und Kohlendioxid absorbieren als eine kleinere Pflanze, und wird deshalb wahrscheinlich während derselben Zeitdauer ein größeres Gewicht gewinnen (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50: 39). Dies kommt zusätzlich zu der potentiellen Fortdauer des mikroumgebungsbezogenen oder genetischen Vorteils hinzu, den die Pflanze hatte, um anfänglich die höhere Größe zu erreichen. Es existiert eine starke genetische Komponente hinsichtlich Pflanzengröße und Wachstumsrate (z. B. ter Steege et al., 2005, Plant Physiology 139: 1078), und daher besteht, für eine Auswahl an diversen Genotypen, wahrscheinlich eine Korrelation der Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung mit der Größe unter einer anderen (Hittalmani et al., 2003, Theoretical Applied Genetics 107: 679). Auf diese Weise wird eine Standardumgebung als Stellvertreter für die vielfältigen und dynamischen Umgebungen benutzt, welche von Nutzpflanzen auf dem Feld an unterschiedlichen Örtlichkeiten und Zeitpunkten angetroffen werden.
Eine andere bedeutende Eigenschaft für viele Nutzpflanzen ist die Früh-Wuchskraft. Die Verbesserung der Früh-Wuchskraft ist ein wichtiges Ziel bei modernen Reis-Züchtungsprogrammen sowohl in gemäßigten als auch tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind wichtig für eine korrekte Bodenverankerung bei in Wasser ausgesätem Reis. Falls Reis direkt in überflutete Ackerfelder ausgesät wird, und falls die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen müssen, stehen längere Sprosse bzw. Triebe mit der Wuchskraft in Zusammenhang. Wo eine Aussaat mit Drillvorrichtung praktiziert wird, sind längere Mesokotyle und Koleoptile für eine günstige Setzlingsemergenz bedeutsam. Die Fähigkeit, Früh-Wuchskraft künstlich in Pflanzen einzubringen, wäre für die Landwirtschaft von großer Bedeutung. Zum Beispiel war eine geringe Früh-Wuchskraft eine Einschränkung bei der Einführung von Mais(Zea Mais L.)-Hybriden auf Basis von ”Corn Belt”-Keimplasma im europäischen Atlantikraum.
Der Ernteindex, das Verhältnis von Samenertrag zu oberirdischem Trockengewicht, ist unter vielen Umweltbedingungen verhältnismäßig stabil, und somit kann häufig eine beständige Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag erhalten werden (z. B. Rebetzke et al., 2002, Crop Science 42: 739). Diese Prozesse sind intrinsisch verknüpft, weil die Mehrheit der Kornbiomasse von der aktuellen oder gespeicherten photosynthetischen Produktivität seitens der Blätter und des Stengels der Pflanze abhängig ist (Gardener et al., 1985, Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, S. 68–73). Deshalb ist das Selektieren hinsichtlich der Pflanzengröße sogar bei frühen Entwicklungsstadien, als ein Indikator für den zukünftigen potentiellen Ertrag verwendet worden (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Beim Testen hinsichtlich der Auswirkung von genetischen Unterschieden auf die Stresstoleranz ist die Fähigkeit zur Standardisierung von Bodeneigenschaften, Temperatur, Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit sowie Lichtintensität ein spezifischer Vorteil von Gewächshaus- oder Pflanzenwachstumskammer-Umgebungen im Vergleich zu Feldbedingungen. Allerdings können künstliche Einschränkungen auf den Ertrag wegen geringer Bestäubung aufgrund des Fehlens von Wind oder Insekten oder wegen ungenügendem Raum für die reife Wurzel oder das Laubkronenwachstum (canopy growth) die Anwendung dieser regulierten Umgebungen zum Testen von Ertragsunterschieden begrenzen. Deshalb sind Messungen der Pflanzengröße in der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus Standardpraktiken, um Hinweise auf potentielle genetische Ertragsvorteile bereitzustellen.
Ein anderes Merkmal von Bedeutung ist jenes der verbesserten Toleranz gegenüber abiotischem Stress. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweiten Ernteverlust, wobei die Durchschnittserträge für die meisten wichtigen Nutzpflanzen um mehr als 50% reduziert werden (Wang et al. (2003) Planta 218: 1–14). Abiotische Stressformen können durch Dürre, Salzgehalt, Temperatur-Extreme, chemische Toxizität, Überschuss oder Mangel an Nährstoffen (Makroelemente und/oder Mikroelemente), Strahlung und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit zur Erhöhung der Pflanzentoleranz gegenüber abiotischem Stress wäre weltweit für Landwirte von großem wirtschaftlichen Vorteil und würde den Anbau von Nutzpflanzen während ungünstigen Bedingungen sowie in Territorien, auf welchen eine Kultivierung von Nutzpflanzen ansonsten nicht möglich sein kann, gestatten.
Der Nutzpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben erwähnten Faktoren erhöht werden.
Abhängig von der Endanwendung kann die Modifikation bestimmter Ertragseigenschaften gegenüber anderen bevorzugt sein. Beispielsweise kann für Anwendungen, wie Futtermittel- oder Holzproduktion, oder Biotreibstoff-Ressourcen, ein Zuwachs bei den vegetativen Teilen einer Pflanze wünschenswert sein, und für Anwendungen, wie Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann ein Zuwachs hinsichtlich der Samenparameter besonders erwünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können, abhängig vom Verwendungszweck, manche gegenüber anderen bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Erhöhung des Samenertrags beitragen, ungeachtet dessen, ob diese in Form einer erhöhten Samengröße oder einer erhöhten Samenzahl vorliegt.
Eine Vorgehensweise zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann durch Modifikation der inhärenten Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie etwa dem Zellzyklus oder verschiedenen Signalleitungswegen, die am Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind.
Es ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen verbessert werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein TCP1- oder ein TCP2- oder ein Epsin-like- oder ein SHR-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze moduliert.
In einer anderen Ausführungsform ist festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein tRNA-delta(2)-Isopentenylpyrophosphat-Transferase(IPPT)-Polypeptid, in den Samen einer Pflanze erhöht. Die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhter Früh-Wuchskraft, erhöhter oberirdischer Biomasse, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Gesamtzahl an Samen, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Anzahl an Blüten pro Rispe und erhöhtem Ernteindex.
Hintergrund
TCP1/TCP2-Polypeptide
Transkriptionsfaktoren sind üblicherweise als Proteine definiert, welche sequenzspezifische DNA-Bindungsaffinität aufzeigen und welche zum Aktivieren und/oder Unterdrücken von Transkription in der Lage sind. Das Genom von Arabidopsis thaliana codiert mindestens 1533 transkriptionelle Regulatoren, was ~ 5,9% seiner geschätzten Gesamtzahl an Genen ausmacht (Riechmann et al. (2000) Science 290: 2105–2109). Die TCP-Familie der Transkriptionsfaktoren ist benannt nach ihren ersten charakterisierten Vertretern (Teosintebranched1 (TB1), Cycloidea (CYC) und PCNA-Faktor (PCF); Cubas P., et al. (1999), Plant J. 18 (2): 215–22). In Arabidopsis thaliana sind mehr als 20 Mitglieder der TCP-Familie-Polypeptide identifiziert und basierend auf Sequenzähnlichkeit in der TCP-Domäne in Klasse-I-Transkriptionsfaktoren (ebenfalls bezeichnet als Gruppe I oder PCF-Gruppe), welche Genexpression positiv regulieren, und Klasse-II-Transkriptionsfaktoren (ebenfalls bezeichnet als Gruppe II oder CYC-TB1-Gruppe), welche Proliferation negativ regulieren, klassifiziert worden. Alle TCP-Transkriptionsfaktoren sind durch eine nicht-kanonische vorhergesagte basic-Helix-Loop-Helix (bHLH) gekennzeichnet, welche sowohl für DNA-Bindung als auch Homo- und Hetero-Dimerisierung erforderlich ist (siehe Cubas et al. oben).
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass das Erhöhen der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, die einen TCP1- oder einen TCP2-Transkriptionsfaktor codiert, Pflanzen ergibt, welche gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, aufweisen. Die jeweilige Untergruppe von TCP-Polypeptiden, die zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften geeignet ist, ist nachstehend ausführlich beschrieben.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Epsin-like-Proteine
Eukaryotische Zellen besitzen ein ausgeklügeltes Membransystem, das bei der Aufnahme von Molekülen (Endocytose) oder beim Transport von Molekülen in den Zellaußenraum (sekretorischer Weg) funktioniert. Der sekretorische Weg führt vom endoplasmatischen Retikulum über den Golgi-Apparat zur Zellmembran. Der endocytotische Weg verläuft von der Zellmembran ins Zellinnere. Alle diese Wege benutzen Vesikel, welche aus der Organelle, aus der sie stammen, abknospen und welche in Hinsicht auf den Inhalt, den sie enthalten, sowie ihren Zielort hochselektiv sind. Neu synthetisierte Proteine müssen zu den verschiedenen subzellulären Orten transportiert oder in die extrazelluläre Umgebung exportiert werden. Das intrazelluläre Trafficking wird von vielen Proteinen reguliert, die zum Beispiel Teil des Vesikels sind oder bei der Vesikelbildung oder -fusion helfen oder das Trafficking regulieren oder bei der Auswahl von Nutzlastproteinen helfen, etc. Viele dieser Proteine sind Pflanzen, Hefe und Tieren gemeinsam, was zeigt, dass die intrazelluläre Trafficking-Maschinerie unter Eukaryoten konserviert ist. Eine derartige Gruppe von Proteinen ist durch die Gegenwart einer konservierten ”Epsin N-Terminale Homologie” (ENTH)-Domäne gekennzeichnet. Die ENTH-Domäne ist zur Bindung an Phosphatidylinositole befähigt, und deshalb nimmt man an, dass sie eine Rolle bei der Lenkung dieser Proteine zu spezifischen Kompartimenten spielt und bei der Clathrin-vermittelten Knospung hilft. Es wird postuliert, dass ANTH(AP180 N-Terminale Homologie)-Domänen eine ähnliche Funktion wie ENTH-Domänen besitzen, aber Teil von strukturell unterschiedlichen Proteinen sind.
Epsin-like-Proteine umfassen sämtlich eine ENTH-Domäne, und es wird postuliert, dass sie ähnliche Rollen bei der Bildung von Clathrin-beschichteten Vesikeln spielen; es wurde berichtet, dass Epsin-like-Proteine mit verschiedenen Proteinen Wechselwirken (Lee et al., Plant Physiology 143, 1561–1575, 2007; Song et al., Plant Cell 18, 2258–2274, 2006).
Adenylat-IPTs (AMP-Isopentyltransferasen/ATP/ADP-Isopentyltransferasen) Phytohormone steuern Pflanzenwachstum und -entwicklung in Antwort auf endogene und umweltbedingte Stimuli. Zu Beispielen für Phytohormone zählen Abscisinsäure, Auxine, Cytokinine, Ethylen, Gibberelline, Brassinolide, Salicylsäure, Jasmonate, Signalleitungs-Peptide und Systemin.
In Pflanzen bilden natürlich vorkommende Cytokinine (CKs) eine Gruppe von Adeninderivaten, die entweder eine Isopentenyl-Seitenkette (Isoprenoid-CKs; häufigster Typ) oder eine aromatische Gruppe (aromatische CKs; selten) tragen, und spielen eine essentielle Rolle bei der Pflanzenentwicklung. Der erste und Geschwindigkeits-limitierende Schritt der Biosynthese von Isoprenoid-CKs wird von Isopentenyltransferasen katalysiert, welche den Isopentenyl-Rest von delta(2)-Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) oder Hydroxymethylbutenyldiphosphat (HMBDP) auf die Position N⁶ auf einem konjugierten Adenin übertragen. Die Isopentyltransferasen können in drei Subgruppen unterteilt werden, abhängig davon, welches konjugierte Adenin sie verwenden:

1) AMP-Isopentyltransferasen (ebenfalls bezeichnet als DMAPP:AMP-Isopentyltransferase, EC 2.5.1.27), die präferentiell Adenosin-5'-monophosphat als Akzeptormolekül benutzen; typische Beispiele findet man in phytopathogenen Bakterien, wie in Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas syringae, Pseudomonas solanacearum (Ralstonia solanacearum) und Pantoea agglomerans (Erwinia herbicola), dem Stickstoff-fixierenden symbiotischen Cyanobakterium Nostoc, oder dem Schleimpilz Disctyostelium discoideum.
2) ATP/ADP-Isopentyltransferasen (ebenfalls bezeichnet als DMAPP:ATP/ADP-Isopentyltransferase), die präferentiell Adenosin-5'-triphosphat oder Adenosin-5'-diphosphat als Akzeptormolekül benutzen; zum Beispiel finden sich 8 ATP/ADP-Isopentyltransferasen in Arabidopsis thaliana (Miyawaki et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (44): 16598–16603).
3) tRNA-Isopentyltransferasen (ebenfalls bezeichnet als DMAPP:tRNA-Isopentyltransferase, oder tRNA-delta(2)-Isopentenyl-Pyrophosphat-Transferase (IPPT), EC 2.5.1.8), die präferentiell Adenin an Position 37 von bestimmten tRNAs (lokalisiert im Cytoplasma, in den Plastiden und in den Mitochondrien), nahe dem Anticodon, benutzen; das Enzym ist gereinigt und das Gen aus Bakterien, Hefe, Tieren und Pflanzen kloniert worden.

Die zwei ersten Subgruppen (kollektiv Adenylat-IPTs genannt) katalysieren die direkte Denovo-Biosynthese von freien Cytokininen, im Wesentlichen bestehend aus Isopentenyladenin-(iP)-Typen and Transzeatin-(tZ)-Typen von Cytokininen. Die dritte Subgruppe (genannt tRNA-IPTs oder IPPTs) katalysiert die Cytokininbildung durch Isopentenylierung von tRNA, welche beim Abbau Cytokinin-Nukleotide freigibt, die ihrerseits verwendet werden, um cis-Zeatin(cZ)-Typen von Cytokininen zu biosynthetisiren. Somit bestimmt auch die Rate des tRNA-Turnovers in starkem Maße die Verfügbarkeit von freien Cytokinin-Nukleotiden.
Obgleich tRNA eine übliche Quelle von freien Cytokininen in Prokaryoten ist (Koenig et al. (2002) J. Bacteriol. 184: 1832–1842), tragen sowohl die tRNA- als auch die Adenylat-IPT-Wege zur Cytokinin-Biosynthese in Samenpflanzen bei (Miyawaki et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (44): 16598–16603). Allerdings geht man im Allgemeinen davon aus, dass der tRNA-Weg ungenügend ist, um eine signifikante Quelle von Cytokininen in Samenpflanzen auszumachen. Schlussendlich führen die zwei biosynthetischen Wege zur Synthese von unterschiedlichen Cytokininen und zu unterschiedlichen Proportionen.
Sowohl Adenylat-IPTs als auch tRNA-IPTs weisen in ihrem N-Terminus das ATP/GTP-P-loop-Bindungsmotiv (A, G)-X4-G-K-(S, T) auf. Eine andere allgemein bekannte konservierte Region, die spezifisch für eukaryotische tRNA-IPTs ist und in prokaryotischen tRNA-IPTs fehlt, ist am C-Terminus lokalisiert: das Zn-Finger-ähnliche Motiv C2H2 (C-X2-C-X(12,18)-H-X5-H). Die Funktion eines Zn-Finger-ähnlichen Motivs in tRNA-IPTs steht möglicherweise mit Protein-Protein-Wechselwirkungen und der Zellkern-Lokalisierung in Zusammenhang (Golovko et al. (2000) Gene 258: 85–93).
Wenn eine Adenylat-IPT aus Agrobacterium tumefaciens konstitutiv in Pflanzen überexprimiert wurde, oder schwächer oder konditionell exprimiert wurde, zeigten diese die typischen Effekte von Cytokinin-Überproduktion, wie etwa unkontrolliertes Achselknospen-Wachstum (reduzierte Apikaldominanz), Bildung von kleinen gekräuselten Blättern, verzögerte Wurzelbildung und modifizierte Seneszenz (zum Beispiel, Luo et al. (2005) Plant Growth Regulation 47: 1–47, und Bezugsstellen darin).
Transgene Arabidopsis- und Canola-Pflanzen, die eine bakterielle Adenylat-IPT unter der Steuerung eines samenspezifischen Promotors exprimieren, wiesen einen durchschnittlichen Samenertag pro Pflanze auf, der im Vergleich zu Kontrollpflanzen nicht bedeutend erhöht war (Roeckel et al. (1997) Transgenic Res. 6 (2): 133–41).
Die US-Patentanmeldung 2006/0010515 beschreibt transgene Arabidopsis thaliana-Pflanzen, die eine Adenylat-IPT von Agrobacterium tumefaciens unter unabhängiger Verwendung von drei Zellzyklus-regulierten Promotoren exprimieren, wobei die Pflanzen erhöhte Blattgröße/vegetative Masse, erhöhte Pflanzenhöhe, erhöhte Zweiganzahl, erhöhte Blüten- und Schotenzahl aufweisen.
SHORT ROOT (SHR)
Mitglieder der GRAS-Genfamilie (ein Akronym basierend auf den Bezeichnungen von bekannten Genen: GAI, RGA und SCR) codieren transkriptionelle Regulatoren, welche diverse Funkltionen in Pflanzen-Wachstum und -Entwicklung aufweisen, wie etwa Gibberellin-Signaltransduktion; Wurzel-Radial-Musterentstehung, Bildung von axillärem Meristem, Phytochrom-A-Signaltransduktion und Gametogenese. Die phylogenetische Analyse unterteilt die GRAS-Genfamilie in acht Subfamilien, welche eigene konservierte Domänen und Funktionen aufweisen (Tian et al., 2004 (Plant Molecular Biology, Band 54, Nummer 4, S. 519–532). GRAS-Proteine enthalten eine konservierte Region von etwa 350 Aminosäuren, welche in fünf Motive unterteilt werden kann, die in der nachstehenden Reihenfolge vorgefunden werden: Leucin-Heptaden-Repeat I, das VHIID-Motiv, Leucin-Heptaden-Repeat II, das PFYRE-Motiv und das SAW-Motiv.
SHORT ROOT, oder SHR, ist ein Mitglied der GRAS-Familie von Pflanzen-Transkriptionsfaktoren und ist ein Protein, das an der Wurzelentwicklung beteiligt ist.
Das erteilte Patent US 6 927 320 B1 beschreibt SHR-Gene und offenbart, dass die SHR-Genexpression die Zellteilung bestimmter Zelltypen in Wurzeln reguliert, die Organisation von Wurzel und Stengel beeinflußt und den Gravitropismus von oberirdischen Strukturen beeinflußt. Es wird erwogen, dass die Modulation von SHR-Expressionsniveaus angewandt werden kann, um Wurzel und oberirdische Strukturen von transgenen Pflanzen zu modifizieren und die agronomischen Eigenschaften derartiger Pflanzen zu steigern. Es wird auch vorgeschlagen, dass Pflanzen, bei denen eine SHR-Überexpression künstlich herbeigeführt wird, verbesserte Vital-Wachstumscharakteristika aufzeigen können, welche durch Untersuchen eines beliebigen der folgenden Parameter identifiziert werden können: 1. Wachstumsrate, 2. vegetativer Ertrag der reifen Pflanze, 3. Samen- oder Fruchtertrag, 4. Samen- oder Fruchtgewicht, 5. Gesamt-Stickstoffgehalt der Pflanze, 6. Gesamt-Stickstoffgehalt der Frucht oder des Samens, 7. freier Aminosäuregehalt der Pflanze, B. freier Aminosäuregehalt der Frucht oder des Samens, 9. Gesamtproteingehalt der Pflanze, und 10. Gesamtproteingehalt der Frucht oder des Samens.
Zusammenfassung
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid codiert, Pflanzen ergibt, welche gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften, insbesondere erhöhten Ertrag und Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, aufweisen.
Ebenfalls überraschend ist es festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein Epsin-like-Polypeptid codiert, Pflanzen ergibt, welche gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften, insbesondere erhöhten Ertrag und/oder erhöhte Früh-Wuchskraft, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, aufweisen.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von ertragsbezogenen Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein Epsin-like-Polypeptide codiert, in einer Pflanze umfasst. Die verbesserten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen erhöhten Ertrag und/oder erhöhte Früh-Wuchskraft.
Ferner ist es überraschend festgestellt worden, dass das Erhöhen der Expression, in den Samen einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, die ein IPPT-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, Pflanzen ergibt, welche erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein IPPT-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in den Samen einer Pflanze. Die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere von: erhöhte Früh-Wuchskraft, erhöhte oberirdische Biomasse, erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze, erhöhte Gesamtzahl an Samen, erhöhte Anzahl an gefüllten Samen, erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispe und erhöhter Ernteindex.
Weiterhin ist es überraschend festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein SHR-Polypeptid codiert, in Pflanzen, die unter Bedingungen mit sub-optimaler Nährstoffverfügbarkeit kultiviert werden, den Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen gibt. Es ist ebenfalls überraschend festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein SHR-Polypeptid codiert, in unter nicht-nährstofflimitierenden Bedingungen kultivierten Pflanzen den Pflanzen ein erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW) im Vergleich zu Kontrollpflanzen gibt.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Steigerung von den Pflanzenertrag betreffenden Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein SHR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, die unter Bedingungen mit sub-optimaler Nährstoffverfügbarkeit kultiviert wird.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung des Tausendkerngewichts (TKW) in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein SHR-Polypeptid codiert, in Pflanzen, die unter nicht-nährstofflimitierenden Bedingungen kultiviert werden.
Definitionen
Polypeptid(e)/Protein(e)
Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden hierin austauschbar verwendet und betreffen Aminosäuren in einer polymeren Form von beliebiger Länge, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, ”Nukleinsäuremolekül” werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beiden, in einer polymeren unverzweigten Form von beliebiger Länge.
Kontrollpflanze(n)
Die Auswahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein routinemäßiger Teil eines experimentellen Ansatzes und kann entsprechende Wildtyp-Pflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das Gen von Interesse einschließen. Die Kontrollpflanze stammt typischerweise aus der gleichen Pflanzenart oder sogar aus der gleichen Varietät, wie die zu untersuchende Pflanze. Die Kontrollpflanze kann auch eine Nullizygote der zu untersuchenden Pflanze sein. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich nicht nur auf ganze Pflanzen, sondern auch auf Pflanzenteile, einschließlich Samen und Samenteilen.
Homolog(e)
”Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme, welche Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen im Vergleich zum betreffenden unmodifizierten Protein aufweisen und eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind, besitzen.
Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
Eine Insertion bezieht sich darauf, dass ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorherbestimmte Stelle in einem Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Intra-Sequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren umfassen. Im Allgemeinen werden Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Resten, sein. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide zählen die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG^®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.

Eine Substitution bezieht sich auf die Ersetzung von Aminosäuren des Proteins mit anderen Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie etwa einer ähnlichen Hydrophobizität, Hydrophilizität, Antigenizität, Neigung zur Bildung oder Aufbrechung von α-helikalen Strukturen oder β-Blatt-Strukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise an Einzelresten vorhanden, aber können abhängig von den funktionellen Erfordernissen, welche dem Polypeptid auferlegt sind, gehäuft vorliegen; Insertionen werden üblicherweise eine Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten aufweisen. Die Aminosäuresubstitutionen sind vorzugsweise konservative Aminosäuresubstitutionen. Tabellen über konservative Substitution sind im Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) sowie die nachstehende Tabelle 1). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen

Rest	Konservative Substitutionen	Rest	Konservative Substitutionen
Ala	Ser	Leu	Ile; Val
Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Ser	Thr	Ser; Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
Ile	Leu, Val

Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen können mit Hilfe von auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Peptidsynthesetechniken, wie etwa der Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, leicht ausgeführt werden. Verfahren für die Manipulierung von DNA-Sequenzen zur Erzeugung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel sind Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange-ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige ortsgerichtete Mutagenese-Protokolle ein.
Derivate
”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche im Vergleich zur Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie dem Protein von Interesse, Substitutionen von Aminosäuren mit nicht-natürlichen vorkommenden Aminosäureresten, oder Additionen von nicht-natürlich vorkommenden Aminosäureresten, umfassen können. ”Derivate” eines Proteins beinhalten außerdem Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche natürlich vorkommende, veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristylierte, sulfatierte etc.) oder nicht-natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann außerdem eine oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder -Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, aus der es abgeleitet ist, wie zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Ligand, der kovalent oder nicht-kovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie etwa ein Reportermolekül, das gebunden ist, um deren Nachweis zu erleichtern, sowie nicht-natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zur Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins, umfassen. Ferner zählen zu ”Derivaten” ebenfalls Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Übersichtsartikel über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
Ortholog(e)/Paraloq(e)
Orthologe und Paraloge umfassen evolutionäre Konzepte, die zur Beschreibung der ancestralen Beziehungen von Genen zur Anwendung kommen. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Spezies, welche aus der Duplikation eines ancestralen Gens hervorgegangen sind; Orthologe sind Gene aus unterschiedlichen Organismen, welche durch Speziation hervorgegangen sind, und sind ebenfalls von einem gemeinsamen ancestralen Gen abgeleitet.
Domäne
Der Begriff ”Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen evolutionär verwandter Proteine konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen variieren können, deuten Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen hochkonserviert sind, auf Aminosäuren hin, die wahrscheinlich in der Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins wesentlich sind. Identifiziert durch das hohe Ausmaß ihrer Konservierung in alignierten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen, können sie als Identifikatoren verwendet werden, um zu ermitteln, ob ein beliebiges, fragliches Polypeptid einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie angehört.
Motiv/Consensus-Sequenz/Signatur
Der Begriff ”Motiv” oder ”Consensus-Sequenz” oder ”Signatur” bezieht sich auf eine kurze, konservierte Region in der Sequenz von evolutionär verwandten Proteinen. Motive sind häufig hochkonservierte Teile von Domänen, aber können ebenfalls lediglich einen Teil der Domäne einschließen oder außerhalb einer konservierten Domäne liegen (wenn alle der Aminosäuren des Motives außerhalb einer definierten Domäne liegen).
Hybridisierung
Der Begriff ”Hybridisierung”, wie hierin definiert, ist ein Verfahren, in dem im wesentlichen homologe, komplementäre Nukleotidsequenzen miteinander annealen bzw. sich aneinander anlagern. Das Hybridisierungsverfahren kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Das Hybridisierungsverfahren kann ebenfalls stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an eine Matrix, wie magnetische Kügelchen, Sepharose-Kügelchen oder ein beliebiges anderes Harz, immobilisiert ist. Das Hybridisierungsverfahren kann ferner stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an einem festen Träger immobilisiert ist, wie etwa einer Nitrozellulose- oder Nylonmembran, oder z. B. durch Photolithografie beispielsweise an einem silikatischen Glasträger immobilisiert ist (wobei man letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder Mikroarrays oder als Nukleinsäure-Chips kennt). Um zu ermöglichen, dass eine Hybridisierung stattfindet, werden die Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufzuschmelzen und/oder Haarnadeln oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen.
Der Begriff ”Stringenz” bezieht sich auf die Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz einer Hybridisierung wird von Bedingungen, wie der Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und der Hybridisierungspuffer-Zusammensetzung, beeinflusst. Im Allgemeinen werden Niederstringenzbedingungen so gewählt, dass sie um etwa 30°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert sind. Mittlere Stringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 20°C unterhalb von T_m liegt, und Hochstringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 10°C unterhalb der T_m liegt. Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen werden in der Regel zum Isolieren von hybridisierenden Sequenzen angewandt, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ziel-Nukleinsäuresequenz aufweisen. Allerdings können Nukleinsäuren hinsichtlich der Sequenz abweichen und aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes immer noch ein im Wesentlichen identisches Polypeptid codieren. Deshalb können manchmal mittelstringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich sein, um derartige Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren.
Die T_m ist die Temperatur bei definierter Ionenstärke und pH, bei welcher 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Die T_m ist von den Lösungsbedingungen und der Rasenzusammensetzung sowie der Länge der Sonde abhängig. Zum Beispiel hybridisieren längere Sequenzen spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Rate der Hybridisierung wird bei etwa 16°C bis 32°C unter der T_m erhalten. Das Vorhandensein von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung verringert die elektrostatische Abstoßung zwischen den zwei Nukleinsäure-Strängen, wodurch die Hybridbildung gefördert wird; dieser Effekt ist für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M sichtbar (für höhere Konzentrationen kann dieser Effekt vernachlässigt werden). Formamid senkt die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen um 0,6 bis 0,7°C für jedes Prozent an Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid gestattet, dass die Hybridisierung bei 30 bis 45°C durchgeführt werden kann, obwohl die Rate bzw. Geschwindigkeit der Hybridisierung vermindert wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die thermische Stabilität der Duplizes. Im Durchschnitt, und für große Sonden, sinkt die T_m um etwa 1°C je Prozent an Basenfehlpaarung. Die T_m kann mit Hilfe der folgenden Gleichungen, abhängig von den Typen der Hybride, berechnet werden:

1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): T_m = 81,5°C + 16,6 × log₁₀[Na⁺]^a + 0,41 × %[G/C^b] – 500 × [L^c]^–1 – 0,61 × %Formamid
2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: T_m = 79,8 + 18,5(log₁₀[Na⁺]^a) + 0,58(%G/C^b) + 11,8(%G/C^b)² – 820/L^c
3) Oligo-DNA- oder Oligo-RNA^d-Hybride: Für < 20 Nukleotide: T_m = 2 (l_n) Für 20–35 Nukleotide: T_m = 22 + 1,46 (l_n)

a

oder für ein sonstiges einwertiges Kation, aber nur exakt im Bereich von 0,01–0,4 M.

b

nur exakt für %GC im Bereich von 30% bis 75%.

L

= Länge des Duplex in Basenpaaren.

d

Oligo, Oligonukleotid; l_n, = effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. v. G/C) + (Anz. v. A/T).

Nicht-spezifische Bindung kann unter Anwendung einer von vielen bekannten Techniken reguliert werden, wie z. B. Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusetzungen von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nicht-homologe Sonden kann eine Serie von Hybridisierungen durchgeführt werden mittels Variieren von einem von (i) progressivem Senken der Annealing-Temperatur (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) progressivem Senken der Formamidkonzentration (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während einer Hybridisierung verändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung in der Regel auch von der Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten ab. Um den aus nichtspezifischer Hybridisierung resultierenden Hintergrund zu entfernen, werden Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu den kritischen Faktoren bei derartigen Waschschritten zählen die Ionenstärke und Temperatur der letztendlichen Waschlösung: je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur, umso höher ist die Stringenz des Waschschritts. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unter der Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, welches mindestens das Zweifache von demjenigen des Hintergrundes ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays oder Genamplifikations-Nachweisverfahren wie oben angegeben beschaffen. Auch können mehr oder weniger stringente Bedingungen gewählt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während des Waschens abgeändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Zum Beispiel umfassen typische Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC. Beispiele von Mittelstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die vorhergesehene Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Wenn Nukleinsäuren von bekannter Sequenz hybridisiert werden, kann die Hybridlänge bestimmt werden durch Alignieren der Sequenzen und Identifizieren der hierin beschriebenen konservierten Regionen. 1 × SSC steht für 0,15 M NaCl and 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagenz, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 0,5% Natriumpyrophosphat, enthalten.
Für die Zwecke des Definierens der Höhe der Stringenz kann auf Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder auf Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Aktualisierungen) Bezug genommen werden.
Splice-Variante
Der Begriff ”Splice-Variante” wie hierin verwendet, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in welchen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verschoben oder hinzugefügt worden sind, oder in welchen Introns verkürzt oder verlängert worden sind. Derartige Varianten werden solche sein, in denen die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleibt; dies kann durch selektives Beibehalten von funktionellen Segmenten des Proteins bewirkt werden. Derartige Splice-Varianten können in der Natur vorgefunden oder vom Menschen erzeugt sein. Verfahren zum Vorhersagen und Isolieren derartiger Splice-Varianten sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
Allelische Variante
Allele oder allelische Varianten sind alternative Formen eines gegebenen Gens, welche an der gleichen chromosomalen Position lokalisiert sind. Allelische Varianten umfassen Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), sowie ”Kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen” (INDELs). Die Größe von INDELs beträgt in der Regel weniger als 100 bp. SNPs und INDELs bilden die größte Gruppe von Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
Gen-Shuffling/gerichtete Evolution
Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution besteht aus Iterationen des DNA-Shuffling, gefolgt von einem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Abschnitten davon zu erzeugen, welche Proteine mit einer modifizierten biologischen Aktivität codieren (Castle et al., (2004) Science 304 (5674): 1151–4; U.S.-Patente 5 811 238 und 6 395 547 ).
Regulatorisches Element/Steuerungssequenz/Promotor
Die Begriffe ”regulatorisches Element”, ”Steuerungssequenz” und ”Promotor” werden hierin alle austauschbar verwendet und beziehen sich, wobei sie in einem weiten Kontext zu verstehen sind, auf regulatorische Nukleinsäuresequenzen, die zum Bewirken der Expression der Sequenzen in der Lage sind, an welche sie ligiert sind. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäure-Steuerungssequenz, welche sich stromaufwärts vom transkriptionellen Start eines Gens befindet und welche an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verbundenen Nukleinsäure gesteuert wird. Bei den zuvor erwähnten Begriffen sind transkriptionelle regulatorische Sequenzen eingeschlossen, die aus einem klassischen eukaryotischen genomischen Gen abgeleitet sind (einschließend die TATA-Box, welche für eine exakte Transkriptionsinitiation erforderlich ist, mit oder ohne einer CCAAT-Box-Sequenz), sowie weitere regulatorische Elemente (d. h. ”Upstream-Aktivierende Sequenzen”, ”Enhancer” und ”Silencer”), welche die Genexpression in Antwort auf entwicklungsmäßige und/oder externe Stimuli oder in einer gewebespezifischen Weise verändern. Ebenfalls innerhalb des Begriffs eingeschlossen ist eine transkriptionelle regulatorische Sequenz eines klassischen prokaryotischen Gens, wobei er in diesem Fall eine -35-Box-Sequenz und/oder transkriptionsregulierende -10-Box-Sequenzen einschließen kann. Der Begriff ”regulatorisches Element” beinhaltet außerdem ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, welches die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ herbeiführt, aktiviert oder steigert.
Ein ”Pflanzenpromotor” umfasst regulatorische Elemente, welche die Expression eines codierenden Sequenzsegments in Pflanzenzellen vermitteln. Folglich muss ein Pflanzenpromotor nicht von pflanzlichem Ursprung sein, sondern kann aus Viren oder Mikroorganismen stammen, beispielsweise aus Viren, welche Pflanzenzellen angreifen. Der ”Pflanzenpromotor” kann auch aus einer Pflanzenzelle stammen, z. B. aus der Pflanze, welche mit der Nukleinsäuresequenz transformiert wird, die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden soll und hierin beschrieben ist. Dies gilt auch für andere regulatorische ”Pflanzen”-Signale, wie etwa ”Pflanzen”-Terminatoren. Die Promotoren stromaufwärts der Nukleotidsequenzen, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -Insertion(en) und/oder -Deletion(en) modifiziert sein, ohne die Funktionalität oder Aktivität von entweder den Promotoren, dem offenen Leserahmen (ORF) oder der 3'-regulatorischen Region, wie Terminatoren oder sonstigen 3'-regulatorischen Regionen, welche sich entfernt vom ORF befinden, zu stören. Es ist ferner möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht wird, oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar Promotoren aus heterologen Organismen, ersetzt werden. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder diesen umfassen, welcher das Gen zum richtigen Zeitpunkt und beim erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
Für die Identifizierung von funktionell äquivalenten Promotoren können die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, zum Beispiel durch funktionsfähiges Verknüpfen des Promotors an ein Reportergen und Testen des Expressionsspiegels und -musters des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze. Zu geeigneten, allgemein bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase. Die Promotoraktivität wird durch Messen der enzymatischen Aktivität der Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase getestet. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit denjenigen eines Referenzpromotors verglichen werden (wie etwa jenem, der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren von mRNA-Spiegeln oder durch Vergleich von mRNA-Spiegeln der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure mit mRNA-Spiegeln von Haushaltsgenen, wie etwa 18S-rRNA, geassayt werden, wobei im Fachgebiet bekannte Verfahren, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994) zur Anwendung kommen. Mit ”schwacher Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor bezeichnet, der die Expression einer codierenden Sequenz auf einem geringen Spiegel antreibt. Mit ”geringer Spiegel” werden Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis etwa 1/100000 Transkripte, bis etwa 1/5000000 Transkripten pro Zelle gemeint. Demgegenüber treibt ein ”starker Promotor” die Expression einer codierenden Sequenz bei einem hohen Niveau oder bei etwa 1/10 Transkripte bis etwa 1/100 Transkripte bis etwa 1/1000 Transkripte pro Zelle an. Mit ”mittelstarker Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor gemeint, der die Expression einer codierenden Sequenz bei einem Spiegel antreibt, welcher in allen Fällen unterhalb von demjenigen liegt, der unter der Steuerung eines 35S-CaMV-Promotors erhalten wird.
Funktionsfähig verbunden
Der Begriff ”funktionsfähig verbunden”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine funktionale Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem Gen von Interesse, so dass die Promotorsequenz in der Lage ist, die Transkription des Gens von Interesse zu initiieren.
Konstitutiver Promotor

Ein ”konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, der während den meisten, aber nicht notwendigerweise allen, Phasen des Wachstums und der Entwicklung, sowie unter den meisten Umweltbedingungen, in mindestens einer/einem Zelle, Gewebe oder Organ transkriptionell aktiv ist. Die nachstehende Tabelle 2a gibt Beispiele von konstitutiven Promotoren an. Tabelle 2a: Beispiele von konstitutiven Promotoren

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
Actin	McElroy et al., Plant Cell, 2: 163–171, 1990
HMGP	WO 2004/070039
CAMV 35S	Odell et al., Nature, 313: 810–812, 1985
CaMV 19S	Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997
GOS2	de Pater et al., Plant J. Nov; 2 (6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
Ubiquitin	Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
Reis-Cyclophilin	Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25 (5): 837–43, 1994
Mais-H3-Histon	Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
Alfalfa-H3-Histon	Wu et al., Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
Actin 2	An et al., Plant J. 10 (1); 107–121, 1996
34S FMV	Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443
kleine Rubisco-Untereinheit	US 4 962 028
OCS	Leisner (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (5): 2553
SAD1	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
SAD2	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
nos	Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12 (20): 7831–7846
V-ATPase	WO 01/14572
Super-Promoter	WO 95/14098
G-Box-Proteine	WO 94/12015

Ubiquitärer Promotor
Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
Entwicklungsmäßig regulierter Promotor
Ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor ist während bestimmter Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, die entwicklungsbedingten Änderungen unterliegen, aktiv.
Induzierbarer Promotor
Ein induzierbarer Promotor zeigt induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation in Antwort auf eine Chemikalie (zur Übersicht siehe Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen umweltmäßigen oder physikalischen Stimulus, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt wird, oder ”pathogeninduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze der Exposition an verschiedene Pathogene ausgesetzt wird.
Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein solcher, der fähig ist, die Transkription in bestimmten Organen oder Geweben präferentiell zu initiieren, wie etwa Blättern, Wurzeln, Samengewebe etc. Zum Beispiel ist ein ”wurzelspezifischer Promotor” ein Promotor, der vorwiegend in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Promotoren, die zum Initiieren der Transkription nur in bestimmten Zellen fähig sind, werden hierin als ”zellspezifisch” bezeichnet.

Beispiele wurzelspezifischer Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2b aufgeführt: Tabelle 2b: Beispiele von wurzelspezifischen Promotoren

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
RCc3	Plant Mol. Biol. 1995 Jan; 27 (2): 237–48
Arabidopsis PHT1	Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
Medicago-Phosphat-Transporter	Xiao et al., 2006
Arabidopsis Pyk10	Nitz et al. (2001) Plant. Sci. 161 (2): 337–346
wurzelexprimierbare Gene	Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987.
Tabak, auxin-induzierbares Gen	Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.
β-Tubulin	Oppenheimer, et al., Gene 63: 87, 1988.
Tabakwurzelspezifische Gene	Conkling, et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.
B. napus G1-3b Gen	US-Patent Nr. 5 401 836
SbPRP1	Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993.
LRX1	Baumberger et al., 2001, Genes & Dev. 15: 1128
BTG-26 Brassica napus	US 20050044585
LeAMT1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
The LeNRT1-1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
Klasse I Patatin-Gen (Kartoffel)	Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386–395, 1991.
KDC1 (Daucus carota)	Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
TobRB7-Gen	W. Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
OsRAB5a (Reis)	Wang et al. 2002, Plant Sci. 163: 273
ALF5 (Arabidopsis)	Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
NRT2;1Np (N. plumbaginifolia)	Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)

Ein samenspezifischer Promotor is hauptsächlich in Samengewebe transkriptionell aktiv, jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich in Samengewebe (in Fällen von Leckexpression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promotor kann ein Endosperm- und/oder Aleuron- und/oder Embryo-spezifischer sein. Beispiele samenspezifischer Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2c bis 2f gezeigt. Weitere Beispiele samenspezifischer Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, wobei diese Offenbarung, als ob sie vollständig dargelegt ist, hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Tabelle 2c: Beispiele samenspezifischer Promotoren

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
samenspezifische Gene	Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
	Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.;
	Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
Paranuss-Albumin	Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992.
Legumin	Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988.
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
	Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987.
Zein	Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14 (3): 323–32 1990
napA	Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996.
Weizen-LMW- und HMW-Glutenin-1	Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
Weizen-SPA	Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
Weizen-α,β,γ-Gliadine	EMBO J. 3: 1409–15, 1984
Gerste ltr1-Promotor	Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248 (5): 592–8
Gerste B1, C, D, Hordein	Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996
Gerste DOF	Mena et al., The Plant Journal, 116 (1): 53–62, 1998
blz2	EP99106056.7
synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998.
Reis Prolamin NRP33	Wu et al, Plant Cell Physiology 39 (8) 885–889, 1998
Reis a-Globulin Glb-1	Wu et al, Plant Cell Physiology 39 (8) 885–889, 1998
Reis OSH1	Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
Reis α-gobulin REB/OHP-1	Nakase et al., Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Trans. Res. 6: 157–68, 1997
Mais ESR-Genfamilie	Plant J. 12: 235–46, 1997
Sorghum α-Kafirin	DeRose et al., Plant Mol. Biol 32: 1029–35, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
Reis Oleosin	Wu et al., J. Biochem. 123: 386, 1998
Sonnenblume Oleosin	Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
PRO0117, putatives ribosomales 40S Protein von Reis	WO 2004/070039
PRO0136, Alanin-Aminotransferase von Reis	Unveröffentlicht
PRO0147, Trypsininhibitor ITR1 (Gerste)	Unveröffentlicht
PRO0151, Reis WSI18	WO 2004/070039
PRO0175, Reis RAB21	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin β-ähnliches Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

Tabelle 2d: Beispiele von endosperm-spezifischen Promotoren

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 208: 15–22; Takaiwa et al. (1987) FEBS Letts. 221: 43–47
Zein	Matzke et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14 (3): 323–32
Weizen LMW- und HMW-Glutenin-1	Colot et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, Anderson et al. (1989) NAR 17: 461–2
Weizen SPA	Albani et al. (1997) Plant Cell 9: 171–184
Weizen Gliadine	Rafalski et al. (1984) EMBO 3: 1409–15
Gerste Itr1-Promotor	Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248 (5): 592–8
Gerste B1, C, D, Hordein	Cho et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62; Muller et al. (1993) Plant J 4: 343–55; Sorenson et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 250: 750–60
Gerste DOF	Mena et al., (1998) Plant J. 116 (1): 53–62
blz2	Onate et al. (1999) J. Biol. Chem. 274 (14): 9175–82
synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J. 13: 629–640
Reis Prolamin NRP33	Wu et al., (1998) Plant Cell Physiol. 39 (8) 885–889
Reis Globulin Glb-1	Wu et al., (1998) Plant Cell Physiol. 39 (8) 885–889
Reis Globulin REB/OHP-1	Nakase et al., (1997) Plant Molec. Biol. 33: 513–522
Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Russell et al. (1997) Trans. Res. 6: 157–68
Mais ESR-Genfamilie	Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J. 12: 235–46
Sorghum Kafirin	DeRose et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1029–35

Tabelle 2e: Beispiele von embryospezifischen Promotoren:

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
Reis OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
PRO0151	WO 2004/070039
PRO0175	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039

Tabelle 2f: Beispiele von aleuronspezifischen Promotoren:

Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin β-ähnliches Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, wie hierin definiert, ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird.

Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2g gezeigt. Tabelle 2g: Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren

Gen	Expression	Bezugsstelle
Mais, Orthophosphat-Dikinase	blattspezifisch	Fukavama et al., 2001
Mais, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Kausch et al., 2001
Reis, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Liu et al., 2003
Reis, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Nomura et al., 2000
Reis, beta-Expansin EXBP9	spross-spezifisch	WO 2004/070039
Straucherbse, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Panguluri et al., 2005
Erbse RBCS3A	blattspezifisch

Ein weiteres Beispiel eines gewebespezifischen Promotors ist ein meristemspezifischer Promotor, der vorwiegend in meristematischem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine gewisse Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Beispiele von für grünes Meristem spezifischen Promotoren, welche zur. Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2h gezeigt. Tabelle 2h: Beispiele von meristemspezifischen Promotoren

Genquelle	Expressionsmuster	Literatur-Bezugsstelle
Reis OSH1	Spross-Apikalmeristem, vom globulärer Embryostadium bis zum Setzlingsstadium	Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
Reis-Metallothionein	meristemspezifisch	BAD87835.1
WAK1 & WAK2	Spross- und Wurzel-Apikalmeristeme, und in expandierenden Blättern und Kelchblättern	Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13 (2): 303–318

Terminator
Der Begriff ”Terminator” beinhaltet eine Steuerungssequenz, welche eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit ist, welche die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines Primärtranskripts und die Termination der Transkription signalisiert. Der Terminator kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel aus den Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthase-Genen oder alternativ aus einem anderen Pflanzengen oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen anderen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
Modulierung
Der Begriff ”Modulierung” bedeutet in Bezug auf Expression oder Genexpression ein Verfahren, in welchem der Expressionsspiegel durch die Genexpression im Vergleich zur Kontrollpflanze verändert wird, wobei der Expressionsspiegel erhöht oder verringert werden kann. Die ursprüngliche, nicht modulierte Expression kann jede Art von Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation sein. Der Begriff ”Modulieren der Aktivität” soll jedwede Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder codierten Proteine bedeuten, welche zu einem erhöhten Ertrag und/oder erhöhten Wachtsum der Pflanzen führt.
Expression
Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet insbesondere die Transkription von einem Gen oder Genen oder einem gentechnischen Konstrukt zu struktureller RNA (rRNA, tRNA) oder zu mRNA mit oder ohne anschließende Translation der letzteren in ein Protein. Das Verfahren beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des resultierenden mRNA-Produkts.
Erhöhte Expression/Überexpression
Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie hierin verwendet, bedeutet eine beliebige Form von Expression, welche zusätzlich zum ursprünglichen Wildtyp-Expressionsspiegel erfolgt.
Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert und beinhalten zum Beispiel die durch geeignete Promotoren angetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder von Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, welche als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (typischerweise stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, welche das Polypeptid von Interesse codiert, hochreguliert wird. Beispielsweise können endogene Promotoren in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5 565 350 ; Zarling et al., WO9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der richtigen Orientierung und im richtigen Abstand zu einem Gen der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
Wenn eine Polypeptidexpression gewünscht wird, ist es im Allgemeinen wünschenswert, eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer codierenden Polynukleotidregion einzuschließen. Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Die 3'-End-Sequenz, welche hinzugefügt werden soll, kann: zum Beispiel aus den Genen für Nopalin-Synthase oder Octopin-Synthase oder alternativ dazu aus einem anderen Pflanzengen, oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen sonstigen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
Auch eine Intronsequenz kann an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder die codierende Sequenz der partiellen codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert. Der Einschluss eines spleißbaren Introns in der Transkriptionseinheit sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Expressionskonstrukten erhöht gezeigtermaßen die Genexpression sowohl auf der mRNA- als auch der Protein-Ebene bis zu 1000-fach (Buchman und Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183–1200). Eine derartige Intron-Verstärkung der Genexpression ist typischerweise am größten bei Platzierung nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S Intron 1, 2 und 6, sowie des Bronze-1-Introns sind im Fachgebiet bekannt. Für allgemeine Informationen siehe: The Maize Handbook, Kapitel 116, Hrsg.: Freeling und Walbot, Springer, N. Y. (1994).
Endogenes Gen
Die Bezugnahme hierin auf ein ”endogenes” Gen bezieht sich nicht nur auf das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form (d. h. ohne dass irgendein menschlicher Eingriff stattgefunden hat) vorgefunden wird, sondern bezieht sich außerdem auf das gleiche Gen (oder ein(e) im Wesentlichen homologe(s) Nukleinsäure/Gen) in einer isolierten Form, welches anschließend in eine Pflanze (wieder) eingeführt wird (ein Transgen). Zum Beispiel kann eine transgene Pflanze, die ein derartiges Transgen enthält, eine erhebliche Reduktion der Transgen-Expression und/oder eine erhebliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder vom Menschen, zum Beispiel durch chemische Synthese, erzeugt werden.
Verringerte Expression
Eine Bezugnahme hierin auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” von Expression wird verwendet, um eine Verringerung der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptidspiegel und/oder der Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen zu bezeichnen. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung beträgt, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Verringerung im Vergleich zu derjenigen von Kontrollpflanzen. Verfahren für die Verringerung der Expression sind im Fachgebiet bekannt, und der Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten Promotors.
Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze wird eine ausreichende Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz benötigt. Um ein ”Gensilencing” durchzuführen kann diese so gering wie 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide sein, wobei sie alternativ so groß sein kann, wie das gesamte Gen (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder zum Teil oder insgesamt). Die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden kann aus der Nukleinsäure, welche das Protein von Interesse codiert (Zielgen), oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist, abgeleitet sein. Vorzugsweise ist die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden in der Lage, Wasserstoffbrücken mit dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang) zu bilden, und weiter bevorzugt besitzt die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zum Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, welche ein (funktionales) Polypeptid codiert, ist keine Voraussetzung für die verschiedenen, hierin erörterten, Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann unter Anwendung von routinemäßigen Hilfsmitteln und Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder substantielle Eliminierung von endogener Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, eines genetischen Konstrukts, in welches die Nukleinsäure (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von einem beliebigen von dem Protein von Interesse in der Lage ist) als ein invertierter Repeat (teilweise oder vollständig), getrennt durch einen Spacer bzw. Abstandhalter (nicht-codierende DNA), einkloniert ist.
In einem derartigen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines invertierten Repeats einer Nukleinsäure oder eines Teils davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist), welcher vorzugsweise zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur fähig ist. Der ”Inverted Repeat” wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Steuerungssequenzen umfasst. Eine nicht-codierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Abstandhalter, zum Beispiel ein Matrix-Anheftungs-Region-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker, etc.) ist zwischen den zwei invertierten Nukleinsäuren, welche den ”Inverted Repeat” bilden, befindlich. Nach der Transkription des Inverted Repeat wird eine chimäre RNA mit einer selbst-komplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als die Haarnadel-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, welche in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut werden. Der RISC spaltet die mRNA-Transkripte weiter, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die in Polypeptide translatiert werden können, wesentlich verringert wird. Für weitere allgemeine Einzelheiten, siehe zum Beispiel Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ).
Die Ausführung der Verfahren der Erfindung beruht nicht auf dem Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem genetischen Konstrukt, in welches die Nukleinsäure als ein ”Inverted Repeat” einkloniert ist, sondern es können ein oder mehrere beliebige von einigen, allgemein bekannten ”Gen-Silencing”-Verfahren zur Anwendung kommen, um die gleichen Effekte zu erzielen.
Ein derartiges Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing von Genexpression (Herunterregulieren). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze von einer doppelsträngigen RNA-Sequenz (dsRNA) ausgelöst, welche im Wesentlichen ähnlich zum endogenen Zielgen ist. Diese dsRNA wird von der Pflanze zu etwa 20 bis etwa 26 Nukleotiden weiterprozessiert, welche als kurze interferierende RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, welcher das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense-Orientierung” bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche homolog zu einem mRNA-Transkript davon ist. Deswegen wird man in eine Pflanze mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz einführen. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens verringern, was zur Entstehung eines Phänomens führt, welches als Co-Suppression bekannt ist. Die Reduktion der Genexpression wird noch erheblicher sein, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und der Auslösung von Co-Suppression besteht.
Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die ein Protein codiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz ist. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem endogenen Gen, welches stumm gemacht bzw. gesilenct werden soll. Die Komplementarität kann in der ”codierenden Region” und/oder in der ”nicht-codierenden Region” eines Gens lokalisiert sein. Der Begriff ”codierende Region” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff ”nicht-codierende Region” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche die codierende Region flankieren und welche transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (ebenfalls bezeichnet als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen).
Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß den Regeln der Watson-und-Crick-Basenpaarung entworfen werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann zur gesamten Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) komplementär sein, aber kann ebenfalls ein Oligonukleotid sein, welches den Antisense zu lediglich einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der 5'- und 3'-UTR der mRNA) darstellt. Zum Beispiel kann die Antisense-Oligonukleotidsequenz komplementär zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid codiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotidsequenz ist im Fachgebiet bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung kann unter Anwendung von chemischer Synthese sowie enzymatischer Ligationsreaktionen mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine Antisense-Oligonukleotidsequenz) chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedenartig modifizierte Nukleotide verwendet werden, entworfen zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität des zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildeten Duplex, wobei z. B. Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden können. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Zyklisierung und 'Caps' sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, wie etwa Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in welchen eine Nukleinsäuresequenz in einer Antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h., die von der inserierten Nukleinsäure transkribierte RNA wird bezüglich einer Zielnukleinsäure von Interesse eine Antisense-Orientierung aufweisen). Vorzugsweise findet die Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäurekonstrukts statt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verbundenes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
Die zum Silencing in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküle (ob in eine Pflanze eingeführt oder in situ erzeugt) hybridisieren oder binden an, ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte und/oder genomische DNA, um dadurch die Expression des Proteins zu inhibieren, z. B. durch Inhibieren von Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex erfolgen, oder, zum Beispiel im Fall einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, welche an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer spezifischen Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ dazu können Antisense-Nukleinsäuresequenzen modifiziert sein, um ausgewählte Zellen anzuzielen, und dann systemisch verabreicht werden. Für die systemische Verabreichung können Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Beispiel so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, welche an Zelloberflächen-Rezeptoren oder -Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen zugeführt werden.
Gemäß eines weiteren Aspekts ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische, doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann außerdem ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327–330) umfassen.
Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der endogenen Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen durchgeführt werden. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche zum Spalten einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, wie einer mRNA, zu der sie eine komplementäre Region besitzen, in der Lage sind. Somit können Ribozyme (z. B. Hammerkopf-Ribozyme; beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) verwendet werden, um ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, wodurch die Anzahl an mRNA-Transkripten, welche in ein Polypeptid translatiert werden können, wesentlich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entworfen werden (siehe zum Beispiel: Cech et al., U.S.-Patent Nr. 4 987 071 ; und Cech et al., U.S.-Patent Nr. 5 116 742 ). Alternativ dazu können mRNA-Transkripte, welche einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren (Bartel und Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist auf dem Fachgebiet bekannt (z. B., Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
Gen-Silencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie unter anderem von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J. 20 (3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden.
Gen-Silencing kann auch auftreten, wenn eine Mutation auf einem endogenen Gen und/oder eine Mutation auf einem isolierten Gen/Nukleinsäure, welche(s) anschließend in eine Pflanze eingebracht wird, vorhanden ist. Die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzungen) können daher ein Polypeptid vorsehen, das noch zum Binden an interagierende Proteine (wie etwa Rezeptorproteine) in der Lage ist, aber seine normale Funktion nicht aufzeigen kann (wie etwa Signalleitungs-Ligand).
Ein weiteres Vorgehen für das Gen-Silencing besteht im Ziellenken von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens (z. B. dem Promotor und/oder Enhancern) komplementär sind, wodurch tripelhelikale Strukturen gebildet werden, welche die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36, 1992; und Maher, L. J., Bioassays 14, 807–15, 1992.
Andere Verfahren, wie etwa die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, zum Inhibieren von dessen Funktion in planta oder zum Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann allgemein bekannt sein. Insbesondere mag es in Betracht gezogen werden, dass vom Menschen geschaffene Moleküle zum Inhibieren der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder zur Störung des Signalleitungsweges, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
Alternativ dazu kann ein Screening-Programm angesetzt werden, um natürliche Varianten eines Gens in einer Pflanzenpopulation zu identifizieren, wobei die Varianten Polypeptide mit verringerter Aktivität codieren. Solche natürlichen Varianten können beispielsweise auch zur Ausführung von homologer Rekombination angewandt werden.
Künstliche und/oder natürliche MicroRNAs (miRNAs) können verwendet werden, um Genexpression und/oder mRNA-Translation auszuknocken. Endogene miRNAs sind einzelsträngige, kleine RNAs mit einer Länge von typischerweise 19–24 Nukleotiden. Sie funktionieren vorwiegend zum Regulieren der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen MicroRNAs (miRNAs) weisen eine perfekte oder beinahe perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Allerdings gibt es natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Sie werden aus längeren nicht-codierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch Doppelstrang-spezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Nach der Prozessierung werden sie in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) durch Binden an dessen Hauptkomponente, ein Argonaute-Protein, eingebaut. MiRNAs dienen als die Spezifitätskomponenten des RISC, da sie mit Zielnukleinsäuren, vorwiegend mRNAs, im Cytoplasma eine Basenpaarung eingehen. Anschließende regulatorische Ereignisse beinhalten die Ziel-mRNA-Spaltung und -Zerstörung und/oder die Translationsinhibition. Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich deshalb häufig in verringerten mRNA-Spiegeln von Zielgenen.
Artifizielle MikroRNAs (amiRNAs), welche typischerweise eine Länge von 21 Nukleotiden besitzen, können in spezifischer Weise gentechnisch erzeugt werden, um die Genexpression von einzelnen oder mehreren Genen von Interesse negativ zu regulieren. Determinanten der Pflanzen-MikroRNA-Zielauswahl sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Empirische Parameter für die Zielerkennung sind definiert worden und können angewandt werden, um beim Entwurf von spezifischen amiRNAs zu helfen (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Zweckdienliche Hilfsmittel für den Entwurf und die Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorläufern sind ebenfalls öffentlich verfügbar (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
Für eine optimale Leistung erfordern die Gen-Silencing-Techniken, die zum Reduzieren der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze angewandt werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotyledonen Pflanzen für die Transformation monokotyledoner Pflanzen, und aus dikotyledonen Pflanzen für die Transformation dikotyledoner Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer beliebigen gegebenen Pflanzenspezies in diese selbe Spezies eingebracht. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Allerdings ist es kein absolutes Erfordernis, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz aus derselben Pflanzenspezies stammt, wie die Pflanze, in welcher sie eingeführt wird. Es ist ausreichend, dass eine wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäure besteht.
Beispiele verschiedener Verfahren für die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze sind oben beschrieben. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die oben genannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch Verwenden eines geeigneten Promotors.
Selektierbares Marker(gen)/Reportergen
Unter ”selektierbarer Marker”, ”selektierbares Markergen” oder ”Reportergen” ist ein beliebiges Gen eingeschlossen, welches einen Phänotyp an eine Zelle vermittelt, in der es exprimiert wird, so dass die Identifizierung und/oder Selektion von Zellen erleichtert wird, die mit einem Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung transfiziert oder transformiert sind. Diese Markergene ermöglichen die Identifizierung eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuremoleküle durch eine Reihe unterschiedlicher Prinzipien. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, welche Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz vermitteln, welche eine neue metabolische Eigenschaft einbringen oder welche eine visuelle Selektion zulassen. Zu Beispielen von selektierbaren Markergenen zählen Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie etwa nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, welche Resistenz zum Beispiel gegen Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chlorampenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin vermitteln) sowie gegen Herbizide vermitteln (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta^® vermittelt; aroA oder gox, welche Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, welche zum Beispiel Resistenz gegen Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff vermitteln), oder Gene, die ein metabolisches Merkmal bereitstellen (wie etwa manA, das Pflanzen gestattet, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, oder Xylose-Isomerase für die Verwertung von Xylose, oder antinutritive Marker, wie die Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Erzeugung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit seinen gefärbten Substraten, beispielsweise X-Gal), Lumineszenz (wie etwa das Luciferin/Luciferase-System) oder Fluoreszenz (Grün-fluoreszierendes Protein, GFP, und Derivate davon). Diese Liste repräsentiert nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit derartigen Markern vertraut. Es werden, abhängig von dem Organismus und dem Selektionsverfahren, unterschiedliche Marker bevorzugt.
Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeteten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie denjenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktional sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markergen-Entfernung sind im Fachgebiet bekannt, verwendbare Techniken sind oben im Abschnitt 'Definitionen' beschrieben.
Da die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich oder unerwünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, wendet das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen der Nukleinsäuren in vorteilhafter Weise Techniken an, welche die Entfernung oder Exzision dieser Markergene ermöglichen. Ein derartiges Verfahren ist die sogenannte Co-Transformation. Das Co-Transformations-Verfahren verwendet zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und ein zweiter die Markergen(e) trägt. Ein großer Anteil an Transformanten empfängt oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beide Vektoren. Im Fall der Transformation mit Agrobakterien empfangen die Transformanten in der Regel nur einen Teil des Vektors, d. h. die von der T-DNA flankierte Sequenz, welche üblicherweise die Expressionskassette repräsentiert. Die Markergene können anschließend durch Ausführen von Kreuzungen aus der transformierten Pflanze entfernt werden. In einem anderen Verfahren werden in ein Transposon integrierte Markergene für die Transformation gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (bekannt als Ac/Ds-Technologie). Die Transformanten können mit einer Transposase-Quelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäurekonstrukt, welches die Expression einer Transposase vermittelt, transient oder stabil transformiert. In einigen Fällen (ungefähr 10%), springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle heraus, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen durch Ausführen von Kreuzungen eliminiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, welche das Detektieren derartiger Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen; deren Vorteil besteht darin, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieses Typs ist das sogenannte Cre/Iox-System. Cre1 ist eine Rekombinase, welche die zwischen den IoxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Wenn das Markergen zwischen den IoxP-Sequenzen integriert ist, wird es entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und zwar durch die Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Selbstverständlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen, wie Hefe, Pilze oder Bakterien, angewandt werden.
Transgenisch/Transgen/Rekombinant
Für die Zwecke der Erfindung bedeuten ”transgenisch”, ”Transgen” oder ”rekombinant”, zum Beispiel in Hinsicht auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, umfassend die Nukleinsäuresequenz, oder einen Organismus, der mit den Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren gemäß der Erfindung transformiert ist, wobei alle diese Konstruktionen durch rekombinante Verfahren bewerkstelligt werden, in welchen entweder

(a) die Nukleinsäuresequenzen, welche in den Verfahren der Erfindung nützliche Proteine codieren, oder
(b) genetische Steuerungsequenz(en), welche funktionsfähig mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz verknüpft sind, wie beispielsweise ein Promotor, oder
(c) a) und b) nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung lokalisiert sind oder durch rekombinante Verfahren modifiziert worden sind, wobei es möglich ist, dass die Modifikation zum Beispiel die Form einer Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotidresten annimmt. Es versteht sich, dass mit der natürlichen genetischen Umgebung der natürliche genomische oder chromosomale Locus bzw. Genort in der Ursprungspflanze oder das Vorhandensein in einer genomischen Bibliothek gemeint ist. Im Falle einer genomischen Bibliothek wird die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise zumindest teilweise beibehalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz mindestens auf einer Seite und besitzt eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, vorzugsweise mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, am stärksten bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der Nukleinsäuresequenzen mit der entsprechenden Nukleinsäuresequenz, welche ein in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliches Polypeptid codiert, wie oben definiert – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese Expressionskassette durch nicht-natürliche, synthetische (”künstliche”) Verfahren, wie zum Beispiel mutagene Behandlung, modifiziert wird. Geeignete Verfahren sind zum Beispiel in US 5 565 350 oder WO 00/15815 beschrieben.

Es versteht sich daher, dass mit einer transgenen Pflanze für die Absichten der Erfindung, wie oben, gemeint ist, dass die im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Genort im Genom der Pflanze vorliegen, wobei es möglich ist, dass die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Wie erwähnt, bedeutet ”transgen” jedoch ebenfalls, dass, obwohl die erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren an ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz im Vergleich zur natürlichen Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Es versteht sich, dass ”transgen” vorzugsweise die Expression der Nukleinsäuren gemäß der Erfindung an einem unnatürlichen Genort im Genom, d. h. homolog, bedeutet, oder dass vorzugsweise eine heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen sind hierin erwähnt.
Transformation
Der Begriff ”Einbringung” oder ”Transformation”, wie hierin darauf Bezug genommen wird, beinhaltet den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des für den Transfer angewandten Verfahrens. Pflanzengewebe, das zur anschließenden klonalen Vermehrung in der Lage ist, ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem genetischen Konstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert, und eine gesamte Pflanze daraus regeneriert werden. Das gewählte, jeweilige Gewebe wird von den klonalen Propagationssystemen abhängen, welche für die zu transformierende jeweilige Spezies verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebeziele schließen Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Callusgewebe, existierendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonmeristem und Hypokotylmeristem) ein. Das Polynukleotid kann transient oder stabil in eine Wirtszelle eingebracht und kann nicht-integriert, zum Beispiel als ein Plasmid, beibehalten werden. Alternativ dazu kann es in das Wirtsgenom integriert werden. Die resultierende, transformierte Pflanzenzelle kann dann zum Regenerieren einer transformierten Pflanze auf eine Weise, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, verwendet werden.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenspezies ist heutzutage eine durchaus routinemäßige Technik. In vorteilhafter Weise kann ein beliebiges von mehreren Transformationsverfahren angewandt werden, um das Gen von Interesse in eine geeignete Vorfahrenzelle einzubringen. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren können für transiente oder für stabile Transformationen angewandt werden. Transformationsverfahren beinhalten die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, welche die Aufnahme freier DNA erhöhen, direkte Injektion der DNA in die Pflanze, Beschuss mit einer Partikelkanone, Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen sowie Mikroprojektion. Man kann Verfahren auswählen unter dem Calcium/Polyethylenglykol-Verfahren für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982) Nature 296, 72–74; Negrutiu, I., et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 363–373); der Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al. (1985) Bio/Technol. 3, 1099–1102); der Mikroinjektion in Pflanzenmaterial hinein (Crossway, A., et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); dem Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Teilchen (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70), der Infektion mit (nicht-integrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, einschließlich transgener Nutzpflanzen, werden vorzugsweise durch Agrobacterium-vermittelte Transformation hergestellt. Ein vorteilhaftes Transformationsverfahren ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck ist es zum Beispiel möglich, den Agrobakterien zu gestatten, auf Pflanzensamen einzuwirken, oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien zu inokulieren. Es hat sich gemäß der Erfindung als besonders zweckmäßig erwiesen, zu gestatten, dass eine Suspension transformierter Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest auf die Blütenanlagen einwirkt. Die Pflanze wird anschließend weiter wachsen gelassen, bis die Samen der behandelten Pflanze erhalten werden (Clough und Bent, Plant J. (1998) 16, 735–743). Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis schließen allgemein bekannte Verfahren für die Reistransformation ein, wie etwa diejenigen, welche in einem beliebigen von Folgendem beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Plants 199: 612–617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), wobei diese Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargelegt wären. Im Falle von Mais-Transformation ist das bevorzugte Verfahren beschaffen, wie entweder in Ishida et al. (Nat. Biotechnol. 14 (6): 745–50, 1996) oder Frame et al. (Plant Physiol. 129 (1): 13–22, 2002) beschrieben, deren Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wären. Die Verfahren sind beispielsweise ferner in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128–143, sowie in Potrykus (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die Nukleinsäuren oder das Konstrukt, welche(s) exprimiert werden sollen, wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der zum Transformieren von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie etwa Pflanzen, welche als Modell herangezogen werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung nicht als Nutzpflanze betrachtet) oder Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, beispielsweise durch Eintauchen von zerquetschten Blättern oder zerhackten Blättern in einer Agrobakterienlösung und danach Kultivieren derselben in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist zum Beispiel von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877, beschrieben oder ist unter anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38.
Zusätzlich zur Transformation von somatischen Zellen, welche dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, ist es ebenfalls möglich, die Zellen von Pflanzenmeristemen und insbesondere diejenigen Zellen, welche sich zu Gameten entwickeln, zu transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung, wodurch es zur Entstehung transgener Pflanzen kommt. So werden beispielsweise Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und Samen werden aus den sich entwickelnden Pflanzen erhalten, von denen ein gewisser Anteil transformiert und somit transgen ist [Feldman, KA, und Marks, MD (1987). Mol. Gen Genet. 208: 274–289; Feldmann, K., (1992). In: C. Koncz, N-H. Chua und J. Shell (Hrsg.), Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren basieren auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und der Inkubation der Schnittstelle im Zentrum der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch in ähnlicher Weise transformierte Samen zu einem späteren Zeitpunkt erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen Genet., 245: 363–370). Ein besonders effektives Verfahren ist jedoch das Vakuuminfiltrationsverfahren mit seinen Modifikationen, wie dem ”floral dip”-Verfahren. Im Falle von Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N. (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], wohingegen im Fall des ”floral dip”-Verfahrens das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer tensidbehandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ, und Bent, AF (1998) The Plant J. 16, 735–743]. In beiden Fällen wird ein gewisser Anteil an transgenen Samen geerntet, und diese Samen können von nicht-transgenen Samen durch Kultivieren unter den oben beschriebenen selektiven Bedingungen unterschieden werden. Darüber hinaus besitzt die stabile Transformation von Plastiden Vorteile, weil Plastiden in den meisten Nutzpflanzen maternal vererbt werden, was das Risiko eines Transgen-Flusses durch Pollen verringert oder eliminiert. Die Transformation des Chloroplastengenoms wird im Allgemeinen durch ein Verfahren bewirkt, das in Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] schematisch geschildert worden ist. Kurz gesagt, werden die zu transformierenden Sequenzen zusammen mit einem selektierbaren Markergen zwischen flankierende Sequenzen, die homolog zum Chloroplastengenom sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen lenken die ortsspezifische Integration in das Plastom. Plastidale Transformation ist für viele verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden, und eine Übersicht erhält man in Bock (2001) "Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology". J. Mol. Biol., 21. Sep. 2001; 312 (3): 425–38, oder Maliga, P. (2003) "Progress towards commercialization of plastid transformation technology". Trends Biotechnol. 21, 20–28. In jüngster Zeit ist über einen weiteren biotechnologischen Fortschritt in Form von markerfreien Plastidentransformanten, welche mittels eines transienten, cointegrierten Markergens hergestellt werden können, berichtet worden (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22 (2), 225–229).
T-DNA-Aktivierungs-Tagging
T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, üblicherweise enthaltend einen Promotor (es kann sich auch um einen Translations-Enhancer oder einen Intron handeln), in die genomische Region des Gens von Interesse oder 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der codierenden Region eines Gens in einer derartigen Konfiguration, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Typischerweise wird die Regulierung der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor zerstört, und das Gen kommt unter die Kontrolle des neu eingebrachten Promotors. Der Promotor ist typischerweise in einer T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom inseriert, zum Beispiel durch Agrobacterium-Infektion, und führt zur modifizierten Expression von Genen nahe der inserierten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression von Genen nahe dem eingebrachten Promotor.
TILLING
Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnologie, die zum Erzeugen und/oder Identifizieren von Nukleinsäuren nützlich ist, welche Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität codieren. TILLING erlaubt auch die Selektion von Pflanzen, welche derartige Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufzeigen, entweder hinsichtlich Stärke oder Lokalisierung oder Zeitgebung (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufzeigen, als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. TILLING vereinigt Hochdichte-Mutagenese mit Hochdurchsatz-Screeningverfahren. Die beim TILLING typischerweise befolgten Schritte sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei, GP, und Koncz, C (1992), in: Methods in Arabidopsis Research, Koncz, C, Chua, NH, Schell, J (Hrsg.), Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) in: Meyerowitz. EM, Somerville. CR (Hrsg.), "Arabidopsis". Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner, J., und Caspar, T. (1998) in: J. Martinez-Zapater, J. Salinas, (Hrsg.), Methods an Molecular Biology, Bd. 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Präparation und Vereinigen bzw. Poolen der Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer Region von Interesse; (d) Denaturieren und Annealen, um die Bildung von Heteroduplexen zu gestatten; (e) DHPLC, wobei die Gegenwart eines Heteroduplex in einem Pool als ein Extra-Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifikation des Mutanten-Individuums; und (g) Sequenzieren des Mutanten-PCR-Produkts. Verfahren für TILLING sind im Fachgebiet allgemein bekannt (McCallum et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18: 455–457; übersichtmäßig zusammengefasst von Stemple (2004) Nat. Rev. Genet. 5 (2): 145–50).
Homologe Rekombination
Homologe Rekombination gestattet die Einbringung einer gewählten Nukleinsäure in einem Genom an einer definierten gewählten Position. Homologe Rekombination ist eine Standardtechnologie, die in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen, wie Hefe oder das Moos Physcomitrella, routinemäßig angewandt wird. Verfahren zur Durchführung homologer Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen beschrieben worden (Offringa et al. (1990) EMBO J. 9 (10): 3077–84) sondern auch für Nutzpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al. (2002) Nat. Biotech. 20 (10): 1030-4; lida und Terada (2004) Curr. Opin. Biotech. 15 (2): 132–8), und es existieren Vorgehensweisen, welche, ungeachtet des Zielorganismus, allgemein anwendbar sind (Miller et al., Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
Ertrag
Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen einen messbaren Gewinn von wirtschaftlichem Wert, typischerweise in Bezug auf eine spezifizierte Nutzpflanze, ein Gebiet und eine Zeitperiode. Individuelle Pflanzenteile tragen auf Basis ihrer Anzahl, Größe und/oder Gewicht direkt zum Ertrag bei, oder die tatsächliche Ausbeute ist der Ertrag pro Quadratmeter für eine Nutzpflanze und pro Jahr, was mittels Dividieren der Gesamtproduktion (einschließlich sowohl geernteter und geschätzter Produktion) durch die bepflanzten Quadratmeter bestimmt wird. Der Begriff ”Ertrag” an einer Pflanze kann sich auf vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Sprossbiomasse), auf die reproduktiven Organe und/oder auf Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze beziehen.
Früh-Wuchskraft
”Früh-Wuchskraft” bezieht sich auf aktives gesundes, richtig ausgewogenes Wachstum, insbesondere während der frühen Stadien des Pflanzenwachstums, und kann aus einer erhöhten Pflanzenfitness resultieren, beispielsweise aufgrund dessen, dass die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. Optimieren der Verwendung von Energieresourcen und der Aufteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit Früh-Wuchskraft zeigen außerdem erhöhtes Setzlings-Überleben und eine bessere Hervorbringung der Nutzpflanze, was häufig zu sehr gleichmäßigen Feldern (wobei die Nutzpflanze in gleichmäßiger Weise wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen die verschiedenen Stadien der Entwicklung im Wesentlichen zur gleichen Zeit erreicht) und oftmals zu einem besserem und höheren Ertrag führt. Deshalb kann die Früh-Wuchskraft durch Messen verschiedener Faktoren, wie etwa Tausendkerngewicht, Prozentsatz der Keimung, Prozentsatz der Emergenz, Setzlingswachstum, Setzlingshöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und vielen anderen, bestimmt werden.
Erhöhen/Verbessern/Steigern
Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind austauschbar und sollen im Sinn der Patentanmeldung im Fall von TCP1, TCP2, Epsin-like oder SHR codierenden Nukleinsäuren oder TCP1-, TCP2-, Epsin-like- oder SHR-Polypeptiden mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, weiter bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wie hierin definiert, und im Falle von IPPT codierenden Nukleinsäuren oder IPPT-Polypeptiden mindestens 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, weiter bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wie hierin definiert, bedeuten.
Samenertrag
Erhöhter Samenertrag kann sich als eines oder mehrere der folgenden manifestieren: a) eine Erhöhung der Samenbiomasse (Gesamtsamengewicht), welche auf Einzelsamen-Basis und/oder pro Pflanze und/oder pro Quadratmeter bezogen sein kann; b) erhöhte Anzahl von Blüten pro Rispe und/oder pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl von (gefüllten) Samen; d) erhöhte Samen-Füllrate (welche als das Verhältnis zwischen der Zahl gefüllter Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Ernteindex, der als ein Verhältnis des Ertrags an erntefähigen Teilen, wie Samen, dividiert durch die Gesamtbiomasse, ausgedrückt wird; f) erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW) und g) erhöhte Anzahl an Hauptrispen, was aus der gezählten Zahl gefüllter Samen und deren Gesamtgewicht extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKW kann aus erhöhter Samengröße und/oder Samengewicht resultieren, und kann auch aus einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße resultieren.
Eine Erhöhung im Samenertrag kann sich auch als eine Erhöhung in Samengröße und/oder Samenvolumen manifestieren. Ferner kann sich eine Erhöhung des Samenertrags auch als eine Erhöhung bei Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder Samenumfang manifestieren. Erhöhter Ertrag kann auch zu modifierter Architektur führen, oder kann aufgrund einer modifierten Architektur auftreten.
Grünheits-Index
Der ”Grünheits-Index”, wie hierin verwendet, wird aus Digitalbildern von Pflanzen berechnet. Für jeden Pixel, der zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehört, wird das Verhältnis des Grünwerts gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell zum Codieren von Farbe) berechnet. Der Grünheits-Index wird als der Prozentsatz an Pixeln ausgedrückt, für den das Grün-zu-Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit wird der Grünheits-Index von Pflanzen in der letzten Abbildung vor dem Aufblühen gemessen. Im Gegensatz dazu wird der Grünheits-Index von Pflanzen unter Dürrestress-Wachstumsbedingungen in der ersten Abbildung nach der Dürre gemessen.
Pflanze
Der Begriff ”Pflanze”, wie hierin verwendet, umfasst ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen sowie Pflanzenteile, einschließlich Samen, Sprosse, Stengel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst. Der Begriff ”Pflanze” beinhaltet außerdem Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Callusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst.
Zu Pflanzen, welche in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen, einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher, ausgewählt aus der Liste, die unter anderem Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölsamenraps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticale sp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp. umfasst.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid oder ein Epsin-like-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Merkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid oder ein Epsin-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Ein bevorzugtes Verfahren für das Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid codiert, erfolgt durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid oder ein Epsin-like-Polypeptid codiert.
Ferner ist es überraschenderweise festgestellt worden, dass das Erhöhen der Expression, in den Samen einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein IPPT-Polypeptid, wie hierin definiert, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Merkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein IPPT-Polypeptid codiert, in den Samen einer Pflanze umfasst.
Ein bevorzugtes Verfahren für das Erhöhen der Expression, in den Samen einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, die ein IPPT-Polypeptid codiert, erfolgt durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein IPPT-Polypeptid codiert, in den Samen einer Pflanze.
Ebenso überraschend ist festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, die ein SHR-Polypeptid codiert, in Pflanzen, die unter Bedingungen mit suboptimaler Nährstoffverfügbarkeit kultiviert werden, den Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen gibt. Es ist auch überraschend festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, die ein SHR-Polypeptid codiert, in Pflanzen, die unter nicht-nährstofflimitierenden Bedingungen kultiviert werden, den Pflanzen ein erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW) im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein SHR-Polypeptid codiert, in Pflanzen, die unter Bedingungen mit sub-optimaler Nährstoffverfügbarkeit kultiviert werden, umfasst.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung des Tausendkerngewichts (TKW) in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein SHR-Polypeptid codiert, in Pflanzen, die unter nicht-nährstofflimitierenden Bedingungen kultiviert werden, umfasst.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung (vorzugsweise Erhöhung) der Expression einer Nukleinsäure, welche ein SHR-Polypeptid codiert, erfolgt durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, welche ein SHR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
In Bezug auf TCP1- oder TCP2-Polypeptide/Gene versteht sich jegliche Bezugnahme hierin nachstehend auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede Bezugnahme hierin nachstehend auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die in der Lage ist, solch ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid zu codieren. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und deshalb bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist), ist eine beliebige Nukleinsäure, codierend den Typ von Protein, der nun beschrieben werden wird, ebenfalls bezeichnet als eine ”TCP1-Nukleinsäure” oder ”TCP1-Gen” oder ”TCP2-Nukleinsäure” oder ”TCP2-Gen”.
In Hinsicht auf Epsin-like-Polypeptide/Gene versteht sich jegliche Bezugnahme hierin nachstehend auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein Epsinlike-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede Bezugnahme hierin nachstehend auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die in der Lage ist, ein solches Epsin-like-Polypeptid zu codieren. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und deshalb bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist), ist eine beliebige Nukleinsäure, codierend den Typ von Protein, der nun beschrieben werden wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”Epsin-like-Nukleinsäure” oder ”Epsin-like-Gen”.
In Bezug auf IPPT-Polypeptide/Gene versteht sich jegliche Bezugnahme hierin nachstehend auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein IPPT-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede Bezugnahme hierin nachstehend auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäuresequenz” versteht sich so, dass eine Nukleinsäuresequenz gemeint ist, die in der Lage ist, ein solches IPPT-Polypeptid zu codieren. Die Nukleinsäuresequenz, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und deshalb bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist), ist eine beliebige Nukleinsäuresequenz, codierend den Typ von Protein, der nun beschrieben werden wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”IPPT-Nukleinsäuresequenz” oder ”IPPT-Gen”.
In Hinsicht auf SHR-Polypeptide/Gene versteht sich jegliche Bezugnahme hierin nachstehend auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein SHR-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede Bezugnahme hierin nachstehend auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die in der Lage ist, ein solches SHR-Polypeptid zu codieren. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und deshalb bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist), ist eine beliebige Nukleinsäure, codierend den Typ von Protein, der nun beschrieben werden wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”SHR-Nukleinsäure” oder ”SHR-Gen”.
Ein ”TCP1-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezeichnet ein beliebiges Polypeptid, umfassend:

(i) eine TCP-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu der TCP-Domäne von einer beliebigen der Sequenzen, die in 1 angegeben sind; und
(ii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne A von einer beliebigen der Sequenzen, die in 1 angegeben sind; und
(iii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne B von einer beliebigen der Sequenzen, die in 1 angegeben sind; und
(iv) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne C von einer beliebigen der Sequenzen, die in 1 angegeben sind.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das TCP1-Polypeptid:

(i) eine TCP-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu der TCP-Domäne der Sequenz, repräsentiert durch Ms_TCP_sugar in 1; und
(ii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne A der Sequenz, repräsentiert durch Ms_TCP_sugar in 1; und
(iii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne B der Sequenz, repräsentiert durch Ms_TCP_sugar in 1; und
(iv) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne C der Sequenz, repräsentiert durch Ms_TCP_sugar in 1.

Ein ”TCP2-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezeichnet ein beliebiges Polypeptid, umfassend:

(i) eine TCP-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu der TOP-Domäne von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind; und
(ii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 1 von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind; und
(iii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 2 von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind; und
(iv) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 3 von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das TCP2-Polypeptid:

(i) eine TCP-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zur TOP-Domäne der Sequenz, repräsentiert durch Mt_TCP2_sugar in 2; und
(ii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 1 der Sequenz, repräsentiert durch Mt_TCP2_sugar in 2; und
(iii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 2 der Sequenz, repräsentiert durch Mt_TCP2_sugar in 2; und
(iv) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 3 der Sequenz, repräsentiert durch Mt_TCP2_sugar in 2.

Darüber hinaus kann das TCP2-Polypeptid ein beliebiges oder beides von folgendem umfassen:

(v) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 4 von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind;
(vi) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 5 von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind.

Vorzugsweise weist Domäne 4, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 4 der Sequenz, repräsentiert durch Mt_TCP2_sugar in 2, auf.
Vorzugsweise weist Domäne 5, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 5 der Sequenz, repräsentiert durch Mt_TCP2_sugar in 2, auf.
Das TCP1- oder TCP2-Protein besitzt, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Gesamt-Sequenzidentität zu der Aminosäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 2 bzw. SEQ ID NR: 4. Die Gesamt-Sequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern, ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
Vorzugsweise lässt sich die TCP1- oder TCP2-Polypeptidsequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen TCP-Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 2 abgebildet ist, eher bei der Gruppe von TCP1- oder TCP2-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 4 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen bzw. clustern.
Ein ”Epsin-like Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, das eine ENTH-Domäne (SMART-Zugangsnummer SM00273) in seiner N-terminalen Hälfte umfasst. Die ENTH Domäne ist im Fachgebiet bekannt und ist in der InterPro-Datenbank beschrieben: Die ENTH(Epsin N-terminale Homologie)-Domäne ist ungefähr 150 Aminosäuren lang und findet sich immer an den N-Termini von Proteinen gelegen. Die Domäne bildet eine kompakte globuläre Struktur, aufgebaut aus 9 Alpha-Helizes, die durch Schleifen von variierender Länge verbunden sind. Die allgemeine Topologie wird von drei helikalen Haarnadeln bestimmt, welche nacheinander mit einer rechtsläufigen Drehung gestapelt vorliegen. Eine N-terminale Helix faltet sich zurück, wodurch eine tiefe basische Furche gebildet wird, welche die Bindungstasche für den Ins(1,4,5)P3-Liganden bildet. Der Ligand wird koordiniert durch Reste von umgebenden Alpha-Helizes, und alle drei Phosphate werden mehrfach-koordiniert. Die Koordination von Ins(1,4,5)P3 legt nahe, dass ENTH spezifisch für bestimmte Kopfgruppen ist. Es wurde festgestellt, dass Proteine, die diese Domäne enthalten, PtdIns(4,5)P2 und PtdIns(1,4,5)P3 binden, was darauf schließen lässt, dass die Domäne ein Membran-interagierendes Molekül sein kann. Die Hauptfunktion von Proteinen, die diese Domäne enthalten, scheint darin zu bestehen, als akzessorische Clathrin-Adaptoren bei der Endocytose zu wirken. Epsin ist fähig, die Clathrin-Polymerisation auf einer Lipidmonoschicht zu rekrutieren und zu fördern, aber kann weitere Rollen in der Signalleitung und Aktin-Regulierung besitzen. Epsin verursacht ein starkes Ausmaß an Membrankrümmung sowie Tubulierung, und sogar die Fragmentierung von Membranen mit einem hohen PtdIns(4,5)P2-Gehalt. Die Epsin-Bindung an Membranen erleichtert deren Verformung durch Insertion der N-terminalen Helix in das äußere Blatt der Doppelschicht, wodurch die Kopfgruppen auseinander gedrückt werden. Dies verringert die Energie, die benötigt wird, um die Membran zu einem Vesikel zu krümmen, was es für den Clathrin-Käfig leichter macht, die gekrümmte Membran zu fixieren und zu stabilisieren. Dies deutet auf eine wegbereitende Rolle von Epsin in der Vesikel-Knospung hin, da es sowohl eine Antriebskraft als auch ein Verbindungsglied zwischen Membraninvagination und Clathrinpolymerisation vorsieht (Anmerkung IPR013809).
Vorzugsweise umfasst das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliche Epsin-like-Polypeptid ferner zwei oder mehr der folgenden Motive:
Motiv 1: (V/I)(L/R)(D/E)AT(S/D/N)(N/D/E/S)E(P/S)WGPHG(T/S/E) (SEQ ID NR: 48)
Vorzugsweise ist Motiv 1: (V/I)LDAT(S/D/N)(N/D)E(P/S)WGPHG(T/S)
Weiter bevorzugt ist Motiv 1 VLDATDNEPWGPHGT
Motiv 2:
F(Q/E)(Y/F)(I/L/V/R/K)(D/E)(S/P/A)(S/G/N/Q/R)G(R/K)D(Q/V/A/H/E)G(S/N/L/I/V)NVR (SEQ ID NR: 49)
Vorzugsweise ist Motiv 2:
F(Q/E)(Y/F)(I/L/V)(D/E)(S/P)(S/G/N)G(R/K)D(Q/V/A)G(S/N/L/I)NVR
Weiter bevorzugt ist Motiv 2 FEYVEPNGKDVGINVR
Motiv 3: (E/S/A/Q)(V/I/E/A)R(Q/E/D/N)KA(A/L/V/E)(A/V/S/R/K)(N/T)(R/A)(D/E/N/G)K (SEQ ID NR: 50)
Vorzugsweise ist Motiv 3: (E/S/A)(V/I)R(Q/E/D/N)KA(A/L/V)(A/V/S)(N/T)R(D/E/N)K
Weiter bevorzugt ist Motiv 3 EIRDKAVANRNK
Motiv 4: WAD(T/S)LSRGL(V/I) (SEQ ID NR: 51)
Vorzugsweise ist Motiv 4: WADSLSRGLI
Motiv 5: L(A/S)D(I/V)G(I/V)(D/V)(F/G)(D/E/P/G) (SEQ ID NR: 52)
Vorzugsweise ist Motiv 5: LADVGVVGD
Zusätzlich zu den vorangehenden Motiven umfasst das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliche Protein vorzugsweise, in seiner nativen Form, auch eines oder mehrere der folgenden Motive:
Motiv 6 (a bis c): eines der folgenden Tetrapeptide: GGYG, GSYG oder GGYD (SEQ ID NR: 53, 54, 55)
Motiv 7 (a bis d): eines der folgenden Tetrapeptide: SAAS, SSAS, SSAP oder SSAT (SEQ ID NR: 56, 57, 58, 59)
Motiv 8 (a bis e): eines der folgenden Tetrapeptide: DEFD, DFFD, DDDF, EDDF oder DDFD (SEQ ID NR: 60, 61, 62, 63, 64)
Alternativ dazu besitzt das Homolog eines Epsin-like-Proteins, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Gesamt-Sequenzidentität zu der Aminosäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 44, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein zwei oder mehr der konservierten Motive, wie oben geschildert, umfasst. Die Gesamt-Sequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern, ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden. Zum Beispiel wird beim Vergleichen der ENTH-Domäne unter den Epsin-like-Polypeptiden die Sequenzidentität, verglichen mit der Gesamt-Sequenzidentität, viel höher sein.
Vorzugsweise lässt sich die Polypeptidsequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist (Holstein und Oliviusson, Protoplasma 226, 13–21, 2005), eher bei der Gruppe von Epsinlike-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 44 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
Ein ”IPPT-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, das (i) eine tRNA-Isopentenyltransferase-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR002627; und (ii) ein N-terminales ATP/GTP-Bindungsstellen-Motiv A (P-loop) umfasst.
Alternativ oder zusätzlich dazu, bezieht sich ein ”IPPT-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf eine beliebige Polypeptidsequenz mit (i) in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität zu einem N-terminalen ATP/GTP-Bindungsstellen-Motiv A (P-loop), wie durch SEQ ID NR: 199 repräsentiert; und mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität zu einem oder mehreren von: (ii) Konserviertes Motiv I DSR(Q/L)(V/L/I), wie durch SEQ ID NR: 200 repräsentiert; oder (ii) Konserviertes Motiv II (N/D/S/T)(I/V)GTAKP(T/S), wie durch SEQ ID NR: 201 repräsentiert; oder (iii) Konserviertes Motiv III L(V/A/I)GG(S/T)GLY, wie durch SEQ ID NR: 202 repräsentiert; oder (iv) Konserviertes Motiv IV F/Y/L)AK(R/K/Q)Q(R/K/M)TWFR, wie durch SEQ ID NR: 203 repräsentiert.
Alternativ oder zusätzlich dazu, bezieht sich ein ”IPPT-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf ein beliebiges Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität zu dem IPPT-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 144 repräsentiert, oder zu einer beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A4 hierin angegeben sind.
Alternativ oder zusätzlich dazu ist ein ”IPPT-Polypeptid” fähig zum Komplementieren eines Hefe-mod5-Mutantenstamms, dem endogene IPPT-Aktivität fehlt, oder ist fähig zum Komplementieren eines E. coli-miaA-Mutantenstamms, dem endogene IPPT-Aktivität fehlt.
Ein ”SHR-Polypeptid” wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges Volllängenpolypeptid, das sich, wenn es in der Erstellung eines phylogenetischen GRAS-Baums, wie demjenigen, der in 14 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von SHR-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 209 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
SHR-Polypeptide, die Mitglieder der GRAS-Familie von Pflanzen-Transkriptionsfaktoren sind, können für die GRAS-Genfamilie typische Merkmale umfassen. Zu derartigen typischen Merkmalen zählen eine hoch konservierte C-terminale Region, aber eine variable N-terminale Region. Die hoch konservierte C-terminale Region umfasst fünf verschiedene Motive, die typischerweise in der folgenden Reihenfolge gefunden werden:

1. Leucin-Heptaden-Repeat (LHR1),
2. VHIID-Motiv,
3. Leucin-Heptaden-Repeat II (LHR II),
4. PFYRE-Motiv, und
5. SAW-Motiv.

LHR I scheint aus zwei Repeat-Einheiten zu bestehen, welche durch einen Spacer getrennt sind, der häufig einen Prolinrest enthält, der bekanntermaßen alpha-helikale Strukturen unterbricht. Die zwei Einheiten innerhalb von LHR I sind nicht miteinander in Phase. LHR IA ist ähnlich zu LHRs, die in anderen Proteinen gefunden werden, bestehend aus zwischen drei bis fünf regulären Heptaden. LHR IB ist kürzer und besteht üblicherweise aus nur zwei derartigen Repeats. In LHR II können spezifische Leucin-Heptaden-Repeats in dieser Region in fast allen Mitgliedern der GRAS-Familie identifiziert werden, wobei die Zahl an Repeats gering ist, gewöhnlich zwei oder drei.
Die VHIID-Sequenz ist in allen Mitgliedern der Familie leicht erkennbar, obwohl sie nicht absolut konserviert ist: Substitutionen von Valin, Isoleucin und Leucin an den Positionen 1, 3 und 4 ergeben eine Anzahl an Permutationen. Innerhalb der größeren Region, welche wir als das VHIID-Motiv bezeichnen, sind die Reste P-N-H-D-Q-L absolut konserviert. Der Abstand zwischen den Prolin- und Asparagin-Resten ist unter allen Mitgliedern identisch, wie auch der Abstand zwischen den Histidin-, Aspartat-, Glutamin- und Leucin-Resten. Das VHIID-Motiv wird an seinem C-Terminus von einer konservierten Sequenz begrenzt, die der Einfachheit halber als LRITG bezeichnet wird.
Die meisten der Abweichungen von dieser Consensus-Sequenz repräsentieren konservative Änderungen.
Im PFYRE-Motiv ist P absolut konserviert. Innerhalb der PFYRE-Domäne sind die Sequenzen großteils kolinear, und Abschnitte dieser Region zeigen einen hohen Grad an Sequenzähnlichkeit unter allen Mitgliedern der GRAS-Familie.
Das SAW-Motiv ist durch drei Paare von absolut konservierten Resten gekennzeichnet: R-E, W-G und W-W. Das W-W-Paar, das fast am C-Terminus dieser Sequenzen gefunden wird, zeigt absolute Konservierung des räumlichen Abstands, ebenso wie das W-G-Paar.
Zusätzlich dazu, dass sich ein SHR-Polypeptid bei anderen SHR-Polypeptiden in einem phylogenetischen GRAS-Baum einordnen lässt, weist die C-terminale Region eines SHR-Polypeptids, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, vorzugsweise, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der C-terminalen Region der Aminosäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 209, auf.
Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern, ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
Der Begriff ”Domäne” sowie ”Motiv” ist im Abschnitt ”Definitionen” hierin definiert. Es existieren Spezialdatenbanken für die Identifizierung von Domänen, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30, 242–244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (in:) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Hrsg.: Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276–280 (2002)). Eine Auswahl an Werkzeugen für die Analyse von Proteinsequenzen in silico ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server (Schweizer Institut für Bioinformatik; Gasteiger et al., "ExPASy: the Proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis", Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)) verfügbar. Domänen oder Motive können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie etwa durch Sequenzalignment, identifiziert werden.
Die Analyse der Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 144 ist nachstehend im Beispiel 4 hierin wiedergegeben. Zum Beispiel umfasst ein IPPT-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 144, eine tRNA-Isopentenyltransferase-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR002627. Domänen können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie durch Sequenzalignment, identifiziert werden. Ein Alignment der Polypeptide von Tabelle A4 hierin ist in 3 gezeigt. Derartige Alignments sind nützlich zur Identifizierung der am meisten konservierten Domänen oder Motive unter den IPPT-Polypeptiden, wie etwa den Konservierten Motiven bzw. 'Conserved Motifs', wie sie durch SEQ ID NR: 200 bis 203 (enthalten in SEQ ID NR: 144) repräsentiert sind.
Verfahren für das Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wobei GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA zu derartigen Verfahren zählen. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453) zur Ermittlung des globalen (d. h. die vollständigen Sequenzen überspannenden) Alignments von zwei Sequenzen, welches die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10) berechnet die prozentuale Sequenzidentität und führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen durch. Die Software zum Ausführen der BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich verfügbar. Homologe können leicht identifiziert werden, indem zum Beispiel der ClustalW-Multiple-Sequenz-Alignment-Algorithmus (Version 1.83) mit den vorgegebenen paarweisen Alignment-Parametern und einer Bewertungsmethode in Prozent angewandt wird. Die globalen Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität können auch unter Anwendung eines der Verfahren ermittelt werden, die im MatGAT-Software-Paket (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 10. Juli 2003; 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences) verfügbar sind. Zur Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein wird. Darüber hinaus können anstatt der Verwendung von Volllängensequenzen zur Identifizierung von Homologen auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) hinweg bestimmt werden, wobei die oben erwähnten Programme unter Anwendung der Standardparameter verwendet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol. 147 (1); 195–7).
Ferner besitzen TCP1- und TCP2-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise DNA-bindende Aktivität. Werkzeuge und Techniken zum Messen von DNA-Bindungsaktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Weitere Einzelheiten sind in Beispiel 6 angegeben.
Darüber hinaus ergeben TCP1- und TCP2-Polypeptide, bei Expression in Reis gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie im Abschnitt 'Beispiele' geschildert, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Samenertrag.
Ferner weisen Epsin-like-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise Lipid-bindende Aktivität auf. Werkzeuge und Techniken zum Messen von Lipid-bindender Aktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel wird die Lipidbindung durch die ENTH-Domäne von Hom et al. (J. Mol. Biol. 373, 412–423, 2007) beschrieben. Weitere Einzelheiten sind in Beispiel 6 angegeben.
Darüber hinaus ergeben Epsin-like-Polypeptide, bei Expression in Reis gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie in den Beispielen 7 und 8 geschildert, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere einem oder mehren von erhöhtem Gesamtgewicht an Samen, Füllrate, Gesamtzahl an Samen und Anzahl an gefüllten Samen.
Das Beispiel 3 hierin beschreibt in Tabelle B4 den Prozentsatz der Identität zwischen dem IPPT-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 144 repräsentiert, und den in Tabelle A4 aufgelisteten IPPT-Polypeptiden, der so gering wie 39% Aminosäure-Sequenzidentität sein kann.
Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Die Kenntnis der Lokalisierung eines Proteins hilft dabei, seine Funktion aufzuklären. Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisation bis zum Tagging von Proteinen unter Einsatz von Grün-fluoreszierendem Protein (GFP) oder beta-Glucuronidase (GUS). Derartige Verfahren sind exakt, wenngleich arbeitsintensiv im Vergleich zu computergestützten Verfahren. Kürzlich sind große Fortschritte bei der computergestützten Vorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht worden. Unter den einem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannten Algorithmen sind bei den ExPASy-Proteomics-Werkzeugen, welche vom Swiss Institute for Bioinformatics (Schweizer Institut für Bioinformatik) bereitgestellt werden, zum Beispiel PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale, TMHMM und andere verfügbar.
Ferner sind in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliche IPPT-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise fähig zum Übertragen des Isopentenyl-Rests von delta(2)-Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) oder Hydroxymethylbutenyldiphosphat (HMBDP) auf ein Adenin an Position 37 von bestimmten tRNAs. Es existieren viele Assays zum Messen einer solchen enzymatischen Aktivität, einschließlich Komplementationsassays eines Hefestamms mit defekter endogener IPPT-Aktivität (codiert durch das MOD5-Gen; Golovko et al. (2002) Plant Molec. Biol. 49: 161–169), Komplementationsassays eines E. coli-Stamms mit defekter endogener IPPT-Aktivität (codiert durch das miaA-Gen; Dihanich et al. (1987) Mol. Cell Biol. 7: 177–184), oder Quantifizierung von Cytokininen in tRNA (Gray et al. (1996) Plant Physiol. 110: 431–438, Miyawaki et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (44): 16598–16603).
Darüber hinaus geben SHR-Polypeptide, bei Expression in Reis, der unter Bedingungen mit sub-optimaler Nährstoffverfügbarkeit kultiviert wird, den Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen. SHR-Polypeptide vermitteln, bei Expression in Reis, der unter nicht-nährstofflimitierenden Bedingungen kultiviert wird, den Pflanzen ein erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW) in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
In Bezug auf TCP1 und TCP2 wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 1, codierend die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 2, und durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 3, codierend die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 4, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen TCP1-codierenden oder TCP2-codierenden Nukleinsäure, oder unter Verwendung eines TCP1- oder TCP2-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
In Bezug auf TCP1 und TCP2 sind Beispiele für Nukleinsäuren, welche TCP1- und TCP2-Polypeptide codieren, im Beispiel 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuren sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die von den in Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codierten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des TCP1-Polypeptids, repräsentiert durch SEQ ID NR: 2, und die von den in Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codierten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des TCP2-Polypeptids, repräsentiert durch SEQ ID NR: 4, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge wie hierin definiert gemeint sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (zweiter BLAST) (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 1 bis SEQ ID NR: 4 ist, erfolgt der zweite BLAST daher gegen Medicago-Sequenzen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer bzw. ”hit” aus dem ersten Blast aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt.
In Bezug auf Epsin-like-Sequenzen, wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 43 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, codierend die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 44, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer/eines beliebigen Epsin-like codierenden Nukleinsäure oder Epsin-like-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
In Bezug auf Epsin-like-Sequenzen sind Beispiele für Nukleinsäuren, welche Epsin-like-Polypeptide codieren, in Tabelle A3 von Beispiel 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuren sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des durch SEQ ID NR: 44 repräsentierten Epsin-like-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert gemeint sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (zweiter BLAST) (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 43 oder SEQ ID NR: 44 ist, erfolgt der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis-Sequenzen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
In Bezug auf IPPT wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 143 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die IPPT-Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 144 codiert, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die ein IPPT-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, durchgeführt werden.
In Bezug auf IPPT sind Beispiele für Nukleinsäuresequenzen, welche IPPT-Polypeptide codieren, in Tabelle A4 von Beispiel 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuresequenzen sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 144 repräsentierten IPPT-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (zweiter BLAST) (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 143 oder SEQ ID NR: 144 ist, erfolgt der zweite BLAST daher gegen Synechococcus sp. PCC 7942-Sequenzen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
In Bezug auf SHR wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 208, codierend die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 209, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer/eines beliebigen SHR codierenden Nukleinsäure oder SHR-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
In Bezug auf SHR sind Beispiele von Nukleinsäuren, welche SHR-Polypeptide codieren, in der Tabelle A5 von Beispiel 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuren sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des durch SEQ ID NR: 209 repräsentierten SHR-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert gemeint sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Typischerweise beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (zweiter BLAST) (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 208 oder SEQ ID NR: 209 ist, erfolgt der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis-Sequenzen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast aus derselben Spezies stammt, wie jener, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST dann idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
Hoch-eingestufte Übereinstimmungstreffer sind diejenigen mit einem niedrigen E-Wert. Je niedriger der E-Wert, umso signifikanter die Wertung (oder in anderen Worten, umso niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Treffer durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Fachgebiet allgemein bekannt. Zusätzlich zu E-Werten, werden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. Im Fall von großen Familien kann ClustaIW eingesetzt werden, gefolgt von einem Nachbarkopplungs- bzw. ”Neighbour-joining”-Baum, um bei der Visualisierung der Einordnung bzw. Clusterung verwandter Gene zu helfen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
Auch Nukleinsäurevarianten können bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sein. Zu Beispielen solcher Varianten zählen Nukleinsäuren, welche Homologe und Derivate von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen codieren, die von den in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert werden, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hierin definiert beschaffen sind. Außerdem sind Nukleinsäuren in den Verfahren der Erfindung nützlich, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen codieren, welche von den in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert werden. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, besitzen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität, wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind.
Ferner zählen zu den, bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlichen Nukleinsäurevarianten Abschnitte von Nukleinsäuren, die TCP1- oder TCP2-, Epsin-like-, IPPT- oder SHR-Polypeptide codieren, Nukleinsäuren, die an Nukleinsäuren hybridisieren, die TCP1- oder TCP2-, Epsin-like-, IPPT- oder SHR-Polypeptide codieren, Splice-Varianten von Nukleinsäuren, die TCP1- oder TCP2-, Epsin-like-, IPPT- oder SHR-Polypeptide codieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die TCP1- oder TCP2-, Epsin-like-, IPPT- oder SHR-Polypeptide codieren, sowie Varianten von Nukleinsäuren, die TCP1- oder TCP2-, Epsin-like-, IPPT- oder SHR-Polypeptide codieren, welche durch Gen-Shuffling erhalten werden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Splice-Variante, allelische Variante und Gen-Shuffling sind wie hierin beschrieben beschaffen.
Nukleinsäuren, die TCP1 oder TCP2, Epsin-like oder IPPT codieren, müssen nicht Volllängenukleinsäuren sein, da die Ausführung der Verfahren der Erfindung nicht auf die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit Volllänge angewiesen ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem Abschnitt von einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen, codiert von den in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder einem Abschnitt von einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen, die von den in Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert werden.
Nukleinsäuren, die SHR-Polypeptide codieren, müssen nicht Volllängenukleinsäuren sein, da die Ausführung der Verfahren der Erfindung nicht auf der Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit Volllänge beruht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in unter Bedingungen mit sub-optimaler Nährstoffverfügbarkeit kultivierten Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder einem Abschnitt von einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Es wird ebenfalls ein Verfahren zur Erhöhung des TKW in unter nicht-nährstofflimitierenden Bedingungen kultivierten Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder einem Abschnitt von einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen.
Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel durch Vornehmen einer oder mehrerer Deletionen an der Nukleinsäure hergestellt werden. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder sie können an andere codierende (oder nicht-codierende) Sequenzen fusioniert sein, um zum Beispiel ein Protein zu erzeugen, das mehrere Aktivitäten vereint. Sofern es an andere codierende Sequenzen fusioniert ist, kann das resultierende Polypeptid, das nach Translation produziert wird, größer sein als jenes, das für den Proteinabschnitt vorhergesagt wird.
In Bezug auf TCP1 oder TCP2 codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein TCP1- oder TCP2-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die von den in Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert werden, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen codiert, die von den in Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert sind. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 100, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen, welche von den in Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert sind. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 3. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 1 oder 2 abgebildet ist, eher bei der Gruppe von TCP1- oder TCP2-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 4 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
In Bezug auf Epsin-like-Sequenzen codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein Epsin-like-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 43. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist (Holstein und Oliviusson, Protoplasma 226, 13–21, 2005), eher bei der Gruppe von Epsinlike-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 44 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
In Bezug auf IPPT codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein IPPT-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 920 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem IPPT-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 144, oder zu einer beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A4 hierin angegeben sind. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 143.
In Bezug auf SHR codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein SHR-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt von einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 1000, 1250, 1500, 1600, 1700 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 208. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen GRAS-Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 14 abgebildet ist, eher bei der Gruppe von SHR-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 209 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen verringerter Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die ein TCP1- oder TCP2- oder ein Epsin-like- oder ein IPPT- oder ein SHR-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, oder mit einem Abschnitt, wie hierin definiert, in der Lage ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren in der Lage ist, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure in der Lage ist, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer Aminosäure codiert, welche von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert wird.
In Bezug auf TCP1 oder TCP2 oder Epsin-like-Sequenzen, codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein TCP1- oder TCP2- oder ein Epsin-like-Polypeptid, wie hierin definiert, aufweisend im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die von den in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert werden. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren oder an einen Abschnitt von einer beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure in der Lage, codierend ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen, die von den in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert werden. In Bezug auf TCP1 oder TCP2 ist die hybridisierende Sequenz am stärksten bevorzugt fähig zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 1, oder an einen Abschnitt davon, oder SEQ ID NR: 3, oder an einen Abschnitt davon. In Bezug auf Epsin-like-Sequenzen ist die hybridisierende Sequenz am stärksten bevorzugt fähig zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 43, oder an einen Abschnitt davon.
In Bezug auf IPPT codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein IPPT-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen auf. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder an einen Abschnitt von einer beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz fähig zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz mit in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem IPPT-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 144, oder zu einer beliebigen der in Tabelle A4 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 143, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage.
Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Splice-Variante, die ein IPPT-Polypeptid, wie hierin oben stehend definiert, codiert, wobei eine Splice-Variante wie hierin definiert beschaffen ist.
In Bezug auf SHR codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein SHR-Polypeptid, wie hierin definiert, aufweisend im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder an einen Abschnitt von einer beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure in der Lage, codierend ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 208, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage. Vorzugsweise codiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in Volllänge vorliegt und bei der Erstellung eines phylogenetischen GRAS-Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 14 abgebildet ist, eher bei der Gruppe von SHR-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 209 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
In Bezug auf TCP1 oder TCP2 codiert die hybridisierende Sequenz bevorzugt ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in Volllänge vorliegt und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in den 1 oder 2 abgebildet ist, eher bei der Gruppe von TCP1- oder TCP2-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 2 oder 4 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
In Bezug auf Epsin-like-Sequenzen codiert die hybridisierende Sequenz bevorzugt ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in Volllänge vorliegt und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist (Holstein and Oliviusson, Protoplasma 226, 13–21, 2005), eher bei der Gruppe von Epsin-like-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 44 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Splice-Variante, die ein TCP1- oder TCP2- oder ein Epsin-like-, oder ein SHR-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert, wobei eine Splice-Variante wie hierin definiert beschaffen ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Splice-Variante von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder von einer Splice-Variante einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen, die von den in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert werden.
In Bezug auf SHR wird ebenfalls ein Verfahren zur Erhöhung des TKW in Pflanzen bereitgestellt, welches das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Splice-Variante von einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder von einer Splice-Variante einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen, und das Kultivieren von Pflanzen unter nicht-nährstofflimitierenden Bedingungen umfasst.
In Bezug auf TCP1 oder TCP2 handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 1 oder 3, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 oder 4. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in den 1 oder 2 dargestellt ist, eher bei der Gruppe von TCP1- oder TCP2-Polypeptiden, umfassend die Aminosäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 2 oder 4, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
In Bezug auf Epsin-like-Sequenzen handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 43, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 44. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist (Holstein und Oliviusson, Protoplasma 226, 13–21, 2005), eher bei der Gruppe von Epsin-like-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 44 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
In Bezug auf IPPT handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 143, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 144. Vorzugsweise handelt es sich bei der Splice-Variante um eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem IPPT-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 144, oder zu einer beliebigen der in Tabelle A4 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen.
In Bezug auf SHR handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 208, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 209. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen GRAS-Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 14 abgebildet ist, eher bei der Gruppe von SHR-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 209 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein TCP1- oder TCP2- oder ein Epsin-like- oder ein IPPT- oder ein SHR-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert, wobei eine allelische Variante wie hierin definiert beschaffen ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer allelischen Variante einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer allelischen Variante einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen, die von den in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert werden.
In Bezug auf IPPT wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in den Samen einer Pflanze, von einer allelische Variante einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in den Samen einer Pflanze, von einer allelischen Variante einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen.
In Bezug auf SHR wird ebenfalls ein Verfahren zur Erhöhung des TKW in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer allelischen Variante von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer allelischen Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, und das Kultivieren von Pflanzen unter nicht-nährstofflimitierenden Bedingungen.
In Bezug auf TCP1 oder TCP2 weisen die allelischen Varianten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das TCP1- oder TCP2-Polypeptid von SEQ ID NR: 2 oder 4 und eine beliebige der Aminosäuren, codiert von den in Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 1 oder 3 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 oder 4 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in den 1 oder 2 dargestellt ist, eher bei den TCP1- oder TCP2-Polypeptiden, umfassend die Aminosäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 2 oder 4, TCP1 oder TCP2, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
In Bezug auf Epsin-like-Sequenzen weisen die allelischen Varianten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das Epsin-like-Polypeptid von SEQ ID NR: 44 und eine beliebige der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 43 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 44 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist (Holstein und Oliviusson, Protoplasma 226, 13–21, 2005), eher bei der Gruppe von Epsin-like-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 44 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
In Bezug auf IPPT weisen die allelischen Varianten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das IPPT-Polypeptid von SEQ ID NR: 144 und eine beliebige der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 143 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 144 codiert. Vorzugsweise handelt es sich bei der allelischen Variante um eine allelische Variante einer Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem IPPT-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 144 repräsentiert, oder zu einer beliebigen der in Tabelle A4 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen.
In Bezug auf SHR weisen die allelischen Varianten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das SHR-Polypeptid von SEQ ID NR: 209 und eine beliebige der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 208 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 209 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen GRAS-Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 14 abgebildet ist, eher bei der Gruppe von SHR-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 209 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution können ebenfalls zur Anwendung kommen, um Varianten von Nukleinsäuren zu erzeugen, welche TCP1- oder TCP2- oder ein Epsin-like-, oder IPPT- oder SHR-Polypeptide, wie oben definiert, codieren, wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” wie hierin definiert beschaffen ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen oder zur Erhöhung von TKW-Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Variante einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Variante einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen, die von den in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert werden, wobei die Varianten-Nukleinsäure durch Gen-Shuffling erhalten wird, und das Kultivieren der Pflanzen unter nicht-nährstofflimitierenden Bedingungen.
In Bezug auf TCP1 oder TCP2 lässt sich die von der durch Genshuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 1 oder 2 abgebildet ist, vorzugsweise eher bei der Gruppe von TCP1- oder TCP2-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 2 oder 4 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
In Bezug auf Epsin-like-Sequenzen lässt sich die von der durch Genshuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist (Holstein und Oliviusson, Protoplasma 226, 13–21, 2005), vorzugsweise eher bei der Gruppe von Epsin-like-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 44 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
In Bezug auf IPPT codiert die durch Genshuffling erhaltene Varianten-Nukleinsäuresequenz vorzugsweise eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem IPPT-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 144 repräsentiert, oder zu einer beliebigen der in Tabelle A4 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen.
In Bezug auf SHR lässt sich die von der durch Genshuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen GRAS-Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 14 abgebildet ist, vorzugsweise eher bei der Gruppe von SHR-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 209 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
Darüber hinaus können Nukleinsäure-Varianten auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Es sind mehrere Verfahren verfügbar, um eine ortsgerichtete Mutagenese zu bewirken, wobei die häufigsten PCR-basierende Verfahren sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).
TCP1- oder TCP2-Polypeptide codierende Nukleinsäuren können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die TCP1- oder TCP2-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Medicago, und am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Medicago sativa oder Medicago truncatula.
Epsin-like-Polypeptide codierende Nukleinsäuren können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Epsin-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
IPPT-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Die Nukleinsäuresequenz, die ein IPPT-Polypeptid codiert, stammt aus der Domäne Procaryota, vorzugsweise aus Cyanobakterien, weiter bevorzugt aus den Ordnungen Nostocales, Oscillatoriales, Chroococcales, Prochlorales, Gloeobacterales, Pleurocapsales, Stigonematales. Weiter bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz, die ein IPPT-Polypeptid codiert, aus Nostoc, Trichodesmium, Anabaena, Acaryochloris, Microcystis, Thermosynechococcus, Synechococcus, Prochlorococcus, Gloeobacter, Synechocystis. Am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz, die ein IPPT-Polypeptid codiert, aus Synechococcus-Spezies, insbesondere aus Synechococcus PCC 7942.
SHR-Polypeptide codierende Nukleinsäuren können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die SHR-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brasicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
Die Ausführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften. Insbesondere ergibt die Ausführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hierin ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
Es versteht sich, dass die Bezugnahme hierin auf gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften eine Erhöhung der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeutet, welche oberirdische (erntefähige) Teile und/oder (erntefähige) Teile unterhalb des Erdbodens einschließen kann. Insbesondere handelt es sich bei derartigen erntefähigen Teilen um vegetative Pflanzenteile und/oder Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zum Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen.
Wenn man Mais als ein Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung, unter anderem, als eines oder mehreres der folgenden manifestieren: Erhöhung der Anzahl an Pflanzen, welche pro Quadratmeter hervorgebracht werden, eine Erhöhung der Anzahl von Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Ackerreihen, der Anzahl der Kerne pro Reihe, des Kerngewichts, des Tausendkerngewichts, der Ährenlänge/Durchmesser, Erhöhung der Samen-Füllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist). Wenn man Reis als Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem als eine Erhöhung bei einem oder mehreren der folgenden manifestieren: Anzahl an Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl an Rispen pro Pflanze, Anzahl an Ährchen pro Rispe, Anzahl an Blüten (Blütchen) pro Rispe (welche ausgedrückt wird als ein Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen gegenüber der Anzahl an Hauptrispen), Erhöhung der Samenfüllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100, ist), Erhöhung des Tausendkerngewichts.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vor, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein TCP1- oder TCP2- oder ein Epsinlike- oder ein IPPT- oder ein SHR-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
Da die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen eine erhöhte Wachstumsrate (wenigstens während eines Teils ihres Lebenszyklus) im Vergleich zur Wachstumsrate von Kontrollpflanzen bei einem entsprechenden Stadium in ihrem Lebenszyklus aufzeigen.
Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen überall in der gesamten Pflanze herrschen. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Der Lebenszyklus einer Pflanze kann sich so verstehen, dass die Zeit gemeint ist, welche benötigt wird, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, an welchem die Pflanze trockene reife Samen erzeugt hat, die ähnlich zum Ausgangsmaterial sind. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Früh-Wuchskraft, Wachstumsrate, Grünheits-Index, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann an einer oder mehreren Stufen im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Pflanzenlebenszyklus stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der frühen Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann eine erhöhte Wuchskraft reflektieren. Die Erhöhung in der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, was gestattet, dass Pflanzen später ausgesät und/oder früher geerntet werden, als es sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt kann mit einer früheren Blütezeit erreicht werden). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann sie das weitere Aussäen von Samen derselben Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel Säen und Ernten von Reispflanzen, gefolgt von Säen und Ernten weiterer Reispflanzen, sämtlich innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht wird, kann sie, in ähnlicher Weise, das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel das Säen und Ernten von Maispflanzen, gefolgt zum Beispiel von Aussaat und gegebenenfalls Ernte von Sojabohne, Kartoffel oder einer beliebigen anderen geeigneten Pflanze). Im Falle mancher Nutzpflanzen kann auch das mehrmalige Abernten vom gleichen Wurzelstock möglich sein. Das Ändern des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (aufgrund einer Erhöhung der Mehrmaligkeit (z. B. in einem Jahr), bei der eine beliebige jeweilige Pflanze angebaut und geerntet werden kann). Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann auch die Kultivierung transgener Pflanzen in einem weiteren geographischen Gebiet als bei ihren Wildtyp-Gegenstücken zulassen, da die territorialen Eingrenzungen für den Anbau einer Nutzpflanze häufig von nachteiligen Umweltbedingungen entweder zur Zeit des Pflanzens (frühe Jahreszeit) oder zur Zeit des Erntens (späte Jahreszeit) bestimmt werden. Derartige nachteilige Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt wird. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven ermittelt werden, wobei es sich bei derartigen Parametern, unter anderem, um T-Mid (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 90% ihrer maximalen Größe zu erreichen) handeln kann.
Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung, ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein TCP1- oder TCP2- oder ein Epsin-like-, oder ein IPPT-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst. Außerdem wird ein Verfahren zum Erhöhen der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein SHR-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, und das Kultivieren der Pflanzen unter Bedingungen mit sub-optimaler Nährstoffverfügbarkeit umfasst.
Gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften werden durch Ausführung der Verfahren der Erfindung und Kultivieren von Pflanzen unter Bedingungen mit Nährstoffmangel, insbesondere unter Bedingungen mit Stickstoffmangel, erhalten. Nährstoffmangel kann aus einem Mangel an Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und sonstigen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren. Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein SHR-Polypeptid codiert, und das Kultivieren von Pflanzen unter Bedingungen mit Stickstoffmangel umfasst.
Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt ungeachtet dessen, ob sich die Pflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen befindet oder ob die Pflanze verschiedenen Stressformen ausgesetzt ist, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, auf. Pflanzen antworten in der Regel auf eine Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Mäßiger Stress ist demgegenüber als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig, ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums, einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, weiter bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen. Auf Grund der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizidbehandlungen) werden starke Stressformen bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig angetroffen. Als eine Konsequenz ist das, von mäßigem Stress induzierte, beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressformen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressformen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressformen können zurückzuführen sein auf Dürre oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen. Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (insbesondere wegen Dürre), Salzstress, oxidativen Stress oder einem ionischen Stress verursacht wird. Biotische Stressformen sind typischerweise diejenigen Stressarten, welchen von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden.
Im Besonderen können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen mit milder Dürre durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Wie in Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen umweltbedingten Stressformen häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stress-Proteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit.
In Bezug auf IPPT sollte die beispielhafte Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung mit Dürrestress nicht als Einschränkung auf Dürrestress angesehen werden, zumal diverse Umweltstresse ähnliche Wege aktivieren, sondern vielmehr als Abbild zum Aufzeigen der Beteiligung von IPPT-Polypeptiden, wie oben stehend definiert, an der Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen, im Allgemeinen unter abiotischen Stressformen, kultiviert werden.
In Bezug auf IPPT versteht sich, dass der Begriff ”abiotischer Stress”, wie hierin definiert, ein oder mehrere beliebige von folgenden bedeutet: Wasserstress (wegen Dürre oder überschüssigem Wasser), anaerober Stress, Salzstress, Temperaturstress (durch heiße, kalte oder Frost-Temperaturen), Stress durch chemische Toxizität und oxidativer Stress. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionischem Stress. Vorzugsweise ist der Wasserstress ein Dürrestress. Der Begriff Salzstress ist nicht auf gewöhnliches Salz (NaCl) eingeschränkt, sondern es kann sich um einen beliebigen Stress handeln, der unter anderem von einem oder mehreren von: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂ verursacht wird.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt Pflanzen, welche unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter milden Dürre-Bedingungen kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, welche unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter milden Dürre-Bedingungen kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein TCP1- oder TCP2- oder ein Epsin-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt Pflanzen, welche unter Bedingungen von Nährstoffmangel, insbesondere unter Bedingungen von Stickstoffmangel, kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in, unter Bedingungen von Nährstoffmangel kultivierten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein TCP1- oder TCP2- oder ein Epsin-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Nährstoffmangel kann aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten oder anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren.
In Bezug auf IPPT ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, welche erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften unter abiotischen Stressbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, die bei vergleichbaren Stressbedingungen kultiviert werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter abiotischen Stressbedingungen kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein IPPT-Polypeptid codiert, in den Samen einer Pflanze umfasst. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, der aus einem oder mehreren der folgenden ausgewählt ist: Wasser-Stress, Salz-Stress, oxidativer Stress und ionischer Stress.
In Bezug auf IPPT ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung ferner Pflanzen, welche bei Kultivierung unter Bedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, insbesondere unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit, erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter Bedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise verringerter Stickstoffverfügbarkeit, kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein IPPT-Polypeptid codiert, in den Samen einer Pflanze umfasst. Die verringerte Nährstoffverfügbarkeit kann aus einem Mangel oder Überschuss an Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren. Vorzugsweise handelt es sich bei der verringerten Nährstoffverfügbarkeit um eine verringerte Stickstoffverfügbarkeit.
Ein weiteres Beispiel für abiotischen Umweltstress ist die verringerte Verfügbarkeit von einem oder mehreren Nährstoffen, welche von den Pflanzen für das Wachstum und die Entwicklung assimiliert werden müssen. Wegen des starken Einflusses der Nährstoffverwertungseffizienz auf den Pflanzenertrag und die Produktqualität wird eine gewaltige Menge an Düngemitteln über Feldern verteilt, um Pflanzenwachstum und -qualität zu optimieren. Die Produktivität von Pflanzen wird gewöhnlicherweise von drei Hauptnährstoffen limitiert, nämlich Phosphor, Kalium und Stickstoff, der, unter diesen dreien, gewöhnlich das geschwindigkeitslimitierende Element beim Pflanzenwachstum ist. Deshalb ist das für Pflanzenwachstum erforderliche, hauptsächliche Nährstoff-Element der Stickstoff (N). Er ist ein Bestandteil von zahlreichen wichtigen Verbindungen, welche in lebenden Zellen angetroffen werden, einschließlich Aminosäuren, Proteinen (Enzymen), Nukleinsäuren und Cholorphyll. Stickstoff macht 1,5% bis 2% der Pflanzen-Trockensubstanz und ungefähr 16 % des gesamten Pflanzenproteins aus. Somit ist die Stickstoffverfügbarkeit ein hauptsächlicher limitierender Faktor für Nutzpflanzenwachstum und -produktion (Frink et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (4): 1175–1180) und besitzt außerdem einen sehr großen Einfluss auf die Proteinakkumulation und Aminosäure-Zusammensetzung. Daher sind Nutzpflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften bei Kultivierung unter Stickstoff-limitierenden Bedingungen von großem Interesse.
Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen) oder Zellen davon, die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon oder Zellen davon umfassen ein Nukleinsäure-Transgen, codierend ein TCP1- oder TCP2- oder ein Epsin-like-, oder ein SHR-Polypeptid, wie oben definiert. In Bezug auf IPPT umfassen die Pflanzen oder Teile davon oder Zellen davon ein Nukleinsäure-Transgen, codierend ein IPPT-Polypeptid, wie oben definiert, das funktionsfähig mit einem samenspezifischen Promotor verbunden ist.
Die Erfindung sieht außerdem genetische Konstrukte und Vektoren zum Erleichtern des Einbringens und/oder der Expression von TCP1- oder TCP2- oder Epsin-like-, oder IPPT-, oder SHR-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren in Pflanzen vor. Die Genkonstrukte können in Vektoren inseriert werden, welche kommerziell erhältlich sein können, die für das Transformieren in Pflanzen hinein geeignet sind und für die Expression des Gens von Interesse in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hierin definiert, in den Verfahren der Erfindung vor.
Im Genaueren sieht die vorliegende Erfindung ein Konstrukt vor, umfassend:

(a) eine Nukleinsäure, codierend ein TCP1- oder TCP2- oder ein Epsin-like-, oder ein IPPT- oder ein SHR-Polypeptid, wie oben definiert;
(b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationssequenz.

Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, welche ein TCP1- oder TCP2- oder ein Epsin-like-, oder ein IPPT-, oder SHR-Polypeptid codiert, wie oben definiert beschaffen. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert beschaffen.
Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine beliebige der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, welche auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen erfolgreich zu transformieren und Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig an eine oder mehrere Steuerungssequenzen (mindestens an einen Promotor) verknüpft.
In vorteilhafter Weise kann ein beliebiger Typ von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz anzutreiben. Ein konstitutiver Promotor ist in den Verfahren besonders nützlich. Vorzugsweise ist der konstitutive Promotor ebenfalls ein ubiquitärer Promotor. In Bezug auf IPPT ist ein samenspezifischer Promotor besonders nützlich in den Verfahren. Andere organspezifische Promotoren, zum Beispiel für bevorzugte Expression in Blättern, Stengeln, Knollen, Meristemen, sind nützlich in der Ausführung der Verfahren der Erfindung. Entwicklungsregulierte Promotoren sind ebenfalls nützlich in der Ausführung der Verfahren der Erfindung. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin.
Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die TCP1- oder TCP2-Polypeptid codierende Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 1 oder 3 repräsentiert wird, begrenzt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer TCP1- oder TCP2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
In Bezug auf TCP1 oder TCP2, ist der konstitutive Promotor vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, welche im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 5 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 5 repräsentiert (Siehe Tabelle 2b im hierin beschriebenen Abschnitt ”Definitionen” für weitere Beispiele von konstitutiven Promotoren). Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der konstitutive Promotor vorzugsweise ein ”High Mobility Group Protein” (HMGP)-Promotor. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, welche im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 6 ist, wobei der konstitutive Promotor am stärksten bevorzugt beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 6 repräsentiert.
Es sollte auch klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die Epsin-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 43, beschränkt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer Epsinlike-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
Ferner sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf eine Nukleinsäuresequenz, welche das IPPT-Polypeptid codiert, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 143, begrenzt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer IPPT-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz unter der Steuerung durch einen samenspezifischen Promotor begrenzt.
Es sollte außerdem klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die SHR-Polypeptid codierende Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 208, beschränkt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer SHR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
In Bezug auf Epsin-like-Sequenzen ist der konstitutive Promotor vorzugsweise ein GOS2-Promotor, bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, welche im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 45 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 45 repräsentiert. Siehe Tabelle 2 im hierin beschriebenen Abschnitt ”Definitionen” für weitere Beispiele von konstitutiven Promotoren.
In Bezug auf IPPT ist eine der Steuerungssequenzen eines Konstrukts vorzugsweise ein samenspezifischer Promotor. Ein Beispiel eines samenspezifischen Promotors ist ein Dehydrin-Promotor, vorzugsweise ein Reis-Dehydrin-Promotor, weiter bevorzugt ein Dehydrin-Promotor, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 204. Alternativ, ist der samenspezifische Promotor ein Proteinaseinhibitor-Promotor, vorzugsweise ein Reis-Proteinaseinhibitor-Promotor, weiter bevorzugt ein Proteinaseinhibitor-Promotor, wie durch SEQ ID NR: 205 repräsentiert.
Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Weitere regulatorische Elemente können transkriptionelle sowie translationale Enhancer einschließen. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Terminator- und Enhancersequenzen, welche zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Außerdem kann eine Intron-Sequenz an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder in der codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert, wie es im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben ist. Andere Steuerungssequenzen (neben Promotor, Enhancer, Silencer, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Derartige Sequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt oder können von ihm ohne weiteres erhalten werden.
Die genetischen Konstrukte der Erfindung können ferner eine Replikationsursprung-Sequenz enthalten, welche für die Beibehaltung und/oder Replikation in einem spezifischen Zelltyp erfordert wird. Ein Beispiel besteht in dem Fall, dass ein genetisches Konstrukt in einer Bakterienzelle als ein episomales genetisches Element (z. B. Plasmid- oder Cosmid-Molekül) beibehalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den f1-ori und colE1 ein.
Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie in den Verfahren der Erfindung verwendet, und/oder die Selektion von transgenen Pflanzen, welche diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Deshalb kann das genetische Konstrukt gegebenenfalls ein selektierbares Markergen umfassen. Selektierbare Marker sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markerentfernung sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Einbringen und die Expression, in einer Pflanze, von einer beliebigen Nukleinsäure, codierend ein TCP1- oder TCP2- oder ein Epsin-like-Polypeptid, wie hierin oben definiert.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Einbringen und die Expression, in einer Pflanze, von einer beliebigen Nukleinsäure, codierend ein SHR-Polypeptid, wie hierin oben definiert, und das Kultivieren der Pflanzen unter Bedingungen mit sub-optimaler Nährstoffverfügbarkeit umfasst.
Im Genaueren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem (Samen) ertrag, bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder Pflanzenzelle, einer TCP1- oder TCP2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines TCP1- oder TCP2-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
In Bezug auf Epsin-like-Sequenzen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder Pflanzenzelle, einer Epsin-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines Epsin-like-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Einbringen und die Expression, in den Samen einer Pflanze, von einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, codierend ein IPPT-Polypeptid, wie hierin oben definiert, umfasst.
In Bezug auf IPPT stellt die vorliegende Erfindung im Genaueren ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle, einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein IPPT-Polypeptid, unter der Steuerung eines samenspezifischen Promotors; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Nukleinsäuresequenz von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen sein, die zum Codieren eines IPPT-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem (Samen) ertrag bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder Pflanzenzelle, einer SHR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen mit sub-optimaler Nährstoffverfügbarkeit.

In Bezug auf SHR stellt die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhtem TKW im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Einbringen und die Expression, in einer Pflanze, von einer beliebigen Nukleinsäure, codierend ein SHR-Polypeptid, wie hierin oben definiert, und das Kultivieren der Pflanzen unter nicht-nährstofflimitierenden Bedingungen. Im Genaueren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhtem TKW bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder Pflanzenzelle, einer SHR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter nicht-nährstofflimitierenden Bedingungen.

Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines SHR-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich Einbringung in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” ist hierin ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann auf dem Gebiet vertraut ist. Geeignete Verfahren können in den oben erwähnten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer gefunden werden.
Im Allgemeinen werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen, nach der Transformation, hinsichtlich des Vorhandenseins eines oder mehrerer Marker selektiert, welche von, mit dem Gen von Interesse cotransferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen codiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial, in der Regel, selektiven Bedingungen unterworfen, so dass transformierte Pflanzen von nicht-transformierten Pflanzen unterschieden werden können. Zum Beispiel können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und nach einer anfänglichen Wachstumsperiode einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterzogen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Kultivieren der Samen, nötigenfalls nach einer Sterilisierung, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ dazu durchrastert man die transformierten Pflanzen hinsichtlich des Vorhandenseins eines selektierbaren Markers, wie etwa denjenigen, welche oben beschrieben sind.
Im Anschluss an DNA-Transfer und Regeneration können die vermeintlich transformierten Pflanzen außerdem zum Beispiel unter Anwendung von Southern-Analyse hinsichtlich des Vorhandenseins des Gens von Interesse, der Kopienzahl und/oder der genomischen Organisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich dazu können die Expressionsspiegel der neu eingebrachten DNA unter Anwenden von Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei diese beiden Techniken dem Fachmann mit Durchschnittskenntnissen auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
Die erzeugten, transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Methoden vermehrt werden, wie etwa durch klonale Propagation oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder T1) geselbstet, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann durch klassische Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten, transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen einnehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nicht-transformierten Zellen; klonale Transformanten (z. B. wobei alle Zellen transformiert sind, um die Expressionskassette zu enthalten); Propfungen von transformierten und nicht-transformierten Geweben (z. B. in Pflanzen, in denen ein transformierter Wurzelstock an einen nicht-transformierten Spross gepropft wird) sein.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich in deutlicher Weise auf eine beliebige Pflanzenzelle oder Pflanze, welche durch ein beliebiges der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie auf alle Pflanzenteile und Fortpflanzungskeime bzw. Verbreitungseinheiten davon. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner dahingehend, dass die Nachkommenschaft eines/einer primären transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, welche(s) durch ein beliebiges der zuvor erwähnten Verfahren hergestellt worden ist, beinhaltet ist, wobei die einzige Anforderung darin besteht, dass die Nachkommen dieselben genotypischen und/oder phänotypischen Merkmal(e) aufzeigen, wie diejenigen, welche von der Elternform in den Verfahren gemäß der Erfindung hervorgebracht werden.
Die Erfindung umfasst auch Wirtszellen, enthaltend eine isolierte Nukleinsäure, codierend ein TCP1- oder TCP2-, oder ein Epsin-like-, oder ein SHR-Polypeptid, wie hierin oben definiert. Bevorzugte Wirtszellen gemäß der Erfindung sind Pflanzenzellen. In Hinsicht auf IPPT umfasst die Erfindung auch Wirtszellen, enthaltend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, codierend ein IPPT-Polypeptid, wie hierin oben definiert, die funktionsfähig mit einem samenspezifischen Promotor verbunden ist. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, welche in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind, im Prinzip, in vorteilhafter Weise alle Pflanzen, welche zum Synthetisieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptide in der Lage sind.
Die Verfahren der Erfindung sind in vorteilhafter Weise auf eine beliebige Pflanze anwendbar. Zu Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäumen oder Sträuchern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Nutzpflanze. Zu Beispielen von Nutzpflanzen zählen Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Alfalfa, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt ist die Pflanze eine monokotyledone Pflanze. Zu Beispielen von monokotyledonen Pflanzen zählt Zuckerrohr. Weiter bevorzugt ist die Pflanze ein Getreide. Zu Beispielen von Getreiden zählen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf erntefähige Teile einer Pflanze, wie etwa, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stengel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet, vorzugsweise direkt abgeleitet sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, 01, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
In Bezug auf IPPT erstreckt sich die Erfindung ebenfalls auf erntefähige Teile einer Pflanze, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz, codierend ein IPPT (wie hierin oben definiert), welche funktionsfähig mit einem samenspezifischen Promotor verbunden ist, umfassen, wie etwa, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stengel, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet, vorzugsweise direkt abgeleitet sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuresequenzen oder Genen, oder Genprodukten, sind im Fachgebiet gut dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
Gemäß eines bevorzugten Merkmals der Erfindung, ist die modulierte Expression eine erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen, oder Genprodukten, sind im Fachgebiet gut dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
Wie oben erwähnt, erfolgt ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, codierend ein TCP1- oder TCP2- oder ein Epsin-like- oder ein SHR-Polypeptid, durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, codierend ein TCP1- oder TCP2- oder ein Epsin-like- oder ein SHR-Polypeptid; oder ein bevorzugtes Verfahren zur Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein IPPT-Polypeptid, erfolgt durch Einbringen und Exprimieren von einer Nukleinsäuresequenz, welche ein IPPT-Polypeptid codiert, in den Samen einer Pflanze; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften, auch unter Verwendung anderer gut bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, codierend TCP1- oder TCP2- oder ein Epsin-like-, oder ein SHR-Polypeptide, wie hierin beschrieben, sowie die Verwendung dieser TCP1- oder TCP2- oder eines Epsin-like-, oder eines SHR-Polypeptide(s) in der Steigerung beliebiger der bereits erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, codierend IPPT-Polypeptide, wie hierin beschrieben, sowie die Verwendung dieser IPPT-Polypeptide in der Erhöhung beliebiger der zuvor erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen unter normalen Wachstumsbedingungen, unter abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen (vorzugsweise osmotischen Stress-Wachstumsbedingungen) und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit.
Nukleinsäuren, codierend TCP1 oder TCP2 oder ein Epsin-like-, oder ein IPPT- oder ein SHR-Polypeptid, die hierin beschrieben sind, oder die TCP1- oder TCP2- oder die Epsin-like- oder die IPPT- oder ein SHR-Polypeptide selbst, können Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein TCP1 oder TCP2 oder ein Epsin-like- oder ein IPPT- oder ein SHR-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene, oder die TCP1- oder TCP2- oder die Epsin-like- oder die IPPT-, oder ein SHR-Polypeptide selbst, können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften oder erhöhtem TKW, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
Allelische Varianten einer/eines TCP1- oder TCP2-, oder ein Epsin-like-, oder ein SHR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure/Gens können ebenfalls Anwendung in Markerunterstützten Züchtungsprogrammen finden. Solche Züchtungsprogramme erfordern machmal das Einbringen von allelischer Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese angewandt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Sammlung von allelischen Varianten von, unabsichtlich verursachtem, sogenannten ”natürlichen” Ursprung beginnen. Die Identifizierung allelischer Varianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von höherwertigen allelischen Varianten der betreffenden Sequenz, welche einen erhöhten Ertrag ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen, die verschiedene allelische Varianten der betreffenden Sequenz enthalten, ausgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte beinhalten das Kreuzen von Pflanzen, in denen die höherwertige allelische Variante identifiziert worden ist, mit einer anderen Pflanze. Dies könnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
Allelische Varianten einer ein IPPT-Polypeptid codierenden Gen/Nukleinsäuresequenz können ebenfalls Anwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Solche Züchtungsprogramme erfordern machmal das Einbringen von allelischer Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese angewandt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Sammlung von allelischen Varianten von, unabsichtlich verursachtem, sogenannten ”natürlichen” Ursprung beginnen. Die Identifizierung allelischer Varianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von höherwertigen allelischen Varianten der betreffenden Sequenz, welche erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen, die verschiedene allelische Varianten der betreffenden Sequenz enthalten, ausgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte beinhalten das Kreuzen von Pflanzen, in denen die höherwertige allelische Variante identifiziert worden ist, mit einer anderen Pflanze. Dies könnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
Nukleinsäuren, die TCP1 oder TCP2 oder Epsin-like- oder ein IPPT-, oder ein SHR-Polypeptide codieren, können ebenfalls als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, sowie als Marker für mit diesen Genen gekoppelte Merkmale verwendet werden. Derartige Informationen können in der Pflanzenzucht nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwicklen. Eine derartige Verwendung von TCP1 oder TCP2 oder ein Epsin-like, oder ein IPPT, oder ein SHR-Polypeptid codierenden Nukleinsäuren erfordert lediglich eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Die TCP1 oder TCP2 oder ein IPPT, oder das Epsin-like- oder ein SHR-Polypeptid codierenden Nukleinsäuren können als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus(RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J., Fritsch, EF., und Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsverdauter pflanzlicher genomischer DNA können mit den TCP1 oder TCP2 oder den Epsin-like, oder eine IPPT oder einen SHR codierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die resultierenden Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181) unterzogen werden, um eine genetische Karte zu erstellen. Darüber hinaus können die Nukleinsäuren verwendet werden, um Southern-Blots zu sondieren, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs aus einer Auswahl von Individuen enthalten, welche Eltern und Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird aufgezeichnet und verwendet, um die Position der TCP1 oder TCP2 oder das Epsin-like- oder ein IPPT- oder ein SHR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in der genetischen Karte zu berechnen, welche zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
Die Herstellung und Anwendung von Pflanzengen-abgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41, beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwenden der oben geschilderten Methodik oder Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Interkross-Populationen, Rückkreuzungs-Populationen, wahllos gekreuzte Populationen, nah-isogene Linien und andere Individuengruppierungen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Die Nukleinsäuresonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al., in: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346, und darin zitierte Literaturstellen).
In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden bei der direkten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH)-Kartierung verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl derzeitige Verfahren zur FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone begünstigen (mehrere kb bis einige hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), können Verbesserungen der Empfindlichkeit eine Ausführung der FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden erlauben.
Eine Vielzahl von auf Nukleinsäureamplifikation basierenden Verfahren zur genetischen und physikalischen Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotid-Verlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping bzw. Bestrahlungs-Hybridkartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure verwendet, um Primerpaare zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen zu entwerfen und herzustellen. Das Entwerfen derartiger Primer ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. In Verfahren unter Anwendung von PCR-basierter genetischer Kartierung kann es notwendig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften kombiniert werden, wie etwa weiteren ertragssteigernden Eigenschaften, Toleranz gegen abiotische und biotische Stressformen, Toleranz gegen Herbizide, Insektizide, Eigenschaften, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
Beschreibung der Figuren
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben, in denen:
1 ein multiples Alignment von TCP1-Polypeptiden ist, wobei die TCP-Domäne und Domäne A, B und C eingekastet sind.
2 ein multiples Alignment von TCP2-Polypeptiden ist, wobei die TCP-Domäne und die Domänen 1, 2, 3, 4 und 5 eingekastet sind.
3 repräsentiert die Domänenstruktur von SEQ ID NR: 44, wobei die ENTH-Domäne, wie identifiziert in SMART, in Fettdruck angegeben ist, und die konservierten Motive 1 bis 5 unterstrichen formatiert sind.
4 repräsentiert ein multiples Alignment von verschiedenen Epsin-like-Proteinsequenzen. Die Datenbank-Zugangsnummern werden als Identifikatoren verwendet.
5 zeigt einen phylogenetischen Baum von eukaryotischen Proteinen, die eine ENTH- oder ANTH-Domäne umfassen (Holstein und Oliviusson 2005). Der aminoterminale Teil der Proteine (200 Aminosäuren) wurde unter Verwendung von ClustaIW 1.82 aligniert, und das Ausgabeergebnis wurde in DrawTree (PHYLIP-Paket) verwendet. SEQ ID NR: 44 lässt sich in der Gruppe der Pflanzen-ENTHs einordnen.
6 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression in Oryza sativa einer Epsinlike codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotor (pGOS2).
7 zeigt ausführlich Beispiele von Sequenzen, die in der Durchführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
8 repräsentiert schematisch die zwei hauptsächlichen Cytokinin-Biosynthesewege: (a) den Adenylat-IPT-Weg unter Verwendung von AMP, ADP, oder ATP, und DMAPP oder HMBDP, und (b) den tRNA-IPT-Weg unter Verwendung von tRNA und DMAPP. Nach Yevdakova und von Schwartzenberg (2007) Planta 226: 683–695.
9 zeigt ein ausführliches Modell der Isoprenoid-Cytokinin-Biosynthesewege, nach Sakakibara (2006) Annu. Rev. Plant Biol. 57. 431–449. Die tRNA-IPT ist durch einen schwarzen Pfeil in der oberen rechten Ecke angezeigt, das spezifische Cytokinin-Endprodukt (cZ) dieses Weges ist ebenfalls durch einen schwarzen Pfeil in der unteren rechten Ecke angezeigt.
10 zeigt ein mittels AlignX (aus Vektor NTI 10.3, Invitrogen Corporation) durchgeführtes Mehrfach-Sequenzalignment der IPPT-Polypeptide von Tabelle A4. Das N-terminale ATP/GTP-Bindungsstellen-Motiv A (P-loop), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 199, das 'Konservierte Motiv I' DSR(Q/L)(V/L/I), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 200, das 'Konservierte Motiv II' (N/D/S/T)(I/V)GTAKP(T/S), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 201, das 'Konservierte Motiv III' L(V/A/I)GG(S/T)GLY, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 202, und das 'Konservierte Motiv IV' F/Y/L)AK(R/K/Q)Q(R/K/M)TWFR, sind eingekastet. Das vermutete Zinkfinger-Motiv C2H2 (C-X2-C-X(12,18)-H-X5-H, das in eukaryotischen tRNA-IPTs gefunden wird, ist mit einer Klammer markiert, und die konservierten Cys- und His-Reste darin sind eingekastet.
11 zeigt den binären Vektor für erhöhte Expression, in den Samen von Oryza sativa, von einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein IPPT-Polypeptid, unter der Steuerung entweder eines samenspezifischen Dehydrin-Promotors oder eines samenspezifischen Proteinaseinhibitor-Promotors aus Reis.
12 zeigt ausführlich Beispiele von Sequenzen, die in der Durchführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
13 zeigt die Struktur von GRAS-Proteinen mit den für diese Familie typischen 5 Motiven.
14: 'Neighbour-joining'-Baum von GRAS- und SHR-Proteinen. GRAS-Proteine aus Reis, Arabidopsis und SHR-verwandte Proteine aus den verschiedenen Organismen wurden mit Hilfe von MUSCLE aligniert. Ein Neighbour-joining-Baum wurde mit CLUSTALX erstellt. Eine ”Bootstrap”-Analyse wurde während 100 Iterationen durchgeführt. Der Bootstrap-Träger ist nur für die Hauptknoten gezeigt. Die SHR-verwandten Proteine sind angegeben. A. thaliana: Arabidopsis thaliana; E. grandis: Eucalyptus grandis; G. max: Glycine max; L. sativa: Latuca sativa; M trucatula: Medicago truncatula; O. sativa: Oryza sativa; P. taeda: Pinus taeda; P. patens: Physcomitrella patens; P. trichocarpa: Populus trichocarpa; R. communis: Ricinus communis; S. tuberosum: Solanum tuberosum; V. vinifera: Vitis vinifera; Z. mays: Zea mays; part: partielle Sequenz.
15 zeigt den Prozentsatz der Sequenzidentität für Mitglieder der GRAS-Familie, wobei die Einträge über der horizontalen Linie Mitglieder der SHR Familie angeben. Der SHR-Zweig ist in Landpflanzen, einschließlich Moosen und Gymnospermen, hoch konserviert. Die SHR-Proteine in diesem Zweig haben mehr als 41% Identität miteinander gemeinsam, verglichen mit weniger als 33% zu den Mitgliedern der anderen Zweige.
16 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression in Oryza sativa von einer SHR-codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2).
17 zeigt ausführlich Beispiele von Sequenzen, die in der Durchführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
In einer Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf die nachfolgend zusammengefassten Gegenstände:

Punkt 1: Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das TCP1-Polypeptid umfasst:

(i) eine TCP-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu der TCP-Domäne von einer beliebigen der Sequenzen, die in 1 angegeben sind; und
(ii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne A von einer beliebigen der Sequenzen, die in 1 angegeben sind; und
(iii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne B von einer beliebigen der Sequenzen, die in 1 angegeben sind; und
(iv) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne C von einer beliebigen der Sequenzen, die in 1 angegeben sind,

(i) eine TCP-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu der TCP-Domäne von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind; und
(ii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 1 von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind; und
(iii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 2 von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind; und
(iv) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 3 von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind.

1

2

(i) Nukleinsäuresequenz, welche ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid codiert;
(ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (i) in der Lage sind; und gegebenenfalls
(iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder Pflanzenzelle, von einer Nukleinsäuresequenz, welche ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid codiert; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

(i) Motiv 1: (V/I)(L/R)(D/E)AT(S/D/N)(N/D/E/S)E(P/S)WGPHG(T/S/E) (SEQ ID NR: 48),
(ii) Motiv 2: F(Q/E)(Y/F)(I/L/V/R/K)(D/E)(S/P/A)(S/G/N/Q/R)G(R/K)D(Q/V/A/H/E)G(S/N/L/I/V)NVR (SEQ ID NR: 49),
(iii) Motiv 3: (E/S/A/Q)(V/I/E/A)R(Q/E/D/N)KA(A/L/V/E)(A/V/S/R/K)(N/T)(R/A)(D/E/N/G)K (SEQ ID NR: 50)
(iv) Motiv 4: WAD(T/S)LSRGL(V/I) (SEQ ID NR: 51)
(v) Motiv 5: L(A/S)D(I/V)G(I/V)(D/V)(F/G)(D/E/P/G) (SEQ ID NR: 52)

(i) Nukleinsäure, codierend ein Epsin-like-Polypeptid, wie definiert in den Punkten 24 oder 25;
(ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
(iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, codierend ein Epsin-like-Polypeptid, wie definiert in Punkt 24 oder 25; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

a) ein Nukleinsäuremolekül, codierend das Polypeptid, gezeigt in SEQ ID NR: 112, SEQ ID NR: 138 und SEQ ID NR: 142;
b) ein Nukleinsäuremolekül, gezeigt in SEQ ID NR: 111, SEQ ID NR: 137 und SEQ ID NR: 141;
c) ein Nukleinsäuremolekül, das als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes aus einer Polypeptidsequenz, abgebildet in SEQ ID NR: 112, SEQ ID NR: 138 und SEQ ID NR: 142, abgeleitet werden kann und gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
d) ein Nukleinsäuremolekül das, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu einer beliebigen der in SEQ ID NR: 111, SEQ ID NR: 137 und SEQ ID NR: 141 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist und gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
e) ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% oder mehr Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz des von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) codierten Polypeptids codiert und gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
f) Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
g) ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid gewonnen wurden, welches von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) codiert wird;
h) ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, das die Consensus-Sequenz oder ein oder mehrere Polypeptid-Motive, wie gezeigt in Motiv 1 (entsprechend zu SEQ ID NR: 6), Motiv 2 (entsprechend zu SEQ ID NR: 7), Motiv 3 (entsprechend zu SEQ ID NR: 8), Motiv 4 (entsprechend zu SEQ ID NR: 9) oder Motiv 5 (entsprechend zu SEQ ID NR: 10), umfasst;
i) Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, das erhalten wird durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer, die in SEQ ID NR: 46 (prm09481) und SEQ ID NR: 47 (prm09482) gezeigt sind, und
j) ein Nukleinsäuremolekül, das erhältlich ist durch Screening einer geeigneten Nukleinsäure-Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, umfassend eine komplementäre Sequenz von einem Nukleinsäuremolekül von (a) oder (b), oder mit einem Fragment davon, aufweisend mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt von einem Nukleinsäuremolekül, das komplementär ist zu einer Nukleinsäuremolekülsequenz, welche in (a) bis (e) charakterisiert ist.

(a) eine Nukleinsäuresequenz, codierend ein IPPT-Polypeptid, wie definiert in einem beliebigen der Punkte 47 bis 52;
(b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationssequenz.

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle, von einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein IPPT-Polypeptid, wie in einem beliebigen der Punkte 47 bis 52 definiert, unter der Steuerung eines samenspezifischen Promotors; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

2

(i) Nukleinsäure, codierend ein SHR-Polypeptid, wie definiert in Punkt 75;
(ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
(iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein SHR, wie definiert in Punkt 75, codiert; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit.

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein SHR, wie definiert in Punkt 75, codiert; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter nicht-nährstofflimitierenden Bedingungen.

Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche alleinig der Veranschaulichung dienen. Mit den folgenden Beispielen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung vollständig zu definieren oder anderweitig zu begrenzen.
DNA-Manipulation: Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) und Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
Beispiel 1: Identifikation von Sequenzen, die mit der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind
Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen identifiziert, wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Das Programm wurde eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. Zum Beispiel wurde das Polypeptid, welches von der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure codiert wird, für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet, und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen können die Vorgabeparameter angepasst werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann der E-Wert erhöht werden, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise können kurze, fast exakte Übereinstimmungen ermittelt werden.
Die Liste A1 gibt Nukleinsäuresequenzen an, die mit SEQ ID NR: 1 verwandt sind, und die Liste A2 gibt Nukleinsäuresequenzen an, die mit SEQ ID NR: 3 verwandt sind.
Der Ausdruck ”Liste A1”, wie hierin verwendet, ist äquivalent und austauschbar mit ”Tabelle A1”.
Der Ausdruck ”Liste A2”, wie hierin verwendet, ist äquivalent und austauschbar mit ”Tabelle A2”.
Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A” ist als den Inhalt von Tabelle A1, Tabelle A2, Tabelle A3, Tabelle A4 und/oder Tabelle A5 bezeichnend aufzufassen.
Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A1” ist als den Inhalt von Tabelle A1 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A2” ist als den Inhalt von Tabelle A2 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A3” ist als den Inhalt von Tabelle A3 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A4” ist als den Inhalt von Tabelle A4 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A5” ist als den Inhalt von Tabelle A5 angebend aufzufassen. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle A” die Tabelle A1. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle A” die Tabelle A2. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle A” die Tabelle A3. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle A” die Tabelle A4. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle A” die Tabelle A5.
Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle B” ist als den Inhalt von Tabelle B1, Tabelle B2, Tabelle B3 und/oder Tabelle B4 bezeichnend aufzufassen.
Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle B1” ist als den Inhalt von Tabelle B1 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle B2” ist als den Inhalt von Tabelle B2 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle B3” ist als den Inhalt von Tabelle B3 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle B4” ist als den Inhalt von Tabelle B4 angebend aufzufassen. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle B” die Tabelle B1. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle B” die Tabelle B2. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle B” die Tabelle B3. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle B” die Tabelle B4.

Tabelle A1. Sequenzen, die mit SEQ ID NR: 1 verwandt sind

Name	Planzenquelle	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Protein SEQ ID NR:
Ms_TCP_sugar	Medicago sativa	1	2
AtTCP7	Arabidopsis thaliana	7	8
OsTCP4	Oryza sativa	9	10
OsTCP10	Oryza sativa	11	12
Pt\TCP	Populus trichocarpa	13	14
SI\TCP	Solanum lycopersicum	15	16
Vv\CAO70167	Vitis vinifera	17	18

Tabelle A2. Sequenzen, die mit SEQ ID NR: 3 verwandt sind

Name	Planzenquelle	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Protein SEQ ID NR:
Mt_TCP2_sugar	Medicago truncatula	3	4
Am\TCP\CAE45599	Antirrhinum majus	19	20
AT3G47620	Arabidopsis thaliana	21	22
AtTCP15	Arabidopsis thaliana	23	24
Gh\TCP\AAD48836	Gossipum hirsutum	25	26
OSTCP12	Oryza sativa	27	28
OsTCP5	Oryza sativa	29	30
Pt\TCP\scaff_124.66\[1298]\f\[3 1-1218]	Populus trichocarpa	31	32
Sd\TCP\AAT38718	Solanum demissum	33	34
Vv\TCP\AAD48836	Vitis vinifera	35	36
Vv\TCP\CAO62540	Vitis vinifera	37	38

In Bezug auf Epsin-like-Sequenzen, gibt die Tabelle A3 eine Liste von Nukleinsäuresequenzen an, die mit der Nukleinsäuresequenz verwandt sind, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Tabelle A3: Beispiele von Epsin-like-Polypeptiden:

Pflanzenquelle	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Protein SEQ ID NR:
Arabidopsis thaliana	43	44
Arabidopsis thaliana	65	66
Vitis vinifera	67	68
Oryza sativa	69	70
Oryza sativa	71	72
Avena fatua	73	74
Medicago truncatula	75	76
Arabidopsis thaliana	77	78
Arabidopsis thaliana	79	80
Arabidopsis thaliana	81	82
Arabidopsis thaliana	83	84
Oryza sativa	85	86
Arabidopsis thaliana	87	88
Vitis vinifera	89	90
Arabidopsis thaliana	91	92
Arabidopsis thaliana	93	94
Vitis vinifera	95	96
Chlamydomonas reinhardtii	97	98
Ostreococcus lucimarinus	99	100
Oryza sativa	101	102
Oryza sativa		103
Oryza sativa		104
Oryza sativa	105	106
Oryza sativa		107
Oryza sativa	108	109
Oryza sativa		110
Brassica napus	111	112
Glycine max	113	114
Hordeum vulgare	115	116
Medicago truncatula	117	118
Medicago truncatula	119	120
Physcomitrella patents	121	122
Physcomitrella patents	123	124
Physcomitrella patents	125	126
Populus trichocarpa	127	128
Populus trichocarpa	129	130
Populus trichocarpa	131	132
Solanum lycopersicum	133	134
Triticum aestivum	135	136
Triticum aestivum	137	138
Arabidopsis thaliana	139	140
Zea mays	141	142

In manchen Fällen sind verwandte Sequenzen von Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Die Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) kann verwendet werden, um derartige verwandte Sequenzen, entweder durch Stichwort-Suche oder durch Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse, zu identifizieren.

In Bezug auf IPPT gibt die Tabelle A4 eine Liste von Nukleinsäuresequenzen an, die mit der Nukleinsäuresequenz verwandt sind, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Tabelle A4: Beispiele von IPPT-Polypeptidsequenzen und codierende Nukleinsäuresequenzen:

Name	Quellen-Organismus	Öffentliche Datenbank-Zugangsnummer	Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR:	Polypeptidsequenz SEQ ID NR:
Synec_IPPT	Synechococcus sp. PCC 7942	U30252.3	143	144
Acama_IPPT (miaA)	Acaryochloris marina MBIC11017	CP000828	145	146
Anava_IPPT	Anabaena variabilis ATCC 29413	CP000117	147	148
Glovi_IPPT	Gloeobacter violaceus PCC 7421	BA000045	149	150
Micae_IPPT	Microcystis aeruginosa PCC 7806	AM778958	151	152
Nossp_IPPT	Nostoc sp. PCC 7120 DNA	BA000019	153	154
Proma1375_IPPT	Prochlorococcus marinus subsp. marinus str. CCMP1375	AE017126	155	156
Proma9211_IPPT	Prochlorococcus marinus str. MIT 9211	CP000878	157	158
Proma9215_IPPT	Prochlorococcus marinus str. MIT 9215	CP000825	159	160
Proma9301_IPPT	Prochlorococcus marinus str. MIT 9301	CP000576	161	162
Proma9303_IPPT	Prochlorococcus marinus str. MIT 9303	CP000554	163	164
Proma9312_IPPT	Prochlorococcus marinus str. MIT 9312	CP000111	165	166
Proma9313_IPPT	Prochlorococcus marinus MIT9313	BX572095	167	168
Proma9515_IPPT	Prochlorococcus marinus str. MIT 9515	CP000552	169	170
Proma9601_IPPT	Prochlorococcus marinus str. AS9601	CP000551	171	172
PromaMED4_IPPT	Prochlorococcus marinus MED4	BX548174	173	174
PromaNATL1A_IPPT	Prochlorococcus marinus str. NATL1A	CP000553	175	176
PromaNATL2A_IPPT	Prochlorococcus marinus str. NATL2A	CP000095	177	178
SynecJA-3_IPPT	Synechococcus sp. JA-3-3Ab	CP000239	179	180
Synec307_IPPT	Synechococcus sp. RCC307	CT978603	181	182
Synec6803_IPPT	Synechocystis sp. PCC 6803 DNA	BA000022	183	184
Synec7803_IPPT	Synechococcus WH7803	CT971583	185	186
Synec8102_IPPT	Synechococcus sp. WH8102	BX569689.1	187	188
Synec9311_IPPT	Synechococcus sp. CC9311	CP000435	189	190
Synec9605_IPPT	Synechococcus sp. CC9605	CP000110	191	192
Synec9902_IPPT	Synechococcus sp. CC9902	CP000097	193	194
Theel_IPPT	Thermosynechococcus elongatus BP-1	BA000039	195	196
Trier_IPPT	Trichodesmium erythraeum IMS101	CP000393	197	198

In manchen Fällen sind verwandte Sequenzen von Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Die Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) kann verwendet werden, um derartige verwandte Sequenzen, entweder durch Stichwort-Suche oder durch Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäuresequenz oder Polypeptidsequenz von Interesse, zu identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für jeweilige Organismen erstellt worden, wie etwa vom Joint Genome Institute.

In Bezug auf SHR, gibt die Tabelle A5 eine Liste von Nukleinsäuresequenzen an, die mit der Nukleinsäuresequenz verwandt sind, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Tabelle A5: Beispiele von SHR-Polypeptiden

Name	Herkunfts-Spezies	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Polypeptid SEQ ID NR:
	Arabidopsis thaliana	208	209
At4g37650	Arabidopsis thaliana	210	211
TA13018_3352	Pinus taeda	212	213
22633_part	Physcomitrella patents	214	215
14911_part	Physcomitrella patents	216	217
Os03g31880	Oryza sativa	218	219
Os07g39820	Oryza sativa	220	221
US200510879.113	Zea mays	222	223
TA7750_4236	Lactuca sativa	224	225
AC147000	Medicago truncatula	226	227
TC153082	Solanum tuberosum	228	229
WO2005001020_215	Eucalyptus grandis	230	231
AM431974	Vitis vinifera	232	233
scaff_186.17	Populus trichocarpa	234	235
TA2955_3988	Ricinus communis	236	237
US2004031072.68433	Glycine max	238	239
CT027662	Medicago truncatula	240	241

Beispiel 2: Alignment von TCP-Polypeptidsequenzen
Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde unter Verwendung des Programms AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weitverbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert (gap open penalty) ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert (gap extension penalty) von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt. Die TCP1-Polypeptide sind in 1 und die TCP2-Polypeptide in 2 aligniert.
Ein phylogenetischer Baum von TCP-Polypeptiden (1 und 2) wurde mit Hilfe eines Neighbour-joining-Clusterungsalgorithmus erstellt, wie er im Programm AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) zur Verfügung gestellt wird.
In Bezug auf die Epsin-like-Sequenzen sind die Vorgabewerte für den Lückenöffnungsstrafwert ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Gonnet (wenn Polypeptide aligniert werden). Zur weiteren Optimierung des Alignments kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden. Die Sequenzkonservierung zwischen Epsin-like-Polypeptiden liegt im Wesentlichen in der N-terminalen ENTH-Domäne der Polypeptide und im C-terminalen Teil vor, wobei der zentrale Teil üblicherweise hinsichtlich Sequenzlänge und -zusammensetzung variabler ist. Die Epsin-like-Polypeptide sind in 2 aligniert.
Ein Mehrfach-Sequenzalignment aller IPPT-Polypeptidsequenzen in Tabelle A4 wurde unter Verwendung des AlignX-Algorithmus (aus Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation) durchgeführt. Die Resultate des Alignments sind in der 3 der vorliegenden Patentanmeldung gezeigt. Das N-terminale ATP/GTP-Bindungsstellen-Motiv A (P-loop), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 199, das Konservierte Motiv I DSR(Q/L)(V/L/I), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 200, das Konservierte Motiv II (N/D/S/T)(I/V)GTAKP(T/S), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 201, das Konservierte Motiv III L(V/A/I)GG(S/T)GLY, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 202, und das Konservierte Motiv IV F/Y/L)AK(R/K/Q)Q(R/K/M)TWFR, sind eingekastet. Das vermutete Zinkfinger-Motiv C2H2 (C-X2-C-X(12,18)-H-X5-H), das in eukaryotischen tRNA-IPTs vorgefunden wird, ist mit einer Klammer markiert, und die konservierten Cys- und His-Reste darin sind eingekastet.
In Bezug auf SHR, wurde ein Alignment von Polypeptidsequenzen unter Verwendung des Programms AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weitverbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt.
In Hinsicht auf SHR-Sequenzen wurde ein phylogenetischer Baum von GRAS-Polypeptiden (14) erstellt. Ein 'Neighbour-joining'-Baum von GRAS- und SHR-Proteinen wurde unter Verwendung von GRAS-Proteinen aus Reis, Arabidopsis erstellt, und SHR-verwandte Proteine aus den verschiedenen Organismen wurden mit Hilfe von MUSCLE aligniert. Ein Neighbour-joining-Baum wurde mit CLUSTALX erstellt. Eine Bootstrap-Analyse wurde während 100 Iterationen durchgeführt. Der Bootstrap-Träger ist nur für die Hauptknoten gezeigt. Die SHR-verwandten Proteine sind angegeben. A. thaliana: Arabidopsis thaliana; E. grandis: Eucalyptus grandis; G. max: Glycine max; L. sativa: Latuca sativa; M trucatula: Medicago truncatula; O. sativa: Oryza sativa; P. taeda: Pinus taeda; P. patens: Physcomitrella patens; P. trichocarpa: Populus trichocarpa; R. communis: Ricinus communis; S. tuberosum: Solanum tuberosum; V. vinifera: Vitis vinifera; Z. mays: Zea mays; -part: partielle Sequenz.
Beispiel 3: Berechnung der globalen prozentualen Identität zwischen Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
In Bezug auf TCP1 oder TCP2, wurden globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
Die im Vergleich verwendeten Parameter waren folgende:
Wertungsmatrix: Blosum 62
Erstlücke: 12
Lückenerweiterung: 2
Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in der Tabelle B für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist unterhalb der Diagonale in Fettdruck angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist oberhalb der Diagonale angegeben (normal formatiert).
Tabelle B: MatGAT-Ergebnisse for globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen.

Tabelle B1: Ms_TCP_SUGAR-Familie (TCP1)

	1	2	3	4	5	6	7
1. SI\TCP		46,4	45,1	40,7	47,2	29,9	33,3
2. pt\TCP	55,4		55,6	49,8	58,3	37,3	40,3
3. Vv\CAO70167	63,2	62,8		55,9	53,1	46,8	46,2
4. Ms_TCP_SUGAR	55,6	64,3	65,0		55,1	38,4	39,0
5. AtTCP7	57,6	66,9	61,6	70,0		37,2	39,1
6. OsTCP10	47,1	49,4	60,7	50,4	50,8		62,0
7. OsTCP4	50,2	50,6	59,2	53,0	53,2	73,5

Tabelle B2: Mt_TCP2_SUGAR-Familie (TCP2)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
1. Am\TCPCAE45599		61,5	46,4	46,4	48,5	48,5	43,3	40,9	44,1	45,2	47,9	48,2
2. Vv\TCP\CAO62540	73,9		46,4	46,4	62,2	50,7	40,6	47,4	47,5	47,0	53,6	54,3
3. Sd\TCPAAT38718	56,8	59,1		100,0	39,9	34,9	35,9	35,7	35,9	34,4	63,2	64,5
4. Gh\TCP\AAD48836	56,8	59,1	100,0		39,9	34,9	35,9	35,7	35,9	34,4	63,2	64,5
5. Vv\TCP\CAO48409	59,3	74,4	58,0	58,0		48,9	38,3	49,8	47,5	44,7	43,1	44,5
6. Mt_TCP2_SUGAR	63,9	65,4	46,9	46,9	60,1		37,0	40,4	44,3	43,8	35,8	36,6
7. AtTCP14	54,6	53,4	45,6	45,6	46,2	52,4		33,5	38,0	39,9	35,5	36,6
8. AtTCP15	57,3	61,6	56,0	56,0	64,0	55,5	45,4		43,0	39,6	36,1	38,5
9. OsTCP12	59,0	60,5	49,6	49,6	58,4	57,5	48,9	51,9		67,0	34,6	37,0
10. OsTCP5	60,0	60,2	46,3	46,3	54,4	62,5	50,5	50,0	75,6		34,8	36,4
11. Pt197953_gw1.IV.3042.1	57,0	63,8	74,5	74,5	62,3	49,0	43,8	54,2	47,3	46,3		88,4
12. Pt266526_gw1.124.176.1	58,3	63,8	75,2	75,2	61,6	48,8	44,6	54,5	47,8	45,9	93,2

Eine MATGAT-Tabelle für lokales Alignment einer spezifischen Domäne, oder Daten über % Identität/Ähnlichkeit zwischen spezifischen Domänen können ebenfalls erstellt werden.
In Bezug auf Epsin-like-Sequenzen, wurden globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
In Bezug auf Epsin-like-Sequenzen waren die im Vergleich verwendeten Parameter:
Wertungsmatrix: Blosum62
Erstlücke: 12
Lückenerweiterung: 2
Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B3 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale in Fettdruck angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben (normal formatiert).

Der Prozentsatz der Identität zwischen den Epsin-like-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, kann so niedrig wie 14% Aminosäureidentität, verglichen zu SEQ ID NR: 44, sein. Tabelle B3: MatGAT-Ergebnisse for globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
1. SEQID2		96,4	59,5	46,1	41,0	40,9	39,5	37,9	43,0	25,0	25,4	25,4	30,7
2. CAB87689	96,5		58,2	45,1	39,9	40,1	38,4	37,2	42,0	25,7	25,5	25,5	30,9
3. CAO43767	73,4	71,6		46,7	42,0	41,5	40,9	39,4	43,8	25,4	27,8	27,8	31,1
4. CAD41810	61,3	61,3	61,8		44,3	67,3	42,4	40,2	95,8	26,6	25,7	25,7	28,8
5. BAD87030	58,8	59,2	58,6	58,9		40,8	88,0	82,2	42,8	24,8	25,0	25,0	27,5
6. AAB68030	56,1	56,1	55,3	76,0	57,5		40,5	39,3	64,3	26,8	26,9	26,9	29,3
7. EAZ13473	57,5	56,3	58,3	58,1	91,2	56,4		91,1	40,8	23,9	23,8	23,8	27,2
8. EAY75756	54,2	53,7	55,7	58,1	89,2	55,3	93,5		38,6	23,2	24,3	24,0	27,7
9. EAY95411	58,5	58,5	59,4	96,3	56,5	73,2	55,6	55,7		25,2	24,2	24,2	26,8
10. ABN08674	36,8	36,6	37,2	35,8	37,8	38,1	36,4	35,8	34,4		50,0	50,1	38,0
11. BAF01674	39,1	38,4	40,7	38,1	38,9	38,5	37,3	38,0	36,6	62,7		99,9	72,1
12. NP_850387	39,1	38,4	40,7	38,1	38,9	38,4	37,3	37,7	36,6	62,7	100,0		72,2
13. BAD44158	42,3	43,7	45,8	43,5	47,2	43,8	46,9	44,4	41,5	45,9	72,2	72,2
14. AAN72258	39,6	38,9	40,7	38,3	38,8	38,4	37,2	37,5	36,9	62,5	99,8	99,8	72,1
15. BAD19387	36,7	36,3	37,1	36,7	37,5	37,6	36,6	36,5	35,2	58,3	58,3	58,3	42,0
16. EAZ25008	36,7	36,3	37,1	36,7	37,5	37,6	36,6	36,5	35,2	58,3	58,3	58,3	42,0
17. CAB91599	33,3	33,6	34,6	34,6	34,5	35,2	34,5	34,1	33,5	59,2	70,5	70,5	50,9
18. CAO45312	37,4	38,2	39,1	38,3	39,7	40,5	38,6	38,9	36,8	58,3	63,6	63,6	47,8
19. AAL24360	33,5	33,6	34,9	34,8	34,5	35,2	34,5	34,0	33,7	59,1	70,4	70,4	50,9
20. AAC64305	34,1	33,4	35,3	31,6	30,7	28,2	31,7	30,7	29,5	24,9	29,5	29,5	41,3
21. CAN66991	33,8	34,0	36,7	35,9	35,6	35,4	33,8	34,8	35,0	56,3	58,7	58,7	49,7
22. XP001701452	38,9	39,7	38,1	36,9	37,1	35,4	38,9	38,7	35,2	29,4	29,1	29,1	38,9
23. XP001419857	20,5	20,3	20,5	18,7	18,5	18,2	19,3	18,8	17,5	12,4	13,5	13,5	18,9

	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23
1. SEQID2	25,9	25,2	25,3	22,7	27,0	22,7	23,9	22,6	23,2	14,3
2. CAB87689	26,0	24,5	24,6	22,9	27,0	22,9	23,6	22,1	23,8	14,0
3. CAO43767	27,8	25,5	25,5	24,1	27,0	24,2	25,5	22,8	24,0	13,9
4. CAD41810	25,6	24,9	25,1	23,8	25,8	23,9	22,7	22,2	22,1	13,1
5. BAD87030	25,0	25,1	25,1	22,5	25,7	22,6	21,2	21,5	23,1	12,9
6. AAB68030	26,9	25,5	25,5	24,1	26,3	24,2	20,7	23,3	22,7	12,2
7. EAZ13473	23,8	23,5	23,5	23,2	25,1	23,3	21,9	20,3	23,9	13,6
8. EAY75756	24,0	24,0	24,0	22,9	25,0	22,9	20,8	20,3	22,3	13,3
9. EAY95411	24,1	23,5	23,8	22,4	24,4	22,4	20,5	21,0	20,8	11,8
10. ABN08674	49,9	43,5	43,5	47,7	47,6	47,3	21,3	44,5	19,1	8,1
11. BAF01674	99,7	46,1	46,0	62,3	50,1	62,2	29,3	43,8	20,1	8,7
12. NP_850387	99,8	46,0	45,9	62,4	50,2	62,3	29,3	43,9	20,1	8,7
13. BAD44158	72,1	33,6	33,6	44,6	38,7	44,6	41,0	35,9	24,8	12,2
14. AAN72258		45,7	45,6	62,2	50,2	62,1	29,2	43,8	20,1	8,7
15. BAD19387	58,1		99,9	40,8	44,7	40,7	20,1	40,7	20,7	8,0
16. EAZ25008	58,1	100,0		40,7	44,6	40,6	20,1	40,6	20,7	8,0
17. CAB91599	70,3	53,9	53,9		43,3	99,9	21,8	38,4	17,9	8,2
18. CAO45312	63,7	56,8	56,8	54,9		43,2	22,6	77,7	20,6	8,9
19. AAL24360	70,2	53,8	53,8	99,9	54,5		21,8	38,3	17,9	8,3
20. AAC64305	29,4	23,9	23,9	23,9	25,7	23,9		18,9	16,2	26,5
21. CAN66991	58,7	52,9	52,9	50,6	81,8	50,6	23,7		19,5	8,7
22. XP001701452	29,1	30,7	30,7	26,6	31,3	26,6	26,2	31,7		14,2
23. XP001419857	13,5	12,4	12,4	11,6	13,5	11,6	43,1	12,9	20,3

In Bezug auf IPPT wurden globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lücken-Erweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
Die im Vergleich verwendeten Parameter waren folgende:
Wertungsmatrix: Blosum62
Erstlücke: 12
Lückenerweiterung: 2
Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B4 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt (unter Ausschluss der partiellen Polypeptidsequenzen).
Der Prozentsatz der Identität zwischen den Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, kann so niedrig wie 39% Aminosäureidentität, verglichen zu SEQ ID NR: 144, sein.
Beispiel 4: Identifizierung von Domänen, enthalten in Polypeptidsequenzen, die bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites” (InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine zum Ableiten von Proteinsignaturen verwenden. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, Panther, ProDom und Pfam, Smart sowie TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, welche viele häufige Proteindomänen und -familien abdecken. Pfam wird am Senner des Sanger Institute in Großbritannien bereitgehalten bzw. gehostet. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien bereitgehalten.

Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 44 repräsentiert, sind in der Tabelle C1 wiedergegeben. Tabelle C1: Ergebnisse des InterPro-Scans (Haupt-Zugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 44.

Datenbank	Zugangsnummer	Zugangsname	Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NR 44
InterPro	IPR001026	Epsin, N-terminal
HMMPfam	PF01417	ENTH	25–148
HMMSmart	SM00273	ENTH	26–152
ProfileScan	PS50942	ENTH	20–152
InterPro	IPR008943	Phosphoinositide-binding clathrin adaptor, N-terminal
superfamily	SSF48473	PI_bind_N	25–238

Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 144 repräsentiert, sind in der Tabelle C2 wiedergegeben. Tabelle C2: Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 144 repräsentiert.

InterPro-Zugangsnummer und -name	Name der integrierten Datenbank	Zugangsnummer in integrierter Datenbank	Zugangsname in integrierter Datenbank
IPR002627 tRNA isopentenyltransferase	BlastProDom	PD004674	MIAA_SYNP7_Q8GIT6;
IPR002627 tRNA isopentenyltransferase	HMMPfam	PF01715.6	IPP transferase
IPR002627 tRNA isopentenyltransferase	HMMTigr	TIGR00174	miaA: tRNA delta(2)isopentenylpyrophosphate
IPR011593 Isopentenyl transferase-like	BlastProDom	PD005388	MIAA_SYNP7_Q8GIT6
IPR non-integrated	tmhmm	PTHR11088	TRNA DELTA(2)-ISOPENTENYLPYROPHOSPHATE TRANSFERASE-RELATED
IPR non-integrated	superfamily	SSF52540	P-loop containing nucleoside triphosphate hydrolases

Beispiel 5: Topologie-Vorhersage der Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryotischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung bzw. Ortszuweisung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Prä-Sequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität von Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
Eine Reihe von Parametern wird ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschluss-Einstellungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:

• ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada;
• TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark

In Hinsicht auf SEQ ID NR: 44 wurde eine Reihe von Parametern ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschluss-Einstellungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).

Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie sie von SEQ ID NR: 44 repräsentiert ist, sind in der Tabelle D wiedergegeben. Die Organismengruppe ”Pflanze” wurde gewählt, es wurden keine Ausschlussbedingungen (cutoffs) definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde angefordert. Bei der subzellulären Lokalisierung der wie durch SEQ ID NR: 44 repräsentierten Polypeptidsequenz kann es sich um das Cytoplasma oder den Zellkern handeln, wobei kein Transitpeptid vorhergesagt wird. Tabelle D: TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie repräsentiert von SEQ ID NR: 44

Länge (AS)	560
Chloroplasten-Transitpeptid	0,105
Mitochondriales Transitpeptid	0,100
Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid	0,168
Sonstiges subzelluläres Targeting	0,872
Vorhergesagte Lokalisierung	/
Zuverlässigkeitsklasse	2
Vorhergesagte Transitpeptid-Länge	/

Beispiel 6: Assay hinsichtlich der Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
Die Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 4, ist ein Transkriptionsfaktor mit DNA-Bindungsaktivität. Das Vermögen eines Transkriptionsfaktors zur Bindung an eine spezifische DNA-Sequenz kann durch Elektrophoretische-Mobilitäts-Verschiebungs(bzw. Shift)-Assays (EMSAs; auch Gelretardations-Assays genannt) getestet werden, was im Fachgebiet allgemein bekannt ist, und spezifisch für TCPs von Kosugi & Ohashi (2002) Plant J. 30: 337–348, und von Li et al. (2005) PNAS 102 (36): 12978–83, berichtet ist. Ebenfalls von Kosugi & Ohashi berichtet werden Verfahren zum Nachweis von Dimerisierungspartnern und -spezifität, zum Beispiel unter Verwendung des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems, während Li et al. Chromatin-Immunpräzipitationsexperimente zum Charakterisieren der Promotoren, an welche TCPs binden, beschreiben.
In Bezug auf Epsin-like-Polypeptide kann die Lipid-Bindung durchgeführt werden, wie es durch Horn et al. (2007) beschrieben wird. Lösungen von Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin (Avanti) und Phosphatidylinositol(4,5)-bisphosphat-diC16 (C16-PtdIns(4,5)P2, Echelon Biosciences Inc.), gelöst in CHCl₃/MeOH/H₂O (65:25:4, bezogen auf das Volumen), wurden gemischt und unter Vakuum eingetrocknet. Die Lipide wurden in 50 mM Tris, 100 mM KCl (pH 7,0) resuspendiert und bei 64°C während 1 h inkubiert. Die Liposomen wurden dann, für drei Zyklen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei 37°C aufgetaut. Die Liposomen-Lösung wurde durch einen Avanti-Extruder geleitet, wodurch 1,0 μm-Liposomen hergestellt werden. Liposomen wurden durch Zentrifugation bei 25.000 g während 10 Minuten abgesammelt und zu einer Endkonzentration von 2 mM Gesamtlipiden in 100 μl 20 mM Tris, 100 mM KCl-Puffer (pH 6,0, 7,0 oder 8,0) resuspendiert. Liposomen wurden mit den GST-Fusions-ENTH- und -ANTH-Domänen oder GST (2–5 μg/ml Endproteinkonzentration) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann erneut durch Zentrifugation abgesammelt. Die Liposomenpellets wurden in 100 μl Puffer resuspendiert und durch SDS-PAGE and Färbung mittels Coomassie-Brilliant-Blue hinsichtlich der Gegenwart lipidbindender Proteine analysiert.
In Bezug auf IPPT zeigen in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützliche Polypeptide IPPT-Aktivität auf. Es existieren viele Assays zum Messen einer solchen IPPT-Aktivität, einschließlich Komplementationsassays eines Hefestamms mit defekter endogener IPPT-Aktivität (codiert durch das MOD5-Gen; Golovko et al. (2002) Plant Molec. Biol. 49: 161–169), Komplementationsassays eines E. coli-Stamms mit defekter endogener IPPT-Aktivität (codiert durch das miaA-Gen; Dihanich et al. (1987) Mol. Cell Biol. 7: 177–184), oder Quantifizierung von Cytokininen in tRNA (Gray et al. (1996) Plant Physiol. 110: 431–438, Miyawaki et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (44): 16598–16603). Der Fachmann auf dem Gebiet kennt allgemein derartige experimentellen Vorgehensweisen zum Messen von IPPT-Aktivität, einschließlich der IPPT-Aktivität eines IPPT-Polypeptids, wie es durch SEQ ID NR: 144 repräsentiert wird.
Beispiel 7: Klonierung der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz
Klonierung der TCP-Nukleinsäuresequenzen
Die in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenzen wurden mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte Medicago-cDNA-Bibliothek (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hilfe von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren:
welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, wurde danach ausgeführt, wobei darin das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch gemäß der Gateway-Terminologie ein ”Eintritts”- bzw. ”Entry-Klon”, pTCP1 oder pTCP2, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
Der Eintritts-Klon, welcher SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 umfasst, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor oder ein HMGP-Promoter für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
Klonierung von Epsin-like-Sequenzen
Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana-Setzlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm09481 (SEQ ID NR: 46; Sense, Startcodon in Fettdruck):
und prm09482 (SEQ ID NR: 47; rückwärts, komplementär):
welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, wurde danach ausgeführt, wobei darin das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch gemäß der Gateway-Terminologie ein ”Eintritts-Klon”, pEpsin-like, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
Der Eintritts-Klon, umfassend SEQ ID NR: 43, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 45) für wurzelspezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::Epsin-like (4) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
Klonierung von Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 143
Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) sowie Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
Die Synechococcus sp. PCC 7942-Nukleinsäuresequenz, welche eine IPPT-Polypeptidsequenz wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 144 codiert, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize extrahierte genomische DNA aus Synechococcus sp. PCC 7942 verwendet wurde. Für die PCR-Amplifikation wurden die folgenden Primer, welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen, verwendet:

1) Prm 07646 (SEQ ID NR: 206, Sense):
2) Prm 07645 (SEQ ID NR: 207, rückwärts, komplementär):

Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment der erwarteten Länge (beinhaltend die attB-Stellen) wurde amplifiziert und ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, wurde danach ausgeführt, wobei darin das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Eintritts-Klon” hergestellt wurde. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
Klonierung der SHR-Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NR: 208)
Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei eine maßgeschneiderte cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana-Setzlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) als Matrize verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hilfe von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren (SEQ ID NR: 243; Sense, Startcodon in Fettdruck):
welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, wurde danach ausgeführt, wobei darin das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Eintritts-Klon” pSHR hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
Der Eintritts-Klon, der die SEQ ID NR: 208 umfasste, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 242) für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::SHR (16) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
Beispiel 8: Expressionsvektorkonstruktion unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 143 repräsentiert
Der Eintritts-Klon, umfassend SEQ ID NR: 143, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-Dehydrin-Promotor (SEQ ID NR: 204) für samenspezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert. Außerdem wurde ein zweiter Destinationsvektor zur Oryza sativa-Transformation hergestellt, und zwar mit einem Reis-Proteinaseinhibitor-Promotor (SEQ ID NR: 205), ebenfalls für samenspezifische Expression.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurden die resultierenden Expressionsvektoren pDehydrin::IPPT und pProt_inhib::IPPT (4) für samenspezifische Expression gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren unabhängig in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
Beispiel 9: Pflanzentransformation
Transformation von Reis
Agrobacterium, welches den Expressionsvektor enthielt, wurde zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare wurden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wurde durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, gefolgt von sechsmaligem, 15-minütigem Waschen mit sterilen destilliertem Wasser, durchgeführt. Die sterilen Samen wurden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Callus-Induktions-Medium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunklen wurden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Calli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Calli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callus-Stücke wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den Expressionsvektor enthielt, wurde für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den geeigneten Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien wurden dann abgesammelt und in flüssigem Cokultivierungs-Medium zu einer Dichte (OD₆₀₀) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wurde dann in eine Petrischale überführt, und die Calli wurden 15 Minuten lang in der Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe wurden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunklen bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Calli wurden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunklen bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wurde das embryogene Potential freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse wurden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem Auxin-enthaltenden Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse wurden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen wurden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).
Transformation von Mais
Die Transformation von Mais (Zea mays) wird mit einer Abwandlung des Verfahrens durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14 (6): 745–50, beschrieben wird. Die Transformation in Mais ist Genotyp-abhängig, und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzucht-Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elternteil sind gute Quellen von Spendermaterial für eine Transformation, aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden aus der Maispflanze ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) abgeerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Herausgeschnittene Embryos werden auf Callus-Induktionsmedium und anschließend Mais-Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, im Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C während 2 bis 3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Weizen
Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14 (6): 745–50, beschrieben wurde. Üblicherweise wird das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CIMMYT, Mexiko) bei der Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Callus-Induktionsmedium, und dann Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C während 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und während 2–3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Sojabohne Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens transformiert, welches in U.S.-Patent 5 164 310 von Texas A&M beschrieben ist. Mehrere kommerzielle Sojabohnenvarietäten sind einer Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) zur Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für das In-vitro-Aussäen sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Kotyledon werden aus sieben Tage alten Jung-Setzlingen herausgeschnitten. Das Epikotyl und das verbleibende Kotyledon werden weiter wachsen gelassen, um axilläre Nodi zu entwickeln. Diese axillären Nodi werden herausgeschnitten und mit Agrobacterium tumefaciens inkubiert, welches den Expressionsvektor enthält. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien überführt. Regenerierte Sprosse werden herausgeschnitten und auf ein Sprossverlängerungsmedium gebracht. Sprosse, welche nicht länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium gebracht, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Raps/Canola
Kotyledonäre Petiolen bzw. Keimblattstiele sowie Hypokotyle von einem 5–6 Tage alten Jungsämling werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die zur Transformation verwendete Standardvarietät, aber auch andere Varietäten können verwendet werden. Canola-Samen werden für das In-vitro-Aussäen oberflächensterilisiert. Die Kotyledon-Keimblattstiel-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden von den In-vitro-Sämlingen abgeschnitten und mit Agrobacterium (enthaltend den Expressionsvektor) durch Eintauchen des Schnittendes des Blattstiel-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 Stunden Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium werden die Blattstiel-Explantate in bzw. auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) während 7 Tagen überführt und danach auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm Länge aufweisen, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Sprosse von etwa 2 cm Länge werden auf Bewurzelungsmedium (MS0) zur Wurzelinduktion überführt. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Alfalfa
Ein sich regenerierender Klon von Alfalfa (Medicago sativa) wird unter Anwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig, und daher wird eine sich regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Alfalfa-Varietät ausgewählt werden, wie es durch Brown, DCW, und A. Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben wurde. Alternativ dazu ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in der Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Petiolen-Explantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert. Die Explantate werden drei Tage lang im Dunklen auf SH-Induktionsmedium cokultiviert, welches 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon enthält. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum zum Inhibieren des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach einigen Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika sowie 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryonen werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge wurden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Baumwolle (in Bezug auf TCP1/TCP2 und Epsin-like-Sequenzen) Baumwolle wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens gemäß des Verfahrens transformiert, das in US 5 159 135 beschrieben ist. Baumwolle-Samen werden in 3% Natriumhypochlorit-Lösung während 20 Minuten oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann für die Keimung auf bzw. in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl überführt. Hypokotyle von 4 bis 6 Tage alten Setzlingen werden entfernt, in Stücke von 0,5 cm geschnitten und auf 0,8%igen Agar platziert. Eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, transformiert mit dem Gen von Interesse und geeigneten Selektionsmarkern) wird für die Inokulation der Hypokotyl-Explantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Beleuchtung überführt man die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige-und-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl₂, sowie mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten restlicher Bakterien. Individuelle Zelllinien werden nach zwei bis drei Monaten (mit Unterkulturen alle vier bis sechs Wochen) isoliert und werden auf selektivem Medium zur Gewebevermehrung weiter kultiviert (30°C, 16 h Lichtperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend auf nicht-selektivem Medium während 2 bis 3 Monaten weiter kultiviert, was zur Entstehung von somatischen Embryonen führt. Gesund aussehende Embryonen von mindestens 4 mm Länge werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, das mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure ergänzt ist, überführt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Lichtperiode von 16 h kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Blumentöpfe mit Vermiculit und Nährstoffen überführt. Die Pflanzen werden gehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus gebracht.
Transformation von Baumwolle (in Bezug auf IPPT).
Die Transformation von Baumwolle (Gossypium hirsutum L.) wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens auf Hypokotylen-Explantaten durchgeführt. Die kommerziellen Kultivare, wie Coker 130 oder Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX) sind standardmäßige Varietäten, die für die Transformation verwendet werden, aber es können auch andere Varietäten verwendet werden. Die Samen werden oberflächensterilisiert und im Dunkeln keimen gelassen. Hypokotyl-Explantate werden aus den gekeimten Sämlingen zu Längen von etwa 1–1,5 Zentimeter ausgeschnitten. Das Hypokotyl-Explantat wird im Agrobacterium tumefaciens-Inokulum, das den Expressionsvektor enthält, 5 Minuten lang untergetaucht und dann etwa 48 Stunden lang auf MS +1,8 mg/l KNO₃ + 2% Glucose bei 24°C im Dunklen cokultiviert. Die Explantate werden das gleiche Medium überführt, das geeignete bakterielle und pflanzliche selektierbare Marker enthält (mehrmalig erneuert), bis embryogene Calli zu beobachten sind. Die Calli werden getrennt und subkultiviert, bis somatische Embryonen erscheinen. Aus den somatischen Embryonen abgeleitete Pflänzchen werden auf Bewurzelungsmedium heranreifen gelassen, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Blumentopferde im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen hergestellt, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Beispiel 10: Vorgehen zur phänotypischen Auswertung
9.1 Auswertungsansatz
Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Kultivieren und Ernten von T1-Samen überführt. Sechs Ereignisse, bei denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Setzlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Setzlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden an zufälligen Positionen Seite an Seite wachsen gelassen. Die Gewächshausbedingungen bestanden in kurzen Tagen (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C im Dunklen sowie einer relativen Feuchtigkeit von 70%.
Im Fall einer Bestätigungsrunde wurden vier T1-Ereignisse in der T2-Generation, unter Befolgen desselben Auswertungsvorgehens wie für die T1-Generation aber mit mehr Individuen pro Ereignis, weiter ausgewertet. Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
Vier T1-Ereignisse wurden, unter Befolgen desselben Auswertungsvorgehens wie für die T1-Generation aber mit mehr Individuen pro Ereignis, in der T2-Generation weiter ausgewertet. Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
Dürre-Screen (in Bezug auf TCP1/TCP2 und SHR)
In Bezug auf TCP1/TCP2 wurden Pflanzen aus T2-Samen in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens näherten.
In Bezug auf SHR werden Pflanzen aus T2-Samen in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens näherten.
Sie wurden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wurde. Feuchtigkeitssonden wurden in zufällig ausgewählten Blumentöpfen eingesteckt, um den Bodenwassergehalt (SWC) zu überwachen. Als der SWC unter bestimmte Schwellenwerte fiel, wurden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wurde. Die Pflanzen wurden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Dürre-Screen (Epsin-like-Sequenzen)
Pflanzen aus T2-Samen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens nähern. Sie werden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wird. Feuchtigkeitssonden werden in zufällig ausgewählten Blumentöpfen eingesteckt, um den Bodenwassergehalt (SWC) zu überwachen. Wenn der SWC unter bestimmte Schwellenwerte fällt, werden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wird. Die Pflanzen werden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Dürre-Screen (IPPT)
Pflanzen aus einer ausgewählten Anzahl an Ereignissen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/-Rispenschiebens nähern. Sie werden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wird. Feuchtigkeitssonden werden in zufällig ausgewählten Blumentöpfen eingesteckt, um den Bodenwassergehalt (SWC) zu überwachen. Wenn der SWC unter bestimmte Schwellenwerte sinkt, werden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wird. Die Pflanzen werden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Screen der Stickstoffverwendungseffizienz (in Bezug auf TCP1/TCP2)
Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen, mit Ausnahme der Nährstofflösung, wachsen gelassen. Die Blumentöpfe wurden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff(N)-Gehalt enthält, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Screen der Stickstoffverwendungseffizienz (in Bezug auf Epsin-like-Sequenzen)
Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe werden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff(N)-Gehalt enthält, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Screen der Stickstoffverwendungseffizienz (in Bezug auf SHR)
Reispflanzen aus T2-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe wurden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff(N)-Gehalt enthält, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Salzstress-Screen (in Bezug auf Epsin-like-Sequenzen)
Pflanzen werden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfaser und Argex (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wird während der ersten zwei Wochen nach dem Umpflanzen der Pflänzchen in das Gewächshaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen werden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugesetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Dann werden Samen-bezogene Parameter gemessen.
Salzstress-Screen (in Bezug auf IPPT)
Pflanzen werden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfaser und Argex (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wird während der ersten zwei Wochen nach dem Umpflanzen der Pflänzchen in das Gewächshaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen werden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugesetzt, bis die Pflanzen geerntet wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt wurde.
Screen bei verringerter Nährstoff(Stickstoff)-Verfügbarkeit (in Bezug auf IPPT) Pflanzen aus sechs Ereignissen (T2-Samen) werden in Blumentopferde unter Normalbedingungen, mit Ausnahme der Nährstofflösung, wachsen gelassen. Die Töpfe werden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff(N)-Gehalt, in der Regel zwischen 7- bis 8-mal weniger, enthält. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt wurde.
9.2 Statistische Analyse: F-Test
Eine Zwei-Faktor-ANOVA (Analyse von Varianten) wurde als ein statistisches Modell für die Gesamtauswertung von phänotypischen Pflanzenmerkmalen verwendet. Ein F-Test wurde bei allen gemessenen Parametern von allen Pflanzen aller Ereignisse, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung transformiert waren, durchgeführt. Der F-Test wurde durchgeführt, um eine Prüfung hinsichtlich eines Effekts des Gens über alle Transformationsereignisse hinweg vorzunehmen und einen Gesamteffekt des Gens, ebenfalls bekannt als globaler Geneffekt, zu bestätigen. Der Schwellenwert für Signifikanz für einen echten globalen Geneffekt wurde bei einer 5%-Wahrscheinlichkeitsstufe für den F-Test festgesetzt. Ein signifikanter F-Testwert deutet auf einen Geneffekt hin, was heißt, dass es nicht nur die bloße Gegenwart oder Position des Gens ist, welche die Unterschiede beim Phänotyp verursacht.
Weil zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse ausgeführt. Dies ist nützlich, um die Konsistenz der Effekte über die zwei Experimente hinweg zu überprüfen, und, sofern dies der Fall ist, Beweise aus beiden Experimenten zu sammeln, damit die Konfidenz bei der Schlussfolgerung erhöht wird. Das angewandte Verfahren war ein Misch-Modell-Vorgehen, welches die Mehrfachebenen-Struktur der Daten (d. h. Experiment-Ereignis-Segreganten) berücksichtigt. P-Werte wurden durch Vergleichen des Wahrscheinlichkeitsverhältnis-Tests mit Chi-Quadrat-Verteilungen erhalten.
9.3 Gemessene Parameter
Messung von Biomassen-bezogenen Parametern
Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
Die oberirdische Pflanzenfläche (oder blattartige Biomasse) wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln heraus aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist die Fläche, welche an dem Zeitpunkt gemessen wird, an dem die Pflanze ihre maximale Blatt-Biomasse erreicht hatte. Die Früh-Wuchskraft ist die oberirdische Pflanzen(Setzlings)-Fläche drei Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als eine Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als das Maximum der Biomasse von Wurzeln, das während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird); oder als eine Erhöhung im Wurzel/Spross-Index (gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Periode des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
Die Früh-Wuchskraft wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln von oberirdischen Pflanzenteilen, welche sich vom Hintergrund unterschieden, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
Messungen von Samen-bezogenen Parametern
Die reifen Hauptrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit Strichcode etikettiert und dann drei Tage lang in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Rispen wurden dann gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden von den leeren Hülsen unter Verwendung einer Luftgebläsevorrichtung getrennt. Die leeren Hülsen wurden verworfen, und die verbleibende Fraktion wurde erneut gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl an gefüllten Samen wurde durch Zählen der Anzahl an gefüllten Hülsen bestimmt, welche nach dem Trennungsschritt verblieb. Der Gesamtsamenertrag wurde durch Wiegen aller, von einer Pflanze abgeernteten, gefüllten Hülsen gemessen. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde durch Zählen der Anzahl der von einer Pflanze geernteten Hülsen gemessen. Das Tausendkerngewicht (TKW) wird aus der gezählten Anzahl gefüllter Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Ernteindex (HI) ist in der vorliegenden Erfindung definiert als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor 10⁶. Die Gesamtzahl an Blüten pro Rispe, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist das Verhältnis zwischen der Gesamtzahl an Samen und der Anzahl an reifen Hauptrispen. Die Samen-Füllrate, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist der Anteil (ausgedrückt als ein %-Wert) der Anzahl gefüllter Samen gegenüber der Gesamtzahl an Samen (oder Blütchen).
Beispiel 11: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen

Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine TCP1- oder TCP2-Nukleinsäure exprimieren, sind nachstehend gezeigt. Der %-Unterschied gilt für transgene Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Nullizygoten. Ergebnisse der Auswertung von Reispflanzen, welche das Konstrukt pHMGP:: TCP1 (Medicago sativa) oder pGOS2:: TCP1 (Medicago sativa) unter Nicht-Stress- und Dürre-Bedingungen exprimieren

	Dürre	Nicht-Stress
	pHMGP::TCP1	pHMGP::TCP1
Gesamt-Samengewicht	42%	11%
Anz. gefüllter Samen	43%	9%
Füllrate	22%
Blüten pro Rispe	7%	4%
Anz. Hauptrispen		7%
Ernte-Index	36%	7%
Oberirdische Fläche		< 4%
Emergenz-Wuchskraft		8%
TKW		< 5%

Eine positive Tendenz wurde bei den folgenden Parametern: Emergenz-Wuchskraft, Gesamt-Samengewicht und TKW, für das Konstrukt pGOS2::TCP1 (Medicago sativa) unter Nicht-Stress-Bedingungen bemerkt. Ergebnisse der Auswertung von Reispflanzen, exprimierend Konstrukt oder pGOS2:: TCP2 (Medicago truncatula) unter Nicht-Stress- und Dürre-Bedingungen

Parameter	Dürre	Nicht-Stress
	pGOS2::TCP1	pGOS2::TCP1
Ernte-Index	21%	9%
Anz. gefüllter Samen	23%	5%
Füllrate	Na	6%
Wurzel-Spross-Index	Na	9%
Gesamtgewicht Samen	27%	< 5%
Anz. Blüten pro Rispe	10%	Na
TKW	< 5%	Na
Anz. Hauptrispen	8%	Na

Die Ergebnisse der Auswertung von, eine Epsin-like-Nukleinsäure exprimierenden transgenen Reispflanzen sind nachstehend dargestellt. Eine Erhöhung von mehr als 5% wurde für Gesamtsamenanzahl, Gesamtsamenertrag, Anzahl gefüllter Samen und Füllrate beobachtet. Darüber hinaus wurde eine Erhöhung von mehr als 5% bei der oberirdischen Biomasse und bei der Früh-Wuchskraft sowohl in T1- als auch T2-Generationen für mindestens ein Ereignis beobachtet. Tabelle E: Ertragserhöhung, beobachtet in Pflanzen, welche die Epsin-like-Nukleinsäure von SEQ ID NR: 44 exprimieren:

	T1		T2
Parameter	Gesamt % Erhöhung	P-Wert	Gesamt % Erhöhung	P-Wert, kombinierte Analyse
Gesamtgewicht an Samen	> 5	0,0011	> 5	0,0023
Gesamtzahl an Samen	> 5	0,033	> 5	0,1068
Anzahl gefüllter Samen	> 5	0,0017	> 5	0,0069
Füllrate	> 5	0,0024	2,7	0,0001

Resultate der phänotypischen Auswertung der transgenen Reispflanzen, welche die Nukleinsäuresequenz, codierend ein IPPT-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 144 repräsentiert, unter der Steuerung eines samenspezifischen Dehydrin-Promotors exprimieren
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen der T1- und T2-Generation, welche die Nukleinsäuresequenz, codierend ein IPPT-Polypeptid, wie es durch die SEQ ID NR: 144 repräsentiert wird, unter der Steuerung eines samenspezifischen Dehydrin-Promotors exprimierten und unter normalen Wachstumsbedingungen wachsen gelassen wurden, sind nachstehend dargestellt.

Es bestand eine signifikante Erhöhung in der Früh-Wuchskraft, in der oberirdischen Biomasse, im Gesamtsamenertrag pro Pflanze, in der Gesamtzahl an Samen, in der Anzahl gefüllter Samen, in der Anzahl von Blüten pro Rispe und beim Ernteindex der transgenen Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), wie es in Tabelle F gezeigt ist. Tabelle F: Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen der T1- und T2-Generation, welche die Nukleinsäuresequenz, codierend ein IPPT-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 144, unter der Steuerung eines Dehydrin-Promotors für samenspezifische Expression exprimieren.

Eigenschaft	Gesamtdurchschnitt-% Erhöhung in 6 Ereignissen in der T1-Generation	Gesamtdurchschnitt-% Erhöhung in 4 Ereignissen in der T2-Generation
Frühwuchskraft	25	25
oberirdische Biomasse	2	8
Gesamtsamenertrag pro Pflanze	14	13
Gesamtzahl an Samen	8	15
Gesamtzahl gefüllter Samen	15	13
Ernteindex	14	5
Anzahl an Hauptrispen	13	3

Resultate der phänotypischen Auswertung der transgenen Reispflanzen, welche die Nukleinsäuresequenz, codierend ein IPPT-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 144, unter der Steuerung eines samenspezifischen Proteinaseinhibitor-Promotors exprimieren
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen der T1-Generation, welche die Nukleinsäuresequenz, codierend ein IPPT-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 144, unter der Steuerung eines samenspezifischen Proteinaseinhibitor-Promotors exprimierten und unter normalen Wachstumsbedingungen wachsen gelassen wurden, sind nachstehend dargestellt.

Es bestand eine signifikante Erhöhung in der Früh-Wuchskraft, in der oberirdischen Biomasse, im Gesamtsamenertrag pro Pflanze, in der Gesamtzahl an Samen, in der Anzahl gefüllter Samen und in der Anzahl von Blüten pro Rispe der transgenen Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), wie es in Tabelle G gezeigt ist. Tabelle G: Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen der T1-Generation, welche die Nukleinsäuresequenz, codierend ein IPPT-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 144, unter der Steuerung eines Proteinaseinhibitor-Promotors für samenspezifische Expression exprimieren.

Eigenschaft	Gesamtdurchschnitt-% Erhöhung in den zwei besten Ereignissen in der T1-Generation
Frühwuchskraft	34
oberirdische Biomasse	15
Gesamtsamenertrag pro Pflanze	20
Gesamtzahl an Samen ,	23

Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine SHR-Nukleinsäure unter Nicht-Stress-Bedingungen exprimieren, sind nachstehend dargestellt.

Parameter % Unterschied über Kontrollen

TKW 7,3%
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine SHR-Nukleinsäure unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit exprimieren, sind nachstehend dargestellt.

Parameter % Unterschied über Kontrollen

Oberirdische Fläche 10,2%

Emergenz-Wuchskraft 23,2%

Wurzelbiomasse 23,6%

Füllrate 25,3%

TKW 7%
Zusammenfassung
Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zur Herstellung derselben
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung verschiedener ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die einen TCP1- oder einen TCP2-Transkriptionsfaktor codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein TCP1- oder TCP2-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung verschiedener wirtschaftlich bedeutsamer ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen. Im Genaueren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein Epsin-ähnliches bzw. ”Epsin-like”-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, welche ein Epsin-like-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, welche eine ein Epsinlike-Polypeptid codierende Nukleinsäure umfassen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind.
In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Erhöhung verschiedener den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein tRNA-delta(2)-Isopentenylpyrophosphat-Transferase(IPPT)-Polypeptid codiert, in den Samen einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer ein IPPT-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in den Samen, wobei die Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung betrifft außerdem Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Pflanzen, welche die Nukleinsäuresequenzen enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen, die unter Bedingungen mit sub-optimaler Nährstoffverfügbarkeit kultiviert werden, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein SHORTROOT(SHR)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Erhöhung des Tausendkerngewichts (TKW) in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein SHR-Polypeptid codiert, in einer unter nicht-nährstofflimitierenden Bedingungen kultivierten Pflanze umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, welche ein SHR-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt ebenfalls Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression von Nukleinsäure, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) einer Nukleinsäure, codierend ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid, in einer Pflanze, b) einer Nukleinsäure, codierend ein Epsin-like-Polypeptid, wobei das Epsin-like-Polypeptid eine ENTH-Domäne umfasst, in einer Pflanze, c) einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein tRNA-delta(2)-Isopentenylpyrophosphat-Transferase(IPPT)-Polypeptid, wobei das IPPT-Polypeptid (i) eine tRNA-Isopentenyltransferase-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR002627; und (ii) ein N-terminales ATP/GTP-Bindungsstellen-Motiv A (P-loop) umfasst, in den Samen einer Pflanze, und gegebenenfalls Selektieren von Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, und d) einer Nukleinsäure, codierend ein SHR-Polypeptid, in Pflanzen, die unter Bedingungen mit sub-optimaler Nährstoffverfügbarkeit kultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das TCP1-Polypeptid folgendes umfasst: (i) eine TCP-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu der TCP-Domäne von einer beliebigen der Sequenzen, die in 1 angegeben sind; und (ii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne A von einer beliebigen der Sequenzen, die in 1 angegeben sind; und (iii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne B von einer beliebigen der Sequenzen, die in 1 angegeben sind; und (iv) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne C von einer beliebigen der Sequenzen, die in 1 angegeben sind, und wobei das TCP2-Polypeptid folgendes umfasst: (i) eine TCP-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu der TCP-Domäne von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind; und (ii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 1 von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind; und (iii) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 2 von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind; und (iv) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 3 von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das TCP2-Polypeptid folgendes umfasst: (v) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 4 von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind; (vi) eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 5 von einer beliebigen der Sequenzen, die in 2 angegeben sind.
Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei das TCP1-Polypeptid bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen TCP-Baums, wie demjenigen, der in 1 abgebildet ist, dazu neigt, sich eher bei dem Ast von TCP-Polypeptiden, umfassend die Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 2, als bei einem beliebigen anderen TCP-Ast einordnen bzw. clustern zu lassen.
Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei das TCP2-Polypeptid bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen TCP-Baums, wie demjenigen, der in 2 abgebildet ist, dazu neigt, sich eher bei dem Ast von TCP-Polypeptiden, umfassend die Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 4, als bei einem beliebigen anderen TCP-Ast einordnen zu lassen.
Verfahren gemäß einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 oder 4 codiert.
Verfahren gemäß einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei es sich bei der modulierten Expression um die erhöhte Expression einer Nukleinsäure, welche ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid codiert, handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die erhöhte Expression durch eines oder mehrere beliebige aus T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING oder homologer Rekombination bewirkt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die erhöhte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, welche ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
Verfahren gemäß einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhtes Samengewicht im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 9 oder 10, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem HMGP(High Mobility Group Protein)-Promotor oder mit einem GOS2-Promotor, funktionsfähig verbunden ist.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Nukleinsäuresequenz, welche ein TCP1- oder TCP2-Polypeptid codiert, vorzugsweise von pflanzlichem Ursprung, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Medicago-Familie, am stärksten bevorzugt aus Medicao sativa oder Medicago truncatula ist.
Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Pflanze oder der Teil davon ein Nukleinsäure-Transgen umfasst, welches ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid codiert.
Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäuresequenz, welche ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid codiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (i) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
Konstrukt gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei der einen oder mehreren Steuerungssequenz(en) mindestens um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen HMGP- oder GOS2-Promotor, handelt.
Verwendung eines Konstrukts gemäß den Ansprüchen 14 oder 15 zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt gemäß den Ansprüchen 14 oder 15 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei das Verfahren umfasst: (i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder Pflanzenzelle, von einer Nukleinsäuresequenz, welche ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid codiert; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei der erhöhte Ertrag aus der erhöhten Expression einer Nukleinsäure resultiert, welche ein TCP1- oder ein TCP2-Polypeptid codiert, oder eine aus der transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 19, wobei es sich bei dem erhöhten Samenertrag um eines oder mehrere der folgenden handelt: (i) erhöhtes Samengewicht; (ii) erhöhter Ernteindex; oder (iii) erhöhtes Tausendkerngewicht, (iv) erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispe, (v) erhöhte Füllrate, (vi) erhöhte Anzahl an gefüllten Samen.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 13, 17, 19 oder 20, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Sorghum und Hafer ist, oder eine aus der transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 21, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 21 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 22 abgeleitet sind.
Verwendung einer Nukleinsäure, welche ein TCP1- oder TCP2-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags, in Pflanzen.