CN111087459B

CN111087459B - 一种青蒿TCP类转录因子AaTCP15在调控青蒿素表达量中的应用

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Publication number: CN111087459B
Application number: CN202010037470.0A
Authority: CN
Inventors: 唐克轩; 严欣; 吴张宽玉; 马亚男; 付雪晴; 黎凌; 苗志奇; 张耀杰; 刘航; 陈甜甜; 李勇鹏; 秦维; 钱虹妹; 孙小芬; 谢利辉; 王宇婷
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2040-01-14
Also published as: CN111087459A

Abstract

本发明公开了一种青蒿TCP类转录因子AaTCP15及其应用，涉及基因工程技术领域，所述转录因子AaTCP15的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的青蒿TCP类转录因子AaTCP15，能够激活青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子，正向调控DBR2和ALDH1基因的表达，从而促进青蒿素的生物合成；并利用转基因技术将青蒿转录因子AaTCP15的过量表达载体或反义干扰载体转化青蒿，实现了对植株中青蒿素含量增高或降低的调控。本发明提供的转录因子AaTCP15及其应用对于青蒿中青蒿素含量的提高及青蒿的品质改良、培育高含量青蒿素新品种、青蒿素的规模化生产具有重要意义。

Description

一种青蒿TCP类转录因子AaTCP15在调控青蒿素表达量中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种青蒿TCP类转录因子AaTCP15在调控青蒿素表达量中的应用。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属一年生草本植物，是我国重要的传统中药，具有清热解毒、截疟、祛暑和除蒸的功效。青蒿素是从青蒿中提取出来的倍半烯萜内酯类化合物，因其对疟疾有很好的治疗作用而闻名全球。基于青蒿素的联合治疗方法(ACT)是世界卫生组织(WHO)推荐的首选疗法。除了治疗疟疾以外，青蒿素及其衍生物对于治疗红斑狼疮相关肾炎、病毒感染、血吸虫病、肺结核以及糖尿病都有一定的效果，可见青蒿素类化合物作为广谱天然药物具有十分广阔的研究和应用前景。

在植物中，青蒿素的主要来源是从青蒿中提取，但是青蒿素的含量在青蒿中很低，只占青蒿叶片干重的0.01％-1.0％。因此，如何提高青蒿中青蒿素的含量是青蒿产业化中的一个重大问题。目前有多种策略可以提高青蒿中青蒿素的含量，包括过表达青蒿素合成关键酶基因、阻断青蒿素合成竞争支路、青蒿素转运蛋白的调控和青蒿素生物合成基因的转录调控。其中，转录因子能激活植物次生代谢产物合成途径中多个合成酶基因的协同表达而有效促进次生代谢产物的合成，因此对青蒿素生物合成基因的转录调控研究逐渐成为国内外关注的焦点。

TCP类转录因子最早发现于淡水植物轮藻，是一类植物特有的转录因子。TCP类转录因子包含59个氨基酸组成的非典型碱性螺旋-环-螺旋结构域，即TCP结构域，这个结构域主要负责与DNA结合以及蛋白互作。植物中，根据TCP蛋白DNA结合结构域(TCP结构域)的不同将TCP类转录因子分为两个主要的家族，即class I TCPs和class II TCPs。TCP15属于class I TCPs，参与植物的生长发育、次生代谢调控和对激素的响应。

目前，关于TCP类转录因子在植物次生代谢调控中的功能和作用机制研究还较少，仅有的研究也多数集中在模式植物拟南芥中。拟南芥的研究工作表明TCP类转录因子参与调控花青素、叶绿素和类胡萝卜素的生物合成，然而青蒿中TCP类转录因子的功能还报道较少，它们在青蒿素生物合成中的功能和作用机制还有待进一步发掘。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种可以调控促进青蒿素合成的TCP类转录因子，并通过建立该转录因子的过表达载体以及转化植株，培育得到青蒿素合成量提高的转基因植株，为青蒿的品质改良、培育高含量青蒿素新品种、青蒿素的规模化生产提供重要的基础和支持。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何开发一种可以调控促进青蒿素合成的TCP类转录因子，并通过建立该转录因子的过表达载体以及转化植株，培育得到青蒿素合成量提高的转基因植株，为青蒿的品质改良、培育高含量青蒿素新品种、青蒿素的规模化生产提供重要的基础和支持。

为实现上述目的，本发明提供了一种青蒿TCP类转录因子AaTCP15，所述转录因子AaTCP15的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步地，所述转录因子AaTCP15的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种包含如上所述的转录因子AaTCP15的编码基因核苷酸序列的重组表达载体。

本发明还提供了一种包含如上所述的转录因子AaTCP15的氨基酸序列的重组表达转化体。

本发明还提供了一种如上所述的青蒿TCP类转录因子AaTCP15在调控青蒿素表达量中的应用，其特征在于，所述应用通过所述转录因子AaTCP15激活青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子表达来实现，具体包括以下步骤：

步骤一、将所述转录因子AaTCP15的编码基因的核苷酸序列连接于植物表达调控序列上，构建含有所述转录因子AaTCP15的编码基因的植物过量表达载体；

步骤二、将所述青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子ProDBR2和ProALDH1分别连入载体pGreenII0800-LUC，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1；

步骤三、将所述植物过量表达载体和所述植物双荧光素检测报告载体分别转入宿主菌株农杆菌GV3101中，获得含有表达载体的工程菌株；

步骤四、将含有所述植物过量表达载体的所述工程菌株分别与含有所述植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1的所述工程菌株混合后，注射到植株中，并检测荧光强度，确定所述转录因子AaTCP15对所述青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子的激活作用；

步骤五、将所述转录因子AaTCP15的编码基因的核苷酸序列连接于植物表达调控序列上，构建含有所述转录因子AaTCP15的编码基因的反向互补序列的反义干扰载体；

步骤六、将所述步骤一的所述植物过量表达载体与所述步骤六的所述反义干扰载体转入宿主菌株农杆菌EHA105中，分别获得含有所述植物过量表达载体和所述反义干扰载体的工程菌株，并转入青蒿植株中；

步骤七，筛选获得含有转录因子AaTCP15的转化细胞，并再生转基因植株，得到青蒿素含量显著提高的过量表达转基因植株和青蒿素含量显著降低的反义干扰表达转基因植株。

进一步地，所述步骤三和所述步骤六中的所述转入所述宿主菌株的方法采用冻融法。

进一步地，所述植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1转入的所述宿主菌株为带有pSoup19辅助质粒的农杆菌GV3101菌株。

进一步地，所述步骤四中的含有所述植物过量表达载体的所述工程菌株与含有所述植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1的所述工程菌株按1：1混合。

进一步地，所述步骤七中采用抗生素筛选所述转化细胞，优选的，所述抗生素选用卡那霉素。

本发明还提供了一种如上所述的青蒿TCP类转录因子AaTCP15在培育青蒿素含量提高的转基因青蒿植株中的应用。

本发明还提供了一种基因工程菌株，所述菌株含有转录因子AaTCP15的编码基因的植物过量表达载体或者反义干扰载体，宿主菌株为农杆菌GV3101。

本发明还提供了一种通过将所述含有转录因子AaTCP15的编码基因的植物过量表达载体或者反义干扰载体的基因工程菌株转入青蒿植株中获取的转基因植株。

与现有技术相比，本发明至少具备以下有益的技术效果：

(1)本发明提供的转录因子AaTCP15，对青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子具有明显的激活作用，能够显著提高植株中青蒿素的含量；

(2)本发明构建了青蒿转录因子AaTCP15的过量表达载体和反义干扰载体，实现了对青蒿素含量的增高或降低的调控；

(3)本发明实现了转录因子AaTCP15的过量表达载体的构建及青蒿素含量提高的转基因青蒿植株的培育，对青蒿品种的改良、青蒿素的规模化生产具有重要意义。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例的AaTCP15转录因子在青蒿中调控青蒿素表达量结果统计图，其中，A为AaTCP15过量表达载体青蒿中青蒿素的含量，B为AaTCP15反义干扰表达青蒿中青蒿素的含量；

图2是本发明的一个较佳实施例的烟草瞬时转化AaTCP15显著增强ALDH1基因启动子和DBR2基因启动子的相对荧光素酶活性示意图，其中，A为ALDH1基因启动子的相对荧光素酶活性，B为DBR2基因启动子的相对荧光素酶活性。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、青蒿AaTCP15基因的克隆

1.青蒿基因组总RNA的提取

取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA浓度。

2.青蒿AaTCP15基因的克隆

以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成cDNA；根据AaTCP15基因的序列设计基因特异性引物，通过PCR从总cDNA中扩增AaTCP15基因，特异性引物序列如下：

正向引物AaTCP15-PF：5'-CAACTTCGATGCTCGAGTT-3'

反向引物AaTCP15-PR：5'-TGTTACCCCATAAATCCTT-3'

PCR反应总体积为50μL,反应体系为：5μL 10×KODPlus Buffer，5μL dNTPs,2μLMgSO₄，1μL正向引物AaTCP15-PF，1μL反向引物AaTCP15-PR，1μL cDNA模板，1μL KODPlus酶，34μL ddH₂O补齐至50μL。

PCR产物经过回收纯化后，连接平末端pLB载体(天根生化有限公司产品)并测序，获得pLB-AaTCP15质粒载体。

通过上述步骤，获得了青蒿中AaTCP15转录因子的编码序列(SEQ ID NO:1)并推导出其蛋白编码序列(SEQ ID NO：2)，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

实施例2、含AaTCP15基因的植物表达载体的构建

1.过量表达载体pCAMBIA1300-AaTCP15-GFP的构建

从测序正确的平末端载体pLB中扩增AaTCP15基因，将其构建在植物表达载体pCAMBIA1300-GFP上，为了方便表达载体的构建，正向引物引入了SalI的酶切位点，反向引物引入了SpeI的酶切位点，引物序列如下：

正向引物1300-AaTCP15-GFP-F：GGGGCCCGGGGTCGACATGGATGGTGGTAATGATCA

反向引物1300-AaTCP15-GFP-R：TACCGGATCCACTAGTCGAATTGTGACTTGTACTAT

2.反义干扰表达载体pCAMBIA1300-AaTCP15-antisense的构建

将测序正确的AaTCP15核苷酸序列反向互补后，再设计引物，从平末端载体pLB中扩增AaTCP15基因的反向互补序列，并将其构建在植物表达载体pCAMBIA1300-GFP上，为了方便表达载体的构建，正向引物引入了SalI的酶切位点，反向引物引入了SpeI的酶切位点，引物序列如下：

正向引物1300-AaTCP15-ANTI-F：GGGGCCCGGGGTCGACCGAATTGTGACTTGTACTAT

反向引物1300-AaTCP15-ANTI-R：TACCGGATCCACTAGTATGGATGGTGGTAATGATCA

实施例3、青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1启动子双荧光素报告载体的构建

1.PCR扩增青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子

根据NCBI数据库中青蒿DBR2基因启动子(GenBank:KC118524.1)和ALDH1基因启动子(GenBank:KC118522.1)的序列信息，分别设计DBR2和ALDH1基因启动子扩增特异性引物。

DBR2启动子的上下游引物分别含有HindIII和PstI酶切位点，引物序列如下：

pGreen0800-DBR2-F：CGGTATCGATAAGCTTAAGAACTTCGAGATAGAAAA

pGreen0800-DBR2-R：ATCCCCCGGGCTGCAGTCAGTGATGGAGTTGGTAAA

ALDH1启动子的上下游引物分别含有HindIII和PstI酶切位点，引物序列如下：

pGreen0800-ALDH1-F：CGGTATCGATAAGCTTATGAACCATTAGAAGGGAAG

pGreen0800-ALDH1-R：ATCCCCCGGGCTGCAGCTTTGTTTTTTATGAAATTT

以青蒿基因组DNA为模板，PCR扩增DBR2和ALDH1基因的启动子区，并回收纯化。

2.将启动子片段连入双荧光素报告载体

将pGreenII0800-LUC载体用HindIII和PstI双酶切后回收纯化，将上述PCR产物利用同源重组的方法，通过ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺唯赞，南京)试剂盒连接到回收后的pGreenII0800-LUC载体上，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1。

实施例4、烟草瞬时转化检测转录因子AaTCP15对DBR2和ALDH1启动子的激活作用

1.农杆菌工程菌株的获得

将pCAMBIA1300-GFP空载体和实施例2中含AaTCP15的植物表达载体pCAMBIA1300-AaTCP15-GFP采用冻融法转入根癌农杆菌GV3101，并将实施例3中含DBR2和ALDH1基因启动子的植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1采用冻融法转入带有pSoup辅助质粒的根癌农杆菌GV3101，分别获得含有空载体、AaTCP15基因和DBR2、ALDH1基因启动子的农杆菌工程菌株。

2.瞬时转化烟草

将上述农杆菌工程菌株的阳性菌株按1:100的比例接种在10ml液体培养基中扩大培养，28℃培养过夜；6000rpm离心5min收集菌体；用MS液体培养基重悬菌体，并且用MS液体培养基将各个菌株浓度稀释到OD₆₀₀为0.6；加入终浓度为200μmol/L的乙酰丁香酮(AS)和10mmol/L的MES(pH 5.8)，将侵染液室温静置3h。

将包含pCAMBIA1300-AaTCP15-GFP和空载体的农杆菌工程菌株分别与包含pGreenII0800-ProDBR2、pGreenII0800-ProALDH1植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株按1:1比例混合后，通过注射侵染的方式注射到生长5周的烟草叶片中。将烟草叶片在黑暗下培养1天，然后转到光照下培养1天。

3.Dual-Luciferase检测

取培养2天的烟草叶片，用液氮速冻后研磨成粉末。使用Promega公司的Dual-

Reporter Assay System试剂盒和GloMax 20/20Luminometer荧光检测仪检测荧光强度，按照试剂盒说明书进行操作。

检测结果如图2所示(其中A为烟草瞬时转化转录因子AaTCP15显著增强ALDH1基因启动子的相对荧光素酶活性；B图是烟草瞬时转化AaTCP15显著增强DBR2基因启动子的相对荧光素酶活性)，可发现转化表达转录因子AaTCP15可显著激活青蒿素生物合成关键酶基因ALDH1和DBR2的活性，增强表达。

实施例5、根癌农杆菌介导的AaTCP15过量表达和反义干扰载体遗传转化青蒿获得转基因青蒿植株

1.含AaTCP15过量表达和反义干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得

将实施例2中含AaTCP15的植物过量表达和反义干扰表达载体采用冻融法转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证。结果表明，含AaTCP15的植物过量表达和反义干扰载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。

2.根癌农杆菌介导AaTCP15基因转化青蒿

2.1.外植体的预培养

青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog,1962)固体培养基中，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

2.2.农杆菌与外植体的共培养

将所述的叶片外植体，转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含AaTCP15植物过表达和反义干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

2.3.抗性再生植株的筛选

将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.05mg/L+Kan 50mg/L+Hyg 8.75mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan和Hyg抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根，从而获得Kan和Hyg抗性再生青蒿植株。

3.转基因青蒿植株的PCR检测

根据AaTCP15的基因序列和植物pCAMBIA1300-GFP载体序列分别设计正向检测引物(1300-AaTCP15-PF：5’-TTACCAATACATTACACTAGCAT-3’)和反向检测引物(1300-AaTCP15-PF：5’-CGAATTGTGACTTGTACTAT-3’)对过表达植株进行阳性检测；同时设计正向引物(1300-antiTCP15-PF：5’-TTACCAATACATTACACTAGCAT-3’)和反向引物(1300-antiTCP15-PF：5’-ATGGATGGTGGTAATGATCA-3’)对反义干扰植株进行阳性检测。结果表明，利用所设计的PCR特异检测引物，能扩增出特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。

本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌EHA105，获得用于转化青蒿的含AaTCP15的植物过量表达和反义干扰表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。

实施例6、利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量

1.HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制

HPLC：采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)，流动相为甲醇:水，甲醇:水的体积比为70：30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。

ELSD：采用water alliance 2420系统,蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数(gain)为7，载气压力5bar；

精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。

本发明中流动相为甲醇(methanol)：水，比例为70％：30％时，青蒿素的保留时间为5.1min,峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。

2.标准曲线的制作

将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μl，4μl，6μl，8μl，10μl记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X,μg)进行回归分析。通过研究，本发明中青蒿素在4-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为：Y＝1.28e+000X+4.71e+000，R＝0.979546。

3.样品的制备和青蒿素含量的测定

在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鲜的青蒿叶片，于45℃烘箱中烘至恒重。然后从烘干的枝条上敲下叶和花蕾，磨成粉末。称取约0.1g干粉于2mL Eppendorf管中，加入2mL乙醇，用40W超声波处理30min，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，即可用于HPLC-ELSD测定青蒿素的含量。

采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μl,根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。

测定结果如图1所示(其中A为AaTCP15过量表达载体青蒿中青蒿素的含量，B为AaTCP15反义干扰表达青蒿中青蒿素的含量)，本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量，相较于非转化的野生型青蒿中青蒿素含量为10mg/g DW，AaTCP15过量表达载体青蒿中青蒿素的含量平均15.5mg/g DW，相反，AaTCP15反义干扰表达青蒿中青蒿素含量平均为6.5mg/g DW，青蒿素的含量受到显著调控，为利用该基因进行转录调控研究进而提高青蒿中青蒿素的含量提供了有力的实验证据。

本发明的青蒿TCP类转录因子AaTCP15能够提高植物中青蒿素含量，将所述转录因子的编码序列连于植物表达调控载体上，构建含所述编码序列的植物表达载体；将表达载体转入农杆菌、并将农杆菌转入青蒿；通过抗生素筛选，获得含有所述编码序列的转化细胞，得到再生转基因植株。本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量受到显著调控，采用转化AaTCP15过量表达载体的代谢工程策略，发现AaTCP15基因的过量表达可显著提高青蒿素的含量。本发明提供了一个调控青蒿中青蒿素含量的转录因子编码序列，为利用该编码序列大规模生产青蒿素打下了坚实的基础。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种青蒿TCP类转录因子AaTCP15及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1155

<212> DNA

<213> 青蒿(Artemisia annua L.)

<400> 1

atggatggtg gtaatgatca tttcctcaac aaccaccacc accatcacca acggccgaat 60

tttccttttc aattactcga aaagaaagac gatgaagcca ctacctcttc caacaccacg 120

accacagcca cacacacctc gaatttctct aatatgcaaa taatacagac ggcaactaca 180

tcatctggcg agccatctaa gaaacaaccc cctaaaagaa catccacaaa agacaggcat 240

acaaaagtag acggaagagg ccgtcgtatt cgtatgcctg ccttatgtgc agctagggtt 300

tttcagctaa cccgagaact tggacacaaa tctgatggag aaacaataga atggctgcta 360

caacaagccg aaccctccgt tatagcagcc accgggacgg gtactatccc cgcaaacttc 420

acatcactca atatctcact cagaagctca ggatcaagca tgtcaatccc ttctcagctt 480

agatcaacct acttcaaccc taatttcaca attccagaac gaaagaaact tattcagtca 540

atagggttat ctccgtcaga taatagcaac tcttcatcta atcatttaac cttcggggca 600

ggtatgaacc taaaccaact cctacaagca aaacaagaaa tgcgagaaac gaccattgat 660

ataactgaat cagacgatca gactctagca agaaaacgac gttcaccagg cgagctagat 720

ttatcttcac aacaacacca ccaccaacaa cttggaagct atttgatgca atcaacaact 780

ggagctcttg ctactagcca cccctcagtt ccagctaatt tctggatgtt ggctaatgct 840

aatcaacacc aacatcaaca tcagcatcag ataatgaatg gggatcctgt atggacattt 900

cctaacgtaa ataacaacgc gggtgcggtg tatagaggga cggtttctag tggtttgcat 960

tttatgaact ttccacccgt cgcgattatg ccaggccaac aaatggctag cggtggttat 1020

agtgaaggac aagtgaatat gcttggtggg ttgaattcgt ataggccgat atttggcccg 1080

ggttctacgg agtctccggc gagtgggtcc caccgcggtg gtggtggtga tgatagtaca 1140

agtcacaatt cgtaa 1155

<210> 2

<211> 384

<212> PRT

<213> 青蒿(Artemisia annua L.)

<400> 2

Met Asp Gly Gly Asn Asp His Phe Leu Asn Asn His His His His His

1 5 10 15

Gln Arg Pro Asn Phe Pro Phe Gln Leu Leu Glu Lys Lys Asp Asp Glu

20 25 30

Ala Thr Thr Ser Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ala Thr His Thr Ser Asn

35 40 45

Phe Ser Asn Met Gln Ile Ile Gln Thr Ala Thr Thr Ser Ser Gly Glu

50 55 60

Pro Ser Lys Lys Gln Pro Pro Lys Arg Thr Ser Thr Lys Asp Arg His

65 70 75 80

Thr Lys Val Asp Gly Arg Gly Arg Arg Ile Arg Met Pro Ala Leu Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Val Phe Gln Leu Thr Arg Glu Leu Gly His Lys Ser Asp

100 105 110

Gly Glu Thr Ile Glu Trp Leu Leu Gln Gln Ala Glu Pro Ser Val Ile

115 120 125

Ala Ala Thr Gly Thr Gly Thr Ile Pro Ala Asn Phe Thr Ser Leu Asn

130 135 140

Ile Ser Leu Arg Ser Ser Gly Ser Ser Met Ser Ile Pro Ser Gln Leu

145 150 155 160

Arg Ser Thr Tyr Phe Asn Pro Asn Phe Thr Ile Pro Glu Arg Lys Lys

165 170 175

Leu Ile Gln Ser Ile Gly Leu Ser Pro Ser Asp Asn Ser Asn Ser Ser

180 185 190

Ser Asn His Leu Thr Phe Gly Ala Gly Met Asn Leu Asn Gln Leu Leu

195 200 205

Gln Ala Lys Gln Glu Met Arg Glu Thr Thr Ile Asp Ile Thr Glu Ser

210 215 220

Asp Asp Gln Thr Leu Ala Arg Lys Arg Arg Ser Pro Gly Glu Leu Asp

225 230 235 240

Leu Ser Ser Gln Gln His His His Gln Gln Leu Gly Ser Tyr Leu Met

245 250 255

Gln Ser Thr Thr Gly Ala Leu Ala Thr Ser His Pro Ser Val Pro Ala

260 265 270

Asn Phe Trp Met Leu Ala Asn Ala Asn Gln His Gln His Gln His Gln

275 280 285

His Gln Ile Met Asn Gly Asp Pro Val Trp Thr Phe Pro Asn Val Asn

290 295 300

Asn Asn Ala Gly Ala Val Tyr Arg Gly Thr Val Ser Ser Gly Leu His

305 310 315 320

Phe Met Asn Phe Pro Pro Val Ala Ile Met Pro Gly Gln Gln Met Ala

325 330 335

Ser Gly Gly Tyr Ser Glu Gly Gln Val Asn Met Leu Gly Gly Leu Asn

340 345 350

Ser Tyr Arg Pro Ile Phe Gly Pro Gly Ser Thr Glu Ser Pro Ala Ser

355 360 365

Gly Ser His Arg Gly Gly Gly Gly Asp Asp Ser Thr Ser His Asn Ser

370 375 380

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caacttcgat gctcgagtt 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgttacccca taaatcctt 19

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggcccggg gtcgacatgg atggtggtaa tgatca 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taccggatcc actagtcgaa ttgtgacttg tactat 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggggcccggg gtcgaccgaa ttgtgacttg tactat 36

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taccggatcc actagtatgg atggtggtaa tgatca 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggtatcgat aagcttaaga acttcgagat agaaaa 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atcccccggg ctgcagtcag tgatggagtt ggtaaa 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggtatcgat aagcttatga accattagaa gggaag 36

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atcccccggg ctgcagcttt gttttttatg aaattt 36

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttaccaatac attacactag cat 23

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgaattgtga cttgtactat 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttaccaatac attacactag cat 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atggatggtg gtaatgatca 20

Claims

1.一种青蒿TCP类转录因子AaTCP15在调控青蒿素表达量中的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤一、将所述转录因子AaTCP15的编码基因的核苷酸序列连接于植物表达调控序列上，构建含有所述转录因子AaTCP15的编码基因的植物过量表达载体；所述转录因子AaTCP15的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

步骤二、将青蒿素生物合成关键酶基因DBR2和ALDH1的启动子ProDBR2和ProALDH1分别连入载体pGreenII0800-LUC，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1；

步骤六、将所述步骤一的所述植物过量表达载体与所述步骤五的所述反义干扰载体转入宿主菌株农杆菌EHA105中，分别获得含有所述植物过量表达载体和所述反义干扰载体的工程菌株，并转入青蒿植株中；

2.如权利要求1所述的青蒿TCP类转录因子AaTCP15在调控青蒿素表达量中的应用，其特征在于，所述步骤三和所述步骤六中的所述转入所述宿主菌株的方法采用冻融法。

3.如权利要求1所述的青蒿TCP类转录因子AaTCP15在调控青蒿素表达量中的应用，其特征在于，所述植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1转入的所述宿主菌株为带有pSoup19辅助质粒的农杆菌GV3101菌株。

4.如权利要求1所述的青蒿TCP类转录因子AaTCP15在调控青蒿素表达量中的应用，其特征在于，所述步骤四中的含有所述植物过量表达载体的所述工程菌株与含有所述植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1的所述工程菌株按1：1混合。

5.如权利要求1所述的青蒿TCP类转录因子AaTCP15在调控青蒿素表达量中的应用，其特征在于，所述步骤七中采用抗生素筛选所述转化细胞。

6.如权利要求5所述的青蒿TCP类转录因子AaTCP15在调控青蒿素表达量中的应用，其特征在于，所述抗生素选用卡那霉素。