CN108530525B - 一种青蒿bZIP类转录因子AaABF3及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种青蒿bZIP类转录因子，该转录因子标记为AaABF3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ IDN O:2所示。本发明的编码bZIP类转录因子AaABF3通过与青蒿素合成关键酶基因ALDH1的启动子片段结合，并且激活ALDH1的表达，从而促进青蒿素合成；利用转基因技术将青蒿AaABF3基因过量表达载体转化青蒿显著提高转基因青蒿的青蒿素的含量；利用转基因技术将青蒿AaABF3基因干扰载体转化青蒿显著降低转基因青蒿的青蒿素的含量。该发明中AaABF3基因可应用于青蒿品质改良，可提高青蒿中青蒿素的含量，对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

Description

一种青蒿bZIP类转录因子AaABF3及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种青蒿bZIP类转录因子AaABF3及其应用。
背景技术
青蒿(Artemisia annua L.)是起源于中国的传统药用植物，青蒿素是存在于青蒿中的一种倍半萜类化合物，以青蒿素为基础的青蒿素联合疗法(ACTs)被WHO认定为最有效的抗疟疗法。目前，青蒿是青蒿素唯一的商业来源。近年来又发现青蒿素及其衍生物还具有抗血吸虫、抗病毒、抗肿瘤和治疗糖尿病的作用。因此，青蒿素在当下和未来都具有广阔的应用前景。然而，限制青蒿素供给的一个关键因素是普通野生青蒿植株中青蒿素含量很低，仅占叶片干重的0.1％-1％，因此，如何提高青蒿中青蒿素的含量已成为青蒿产业化进程中的重大问题及目前国内外研究的热点。
目前提高青蒿素含量的分子生物学研究主要集中在过量表达代谢途径功能基因、干扰支路代谢途径和转录因子调控功能基因表达这三个方面，其中转录因子因其能同时调控代谢途径中的多个功能基因的表达而倍受关注。
ABF3是ABA信号通路中主要的调控ABA响应基因表达的转录因子。研究表明，ABA响应基因的启动子中大多数都有多个被称为ABA响应元件(ABA-responsive
elements，ABREs)的G-box类顺式作用元件。以ABREs序列作为诱饵使用酵母单杂交筛选技术筛选了大量ABREs结合蛋白或ABREs结合因子(ABFs)。ABF3属于A亚家族的bZIP转录因子，能被干旱，盐和ABA处理诱导。
根据之前的报道，外源喷洒脱落酸(abscisic acid,ABA)可以显著促进青蒿素合成酶基因表达，提高青蒿素含量。在其他的植物中也有相关的ABA处理提高次生代谢产物的报道，特别是一些中国传统药用植物。目前，ABA调控植物逆境反应的研究已经比较充分，但是在次生代谢调控机制方面研究较少。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，通过青蒿分泌型腺毛转录组数据库的bZIP转录因子的分析，从青蒿中克隆出可以调控青蒿素含量的转录因子AaABF3，该转录因子与青蒿素合成关键酶基因ALDH1的启动子片段结合，激活ALDH1基因表达。利用基因工程手段，将青蒿AaABF3转录因子基因过量表达载体转化青蒿，显著提高转基因青蒿的青蒿素的含量；利用转基因技术将青蒿AaABF3转录因子基因干扰载体转化青蒿，显著降低转基因青蒿的青蒿素的含量。该发明中AaABF3基因可应用于青蒿品质改良，可提高青蒿中青蒿素的含量，对于改良并提高青蒿中青蒿素的含量具有重要的意义。为实现上述目的，本发明提供了一种青蒿bZIP类转录因子，其特征在于，所述转录因子青蒿bZIP类转录因子标记为AaABF3，所述AaABF3的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。。
进一步地，所述AaABF3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提供了一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体编码如权利要求1所述的青蒿bZIP类转录因子的氨基酸序列，
进一步的，所述重组表达载体包括SEQ ID NO：1中的核苷酸序列。
本发明提供了一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包括AaABF3氨基酸或者核苷酸序列的重组表达载体。优选的，所述转化体为宿主菌株为根癌农杆菌。
本发明还提供一种青蒿bZIP类转录因子在调节青蒿素表达量中的应用，所述AaABF3转录因子通过与青蒿素合成关键酶基因ALDH1的启动子片段结合，激活ALDH1基因表达，调控青蒿素的表达。
进一步的，所述提高青蒿素表达量的应用包括如下步骤：
步骤一，将AaABF3核苷酸序列连接于酵母表达调控序列上，构建含AaABF3转录因子编码序列的酵母单杂载体pB42AD-AaABF3；
步骤二，将步骤一中的载体转入酵母单杂菌株EGY48；
步骤三，通过阳性克隆菌株的筛选，获得含有AaABF3转基因酵母菌，所述转基因酵母菌转接到酵母单杂交显色板上，验证AaABF3与青蒿素合成关键酶基因ALDH1启动子的结合。
步骤四，将AaABF3核苷酸序列连于植物表达调控序列上，构建含AaABF3的植物过表达和干扰载体；
步骤五，将步骤一中的表达载体转入农杆菌EHA105，获得具有过量表达和干扰表达载体的根癌农杆菌菌株；将农杆菌转入青蒿；
步骤六，通过抗生素筛选，获得含有青蒿bZIP类转录因子编码序列AaABF3的转化细胞，再生转基因植株，所述过表达AaABF3转基因植株的青蒿素含量得到提高；干扰AaABF3转基因植株的青蒿素含量降低。
进一步的，所述转入具体为：采用冻融法进行转入。
本发明提供一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、对青蒿分泌型腺毛转录组数据库bZIP类转录因子分析，从青蒿cDNA文库中克隆到青蒿bZIP类转录因子AaABF3；
步骤二、把AaABF3基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaABF3基因的植物过表达和RNAi干扰载体；
步骤三、将含AaABF3基因的植物过表达和干扰表达载体分别转化根癌农杆菌EH105，获得具有该过表达和干扰表达载体的根癌农杆菌菌株；
步骤四、利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，经抗生素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青蒿苗；
步骤五、对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，进而获得青蒿素含量提高的青蒿植株。
进一步地，步骤四中，所述的经PCR检测的转基因青蒿植株是指，分别设计合成AaABF3基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株。
本发明还提供了一种青蒿bZIP类转录因子编码序列AaABF3的克隆方法，其特征在于，所述克隆方法包括以下步骤：
步骤一、总RNA的提取与纯化，采用各种通用的植物总RNA提取试剂盒提取并纯化获得青蒿叶片总RNA；
步骤二、用反转录酶将所述青蒿叶片总RNA反转成cDNA；
步骤三、以所述cDNA为模板，通过设计基因特异引物，采用PCR的方法扩增，获得PCR产物，所述基因特异引物为：
正向引物P1：5’-ATGAGTTCATTAATGAATCCCAAG-3’；
反向引物P2：5’-CTACCAAGGTCCTGATAACGTTCTT-3’；
步骤四、PCR产物回收纯化测序，获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明通过对青蒿分泌型腺毛转录组数据库bZIP类转录因子分析，从青蒿中克隆AaABF3基因，构建含AaABF3基因的植物过表达和干扰表达载体，用根癌农杆菌EH105介导，采用叶盘法将AaABF3基因过表达和干扰表达载体转化青蒿；PCR检测外源目的基因AaABF3的整合情况，高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定青蒿中青蒿素含量，表明获得的转基因青蒿中的青蒿素含量显著提高。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的青蒿AaABF3蛋白多肽时，可以将青蒿AaABF3蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成青蒿AaABF3蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连接于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
本发明中所涉及的农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EH105，该菌株可以从市场上公开购买(来源于澳大利亚CAMBIA公司，菌株编号为Gambar1)。
本发明克服了现有技术中的不足，提供一种青蒿bZIP类转录因子AaABF3编码序列，该基因编码bZIP类转录因子AaABF3，AaABF3结合青蒿素合成关键酶基因ALDH1的启动子，并激活ALDH1的基因表达；利用转基因技术将青蒿AaABF3转录因子基因过量表达载体转化青蒿，显著提高转基因青蒿的青蒿素的含量；利用转基因技术将青蒿AaABF3转录因子基因干扰载体转化青蒿，显著降低转基因青蒿的青蒿素的含量。该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。
附图说明
图1是AaABF3结合ALDH1基因启动子的ABRE区域；
图2是AaABF3转录因子在调节青蒿素表达量，其中A图示出了在青蒿中过量表达AaABF3基因，显著提高了青蒿素含量；B图示出了在青蒿中抑制AaABF3基因的表达，显著降低了青蒿素含量显著提高了青蒿素含量；
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1、青蒿AaABF3基因的克隆
1.青蒿基因组总RNA的提取
取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用琼脂糖胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
2.青蒿AaABF3基因的克隆
以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成cDNA；根据AaABF3基因的序列设计基因特异性引物，如表1所示，通过PCR从总cDNA中扩增AaABF3基因，并测序。
通过上述步骤，获得了青蒿中该转录因子的全长编码序列(SEQ ID NO:1)并推导出其蛋白编码序列(SEQ ID NO：2)，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。
表1 PCR引物
引物名称 引物序列(5’→3’)
AaABF3-FP ATGAGTTCATTAATGAATCCCAAG
AaABF3-RP CTACCAAGGTCCTGATAACGTTCTT
表2 PCR的反应体系
青蒿cDNA 1μL
10×KODPlusBuffer 5μL
dNTP 5μL
MgSO<sub>4</sub> 2μL
AaABF3-FP 1μL
AaABF3-RP 1μL
KODPlus 1μL
ddH<sub>2</sub>O 34μL
总体积 50μL
实施例2、含AaABF3基因的酵母单杂载体的构建
将AaABF3基因构建在酵母单杂载体上，为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了EcoRI的酶切位点，反向引物中引入了XhoI的酶切位点，引物如表3所示；
表3 pB42AD-AaABF3载体构建的PCR引物
引物名称 引物序列(5’→3’)
EcoRI-AaABF3-FP CGGAATTCATGAGTTCATTAATGAATCCCAAG
AaABF3-XhoI-RP GCCTCGAGCTACCAAGGTCCTGATAACGTTCTT
实施例3、AaABF3与ALDH1启动子的酵母单杂交
1.酵母感受态细胞制备
从-80℃冰箱取出EGY48菌株在YPDA培养基上划线，于30℃恒温培养箱培养三天，挑取生长较快的单克隆于10mL的YPDA上过夜培养(30，220rpm)，第二天测OD600大于2.0之后，将菌液用YPDA培养基稀释至OD600为0.4，继续在30℃中速摇菌2-4h，室温2500rpm离心10分钟，弃上清，然后用40mL 1×TE悬浮，再室温2500rpm离心10min，小心弃上清，用2mL 1×LiAC/0.5×TE悬浮，室温放置10min，即为酵母感受态。
2.酵母转化
将含AaABF3基因的质粒和含ALDH1启动子片段的质粒各取2μL加入无菌的1.5mLEP管中，再加入10μL 10mg/mL的预变性鲑鱼精DNA(Clontech)和100μL酵母感受态细胞，轻轻混匀后，加入700μL 1×LiAc/40％PEG3350/1×TE，震荡混匀后放在30℃金属水浴锅30min，期间颠倒数次。然后加入88μL DMSO，42℃热击7min，转化后的菌13200rpm离心15s，用移液枪小心吸掉上清后加入1mL 1×TE悬浮菌，然后再13200rpm离心15s，用移液枪小心吸掉上清后加入100μL的1×TE悬浮菌体，并全部涂布于SD-T-L营养缺陷培养基，于30℃恒温培养箱培养三天。将缺陷型培养基上长出来的酵母单菌落点板于含有X-GAL的定性板上，于30℃恒温培养箱避光培养三天，酵母斑呈现蓝色说明AaABF3可以和青蒿素合成关键酶基因ALDH1的启动子片段结合，结果如图1所示。
实施例4、含AaABF3基因的植物过量表达载体的构建
将AaABF3基因构建在过量表达载体pHB上，为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了SacI的酶切位点，反向引物中引入了XbaI的酶切位点，引物如表3所示；
表3 pHB-AaABF3载体构建的PCR引物
引物名称 引物序列(5’→3’)
SacI-AaABF3-FP CGAGCTCATGAGTTCATTAATGAATCCCAAG
AaABF3-XbaI-RP TGCTCTAGACTACCAAGGTCCTGATAACGTTCTT
实施例5、含AaABF3基因的植物干扰表达载体的构建
1.中间载体pTOPO-AaABF3的构建
在AaABF3基因的非保守区域设计上游引物和下游引物，用以构建干扰载体。在上游引物ATG碱基前添加CACC四个碱基以构建Gateway入门载体。按照Invitrogen公司pENTRTM/
Figure BDA0001644251860000061
Cloning Kit的操作步骤，先用平端酶扩增得到AaABF3的片段，回收纯化后通过Gateway克隆技术连接到pENTR/D-TOPO载体。
2.植物表达干扰载体pHELLSGATE1.2-AaABF3的构建
按照Invitrogen公司的LR
Figure BDA0001644251860000062
II Enzyme试剂盒的操作，将pENTR-AaABF3载体中的AaABF3的干扰片段重组到RNA干扰载体pHELLSGATE1.2的两个可以形成发夹结构的重组位点中，得到AaABF3的RNA干扰载体pHELLSGATE1.2-AaABF3。
本实施例将青蒿AaABF3基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaABF3发卡结构的植物表达干扰载体，该载体可用于通过代谢工程策略来调控青蒿中青蒿素的含量。所需引物如表4所示：
表4 Phellsgate1.2-AaABF3载体构建的PCR引物
引物名称 引物序列(5’→3’)
AaABF3-RNAi-FP CACCGGTGGTCATTGTCAGAATGGAGT
AaABF3-RNAi-RP ATTCTGAAGCCTTCCATTTGTTC
实施例6、根癌农杆菌介导的AaABF3过表达和干扰载体遗传转化青蒿获得转基因青蒿植株
1.含AaABF3过量表达和干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得
将实施例2中含AaABF3的植物过量表达和干扰表达载体采用冻融法分别转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证。结果表明，含AaABF3的植物过量表达和干扰表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。
2.根癌农杆菌介导AaABF3基因转化青蒿
2.1.外植体的预培养
青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog,1962)固体培养基中，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。
2.2.农杆菌与外植体的共培养
将所述的叶片外植体，转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含AaABF3植物过量表达和干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。
2.3.抗性再生植株的筛选
将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+Hyg(过表达)/Kan(干扰)50mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Hyg/Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根，从而获得Hyg/Kan抗性再生青蒿植株。
3.转基因青蒿植株的PCR检测
根据AaABF3基因序列和植物表达序列分别设计正向检测引物(AaABF3-FP2:5’-GCTGCTTTCAACTTCAACACTTC-3’)和反向检测引物(rbc48a:5’-GCATTGAACTTGACGAACGTTGTCGA-3’)对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AaABF3植物过量表达和干扰表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。
实施例7、利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量
1.HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制
HPLC：采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)，流动相为甲醇:水，甲醇:水的体积比为70:30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。
ELSD：采用water alliance 2420系统,蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数(gain)为7，载气压力5bar；
精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。
本发明中流动相为甲醇(methanol)：水，比例为70％：30％时，青蒿素的保留时间为5.1min,峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。
2.标准曲线的制作
将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μl，4μl，6μl，8μl，10μl记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X,μg)进行回归分析。通过研究，本发明中青蒿素在4-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为：Y＝4.58e+000X+1.32e+000，R2＝0.998716。
3.样品的制备和青蒿素含量的测定
在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鲜的青蒿叶片，于45℃烘箱中烘至恒重。然后从烘干的枝条上敲下叶和花蕾，磨成粉末。称取约0.1g干粉于2mL Eppendorf管中，加入2mL乙醇，用40W超声波处理30min，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，即可用于HPLC-ELSD测定青蒿素的含量。
采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μl,根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。
本发明的青蒿bZIP类转录因子编码序列AaABF3能够实现提高植物中青蒿素含量，将所述编码序列连于植物表达调控载体上，构建含所述编码序列的植物表达载体；将表达载体转入农杆菌，将农杆菌转入青蒿；通过抗生素筛选，获得含有所述编码序列的转化细胞，再生转基因植株；本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量受到显著调控，在非转化普通青蒿含量为9mg/g DW时，同时期转AaABF3干扰载体青蒿中青蒿素的含量平均为6mg/gDW，相反，AaABF3过量表达载体青蒿中青蒿素的含量平均为14mg/g DW。本发明提供了一个调控青蒿中青蒿素含量的转录因子编码序列，为利用该编码序列大规模生产青蒿素打下了坚实的基础(图2)。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种青蒿bZIP类转录因子AaABF3及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1149
<212> DNA
<213> 青蒿(Artemisia annua L.)
<400> 1
atgagttcat taatgaatcc caagaactgt agttcccaaa ccagtaagtc gacaatgacg 60
aattcaccat tgccccaaca atcttctgtt tacgcgttaa ctttcgaaga attacagaac 120
acaatgggtg gaagtgggaa ggactttgga tcaatgaata tggatgagct tttaaagaac 180
atttggactg ctgaagagac tcaagaaatg acaccaaacc tcaatttgag tgtcgttaat 240
catgggaatt tgctaaagca aggatcttta acattaccaa gaacgcttag tcagaaaacg 300
gttgatgaag tttggagaga gctggttaaa gaaaatggtg gtcattgtca gaatggagtc 360
aaagatgtga atttgatcaa agaagcagac ttgcagccac aagagaagcc accagcttta 420
cgtgagatga cactagaggc attcttgcag aaagcagggg tagttgggga aaataaccaa 480
actcgaacaa atggaaggct tcagaatgat gcaccttttg gtgatggaag tagttttgtt 540
tttgggttta aaaactcgaa tcagaataca gggtatcatc aacaagcagt tggtaccaaa 600
agaaaaactg aagttgacaa tttgcaaggt gttagatctt cacaacaacc aaaaccgcag 660
aaaattcttc caaagcaagc tgctttcaac ttcaacactt catcaaatgt agtgaagaat 720
actcagatga gtagtcatgg aaatgatgtt tctataattc gaaagacaga taatccaata 780
aaaactagca tggctcaacg tgatttattt acaaatagta atttggatac atcaccatct 840
ccaccgtctt acgcatatag tcaaggtgtt catgaaagaa aaaggagtgg tactttggag 900
aaagtggtgg agagaaggca gaagaggatg attaagaata gagagtccgc tgcacggtca 960
cgggctcgga aacaggcgta cacattggaa ttggaagctg aagttgaaaa actaaaagaa 1020
gttaaccacg agttgcagaa aaagcaggaa gagatcatgg agtcacagaa ttttcaggta 1080
cctgagaaga caaagttgag tggaagtaga agattatgtt taagaagaac gttatcagga 1140
ccttggtag 1149
<210> 2
<211> 382
<212> PRT
<213> 青蒿(Artemisia annua L.)
<400> 2
Met Ser Ser Leu Met Asn Pro Lys Asn Cys Ser Ser Gln Thr Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Met Thr Asn Ser Pro Leu Pro Gln Gln Ser Ser Val Tyr Ala
20 25 30
Leu Thr Phe Glu Glu Leu Gln Asn Thr Met Gly Gly Ser Gly Lys Asp
35 40 45
Phe Gly Ser Met Asn Met Asp Glu Leu Leu Lys Asn Ile Trp Thr Ala
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Glu Met Thr Pro Asn Leu Asn Leu Ser Val Val Asn
65 70 75 80
His Gly Asn Leu Leu Lys Gln Gly Ser Leu Thr Leu Pro Arg Thr Leu
85 90 95
Ser Gln Lys Thr Val Asp Glu Val Trp Arg Glu Leu Val Lys Glu Asn
100 105 110
Gly Gly His Cys Gln Asn Gly Val Lys Asp Val Asn Leu Ile Lys Glu
115 120 125
Ala Asp Leu Gln Pro Gln Glu Lys Pro Pro Ala Leu Arg Glu Met Thr
130 135 140
Leu Glu Ala Phe Leu Gln Lys Ala Gly Val Val Gly Glu Asn Asn Gln
145 150 155 160
Thr Arg Thr Asn Gly Arg Leu Gln Asn Asp Ala Pro Phe Gly Asp Gly
165 170 175
Ser Ser Phe Val Phe Gly Phe Lys Asn Ser Asn Gln Asn Thr Gly Tyr
180 185 190
His Gln Gln Ala Val Gly Thr Lys Arg Lys Thr Glu Val Asp Asn Leu
195 200 205
Gln Gly Val Arg Ser Ser Gln Gln Pro Lys Pro Gln Lys Ile Leu Pro
210 215 220
Lys Gln Ala Ala Phe Asn Phe Asn Thr Ser Ser Asn Val Val Lys Asn
225 230 235 240
Thr Gln Met Ser Ser His Gly Asn Asp Val Ser Ile Ile Arg Lys Thr
245 250 255
Asp Asn Pro Ile Lys Thr Ser Met Ala Gln Arg Asp Leu Phe Thr Asn
260 265 270
Ser Asn Leu Asp Thr Ser Pro Ser Pro Pro Ser Tyr Ala Tyr Ser Gln
275 280 285
Gly Val His Glu Arg Lys Arg Ser Gly Thr Leu Glu Lys Val Val Glu
290 295 300
Arg Arg Gln Lys Arg Met Ile Lys Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser
305 310 315 320
Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr Leu Glu Leu Glu Ala Glu Val Glu
325 330 335
Lys Leu Lys Glu Val Asn His Glu Leu Gln Lys Lys Gln Glu Glu Ile
340 345 350
Met Glu Ser Gln Asn Phe Gln Val Pro Glu Lys Thr Lys Leu Ser Gly
355 360 365
Ser Arg Arg Leu Cys Leu Arg Arg Thr Leu Ser Gly Pro Trp
370 375 380
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgagttcat taatgaatcc caag 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctaccaaggt cctgataacg ttctt 25
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12

Claims (7)

1.一种青蒿bZIP类转录因子，其特征在于，所述转录因子青蒿bZIP类转录因子标记为AaABF3，所述AaABF3的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体编码如权利要求1所述的青蒿bZIP类转录因子的氨基酸序列。
3.一种如权利要求1所述的青蒿bZIP类转录因子在调节青蒿素表达量中的应用，所述AaABF3转录因子通过与青蒿素合成关键酶基因ALDH1的启动子片段结合，激活ALDH1基因表达，调控青蒿素的表达。
4.如权利要求3所述的青蒿bZIP类转录因子在调节青蒿素表达量中的应用，其特征在于，所述提高青蒿素表达量的应用包括如下步骤：
步骤一，将AaABF3核苷酸序列连接于酵母表达调控序列上，构建含AaABF3转录因子编码序列的酵母单杂载体pB42AD-AaABF3，所述AaABF3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
步骤二，将步骤一中的载体转入酵母单杂菌株EGY48；
步骤三，通过阳性克隆菌株的筛选，获得含有AaABF3转基因酵母菌，所述转基因酵母菌转接到酵母单杂交显色板上，验证AaABF3与青蒿素合成关键酶基因ALDH1启动子的结合；
步骤四，将AaABF3核苷酸序列连于植物表达调控序列上，构建含AaABF3的植物过表达和干扰载体；
步骤五，将步骤一中的表达载体转入农杆菌EHA105，获得具有过量表达和干扰表达载体的根癌农杆菌菌株；将农杆菌转入青蒿；
步骤六，通过抗生素筛选，获得含有青蒿bZIP类转录因子编码序列AaABF3的转化细胞，再生转基因植株，所述过表达AaABF3转基因植株的青蒿素含量得到提高；干扰AaABF3转基因植株的青蒿素含量降低。
5.根据权利要求4青蒿bZIP类转录因子在调节青蒿素表达量中的应用，其特征是，步骤五中，所述转入具体为：采用冻融法进行转入。
6.一种利用如权利要求1所述的青蒿bZIP类转录因子提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、对青蒿分泌型腺毛转录组数据库bZIP类转录因子分析，从青蒿cDNA文库中克隆到青蒿bZIP类转录因子AaABF3；
步骤二、把AaABF3基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaABF3基因的植物过表达和RNAi干扰载体；
步骤三、将含AaABF3基因的植物过表达和干扰表达载体分别转化根癌农杆菌EH105，获得具有该过表达和干扰表达载体的根癌农杆菌菌株；
步骤四、利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，经抗生素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青蒿苗；
步骤五、对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，进而获得青蒿素含量提高的青蒿植株。
7.如权利要求6所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，步骤四中，所述的经PCR检测的转基因青蒿植株是指，分别设计合成AaABF3基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株。
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