CN112375767A - 一种青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因及应用。AaWRKY4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；AaWRKY4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。过量表达AaWRKY4基因提高青蒿中青蒿素含量的方法如下：从青蒿中克隆青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因；构建含AaWRKY4基因的植物表达载体；用根癌农杆菌介导，将AaWRKY4基因转入青蒿并再生出植株；PCR检测目的基因整合情况；HPLC‑ELSD测定转基因青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明提供的转AaWRKY4基因青蒿的青蒿素含量比非转化青蒿提高了35％‑50％，为青蒿素的规模化生产提供了高产、稳定的植物基源。

Description

一种青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种青蒿WRKY类转录因子 AaWRKY4基因及应用，尤其是，一种青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因、 AaWRKY4蛋白、重组表达载体、重组表达转化体及应用。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是 从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认 的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的 特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生 物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜 力的天然药物。

目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，不同种植环境和种植品种中其平均含量为青蒿叶片干重的0.01～1％，使 得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度 大，产量低，成本高，不具有可行性。也有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来 生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有 干重的0.16％，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞 工程来生产青蒿素的可行性也不高。

随着青蒿素生物合成途径的逐渐清晰，采用基因工程手段提高青蒿中青蒿素含量具有非常大的潜力，例如过量表达青蒿素合成途径关键酶编码基因和相关的转录 调控因子被证实是一种提高青蒿素含量的有效方法。现有技术中过量表达青蒿素合 成途径关键酶编码基因(如ADS,CYP等基因的表达)能够提高青蒿中青蒿素的含 量。研究发现转录调控因子(如ERF类，bHLH类等转录调控因子)也参与调控 青蒿素的代谢调控。因此，寻找更多的转录调控因子，将打破青蒿素生物合成的限 速瓶颈，获得青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供了一条新途径。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种青蒿WRKY类转录因子 AaWRKY4基因及应用。

本发明的目的是通过以下方案实现的：

本发明的第一方面提供一种青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因，所述 AaWRKY4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二方面提供一种青蒿AaWRKY4蛋白，所述AaWRKY4蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的第三方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。

本发明的第四方面提供一种重组表达转化体，所述重组表达转化体包含如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。

优选地，所述重组表达转化体的宿主菌株为根癌农杆菌。

本发明的第五方面提供上述青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因在提高青蒿 素含量中的应用。

本发明的第六方面提供一种青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因提高青蒿中 青蒿素含量的方法，包括以下步骤：

步骤一、采用基因克隆方法获得青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因，所述 AaWRKY4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

步骤二、把所述AaWRKY4基因连接于表达调控序列，构建含AaWRKY4基因 的植物表达载体；

步骤三、将含AaWRKY4基因的植物表达载体转化宿主菌株，获得具有所述植 物表达载体的菌株；宿主菌株优选为根癌农杆菌菌株；

步骤四、利用步骤三中构建的所述菌株转化青蒿，经抗生素筛选得到抗性苗， 再经PCR检测得到整合外源目的基因AaWRKY4的转基因青蒿植株；

步骤五、对步骤四中得到的所述转基因青蒿植株中青蒿素含量进行HPLC-ELSD 测定，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

进一步地，所述步骤一中，基因克隆方法中，使用的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，在步骤四中，所述转化包括以下步骤：外植体的预培养；农杆菌与 外植体的共培养；抗性再生植株的筛选。

所述预培养包括以下步骤：青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO 浸泡10min，无菌水冲洗3～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的 MS固体培养基中，23℃光照培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm后，剪取 无菌苗叶片外植体用于转化。

所述共培养包括以下步骤：将所述叶片外植体转到共培养培养基中，加含活化 的所述含AaWRKY4基因植物表达载体的根癌农杆菌的1/2MS悬液浸染，使所述外 植体与所述含AaWRKY4基因植物表达载体的悬液充分接触，28℃暗培养3天，以 浸染不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

所述筛选包括以下步骤：将所述共培养3天的青蒿外植体转入到芽诱导培养基 上于23℃光照培养，每两周继代培养一次，经过2～3次继代后即可获得Kan(卡 那霉素)抗性丛生芽，将所述生长良好的抗性丛生芽分植，并转入生根培养基上培 养至生根，即可获得Kan(卡那霉素)抗性再生青蒿植株。

进一步地，步骤四中，PCR检测中使用的正向引物序列如SEQ ID NO.3所示； 反向引物序列如SEQ ID NO.4所示。所述PCR检测包括以下步骤：设计合成 AaWRKY4基因的引物；提取抗生素筛选阳性植株的总DNA，进行目的DNA的PCR 扩增；紫外线下观察到目的条带的抗生素筛选阳性株系即为转基因青蒿植株。

进一步地，在步骤五中，所述HPLC-ELSD测定包括以下条件：色谱柱C-18反 相硅胶柱，流动相为甲醇：水，甲醇：水的体积比为70：30，柱温30℃，流速1.0 mL/min，进样量为20μL，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数为7，载 气压力5bar。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明提供一种青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因提高青蒿中青蒿素 含量的方法，获得的转基因青蒿株系的青蒿素含量显著提高，转AaWRKY4基因青 蒿中青蒿素的含量比非转化青蒿含量提高了35％-50％，为青蒿素的规模化生产提供 了高产、稳定的新药源。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明提供的转AaWRKY4基因青蒿株中青蒿素的含量检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人 员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于 本发明的保护范围。

青蒿WRKY类转录因子AaWRKY1能够调控青蒿素合成途径中关键酶基因，是 青蒿素代谢工程的重要元件，采用基因工程手段，过量表达AaWRKY1基因转化青 蒿，也能提高青蒿中青蒿素的含量。

本发明从青蒿中克隆AaWRKY4基因，构建含AaWRKY4基因的植物表达载体，用 根癌农杆菌介导，将AaWRKY4基因导入青蒿并再生出植株；PCR检测外源目的基因 AaWRKY4的整合情况，HPLC-ELSD测定青蒿中青蒿素含量，筛选获得青蒿素含量提 高的转基因青蒿植株。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的 条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、青蒿AaWRKY4基因的克隆

一、青蒿总RNA的提取

1.11、青蒿总RNA|的提取使用总RNA提取试剂盒(TIANGEN，编号DP432)。剪 取新鲜青蒿叶片(以100mg为例)，加入液氮在研钵中迅速研磨成粉末，转入1.5mL 离心管，并加入450μL RL(使用前加入β-巯基乙醇)，涡旋混匀；

1.12、用移液器将溶液转移至试剂盒收集管中的过滤柱上，放入离心机12000rpm离 心4min，后取上清至RNase-free的Eppendorf管中；

1.13、缓慢加入约225μL无水乙醇，混匀，将混合液转入吸附柱，放入离心机12000rpm离心50s，弃废液，将吸附柱重新放在收集管上；

1.14、加入350μL去蛋白液RW1，放入离心机12000rpm离心50s，弃废液，将吸 附柱重新放在收集管上；

1.15、按照说明书配制DNase I工作液；向吸附柱中间加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min；

1.16、加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心50s，弃废液，将吸附柱重新放在收集管上；

1.17、加入500μL漂洗液RW(使用前确保已加入乙醇)，室温静置2min后转入离心机，12000rpm离心50s，弃废液，将吸附柱重新放在收集管上；

1.18、重复上一步操作步骤一次(步骤1.17)；

1.19、继续12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱置于室温放置10min，以晾干残余的漂洗液；

1.20、将吸附柱放入一个新的RNase-free的Eppendorf管中，向吸附膜的中央滴加50μL RNase-free的无菌水，室温溶解2min，随后放入离心机，12000rpm离心2min， 即得青蒿总RNA溶液。

1.21、用琼脂糖凝胶(变性胶)电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定 RNA含量，经测定，RNA的含量为400ng/μL。

(二)、青蒿AaWRKY4基因的克隆

将上步所提取的青蒿基因组总RNA通过反转录酶反转录获得第一链cDNA，根据 所述青蒿AaWRKY4基因的编码序列(如SEQ ID NO.5所示)，设计扩增出完整编码框的 上下游引物，(上游引物序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物序列如SEQ ID NO.2所示) 并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，以便构建表达载体。以所述的第一 链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海Invitrogen公司测序 完成。

PCR扩增用KOD-plus扩增(50μL体系)：

成分	含量
		ddH<sub>2</sub>O	34.5μL
10×KOD-plus buffer	5μL
		25mM MgSO<sub>4</sub>	2μL
2.5mM dNTPs	5μL
		10μM上游引物	1μL
10μM下游引物	1μL
		KOD-plus	0.5μL
DNA template	1μL

PCR程序：

1)94℃，4min预变性；2)变性94℃，1min；3)退火56℃，1min；

4)延伸68℃，1min；5)Go to step 2，32cycles；6)68℃，10min；

7)10℃，10min；8)End。

通过上述步骤，获得了青蒿中WRKY类转录因子AaWRKY4的编码序列(如SEQ IDNO.5所示)，并推导出其蛋白的氨基酸编码序列(SEQ ID NO：6)，其中，起始密码子为 ATG，终止密码子为TAA。

氨基酸编码序列(SEQ ID NO：6)如下所示：

MAVDLIMSTTTEHNAVQEAASGLESVQKLIRLLSHQQSSQQVAPDEYQAVADMA VNKFKRVISLLGRTNRELTGHARFRRAPSVNSNNNNNNNSSSIVIRNSEQDDVVSDES ETKVYNPTPIQQVPFVPPPPVMQPAPPAMFQRKDSLPKTISFSYSPAVSRASSFMSSLTG DSDGKQLSAGGKPPLCSASCVKRKCSSSENGGSGKCSGGSSGRCQCSKRRKLRMKR VVRVKAISMKLADIPPDDYSWRKYGQKPIKGSPHPRGYYKCSSVRGCPARKHVERALDDPSMLIVTYEGDHNHALSIAEASGLILESS。

实施例2、含AaWRKY4基因的植物双元表达载体的构建

(一)中间载体pMD18T-AaWRKY4的构建

选用pMD18T-simple载体(Takara，Dalian)为基本元件，构建中间载体pMD18T-AaWRKY4。具体地，通过高保真酶和引物序列(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)扩 增基因全长，在基因全长中，AaWRKY4基因前后分别引入BamH I和Sac I酶切位点， 通过连接酶连接到pMD18T-simple载体上，由上海Invitrogen公司测序确认基因序列的 正确性。

(二)植物表达载体pHB-AaWRKY4的构建

将实施例1中AaWRKY4基因连入其对应的酶切位点位置。具体方法，将中间载体pMD18T-AaWRKY4和表达载体pHB分别采用限制性内切酶BamH I和Sac I进行双酶 切，回收AaWRKY4基因片段和pHB载体大片段，连接并转化大肠杆菌，挑取单克隆， 提取质粒，用特异性引物序列(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)通过PCR检测和酶 切验证。

本实施例将青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaWRKY4基因的植物表达载体，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高青 蒿中青蒿素的含量。

实施例3、根癌农杆菌介导AaWRKY4基因遗传转化青蒿获得转基因青蒿植株

(一)含AaWRKY4基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得

将实施例2中含AaWRKY4基因的植物双元表达载体pHB转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编 号为Gambar 1)，并进行PCR验证。转化过程如下：1)将8μL重组质粒DNA加至100 μL冰上融化的EHA105感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min；2)在液氮冷冻8min； 3)立即取出放入37℃水浴锅中5min，后置于冰上3min；4)加入400-800μL无抗 生素的YEP液体培养基，轻轻混匀，28℃200rpm震荡培养2h；5)4000rpm室温离 心10min,去上清液，将剩余的菌液混匀重悬；6)将菌液涂于选择平板(含抗生素40 μg/mL Rif(利福平)+40μg/mL Str(链霉素)+100μg/mL Kan(卡那霉素))；7)在 28℃培养箱中倒置培养2-3天，后挑取单克隆，摇菌，用特异性引物序列(SEQ ID NO： 3和SEQ ID NO：4)进行PCR检测。结果表明，含AaWRKY4基因植物双元表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。

(二)根癌农杆菌介导AaWRKY4基因转化青蒿

(1)外植体的预培养

青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡10min，无菌水冲洗3～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固体培 养基中，23℃、16h/8h(light/dark)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左 右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

(2)农杆菌与外植体的共培养

将所述的叶片外植体，转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，滴加活化好的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液(根癌农杆菌工程菌含AaWRKY4基因植物双元表 达载体)，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3天。对照组为：在共培养培养基 (1/2MS+AS(乙酰丁香酮)100μmol/L)中的叶片外植体上，滴加不带有目的基因的根 癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液。

(3)抗性再生植株的筛选

将共培养3天的青蒿外植体，继代接种到芽诱导培养基(MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L十Hyg(潮霉素)50mg/L+Cb 500mg/L)上于23℃、16h/8h光照培养， 每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Hyg抗性丛生芽。将生长良好的抗 性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根，从而获得Hyg(潮 霉素)抗性再生青蒿植株。

(三)转基因青蒿植株的PCR检测

根据目的基因所在表达盒pHB-AaWRKY4序列分别设计上游引物和下游引物(SEQID NO：3和SEQ ID NO：4)对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特 异引物，能扩增出约1kb左右的特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板 时，没有扩增出任何片段。

用Taq酶检测(15μL体系)：

成分	含量
		ddH<sub>2</sub>O	11μL
10×Taq buffer	1.5μL
		2.5mM dNTPs	0.6μL
10μM上游引物	0.3μL
		10μM下游引物	0.3μL
Taq酶	0.3μL
		DNA template	1μL

PCR程序：

1)94℃，4min预变性；2)变性94℃，1min；3)退火56℃，1min

4)延伸72℃，1min；5)Go to step 2，34cycles；6)72℃，10min

7)10℃，1h；8)End

挑取阳性克隆，摇菌并送测序。

本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AaWRKY4基因植物双元表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转 化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高 青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。

实施例4、利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量

(一)HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制

HPLC：采用Water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShield TM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)，流动相为甲醇﹕水，甲醇﹕水的体积比为70﹕ 30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按青 蒿素峰计算不低于2000。

ELSD：采用Water alliance 2420系统，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系 数(gain)为7，载气压力5bar。

精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL 青蒿素标准品溶液，保存于－20℃备用。

本发明中流动相为甲醇﹕水，比例为70％﹕30％时，青蒿素的保留时间为5.1min，峰型良好。理论塔板数按青菌素计算不低于2000。

(二)标准曲线的制作

将上述配制的青蒿素标准品溶液在相应色谱条件下分别进样2μL，4μL，6μL，8μL，10μL记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X，μg)进行回归分析。通 过研究，本发明中青蒿素在4～20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照 品的log-log线性回归方程为Y＝7.286836X+2.033682，R²＝0.997766。

(三)样品的制备和青蒿素含量的测定

将抗性再生青蒿植株移栽到温室的土壤中培养2个月后，采用HPLC的方法，进行青蒿素含量的测定(均进行了三组重复试验)。具体方法如下：

青蒿素的提取过程基于Van Nieuwerburgh et al.(2006)中报道的方法：取少量新鲜的 青蒿叶片(1～2g鲜重)，于50mL试管中将其浸没在10mL氯仿中摇荡1分钟，将浸 出液倒入新的试管中使氯仿挥发完全，取3mL无水乙醇充分溶解提取物，经0.22μm 滤膜过滤后用于HPLC检测。同时，收集氯仿提取后的叶片，放入60℃烘箱进行烘干， 至恒重后称重(计算青蒿叶片的干重dry weight,DW)。

采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μL，根据峰面积代入线形 回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出 青蒿植株中青蒿素的含量。

在本发明中，选用了四组AaWRKY4过量表达的转基因株系：AaWRKY4-6, AaWRKY4-22,AaWRKY4-24,AaWRKY4-28，进行三次生物学重复，并用t-test进行分 析(**,P<0.01)。实验结果如表1和图1所示，与非转基因对照相比，AaWRKY4过量 表达的转基因植株中青蒿素含量得到了显著的提高，四个独立的转基因株系 AaWRKY4-6，AaWRKY4-22，AaWRKY4-24和AaWRKY4-28分别约提高了48％，50％， 48％和35％(含量如表1所示)，即转AaWRKY4基因青蒿中青蒿素的含量比非转化青 蒿含量提高了35％-50％。

表1、四组AaWRKY4过量表达的转基因株系的青蒿素含量的测定结果

本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量，采用转化 AaWRKY4基因的代谢工程策略获得了青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提 供了一种理想方法。

本发明涉及一种青蒿AaWRKY4蛋白及编码基因、通过转基因技术提高青蒿植株的青蒿素含量的方法；从青蒿中克隆青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因；构建含 AaWRKY4基因的植物表达载体；用根癌农杆菌介导，将AaWRKY4基因转入青蒿并再 生出植株；PCR检测目的基因AaWRKY4的整合情况；高效液相色谱法及蒸发光散射 检测器测定转基因青蒿植株中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植 株，提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，为青蒿素的规模化生产提供了高产、稳 定的新药源。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上 述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改， 这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的 特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 衡阳师范学院

安徽中医药大学

<120> 一种青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因及应用

<130> DD11747

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggatcca tggccgttga tctcatcatg t 31

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccgagctct taagatgatt ctaatataag tcc 33

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggccgttg atctcatcat gt 22

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcattgaact tgacgaacgt tgtcga 26

<210> 5

<211> 951

<212> DNA

<213>青蒿(Artemisia annua)

<400> 5

atggccgttg atctcatcat gtcaaccaca acagaacaca acgccgtaca agaagctgcc 60

tcaggtctcg aaagcgtaca gaaactaatc cgtttattat cacatcaaca atcatcacaa 120

caagttgcac cagatgagta tcaagctgtt gctgacatgg ctgttaataa atttaaaaga 180

gttatttctt tactaggtag aactaataga gaattaactg gtcatgcgcg ttttagacgc 240

gcaccatcag ttaattcaaa taataataat aataacaata gtagtagtat tgttataaga 300

aatagtgaac aagacgacgt cgtttcggat gaaagtgaaa ctaaagtgta taatcctaca 360

cctattcaac aagtaccgtt tgttcctcca ccaccggtga tgcaaccggc tccgccggcg 420

atgtttcaaa ggaaggattc gttaccaaaa actatcagtt tttcgtattc acctgctgtg 480

tctagagcta gttcgtttat gtcgtcgtta actggtgatt ctgacggtaa acagctctcg 540

gctggtggta aaccaccgtt gtgttcggcg tcttgtgtga aacggaagtg tagttcgtcg 600

gaaaacggtg gttctggtaa gtgtagcggt ggttcttctg gccgttgtca gtgttctaaa 660

cgaaggaagt tgaggatgaa gagagtagtt agagttaagg cgattagtat gaagcttgcg 720

gatattccac cagatgatta ttcatggagg aagtatggtc aaaaaccgat taaaggatct 780

cctcatccaa gaggatatta caagtgtagt agcgtgagag gatgtcccgc aaggaaacat 840

gtggaacgag cattagatga tccaagtatg ttgattgtta cttatgaagg agatcataac 900

catgctcttt cgattgcgga agctagtgga cttatattag aatcatctta a 951

<210> 6

<211> 316

<212> PRT

<213>青蒿(Artemisia annua)

<400> 6

Met Ala Val Asp Leu Ile Met Ser Thr Thr Thr Glu His Asn Ala Val

1 5 10 15

Gln Glu Ala Ala Ser Gly Leu Glu Ser Val Gln Lys Leu Ile Arg Leu

20 25 30

Leu Ser His Gln Gln Ser Ser Gln Gln Val Ala Pro Asp Glu Tyr Gln

35 40 45

Ala Val Ala Asp Met Ala Val Asn Lys Phe Lys Arg Val Ile Ser Leu

50 55 60

Leu Gly Arg Thr Asn Arg Glu Leu Thr Gly His Ala Arg Phe Arg Arg

65 70 75 80

Ala Pro Ser Val Asn Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Ser Ser

85 90 95

Ile Val Ile Arg Asn Ser Glu Gln Asp Asp Val Val Ser Asp Glu Ser

100 105 110

Glu Thr Lys Val Tyr Asn Pro Thr Pro Ile Gln Gln Val Pro Phe Val

115 120 125

Pro Pro Pro Pro Val Met Gln Pro Ala Pro Pro Ala Met Phe Gln Arg

130 135 140

Lys Asp Ser Leu Pro Lys Thr Ile Ser Phe Ser Tyr Ser Pro Ala Val

145 150 155 160

Ser Arg Ala Ser Ser Phe Met Ser Ser Leu Thr Gly Asp Ser Asp Gly

165 170 175

Lys Gln Leu Ser Ala Gly Gly Lys Pro Pro Leu Cys Ser Ala Ser Cys

180 185 190

Val Lys Arg Lys Cys Ser Ser Ser Glu Asn Gly Gly Ser Gly Lys Cys

195 200 205

Ser Gly Gly Ser Ser Gly Arg Cys Gln Cys Ser Lys Arg Arg Lys Leu

210 215 220

Arg Met Lys Arg Val Val Arg Val Lys Ala Ile Ser Met Lys Leu Ala

225 230 235 240

Asp Ile Pro Pro Asp Asp Tyr Ser Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Pro

245 250 255

Ile Lys Gly Ser Pro His Pro Arg Gly Tyr Tyr Lys Cys Ser Ser Val

260 265 270

Arg Gly Cys Pro Ala Arg Lys His Val Glu Arg Ala Leu Asp Asp Pro

275 280 285

Ser Met Leu Ile Val Thr Tyr Glu Gly Asp His Asn His Ala Leu Ser

290 295 300

Ile Ala Glu Ala Ser Gly Leu Ile Leu Glu Ser Ser

305 310 315

Claims (9)

1.一种青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因，其特征在于，所述AaWRKY4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种青蒿AaWRKY4蛋白，其特征在于，所述AaWRKY4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

4.一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体的宿主菌株为根癌农杆菌EHA105。

6.根据权利要求1所述的青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因在提高青蒿素含量中的应用。

7.一种青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、采用基因克隆方法获得青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因，所述AaWRKY4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

步骤二、把所述AaWRKY4基因连接于表达调控序列，构建含AaWRKY4基因的植物表达载体；

步骤三、将含AaWRKY4基因的植物表达载体转化宿主菌株，获得具有所述植物表达载体的菌株；

步骤四、利用步骤三中构建的所述菌株转化青蒿，经抗生素筛选得到抗性苗，再经PCR检测得到整合外源目的基因AaWRKY4的转基因青蒿植株；

步骤五、对步骤四中得到的所述转基因青蒿植株中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

8.根据权利要求7所述的一种青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述步骤一中，基因克隆方法中，使用的上游引物序列如SEQ IDNO.1所示；下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

9.根据权利要求7所述的一种青蒿WRKY类转录因子AaWRKY4基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述步骤四中，PCR检测中使用的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示；下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。

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