CN113388621A - 一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因及其应用，具体包括基因RgWRKY37的克隆、含有该基因的植物表达载体构建，该基因对毛蕊花糖苷生物合成途径催化酶基因的调控作用，上述地黄RgWRKY37基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，利用转基因技术将地黄RgWRKY37过量表达载体转化地黄显著提高毛状根中毛蕊花糖苷的含量，本发明获得毛蕊花糖苷含量显著提高的转RgWRKY37基因的地黄毛状根，本发明中RgWRKY37基因可应用于地黄品质改良，提高地黄中毛蕊花糖苷的含量，对于毛蕊花糖苷的规模化生产提供高产、新型的优质原料，对于毛蕊花糖苷药源紧缺性问题的缓解有积极的促进意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因及其应用。
背景技术
地黄（Rehmannia glutinosa L.）为玄参科多年生草本植物，以块根入药，是我国常用大宗药材。地黄的地道产区为河南焦作的温县、武陟、修武等沿沁河一带地区，是著名“四大怀药”之一。地黄的用药历史非常悠久，临床疗效明确，在《神农本草经》中被列为上品。
地黄中含有丰富的苯乙醇苷类成分，其中毛蕊花糖苷含量最高。已有的研究表明，毛蕊花糖苷具有抗氧化、抗炎、保肝、免疫调节、增强记忆力、抑制肿瘤等药理活性，尤其是在神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病的治疗和预防上具有良好的应用前景。作为地黄质量控制的指标性成分，毛蕊花糖苷被列入2010 年版和2015年版《中国药典》。然而，不同的地黄品种毛蕊花糖苷含量差异很大，相同品种在不同地区种植含量也有差异，变异范围很大，造成地黄质量差异很大。而且，地黄块根中的毛蕊花糖苷含量比较低，《中国药典》规定地黄药材的毛蕊花糖苷含量不低于0.02%，导致毛蕊花糖苷的提取成本较高。
研究发现，地黄毛状根中的毛蕊花糖苷含量较高，约为块根中含量的10倍，而且培育40-50d即可收获，可以实现规模化生产，为工厂化培养毛状根生产地黄毛蕊花糖苷奠定了基础。而且外源添加水杨酸，可以把毛状根中的毛蕊花糖苷含量提高到原来的2.28倍，进一步提升了毛状根培养生产毛蕊花糖苷的价值。
WRKY转录因子是植物中家族成员非常多的转录因子之一。WRKY转录因子不但参与植物的生长发育，而且参与植物响应生物与非生物胁迫，也是调控植物次生代谢产物生物合成的关键因子。在其它植物中已经发现WRKY调控生物碱类、菲醌类、萜类等化合物的积累。迄今，还没有研究发现WRKY转录因子参与毛蕊花糖苷生物合成的实验证据。也未见WRKY调控地黄次生代谢产物生物合成的报道。
在地黄毛状根中过量表达WRKY转录因子，促进毛蕊花糖苷的生物合成，将显著提高利用地黄毛状根生产毛蕊花糖苷的效率，为商业化生产毛蕊花糖苷提供新型的药源。因此，克隆能够调控毛蕊花糖苷生物合成的WRKY转录因子，对于提高地黄毛状根中毛蕊花糖苷的含量具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因及其应用，该基因编码地黄WRKY转录因子RgWRKY37，利用基因工程手段将该转录因子过量表达载体转化地黄，可以有效提高地黄毛状根中的毛蕊花糖苷的含量。该发明对于毛蕊花糖苷的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要的意义。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明公开了一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因，所述RgWRKY37基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示。
本发明还公开了一种地黄RgWRKY37蛋白，所述RgWRKY37蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
本发明还公开了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还公开了一种重组表达转化体，所述重组表达转化体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
进一步的，所述重组表达转化体的宿主菌株为发根农杆菌MSU440（常规市售）。
本发明还公开了一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因在提高地黄毛蕊花糖苷含量中的应用。
进一步的，本发明还公开了一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因提高地黄毛状根中毛蕊花糖苷含量的方法，包括以下步骤：
（1）采用基因克隆的方法从地黄中克隆获得RgWRKY37基因；
（2）定量PCR测定并分析RgWRKY37基因在水杨酸、甲基茉莉酸和过氧化氢诱导后的地黄毛状根中的表达量；
（3）将RgWRKY37基因构建于亚细胞定位载体，转化根癌农杆菌，进行烟草原生质体的瞬时转化，对RgWRKY37进行亚细胞定位分析；
（4）把RgWRKY37基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含RgWRKY37的植物过量表达载体；
（5）将步骤（4）中所得的含有RgWRKY37的植物过量表达载体转化发根农杆菌，获得具有该过量表达载体的发根农杆菌菌株；
（6）利用步骤（5）所构建的发根农杆菌菌株转化地黄叶片，经抗生素筛选获得抗性毛状根，再经PCR检测获得阳性转基因毛状根系；
（7）定量PCR测定步骤（6）获得的地黄毛状根中的RgWRKY37基因及毛蕊花糖苷合成途径中关键酶基因的相对表达量，并筛选出过表达RgWRKY37基因的毛状根系中基因表达量提高的根系；
（8）对步骤（6）获得的转基因地黄毛状根系中毛蕊花糖苷含量进行测定，获得毛蕊花糖苷含量提高的地黄毛状根系。
进一步的，所述步骤（6）中PCR检测方法如下：
a、设计发根位点基因rolB的特异PCR引物，进行PCR扩增；
b、在RgWRKY37基因内部和35S启动子内部设计特异性引物，进行PCR扩增；
c、紫外线下观察目的条带，出现pBI121-D扩增条带则为阳性转基因地黄毛状根系。
进一步的，步骤（2）和步骤（7）中所述定量PCR检测方法如下：
a、对PCR鉴定为阳性的毛状根进行总RNA的提取，RNA用量为1.0 μg，反转录体系为20μL；
b、分别设计RgWRKY37、关键酶基因和内参基因RgTIP41的定量引物，以相同量的cDNA为模板进行定量PCR检测；
c、分析RgWRKY37及毛蕊花糖苷合成途径相关基因的相对表达量。
步骤（8）中毛蕊花糖苷的测定方法为HPLC法，具体测定方法如下：将毛蕊花糖苷粗提物各取20 μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱为Dikma Diamonsil C18反向硅胶柱，流动相为乙腈-0.1%醋酸水（16:84），柱温30℃，流速1 min/mL，检测波长为334 nm。
本发明具有的优点是：本发明综合应用生物学和基因工程技术如基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、定量PCR分析、毛蕊花糖苷的提取和含量测定等，发明了一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37及其应用的方法，本发明获得的过表达RgWRKY37转基因地黄毛状根中毛蕊花糖苷均显著提高，其中株系OE15毛蕊花糖苷的含量为26.35 mg/g 干重，是对照（14.71 mg/g 干重）的2.47倍，本发明为商业化大量生产毛蕊花糖苷及降低药品价格提供了可能，也为大量生产毛蕊花糖苷临床药物的大量需求提供了重要来源。
附图说明
图1为RgWRKY37在诱导子处理的地黄毛状根中的相对表达量。其中A为RgWRKY37在SA和MeJA处理的毛状根中的表达量，B为RgWRKY37在H2O2处理的毛状根中的表达量。
图2为RgWRKY37的亚细胞定位分析结果。GFP，绿色荧光蛋白；Bright，明场；Chloroplast，叶绿体荧光；Merged，绿色荧光蛋白与明场的合并图。
图3为转35S-RgWRKY37载体的地黄毛状根PCR鉴定。rolB为发根农杆菌的Ri质粒中rolB基因的PCR检测，pBI121为35S-RgWRKY37过量表达载体的PCR检测。泳道1为未转35S-RgWRKY37载体的毛状根，泳道2-7为转35S-RgWRKY37载体的毛状根。
图4为RgWRKY37过量表达地黄毛状根中转录因子基因和毛蕊花糖苷合成途径中催化酶基因的相对表达量检测。其中A为RgWRKY37的表达量，B为RgUGT的表达量，C为RgPPO、RgCuAO、Rg4CL、RgHCT、RgTyDC的表达量。WT，野生型毛状根，OE13和OE19分别为不同的转35S-RgWRKY37毛状根株系。
图5为RgWRKY37过量表达地黄毛状根的毛蕊花糖苷含量测定。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明进行详细说明，使其技术内容更加清楚和便于理解。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如基因克隆中所述的条件，或按照制造厂商所提供的试剂或试剂盒所附带的说明书建议的条件。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1、地黄RgWRKY37基因的克隆
1. 地黄总RNA的提取和cDNA第一链的合成
取地黄叶片组织，在液氮中充分研磨成粉末，然后按照TaKaRa公司提供的MiniBEST核酸提取说明书提取总RNA。用NanoDrop Lite超微量核酸蛋白质测定仪检测RNA的纯度和浓度，用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：胶浓度1.0%；1×TAE电泳缓冲液；120v，30 min）检测RNA的完整性。以所获的1.0 μg地黄总RNA为起始量，用PrimeScript逆转录酶进行第一链cDNA合成（操作步骤按照TaKaRa公司提供的相关说明书）。
2. 地黄RgWRKY37基因的克隆
根据所述RgWRKKY37基因的编码序列（SEQ ID NO.1）设计特异引物，如表1所示，通过PCR从总cDNA中扩增出RgWRKY37基因，并测序。
通过上述步骤，获得了地黄中该转录因子的全长编码序列（SEQ ID NO.1）并推导其蛋白编码序列（SEQ ID NO.2），其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。
表1 PCR扩增引物
| 引物名称 | 引物序列5’-3’ |
| RgWRKY _F | ATGGCGTCTACTATACCCACTG |
| RgWRKY _R | GCTAACTTAGGCTTCGAAATTC |
实施例2、地黄RgWRKY37响应诱导子处理的表达特性分析
为了研究RgWRKY37是否响应非生物诱导子的诱导，对液体MS培养基悬浮培养40天左右的地黄毛状根分别用水杨酸（SA）、甲基茉莉酸（MeJA）和H2O2处理。提取不同处理时间后（SA、MeJA为处理后3h、9h、12h和24h，H2O2为处理后12h、24h和36h）的地黄毛状根的总RNA，并进行总RNA浓度和纯度检测，然后反转录为cDNA，用于实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析，反应体系用TaKaRa公司的TB Green® Premix Ex Taq™ II (TliRNaseH Plus)试剂盒，以RgTIP41为内参基因。定量引物如表2所示。
表2 RgWRKY37表达量检测引物
| 引物名称 | 引物序列5’-3’ |
| RgWRKY37q_F | ATCTCCGGCAATCAAACAGG |
| RgWRKY37q_R | ACATCACCCCCATGATCTGA |
| RgTIP41q_F | TGGCTCAGAGTTGATGGAGTG |
| RgTIP41q_R | TCTCCAGCAGCTTTCTCGGA |
结果显示，RgWRKY37能够响应SA的诱导，在检测的各时间段表达量提高10倍以上；能够响应H2O2的诱导，但对MeJA的响应不明显（图1）。
实施例3、地黄RgWRKY37的亚细胞定位分析
1. 亚细胞定位载体构建
根据克隆获得的地黄RgWRKY37基因的编码区序列，设计特异引物（表3），扩增RgWRKY37基因的编码序列（不含终止密码子），与绿色荧光蛋白基因GFP基因融合，构建35S-RgWRKY37::GFP载体。
表3 亚细胞定位载体构建扩增引物
| 引物名称 | 引物序列5’-3’ |
| RgWRKY37-Sub_F | ATGGCGTCTACTATACCCACTG |
| RgWRKY37-Sub_R | ACTTAGGCTTCGAAATTCAAGAA |
2. 烟草原生质体瞬时表达
将构建好的亚细胞分析融合表达载体35S-RgWRKY37::GFP以PEG 4000介导法导入烟草原生质体，激光共聚焦显微镜观察结果显示，转化35S-RgWRKY37::GFP融合质粒的原生质体细胞核上有明显的绿色荧光蛋白信号，与RgWRKY37作为转录因子的功能是一致的（图2）。
实施例4、植物表达载体pBI121-RgWRKY37的构建
设计特异引物，扩增RgWRKY37基因的全长编码区序列（包含终止密码子），构建到过量表达载体pBI121上，为了方便载体的构建，在扩增引物的上下游分别引入Bam HI和SacI两个酶切位点，引物如表4所示：
表4 RgWRKY37基因过量表达载体构建引物
| 引物名称 | 引物序列5’-3’ |
| RgWRKY _F | CGGGATCCATGGCGTCTACTATACCCACTG |
| RgWRKY _R | ACGAGCTCGCTAACTTAGGCTTCGAAATTC |
实施例5、发根农杆菌介导的RgWRKY37遗传转化地黄获得转基因毛状根
1. 含有RgWRKY37过量表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得
将实施例4种含有RgWRKY37的植物过量表达载体以冻融法转入发根农杆菌（如MSU440，为市场公开出售的生物材料，可从上海唯地生物技术有限公司购得），并进行PCR验证。结果表明，含pBI121-RgWRKY37的植物过量表达载体已经成功转入发根农杆菌中。
2. 发根农杆菌介导的RgWRKY37转化地黄
2.1 外植体的预培养
地黄块根用70%的乙醇表面消毒30 s，然后用0.1%的HgCl2消毒10-15 min，无菌水冲洗5-6次；将带芽眼的部分切成1.5-2 cm的小块放入MS基本培养基中，26℃、14 h/10 h（光/暗）光照培养，即可获得地黄无菌苗，待苗长5~6片叶后，剪取具3篇叶的顶端茎进行继代培养，继代后25 d的无菌苗叶片外植体用于转化。
2.2 农杆菌与外植体的共培养
将地黄无菌苗的叶片去掉主脉，剪成长宽约0.5-1.0 cm的叶片小块，置于制备好的含RgWRKY37过量表达载体的发根农杆菌液中浸泡5-10 min，用无菌滤纸吸去叶盘上多余的菌液，接种含乙酰丁香酮（AS）的共培养培养基（MS+ AS 100 μmol/L）上暗培养48-72 h，以无菌水浸泡的叶片外植体为对照。
2.3 毛状根的诱导和继代培养
将上述的共培养48-72 h后的地黄外植体转接到除菌固体培养基（MS+特美汀200mg/L）中，26℃暗培养2周左右，可从外植体伤口处长出毛状根，将有毛状根的外植体转接到除菌固体培养基（MS+特美汀200 mg/L）上，26℃暗培养2周左右剪取长约1-2 cm的单克隆毛状根作为一个无性系，继续接种于除菌培养基中培养2周，直至无农杆菌生长。将单克隆的毛状根转接到无抗生素的MS培养基上继续暗培养。
3. 转基因地黄毛状根的PCR检测
以CTAB法提取转基因毛状根的基因组DNA。根据pBI121-RgWRKY37过量表达载体的T-DNA插入序列中RgWRKY37内部和35S启动子内部设计特异性引物pBI121_D_F和pBI121_D_R（表5），同时在发根位点基因rolB上设计特异引物rolB_F和rolB_R（表5），利用PCR方法对转基因毛状根的总DNA进行分子检测。
检测结果表明，转基因毛状根能检测出过量表达载体上与目标片段大小的PCR产物，而非转基因毛状根中则没有扩增出此片段（图3）。转RgWRKY37过量表达载体的毛状根和非转基因毛状根中均检测到与rolB基因目标片段大小的毛状根。说明转RgWRKY37过量表达载体的毛状根中外源T-DNA片段已经整合到地黄基因组中。
表5 转基因毛状根检测引物
| 引物名称 | 引物序列5’-3’ |
| pBI121-D-F | CACACTTGTCTACTCCAAAAAT |
| PBI121-D-R | CACGAAAGTATGGTAATAGAAC |
| rolB-F | GCTCTTGCAGTGCTAGATTT |
| rolB-R | GAAGGTGCAAGCTACCTCTC |
本实施例将所述的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化低昂的植物表达载体的发根农杆菌菌株MUS440，利用所构建的发根农杆菌菌株转化地黄叶片，获得经PCR检测为阳性克隆的转基因毛状根。转基因地黄毛状根的获得为筛选高产毛蕊花糖苷的毛状根提供了直接素材。本实施例中选择发根农杆菌MSU440是一种优选实施方式，在实际选择上，发根农杆菌的菌株不限于MSU440，可以根据具体情况选择其它菌株。
实施例6、实时荧光定量PCR检测转基因毛状根中相关基因的表达
1. 毛状根液体培养
选择实施例5中生长速率快、分枝好的地黄毛状根，剪取2-3 cm接入100 mL液体MS培养基中悬浮培养，取适量的新鲜毛状根用吸水纸吸干表面水分后，用锡箔纸包好置入液氮中速冻后保存于-80℃冰箱中用于提取RNA，其余毛状根烘干后用于毛蕊花糖苷含量测定。
2. RNA的提取及cDNA第一链的合成
将-80℃保存的毛状根样品以实施例1中的步骤1的方法进行RNA提取和cDNA第一链的合成。
3. 引物的设计和合成
根据毛蕊花糖苷合成途径相关催化酶基因的编码序列分别设计引物，用于检测转基因地黄毛状根中相关基因的表达情况，以RgTIP41为内参基因（见实施例2）。引物由上海生工生物工程公司合成。定量PCR引物见表6。
表6 毛蕊花糖苷合成相关基因表达量检测引物
| 引物名称 | 引物序列5’-3’ |
| RgUGTq_F | CCTTGTCGTTCAACATCCCA |
| RgUGTq_R | TCTGTGTAGCCTCATCACCA |
| RgPPOq_F | CCAATACCTGGACCACCTTG |
| RgPPOq_R | GAGTCGCGGACACTTTAGAA |
| RgCuAOq_F | GTTCGTGTGACCGACGAAAG |
| RgCuAOq_R | CACAACTACGATCTCAGCCG |
| Rg4CLq_F | GTCCTCGCCTTCACTATTCC |
| Rg4CLq_R | TCGTCTTGGTTGACTCGTTC |
| RgHCTq_F | AAGAACACATCAAGCCCTCC |
| RgHCTq_R | TCGGAGAGCGATTGTTTCAG |
| RgTyDCq_F | CGAACAATCTCAACGCGAAG |
| RgTyDCq_R | CTGCACAACCTTCCATGCTA |
4. 转基因毛状根中相关基因的定量PCR检测
将上述的cDNA第一链为模板，分别用上述的引物进行定量PCR扩增，检测试剂用TaKaRa公司的TB Green® Premix Ex Taq™ II (TliRNaseH Plus)试剂盒，扩增在BIO-RADiQ5仪器上进行。PCR扩增体系见表7。
表7 定量PCR扩增体系
| 试剂 | 使用量（μL） |
| TB Green<sup>® </sup>Premix Ex Taq | 12.5μL |
| 正向引物F | 0.5 μL |
| 反向引物R | 0.5 μL |
| ddH2O | 8.5μL |
| cDNA | 2μL |
PCR反应条件为：95 ℃预变性30秒，40个循环（95℃变性5秒，60℃退火30秒）。目的基因和内参基因各重复3次。反应结束后，根据BIO-RAD iQ5软件生成的Ct（cyclethreshold）值，以2−ΔΔCt计算基因的相对表达量。
定量PCR分析结果表明：相比未转基因毛状根系，RgWRKY37基因在过量表达毛状根系中的表达量显著升高，但不同毛状根系间的表达量有所差异（图4）。同时，RgWRKY37过表达毛状根系中毛蕊花糖苷合成途径的关键酶基因表达量较对照明显提高（图4），说明RgWRKY37可以促进毛蕊花糖苷合成途径中相关基因的表达。
实施例7、利用HPLC测定转基因地黄毛状根中毛蕊花糖苷含量
1. 毛状根中毛蕊花糖苷的提取
将实施例6收获的转基因毛状根烘干至恒重，研磨成粉末，精密称取0. 8 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称重并65℃加热回流提取1.5 h，放凉至室温称重，甲醇补足失重后摇匀，过滤。分别于蒸发皿中精密量取续滤液20 mL，浓缩至近干，残渣用流动相溶解，分别转移至5 mL容量瓶中，并用流动相稀释至刻度，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，待测。
2. HPLC测定毛状根中毛蕊花糖苷的含量
精密称取毛蕊花糖苷对照品粉末2.10 mg，置于5 mL容量瓶，用流动相定容至刻度线，制成浓度为0.4200 mg/mL的毛蕊花糖苷标准品贮备液。
色谱条件：采用色谱柱Dikma Diamonsil C18（4. 6 mm ×250 mm，5 μm），柱温30℃，流速1 min/mL。流动相为乙腈-0.1%醋酸水（16:84），检测波长为334 nm，进样量20 μL。
毛蕊花糖苷的线性关系为Y=30024X-110.9，R²=0.9999。Y为峰面积的积分值，X为样品的质量浓度。毛蕊花糖苷的峰面积与浓度在0.0009~3.076 mg/mL范围内呈良好的线性关系。
将上述样品提取物各取20μL，用高效液相色谱仪检测，记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品毛蕊花糖苷的含量。
在本发明中，测得6个RgWRKY37过量表达载体转基因毛状根株系中的毛蕊花糖苷的含量均显著高于野生型毛状根株系，其中株系OE15和株系OE10含量最高，分别为36.35mg/g干重和33.89 mg/g干重，含量是野生型毛状根的2.47倍以上，见图5。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> 一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因及其应用
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 939
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 1
atggcgtcta ctatacccac tgatcggaaa acggttatcg gagaattgag ccgtggccgg 60
gaaatagctg accagctccg gctcatgctg cgtcaaaccg ggtttgattc taattctact 120
gcagcttctc atggcttgct tggcaaaatc ttggattctt ttactcgttc tattaccata 180
ctttcgtgtg ctggcggtgg tgactccgac gaggtttctc aagttccggc gaaacctggc 240
ttgaaacctg aagattccgg cgacagttgc aagacgccgg cacccaaaga tcggagagga 300
tgctacaaga gaaggaaaac ttcggaaaca tggacaaaag agacccctac tttgtttgag 360
gacgggcatg cttggaggaa atatggacaa aaagttatcc ttaatgccaa acaccctaga 420
aactacttca gatgcaccca caagtttgat caaggatgcc tagcatcaaa acaagtccaa 480
aaaattgaag atgatccacc tctgtacaag accacatacc atggtcaaca cacttgcaaa 540
aacctattaa actccaattc atcccatcac cagattatca tagacgccgc cacacaggat 600
cattcctcca tcatctggag cttcggctca cgccaagaac caaactataa gcctaataat 660
aatagtttgg tgattgaatc tccggcaatc aaacaggaaa acaaggaaga atatcaaatc 720
aaatcatcac cgtctgatga tcaggattat tttgtaacct cagcatttga cacgtgttcg 780
catcatatgg gtggattttc atctgcaggg tcagatcatg ggggtgatgt tatttctcct 840
gatgtctatt cgtgcaccgc aagttctcat agtctggata tggatatgat ggtggactct 900
gtttttgatg attttcttga atttcgaagc ctaagttag 939
<210> 2
<211> 312
<212> PRT
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 2
Met Ala Ser Thr Ile Pro Thr Asp Arg Lys Thr Val Ile Gly Glu Leu
1 5 10 15
Ser Arg Gly Arg Glu Ile Ala Asp Gln Leu Arg Leu Met Leu Arg Gln
20 25 30
Thr Gly Phe Asp Ser Asn Ser Thr Ala Ala Ser His Gly Leu Leu Gly
35 40 45
Lys Ile Leu Asp Ser Phe Thr Arg Ser Ile Thr Ile Leu Ser Cys Ala
50 55 60
Gly Gly Gly Asp Ser Asp Glu Val Ser Gln Val Pro Ala Lys Pro Gly
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Ser Gly Asp Ser Cys Lys Thr Pro Ala Pro Lys
85 90 95
Asp Arg Arg Gly Cys Tyr Lys Arg Arg Lys Thr Ser Glu Thr Trp Thr
100 105 110
Lys Glu Thr Pro Thr Leu Phe Glu Asp Gly His Ala Trp Arg Lys Tyr
115 120 125
Gly Gln Lys Val Ile Leu Asn Ala Lys His Pro Arg Asn Tyr Phe Arg
130 135 140
Cys Thr His Lys Phe Asp Gln Gly Cys Leu Ala Ser Lys Gln Val Gln
145 150 155 160
Lys Ile Glu Asp Asp Pro Pro Leu Tyr Lys Thr Thr Tyr His Gly Gln
165 170 175
His Thr Cys Lys Asn Leu Leu Asn Ser Asn Ser Ser His His Gln Ile
180 185 190
Ile Ile Asp Ala Ala Thr Gln Asp His Ser Ser Ile Ile Trp Ser Phe
195 200 205
Gly Ser Arg Gln Glu Pro Asn Tyr Lys Pro Asn Asn Asn Ser Leu Val
210 215 220
Ile Glu Ser Pro Ala Ile Lys Gln Glu Asn Lys Glu Glu Tyr Gln Ile
225 230 235 240
Lys Ser Ser Pro Ser Asp Asp Gln Asp Tyr Phe Val Thr Ser Ala Phe
245 250 255
Asp Thr Cys Ser His His Met Gly Gly Phe Ser Ser Ala Gly Ser Asp
260 265 270
His Gly Gly Asp Val Ile Ser Pro Asp Val Tyr Ser Cys Thr Ala Ser
275 280 285
Ser His Ser Leu Asp Met Asp Met Met Val Asp Ser Val Phe Asp Asp
290 295 300
Phe Leu Glu Phe Arg Ser Leu Ser
305 310
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 3
atggcgtcta ctatacccac tg 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 4
gctaacttag gcttcgaaat tc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 5
atctccggca atcaaacagg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 6
acatcacccc catgatctga 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 7
tggctcagag ttgatggagt g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 8
tctccagcag ctttctcgga 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 9
atggcgtcta ctatacccac tg 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 10
acttaggctt cgaaattcaa gaa 23
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 11
cgggatccat ggcgtctact atacccactg 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 12
acgagctcgc taacttaggc ttcgaaattc 30
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 13
cacacttgtc tactccaaaa at 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 14
cacgaaagta tggtaataga ac 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
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gctcttgcag tgctagattt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
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<400> 16
gaaggtgcaa gctacctctc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 17
ccttgtcgtt caacatccca 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 18
tctgtgtagc ctcatcacca 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 19
ccaatacctg gaccaccttg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 20
gagtcgcgga cactttagaa 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
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gttcgtgtga ccgacgaaag 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 22
cacaactacg atctcagccg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 23
gtcctcgcct tcactattcc 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 24
tcgtcttggt tgactcgttc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 25
aagaacacat caagccctcc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 26
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<212> DNA
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<400> 27
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<211> 20
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 28
ctgcacaacc ttccatgcta 20
Claims (10)
1.一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因，其特征在于：所述RgWRKY37基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示。
2.一种地黄RgWRKY37蛋白，其特征在于：所述RgWRKY37蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
4.一种重组表达转化体，其特征在于：所述重组表达转化体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的重组表达转化体，其特征在于：所述重组表达转化体的宿主菌株为发根农杆菌MSU440。
6.如权利要求1所述的地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因在提高地黄毛蕊花糖苷含量中的应用。
7.一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因提高地黄毛状根中毛蕊花糖苷含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采用基因克隆的方法从地黄中克隆获得转录因子基因RgWRKY37，所述RgWRKY37基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）把RgWRKY37基因连接于表达调控序列，构建含RgWRKY37基因的植物过量表达载体；
（3）将RgWRKY37基因的植物过量表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化地黄的含有RgWRKY37基因的植物过量表达载体的发根农杆菌菌株；
（4）将所构建的发根农杆菌菌株遗传转化地黄叶片，获得经PCR检测为阳性的转基因毛状根株系；
（5）定量PCR检测地黄转基因毛状根中RgWRKY37基因及毛蕊花糖苷生物合成途径中相关的催化酶基因的相对表达量；
（6）高效液相色谱法测定地黄转RgWRKY37基因毛状根中毛蕊花糖苷的含量，筛选毛蕊花糖苷含量提高的毛状根株系。
8.如权利要求7所述的地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因提高地黄毛状根中毛蕊花糖苷含量的方法，其特征在于，所述步骤（4）中PCR检测方法如下：
a、设计发根位点基因rolB的特异PCR引物，进行PCR扩增；
b、在RgWRKY37基因内部和35S启动子内部设计特异性引物，进行PCR扩增；
C、紫外线下观察目的条带，出现pBI121-D扩增条带则为阳性转基因地黄毛状根系。
9.如权利要求7所述的地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因提高地黄毛状根中毛蕊花糖苷含量的方法，其特征在于，所述步骤（5）中定量PCR检测方法如下：
a.对PCR鉴定为阳性的毛状根进行总RNA的提取，RNA用量为1.0 μg，反转录体系为20 μL；
b.分别设计RgWRKY37、关键酶基因和内参基因RgTIP41的定量引物，以相同量的cDNA为模板进行定量PCR检测；
c.分析RgWRKY37及毛蕊花糖苷合成途径相关基因的相对表达量。
10.如权利要求7所述的地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因提高地黄毛状根中毛蕊花糖苷含量的方法，其特征在于，所述步骤（6）中毛蕊花糖苷的测定方法为HPLC法，具体测定方法如下：将毛蕊花糖苷粗提物各取20 μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱为Dikma Diamonsil C18反向硅胶柱，流动相为乙腈-0.1%醋酸水（16:84），柱温30℃，流速1min/mL，检测波长为334 nm。
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