CN111454955B - 源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段及其应用 - Google Patents

源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段及其应用，属于植物基因工程技术领域，将如SEQ ID NO.1所示的改良DNA序列，以“尾尾相连”的方式组成RNAi片段，其序列如SEQ ID NO.2所示。将该RNAi片段应用于转基因植株中，证明了该RNAi片段具有调控木质素合成的作用。本发明通过对尾叶桉CAD基因序列的研究，有助于推动尾叶桉转基因定向调控木质素合成的基因工程育种。

Description

源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一段源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段的应用。
背景技术
桉树是桃金娘科桉属植物的总称，原产地为澳大利亚。广西的桉树研究在我国处于领先地位，20世纪70年代初期就开始引种，经过多年的引种试验及杂交选育，得到了多个优良树种、优良种源及优良家系。桉树生长快、材质好，广西全区桉树面积居全国首位，已经成为短周期原料林的主要造林树种。尾叶桉GLU4无性系(Eucalyptus urophylla cloneGLU4)是广西广泛种植的桉树良种，因其纤维素含量、纤维素长度等制浆指标显著优于其他桉树品种，成为纸浆材造林首选树种。从纸浆材生产需求出发，希望木材中的木质素含量更低所以定向调控木质素合成，成为纸浆材品质提升的主要研究策略。
CAD催化肉桂醇等几种木质素单体的直接前体合成，被认为是细胞木质化的标志。目前，已从多种植物中克隆了CAD基因，并利用一系列转基因方法(正义、反义等)对其功能进行了研究。在反义抑制CAD的杨树中，低水平CAD活性的植株木质部呈现红褐色，并且木质素更容易被分离，制浆效率提高。在抑制CAD活性的转基因苜宿中，木质素含量不受影响，但改变了S/G比值，表明CAD也参与了木质素单体的特异性合成。在玉米bml突变株中，CAD酶活性下降60％，木质素含量降低近80％。但至目前为止，在尾叶桉中尚未有CAD基因序列的报道，利用其中的基因序列进行基因工程调控尚未开展。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了源于尾叶桉CAD基因的RNAi片段，以及利用此RNAi片段构建得到的植物表达载体、宿主细胞等在植物木质素单体合成调控中的应用，有助于深入尾叶桉CAD基因功能的研究，以有效地定向调控木质素合成，在木质素合成调控的基因工程研究中的发挥重要作用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段，是由一段源于尾叶桉CAD基因的改良的DNA序列以“尾尾相连”的方式组成；所述改良的DNA序列具有如SEQ ID NO.1所示DNA序列。
SEQ ID NO.1gaatttgccacagttacattcaccaggtcaagaattatcttggc
进一步地，所述RNAi片段的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2
gaatttgccacagttacattcaccaggtcaagaattatcttggc gccaagataattcttgacctggtgaatgtaactgtggcaaattc
本发明提供一种重组植物表达载体，包含所述的RNAi片段。
进一步地，所述重组植物表达载体是以pCAMBIA3301为基础，构建得到的重组载体pCAMBIA3301-S1。
本发明提供一种宿主细胞，包含所述的RNAi片段或所述的重组植物表达载体。
进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌、农杆菌或植物细胞。如大肠杆菌JM109菌株、农杆菌LBA4404菌株。
本发明提供一种源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段的应用，是将所述的RNAi片段、所述的重组植物表达载体、或所述的宿主细胞应用于降低植物木质素合成中。
进一步地，是将所述的RNAi片段或重组植物表达载体转化入植物，定向降低植物木质素合成。
进一步地，是将所述宿主细胞侵染植物。具有降低植株木质素含量的效果。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明摒弃了传统研究策略中使用全长基因的思路，通过对尾叶桉CAD基因序列进行生物信息学分析，根据序列编码蛋白的结构域预测，选取了其中一段较短的DNA序列，该段序列编码蛋白包含了与酶活性重要相关的NAD(P)结合位点、底物结合位点和Zn结合催化位点。在此基础上，根据陆生植物CAD序列同源比对分析结果，对序列中的部分碱基进行了改良，得到了改良后的DNA序列：S(SEQ ID NO.1：gaatttgccacagttacattcaccaggtcaagaattatcttggc)。
2.利用本发明获得的改良后的DNA序列构建成RNAi片段，可以高效识别CAD基因中的NAD(P)结合位点、底物结合位点和Zn结合催化位点目标片段，并引发RNA干扰，抑制CAD基因表达，从而降低植物中CAD酶活性。
3.本发明在应用中仅使用较短的DNA序列“尾尾相连”组成RNAi片段，通过序列合成的方式商业化的获得目标RNAi片段，避免了传统研究策略中利用限制性内切酶的构建过程，大大简化了实验步骤，缩短实验周期。
4.本发明对RNAi片段转化烟草植株的木质素含量进行检测，结果显示转基因烟草植株中木质素含量比野生型烟草降低15.26％，验证了RNAi片段对木质素合成的调控作用。
5.本发明在烟草中转化该RNAi片段得到的转基因烟草植株，证明了这段RNAi片段具有抑制木质素合成的作用，可达到降低植株木质素含量的效果，有助于深入尾叶桉CAD基因功能的研究，并推动尾叶桉转基因定向调控木质素合成的基因工程育种。
附图说明
图1是本发明实施例中野生型植株茎部切片的照片。
图2是本发明实施例中转基因型植株茎部切片的照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、改良的DNA序列
利用Blastp、ProtParam、psipred、SWISS-MODEL生物信息学软件对尾叶桉CAD基因序列进行序列分析，筛选得到一段编码蛋白序列富含NAD(P)结合位点、底物结合位点和Zn结合催化位点的候选DNA序列(SEQ ID NO.3：gaatttgccacagtgacattcaccagatcaagaatgatcttggc)，以此候选序列为基础，利用Blastn等在线工具将候选序列与陆生植物CAD基因序列别对，根据序列同源性、一致性分析结果，对候选序列进行改良，得到一段44bp序列S(SEQID NO.1)，序列信息为：5'–gaatttgccacagttacattcaccaggtcaagaattatcttggc-3'。
实施例2、构建RNAi片段
根据实施例1的序列S，以“尾尾相连”的方式设计成反向重复序列S1(SEQ IDNO.2)，序列信息为：5'–gaatttgccacagttacattcaccaggtcaagaattatcttggcgccaagataattcttgacctggtgaatgtaactgtggcaaattc-3'。
实施例3、构建RNAi表达载体
在实施例2所述序列S1两端附加XhoI酶切位点后，交由生物公司合成序列，得到携带目标片段的克隆载体pUC57-S1。
取携带pUC57-S1质粒的大肠杆菌过夜培养菌液，采用离心柱型普通质粒小提试剂盒(天根)完成质粒提取。将质粒用XhoI酶消化，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，切取100bp左右的目标序列S1条带，用Universal DNA纯化回收试剂盒(天根)回收。同时利用XhoI酶消化pCAMBIA3301质粒，得到去除掉bar基因序列的载体骨架，将载体骨架与目标序列S1连接，连接产物转化DH5a，应用载体上的测序引物3301-F(5'–CCCTTATCTGGGAACTACTCAC-3')/3301-R(5'–CGCTGAAATCACCAGTCTCTC-3')对转化子进行PCR鉴定，构建正确的载体可扩增得到200bp左右的特异性条带，对长度正确的克隆提取质粒进行测序，测序结果与目标序列比对，序列一致的为构建成功的RNAi载体，命名为pCAMBIA3301-S1。
实施例4、利用RNAi片段调控烟草木质素合成
采用常规方法，将实施例3中的pCAMBIA3301-S1重组载体导入农杆菌LBA4404，经抗生素平板筛选、PCR鉴定以及测序鉴定得到阳性菌株。按照常规方法农杆菌菌液侵染烟草叶片，经共培养、分化、壮苗、生根、移栽等阶段的培养后，获得转基因烟草小苗。
移栽8周后，采集小苗叶片提取总DNA，用特异性引物3301-F/3301-R对小苗进行PCR鉴定，能成功扩增出约200bp条带的植株，进一步对PCR产物进行测序，测序结果与目标序列比对，序列一致的植株鉴定为阳性转基因植株。
转基因植株在生长上与野生型并没有明显差异，植株叶片展开，叶色翠绿，茎干挺直，8月龄时苗高达到1.5m左右，10月龄时开花结实。8月龄时采集样品用于表型检测，包括以下几方面检测：
(1)目标基因表达水平检测
采用烟草actin基因(EU938079)作为内参基因，烟草CAD基因(X62343.1)做为目标基因，设计荧光定量检测引物，检测RNAi片段对目标基因表达水平的影响，引物序列如下：
actin-F CTGGAATCCATGAGACTACTTACAA；
actin-R AACCGCCACTGAGCACAATA；
CAD-F:GTATGGCACCAGAACAAGCAG；
CAD-R:CCAATGCCTCTTGTCTCTTCTTAT。
在转基因烟草植株茎尖向下第5节处采集叶片组织，以野生型烟草做为对照，采用RNA prep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒进行RNA提取，后采用RNA LA PCR反转录试剂盒合成cDNA。采用ABI SybrGreen PCR Master Mix(2X)试剂盒对基因表达水平进行荧光定量PCR检测。检测到烟草CAD基因表达水平见表1。
表1：转基因烟草中CAD基因表达水平分析
植株编号 烟草CAD基因相对表达水平
野生型 1.0131±0.0125a
转基因植株 0.1251±0.0186b
注：不同字母表示在p<0.05水平上差异显著。
由表1可见，在对转基因植株进行检测时，检测到烟草CAD基因表达水平降低至野生型的12.52％，说明转入的RNAi片段如预期显著抑制了烟草CAD基因的表达。
(2)茎部木质素含量检测
分别选取对照及转基因烟草植株，选择茎部顶端向下数第3节至第10节，摘去叶子，将茎杆切成小段，放置在60℃烘箱中烘干24小时后，粉碎过150目筛，用于酸性洗涤木质素含量检测。酸性洗涤木质素含量测定采用GB/T 20805-2006方法。检测结果见表2。
表2：转基因烟草中木质素含量
植株编号 木质素含量(％)
野生型 13.37±0.04a
转基因植株 11.33±0.03b
注：同系列中不同字母表示在p<0.05水平上差异显著。
由表2检测结果可见，转基因植株中木质素降低15.26％。
(3)转化植株茎部直径、木质部厚度变化
取9月龄烟草茎部顶端向下数第6节茎部组织，按常规方法横切制成石蜡切片，并用番红-固绿法染色，根据切片测量茎部直径和木质部厚度。所述野生型植株切片如图1所示，转基因型植株切片如图2所述。具体数据见表3。
表3转化植株茎部直径、木质部厚度变化
植株编号 木质部厚度(μm) 直径(μm)
野生型 427.53±20.03a 8576.63±422.21a
转基因植株 384.53±15.55b 8357.81±307.51a
注：同系列中不同字母表示在p<0.05水平上差异显著。
根据图1、图2、以及测量其结果表3可见，转基因株系和野生型之间的茎部直径的测量结果显示无差异显著，但转基因植株木质部厚度较野生型降低了10.06％。说明本发明RNAi片段对木质素合成的调控作用。
实施例5、将重组载体转化入植物调控烟草木质素合成
将实施例3中的pCAMBIA3301-S1重组载体提取质粒后，按照常规方法与金粉混合并利用基因枪轰击烟草愈伤组织。按照常规方法，经高渗培养、恢复培养、分化、壮苗、生根、移栽等阶段的培养后，获得转基因烟草小苗。
移栽8周后，采集小苗叶片提取总DNA，用特异性引物3301-F/3301-R对小苗进行PCR鉴定，能成功扩增出约200bp条带的植株，进一步对PCR产物进行测序，测序结果与目标序列比对，序列一致的植株鉴定为阳性转基因植株。
将得到的转基因植株在生长上与野生型进行对比，其外观并没有明显差异，植株叶片展开，叶色翠绿，茎干挺直，8月龄时苗高达到1.5m左右，10月龄时开花结实。8月龄时采集样品用于如实施例4的表型检测，得到的检测结果与实施例4相近，说明本发明中的pCAMBIA3301-S1重组载体转化入植物与宿主侵染植物得到的结果一致，具有重现性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广西壮族自治区林业科学研究院
<120> 源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 尾叶桉(Eucalyptus calophylla)
<400> 1
gaatttgcca cagttacatt caccaggtca agaattatct tggc 44
<210> 2
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaatttgcca cagttacatt caccaggtca agaattatct tggcgccaag ataattcttg 60
acctggtgaa tgtaactgtg gcaaattc 88
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 尾叶桉(Eucalyptus calophylla)
<400> 3
gaatttgcca cagtgacatt caccagatca agaatgatct tggc 44
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Cys Cys Cys Thr Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Ala Cys Thr
1               5                   10                  15
Ala Cys Thr Cys Ala Cys
            20
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Gly Thr
1               5                   10                  15
Cys Thr Cys Thr Cys
            20
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Cys Cys Ala Thr Gly Ala Gly Ala Cys
1               5                   10                  15
Thr Ala Cys Thr Thr Ala Cys Ala Ala
            20                  25
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Ala Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Cys
1               5                   10                  15
Ala Ala Thr Ala
            20
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Thr Ala Thr Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala Cys Ala
1               5                   10                  15
Ala Gly Cys Ala Gly
            20
<210> 9
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Cys Cys Ala Ala Thr Gly Cys Cys Thr Cys Thr Thr Gly Thr Cys Thr
1               5                   10                  15
Cys Thr Thr Cys Thr Thr Ala Thr
            20

Claims (7)

1.一种源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段，其特征在于，是由一段源于尾叶桉CAD基因的改良的DNA序列以“尾尾相连”的方式组成；所述改良的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述RNAi片段的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种重组植物表达载体，其特征在于：包含权利要求1所述的RNAi片段。
3.根据权利要求2所述的重组植物表达载体，其特征在于，所述重组植物表达载体是以pCAMBIA3301为基础，构建得到的重组载体pCAMBIA3301-S1。
4.一种宿主细胞，其特征在于：包含如权利要求1所述的RNAi片段或包含权利要求2或3所述的重组植物表达载体；所述宿主细胞为大肠杆菌或农杆菌。
5.权利要求 1所述的RNAi片段、权利要求2或3所述的重组植物表达载体、或权利要求4所述的宿主细胞在降低烟草木质素合成中的应用。
6.根据权利要求5所述的在降低烟草木质素合成中的应用，其特征在于，是将所述的RNAi片段或重组植物表达载体转化入烟草，定向降低烟草木质素合成。
7.根据权利要求5所述的在降低烟草木质素合成中的应用，其特征在于，是将所述宿主细胞侵染烟草。
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