CN105002194A - 一种桉树tps基因、rna干扰载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明通过PCR和RACE技术获得了萜类合成酶(Terpene？Synthase,TPS)基因，序列如SEQ？ID？NO15所示，选取如SEQ？ID？NO23和SEQ？ID？NO26所示的序列分别作为正向片段和反向片段构建了降低桉树化感物质含量的RNA干扰载体pART27-TPS-RNAi。将该载体转入桉树中，成功获得了低化感物质的植株。本发明为降低桉树化感物质含量基因工程提供了一种重要的化感物质合成酶基因、RNA干扰表达载体以及应用，为RNA干扰及转基因技术在林木分子育种中的应用提供了新的思路。实现了利用RNA干扰原理获得低化感物质桉树新材料的预期目标，为RNA干扰介导的桉树分子育种及基因工程提供了成功的实例，弥补了RNA干扰介导的降低化感物质在本领域研究中的空缺。

Description

一种桉树TPS基因、RNA干扰载体及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及一种桉树TPS基因、用其构建的用于桉树遗传转化的降低化感作用的RNA干扰载体及在桉树上的应用。

背景技术

桉树(Eucalyptus)具有种类多、生长快、耐瘠薄、干形好、用途广的特点，是我国华南各省区最重要和栽培面积最大的速生阔叶造林树种。然而,桉树的大量引种栽植，也带来了一些颇具争议的生态环境问题，如土壤退化、土地生产力下降、生物多样性减弱等。其中，化感作用是桉树人工材生态系统中颇受关注的生态现象，其表现形式是抑制其他植物及林下植被甚至土壤中的微生物生长，导致林地群落结构简单、生物多样性减弱和生态环境退化等现象，它对桉树人工林群落的结构、功能、效益及发展均具有重大影响。

目前国内外关于桉树化感作用的研究已有不少的报道，取得的主要成果是桉树化感物质成分分析、化感物质的释放途径以及化感作用的生物测定等^]，而有关桉树化感物质的生物合成途径和代谢调控机理等方面的研究尚未报道。研究表明，桉树化感物质的主要成分为a-松油醇(a-Terpineol)和桉叶油素(1,8-Cineole)等萜类化合物。在其他已知的一些生物中，萜类物质的生物合成主要由萜类合成酶(Terpene Synthase，TPS)家族催化完成。首先，牻牛儿基焦磷酸盐(Geranyl-PP，GPP)在TPS的催化下，生成a-松油醇，之后a-松油醇进一步在TPS的催化下生成1,8-桉叶油素；此外，牻牛儿基焦磷酸盐GPP在萜类合成酶TPS的催化下还可以分别生成a-蒎烯(a-Pinene)和β-蒎烯(β-Pinene)。因此，可以推测在桉树化感物质的生物合成途径中，萜类合成酶(TPS)对a-松油醇和1,8-桉叶油素的形成有着重要的调控作用。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNA干扰技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。例如，毕海红在2008年利用RNA干扰技术，通过转基因方式使水稻中AOS基因发生了沉默，由此降低了水稻的化感作用。Kazuaki等(2010)利用紫苏(Perilla frutescens)中的柠檬烯合成酶(limonene synthase,LS)基因对赤桉实生苗的下胚轴进行了转基因研究，结果表明转基因桉树叶片中的柠檬烯含量是野生型的4～5倍。

但是，桉树中a-松油醇和桉叶油素的关键调控基因仍未见记载，更未有利用其构建干扰载体应用到桉树上降低桉树的化感作用的记载，因此有必要在这个方向进行进一步的研究。

发明内容

本发明的目的是从桉树中克隆出一条桉树萜类合成酶(Terpene Synthase,说明书及权利要求书中一般简称为TPS)基因的全长cDNA；并构建相关的RNA干扰载体，此载体包含TPS基因的部分核苷酸序列；再用该干扰载体转化桉树调节其a-松油醇和桉叶油素的合成，以降低桉树的化感作用。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种桉树TPS基因，序列如SEQ ID NO7，编码的蛋白质具有催化GPP生成a-松油醇、以及进一步催化a-松油醇生成桉叶油素的功能；并且GPP在TPS的催化下还可以分别生成a-蒎烯(a-Pinene)和β-蒎烯(β-Pinene)。

进一步地，上述桉树TPS基因，是按如下步骤得到：(1)以多种植物的TPS基因的保守功能区为模板，通过RT-PCR获得TPS基因的部分cDNA片段；(2)采用RACE技术，获得TPS基因的5'端和3'端cDNA片段；(3)通过对序列的拼接和分析，获得TPS基因的全长cDNA序列；(4)通过RT-PCR获得桉树TPS基因的cDNA完整编码区片段。

本发明再利用上述的桉树TPS基因，构建一种用于降低桉树化感作用的RNA干扰载体，包括骨架载体和含有正向片段和反向片段的发夹结构，其特征在于，以所述TPS基因的部分片段为正向片段或反向片段，所述TPS基因部分片段序列如SEQ ID NO20。

所述发夹结构由如下方法得到：以pKANNIBAL为骨架载体，所述正向片段插入在酶切位点Xho I和Kpn I之间，反向片段插入在酶切位点Hind III和Xba I之间，之后对pKANNIBAL-TPS-RNAi和pART27载体进行Not I单酶切和连接，即可得到桉树低化感物质RNA干扰载体pART27-TPS-RNAi。

进一步地，所述用于降低桉树化感作用的RNA干扰载体构建包括如下步骤：

(1)选取桉树TPS基因的保守功能区作为RNA干扰片段，通过RT-PCR将Xho I和KpnI酶切位点加RNA干扰片段两端，作为正向片段；将Hind III和Xba I酶切位点加在RNA干扰片段两端，作为反向片段；(2)将步骤(1)得到的正向片段和反向片段克隆至pEASY-Blunt-Zero载体上，分别获得阳性质粒pEASY-TPS-P7和pEASY-TPS-P8；(3)将步骤(2)得到的pEASY-TPS-P7经Xho I和Kpn I双酶切后，与同样经过Xho I和Kpn I双酶切的pKANNIBAL载体连接，得到pKANNIBAL-TPS-P7；(4)将步骤(3)得到的pEASY-TPS-P8经Hind III和Xba I双酶切后，与同样经过Hind III和Xba I双酶切的pKANNIBAL-TPS-P7载体连接，即可得到载体pKANNIBAL-TPS-RNAi；(5)将步骤(4)得到的pKANNIBAL-TPS-RNAi经Not I单酶切后，与同样经过Not I酶切的pART27载体连接，即可得到载体pART27-TPS-RNAi。

上述用于降低桉树化感作用的RNA干扰载体在转基因植物中的应用，所述转基因植物为桉树。

上述用于降低桉树化感作用的RNA干扰载体转化有关受体植物的应用，使受体的化感作用降低，所述受体为赤桉。

进一步地，上述用于降低桉树化感作用的RNA干扰载体转化有关受体植物的应用，所述转化的方法为农杆菌介导法。

进一步地，所述的农杆菌为根瘤农杆菌菌株EHA105。

进一步地，所述赤桉为种子萌发后的下胚轴。

本发明采用pEASY-TPS-P6质粒DNA为模板，根据TPS基因的保守区设计了引物SEQ ID NO21和SEQ ID NO22为引物对，以及SEQ ID NO23和SEQ ID NO24为引物对，PCR扩增得到TPS基因部分片段即TPS-P7和TPS-P8，将其分别作为正向片段和反向片段插入骨架载体中得到本发明的干扰载体。将本发明的干扰载体转入受体植物中，将使TPS发生沉默而不表达，从而降低了该受体植物的化感作用。

RNA干扰载体pART27-TPS-RNAi，适合于农杆菌介导转化桉树，可获得低化感作用的转基因后代，该载体携带有卡那霉素抗性筛选标记基因。采用的骨架载体是载体pKANNIBAL和双元表达载体pART27，将TPS基因的正向片段插入在酶切位点Xho I和Kpn I之间，将反向片段插入在酶切位点Hind III和Xba I之间，形成中间载体pKANNIBAL-TPS-RNAi，之后对pKANNIBAL-TPS-RNAi和pART27进行NotI单酶切，将载体上pKANNIBAL-TPS-RNAi的元件插入到载体pART27中，形成最终干扰载体pART27-TPS-RNAi，这样可用于农杆菌介导转化桉树。

根瘤农杆菌介导的植物遗传转化方法是目前应用最为广泛的转化方法之一，已成功的应用于单、双子叶植物的转基因研究中。本发明最终构建的干扰载体pART27-TPS-RNAi适合超毒力菌株EHA105等农杆菌介导的植物遗传转化。利用根瘤农杆菌EHA105将其导入桉树，所得到的转基因植株可以使桉树植株内的TPS基因发生RNA沉默现象，使a-蒎烯、a-松油醇以及1,8-桉叶油素不能合成或积累，从而降低了植物的化感物质含量。

本发明利用根癌农杆菌介导的转化的方法进行桉树的遗传转化，借助桉树细胞RdRp的转录作用，产生RBSDV的S10基因，再由Dicer III的作用产生siRNA，沉默桉树中TPS基因的表达，从而达到利用RNA干扰降低化感物质的合成或积累，最终筛选出低含量化感物质的转基因桉树植株。

本发明已得到以桉树重要树种赤桉为受体的桉树T0代再生植株，转化载体pART27-TPS-RNAi的植株是105株，通过人工接种的方法在温室进行了化感物质的分析，其中15株的化感物质(a-蒎烯，a-松油醇，1,8-桉叶油素)降低75％左右，10株的降低45％左右，7株的降低25％左右。经PCR检测，化感物质减少的32株全部扩增到目的基因，这说明转基因桉树植株的化感物质较受体有明显的降低。

利用本发明的干扰载体转化所得的降低化感物质含量生物体可以是任何微生物、植物或其组织、细胞，以及由此所获得具有任何降低化感物质含量的微生物、植物，以及该类植物后代的种子、杂交和转育后代。

本发明的有益效果在于：本发明为降低桉树化感作用基因工程提供了一种干扰萜类物质合成酶的基因、其相关的RNA干扰表达载体以及应用，为RNA干扰及转基因技术在林木分子育种中的应用提供了新的思路。将该载体转入桉树中，成功获得了低化感作用的植株。实现了利用RNA干扰原理获得低化感作用桉树新材料的预期目标，为RNA干扰介导的桉树分子育种及基因工程提供了成功的实例，弥补了RNA干扰介导的降低化感作用在本领域研究中的空缺，同时为桉树的分子育种提供了一条快速高效的转基因方法。本发明通过转基因方式降低了桉树的化感作用，克服了现有技术中周期长、效率低的缺点，利用遗传转化方法提供了一种快速、高效降低桉树化感作用的方法，对于降低桉树的化感作用，改善我国南方地区桉树人工林的生态环境和推动我国林业的可持续发展具有重要的意义。

附图说明

图1.TPS-P1片段电泳图；

泳道1.100bp plus marker，2.TPS-P1

图2.TPS-P2片段电泳图；

泳道1.100bp plus marker，2.TPS-P2

图3.TPS-P3片段电泳图；

泳道1.1kb marker，2.TPS-P3

图4.TPS-P4片段电泳图；

泳道1.100bp plus marker，2.TPS-P4

图5.TPS-P5片段电泳图；

泳道1.100bp plus marker，2.TPS-P5

图6.TPS-P3片段电泳图；

泳道1.100bp plus marker，2.TPS-P6

图7.TPS-P7片段电泳图；

泳道1.1kb marker，2-3.TPS-P7

图8.TPS-P8片段电泳图；

泳道1.1kb marker，2-3.TPS-P8

图9.连入TPS基因正向片段重组质粒pKANNIBAL-TPS-P7的PCR鉴定结果

泳道1-3.重组质粒，4.1kb marker，5-7.重组质粒

图10.连入TPS基因正向片段和反向片段重组质粒pKANNIBAL-TPS-RNAi的PCR鉴定结果

泳道1-4.重组质粒，5.1kb marker，6-9.重组质粒

图11.重组质粒pART27-TPS-RNAi的PCR鉴定结果

泳道1.1kb marker，2-9.重组质粒

图12.pART27-TPS-RNAi干扰载体图谱

图13.pART27-TPS-RNAi重组农杆菌的PCR鉴定结果

泳道1-4.重组质粒，5.1kb marker，6.空白对照，7-10.重组质粒

图14.转化后的桉树下胚轴

图15.桉树转基因愈伤组织

图16.桉树转基因不定芽

图17.桉树转基因不定芽的生长

图18.桉树转基因不定芽的生根

图19.桉树转基因阳性植株的移栽

图20.T0代转基因再生植株的PCR鉴定

泳道1.1kb plus marker，2.普通桉树植株，3-10.转基因T0代植株

图21.T0代转基因赤桉植株和对照的化感物质GC-MS峰谱图

A：野生型植株；B：转基因植株a：a-蒎烯；b：1,8-桉叶油素；c：a-松油醇

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

实验中所用cDNA反转录试剂盒Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit，购自美国Thermo Fisher公司。

实验中使用的5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends和3'RACESystem for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒,购自美国Invitrogen公司。

实验中使用的Primestar高保真聚合酶，MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit以及MiniBEST Plasmid Purification Kit购自大连宝生物公司。

实验中使用的XhoI，Kpn I，XbaI，Hind III限制性内切酶以及T4DNA Ligase连接酶购自美国Thermo Fisher公司。

实验中所用的克隆载体pEASY-Blunt-Zero，感受态细胞大肠杆菌DH5a购自北京全式金公司。

实验中所用的DNA marker购自美国Thermo Fisher公司。

实验中使用的植物表达载体购自上海北诺生物科技有限公司，是专门用于植物转化的RNA高效载体，具有卡那霉素抗性，它含有一个丙酮酸磷酸双激酶(Pyruvateorthophosphate dikinase,Pdk)基因的内含子，位于4493-5234bp，在它的上游含有Xho I和Kpn I酶切位点，用来连接目的基因的正向片段，在它的下游含有Hind III和Xba I酶切位点，用来连接目的基因的反向片段，最终获得双链发夹结构。

实施例1、桉树TPS基因全长cDNA的获得

步骤1、桉树TPS基因保守区片段的获得：以多种植物的TPS基因的保守功能区为模板，通过RT-PCR获得TPS基因的部分cDNA片段。

(1)对烟草(GenBank accession No.L04680)、冷杉(GenBank accession No.U87910)、鼠尾草、薄荷(GenBank accession No.L13459)等多种植物的TPS基因进行比对分析，以保守区为模板，设计了如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所述的引物对TPS-F1和TPS-R1；(2)提取桉树叶片总RNA，利用cDNA反转录试剂盒提供的反转录酶RevertAid M-MuLVReverse Transcriptase和Oligo dT18引物反转录成总cDNA；(3)以转录成的cDNA作为模板，以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2为引物进行RT-PCR扩增，目的产物P1约为600bp(图1)；(4)回收产物TPS-P1，与pEASY-Blunt-Zero载体连接，转化大肠杆菌DH5a，得到阳性质粒pEASY-TPS-P1，进行序列分析，如SEQ ID NO3所示。

步骤2、采用RACE技术，获得TPS基因的5'端和3'端cDNA片段。

TPS基因的5'端cDNA片段的获得：

(1)以获得的TPS-P1片段为模板，序列如SEQ ID NO3所示，设计了5'RACE引物GSP1、GSP2和GSP3，序列如SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示；(2)提取桉树叶片总RNA，利用5'RACE试剂盒提供的反转录酶SuperScript II和5'RACE引物GSP1反转录成5'RACE cDNA；(3)之后利用5'RACE试剂盒提供的AAP和GSP2作为引物，以5'RACE cDNA为模板，经过PCR获得产物TPS-P2，大小约为870bp(图2)；(4)然后，利用5'RACE试剂盒提供的UAP和GSP3作为引物，以P2为模板，经过巢式PCR获得产物TPS-P3，大小约为670bp(图3)；(5)回收产物P3，与pEASY-Blunt-Zero载体连接，转化大肠杆菌DH5a，得到阳性质粒pEASY-TPS-P3，进行序列分析，如SEQ ID NO9所示。

TPS基因的3'端cDNA片段的获得：

(1)以获得的TPS-P1片段为模板，序列如SEQ ID NO3所示，设计了3'RACE引物GSP4和GSP5，序列如SEQ ID NO10和SEQ ID NO11所示；(2)提取桉树叶片总RNA，利用3'RACE试剂盒提供的反转录酶SuperScript II和AP引物反转录成3'RACE cDNA；(3)之后利用3'RACE试剂盒提供的UAP和GSP4作为引物，以3'RACE cDNA为模板，经过PCR获得产物TPS-P4，大小约为710bp(图4)；(4)然后，利用3'RACE试剂盒提供的AUAP和GSP5作为引物，以TPS-P4为模板，经过巢式PCR获得产物TPS-P5，大小约为500bp(图5)；(5)回收产物P5，与pEASY-Blunt-Zero载体连接，转化大肠杆菌DH5a，得到阳性质粒pEASY-TPS-P5，进行序列分析，如SEQ ID NO14所示。

步骤3、TPS基因的全长cDNA序列的获得：

通过生物信息学软件Vector NTI11.0对TPS-P1、TPS-P3和TPS-P5片段进行拼接和分析，获得了TPS基因的全长cDNA，序列如SEQ ID NO15所示。

步骤4、TPS基因cDNA完整编码区片段的获得，步骤如下：

(1)以TPS基因全长cDNA序列为模板，设计了TPS基因cDNA完整编码区片段的引物对TPS-F2和TPS-R2，序列如SEQ ID NO16和SEQ ID NO17所示；(2)提取桉树叶片总RNA，利用cDNA反转录试剂盒提供的反转录酶RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase和Oligo dT₁₈引物反转录成总cDNA；(3)之后利用TPS-F2和TPS-R2作为引物，以总cDNA为模板，经过RT-PCR获得产物TPS-P6，大小约为1730bp(图6)；(4)回收产物TPS-P6，与pEASY-Blunt-Zero载体连接，转化大肠杆菌DH5a，得到阳性质粒pEASY-TPS-P6，进行序列分析，如SEQ ID NO19所示。

实施例2、降低桉树化感作用RNA干扰载体的构建

步骤1、设计桉树TPS基因的RNA干扰片段引物

根据TPS基因序列，以及pKANNIBAL载体上存在多克隆位点分析，利用Xho I和Kpn I可以将目的基因的正向片段连接到载体；而利用Hind III和Xba I可以将反向片段连接到载体。因此设计了下述引物：

TPS-RNAi-F1：5'-CATGCTCGAGTGCCTTGACGGACTTCAA-3'(下划线部分为Xho I酶切位点)

TPS-RNAi-R1：5'-CTGAGGTACCATGCTTGGGCTTGCTAAGA-3'(下划线部分为Kpn I酶切位点)

TPS-RNAi-F2：5'-CATGAAGCTTATGCTTGGGCTTGCTAAGA-3'(下划线部分为Hind III酶切位点)

TPS-RNAi-R2：5'-CTGATCTAGATGCCTTGACGGACTTCAACGT-3'(下划线部分为Xba I酶切位点)

步骤2、TPS基因干扰片段的获得

利用pEASY-TPS-P6质粒DNA为模板，以TPS-RNAi-F1(上游引物)和TPS-RNAi-R1(下游引物)作为引物对，以及TPS-RNAi-F2(上游引物)和CS-RNAi-R2(下游引物)作为引物对，经过PCR获得产物TPS-P7(图7)和TPS-P8(图8)，大小约为570bp，回收产物TPS-P7和TPS-P8，与pEASY-Blunt-Zero载体连接，转化大肠杆菌DH5a，得到阳性质粒pEASY-TPS-P7和pEASY-TPS-P8，经由Vector NTI11.0和NCBI Blast上进行比对分析后，确认此片段是TPS基因的部分片段，说明本发明得到的TPS基因片段序列正确。

PCR反应条件：98℃5min，(98℃10sec，66℃30sec，72℃2min)5个循环，(98℃10sec，64℃30sec，72℃2min)5个循环，(98℃10sec，62℃30sec，72℃2min)25个循环，72℃延伸10min，4℃保温。PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳检测。

步骤3、TPS基因正向片段与载体pKANNIBAL的连接

将上述pEASY-TPS-P7质粒DNA与pKANNIBAL载体分别经Xho I和Kpn I双酶切后，65℃处理20min，使内切酶失活，在T4DNA Ligase作用下连接，将目的基因的正向片段插入载体pKANNIBAL，转化大肠杆菌DH5a，经PCR鉴定(图9)、序列分析正确的重组质粒就是含有TPS-P7的正向片段的重组质粒，命名为pKANNIBAL-TPS-P7。

步骤4、TPS基因反向片段与载体pKANNIBAL-CS-P7的连接

将上述pEASY-TPS-P7质粒DNA与pKANNIBAL载体分别经Hind III和Xba I双酶切后，65℃处理20min，使内切酶失活，在T4DNA Ligase作用下连接，将目的基因的反向片段插入载体pKANNIBAL-TPS-P7，转化大肠杆菌DH5a，经PCR鉴定(图10)、序列分析正确的重组质粒就是含有TPS-P7和TPS-P8发夹结构的重组质粒，命名为pKANNIBAL-TPS-RNAi。

步骤5、TPS基因干扰区段插入载体pART27

将上述pKANNIBAL-TPS-RNAi质粒DNA与载体pART27分别经Not I单酶切后，65℃处理20min，使内切酶失活，回收纯化目的片段和载体pART27，并分别进行去磷酸化处理。之后在T4DNA Ligase作用下连接，将TPS基因干扰区段插入载体pKANNIBAL-TPS-P7，转化大肠杆菌DH5a，经PCR鉴定(图11)、序列分析正确的重组质粒就是含有TPS基因干扰区段的重组质粒，命名为pART27-TPS-RNAi。将载体图谱见图12，该载体可用于农杆菌介导的桉树下胚轴的遗传转化。

实施例3、RNA干扰载体电击转化根癌农杆菌EHA105

由于重组质粒pART27-TPS-RNAi向农杆菌EHA105进行热击转化的效率较低，本发明采取了电击转化的方法，获得了含有目的基因的重组农杆菌。具体步骤如下：

步骤1、将1μg质粒pART27-TPS-RNAi与150μl农杆菌EHA105感受态细胞混匀，加入到灭菌后的电击杯中，于2.5KV电压下进行电击转化。

步骤2、然后加800μl液体培养基冲洗电击杯并转入1.5ml离心管，28℃，220rpm培养2h。

步骤3、将培养液涂布YEB固体平板(卡那霉素50μg/ml；利福平50μg/ml)，28℃培养约18h。

步骤4、经挑取单菌落于5ml YEB液体培养基(卡那霉素50μg/ml；利福平50μg/ml)，28℃，220rpm，培养16～24h即可。

步骤5、重组农杆菌的PCR鉴定

菌落PCR鉴定结果表明，阳性转化子和载体质粒为模板的阳性对照分别扩增到约1900bp左右的条带(图13)；以未转化的空的EHA105菌液为模板的阴性对照未得到目的片段。

实施例4、降低桉树化感作用RNA干扰载体的应用。

应用上述含有TPS基因目的片段发夹结构的重组农杆菌转化有关受体植物-赤桉种子萌发后的下胚轴，从而降低桉树的化感作用。图14.转化后的桉树下胚轴；图15.桉树转基因愈伤组织；图16.桉树转基因不定芽；图17.桉树转基因不定芽的生长；图18.桉树转基因不定芽的生根；图19.桉树转基因阳性植株的移栽。本发明已得到以赤桉(Eucalyptus camaldμlensis)为受体的T0代再生植株，转化载体pART27-TPS-RNAi的植株是10株。

实施例5、转基因植株(T0代)的PCR鉴定

本发明以SEQ ID NO21和SEQ ID NO24为引物对，对获得的105株T0代转基因植株进行PCR检测，结果表明：共有32株T0代植株扩增到约1500bp的目的条带，说明目的基因整合进了桉树的基因组(图20)。

实施例6、转基因植株的化感作用测定

本发明通过人工接种的方法，在温室对已得到的转基因105株T0代和未转化的桉叶油组分进行GC-MS解析，结果表明，其中15株的桉叶油(a-蒎烯，a-松油醇，1,8-桉叶油素)降低75％左右，10株的降低45％左右，7株的降低25％左右，阳性率为30.5％(图21)。

本实施例目的在于使本领域专业技术人员可以据其了解本发明的技术方案并加以实施，并不能以其限制本专利的保护范围，凡依据本发明披露技术所作的变形，均落入本发明的保护范围。本发明的保护范围以权利要求书所述内容为准。

Claims (10)

1.一种桉树TPS基因，其特征在于，所述TPS基因序列如SEQ ID NO7，编码的蛋白质具有催化GPP生成a-松油醇、以及进一步催化a-松油醇生成桉叶油素的功能；并且GPP在TPS的催化下还可以分别生成a-蒎烯(a-Pinene)和β-蒎烯(β-Pinene)。

2.根据权利要求1所述的一种桉树TPS基因，其特征在于，是按如下步骤得到：(1)以多种植物的TPS基因的保守功能区为模板，通过RT-PCR获得TPS基因的部分cDNA片段；(2)采用RACE技术，获得TPS基因的5'端和3'端cDNA片段；(3)通过对序列的拼接和分析，获得TPS基因的全长cDNA序列；(4)通过RT-PCR获得桉树TPS基因的cDNA完整编码区片段。

3.一种用于降低桉树化感作用的RNA干扰载体，包括骨架载体和含有正向片段和反向片段的发夹结构，其特征在于，以所述TPS基因的部分片段为正向片段或反向片段，所述TPS基因部分片段序列如SEQ ID NO20。

4.根据权利要求3所述的一种用于降低桉树化感作用的RNA干扰载体，其特征在于，所述发夹结构由如下方法得到：以pKANNIBAL为中间载体，所述正向片段插入在酶切位点Xho I和Kpn I之间，反向片段插入在酶切位点Hind III和Xba I之间，构建得到pKANNIBAL-TPS-RNAi，之后分别对pKANNIBAL-TPS-RNAi和pART27进行Not I单酶切和连接后，得到桉树低化感物质RNA干扰载体pART27-TPS-RNAi。

5.根据权利要求3所述的一种用于降低桉树化感作用的RNA干扰载体，其特征在于，所述干扰载体构建包括如下步骤：

(1)选取桉树TPS基因的保守功能区作为RNA干扰片段，通过RT-PCR将Xho I和KpnI酶切位点加RNA干扰片段两端，作为正向片段；将Hind III和Xba I酶切位点加在RNA干扰片段两端，作为反向片段；(2)将步骤(1)得到的正向片段和反向片段克隆至pEASY-Blunt-Zero载体上，分别获得阳性质粒pEASY-TPS-P7和pEASY-TPS-P8；(3)将步骤(2)得到的pEASY-TPS-P7经Xho I和Kpn I双酶切后，与同样经过Xho I和Kpn I双酶切的pKANNIBAL载体连接，得到pKANNIBAL-TPS-P7；(4)将步骤(3)得到的pEASY-TPS-P8经Hind III和Xba I双酶切后，与同样经过Hind III和Xba I双酶切的pKANNIBAL-TPS-P7载体连接，即可得到载体pKANNIBAL-TPS-RNAi；(5)将步骤(4)得到的pKANNIBAL-TPS-RNAi经Not I单酶切后，与同样经过Not I酶切的pART27载体连接，即可得到载体pART27-TPS-RNAi。

6.根据权利要求3-5任一项所述的一种用于降低桉树化感作用的RNA干扰载体在转基因植物中的应用，其特征在于，所述转基因植物为桉树。

7.根据权利要求3-5任一项所述的一种用于降低桉树化感作用的RNA干扰载体转化有关受体植物的应用，其特征在于，使受体的化感作用降低，所述受体为赤桉。

8.根据权利要求7所述一种用于降低桉树化感作用的RNA干扰载体转化有关受体植物的应用，其特征在于，所述转化的方法为农杆菌介导法。

9.据权利要求8所述一种用于降低桉树化感作用的RNA干扰载体转化有关受体植物的应用，其特征在于，所述的农杆菌为根瘤农杆菌菌株EHA105。

10.根据权利要求7所述一种用于降低桉树化感作用的RNA干扰载体转化有关受体植物的应用，其特征在于，所述赤桉为种子萌发后的下胚轴。