CN108384801A - 一种基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法 - Google Patents

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CN108384801A CN201810146248.7A CN201810146248A CN108384801A CN 108384801 A CN108384801 A CN 108384801A CN 201810146248 A CN201810146248 A CN 201810146248A CN 108384801 A CN108384801 A CN 108384801A
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Abstract

本发明公开了一种基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法。所述方法包括通过向绿豆细胞内引入dsRNA对cha基因的目标区域进行干扰；向绿豆细胞内引入dsRNA的方法包括：针对RNA干扰的目标区域设计DNA片段，所述的DNA片段为5’‑目标序列‑连接序列‑目标序列的反向互补序列‑3’，其中连接序列不与目标序列互补；将所述的干扰片段连入植物表达载体，获得RNAi载体；将所述的RNAi载体转化绿豆植株。本发明利用RNAi技术对cha基因进行RNA干扰，使该基因的表达水平下调，可以选育得到缺失龙骨瓣且柱头、花药外露的绿豆新种质，有利于花粉的互相传播及杂交制种，为绿豆的杂交种利用打下基础。

Description

一种基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法
技术领域
本发明涉及分子育种、基因工程有分子生物学领域，尤其涉及一种基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法。
背景技术
绿豆(Vigna radiate L.)是我国主要食用豆类作物之一，其含有丰富的维生素和矿物质、膳食纤维、蛋白，深得消费者喜爱。但是，绿豆品种均为产量较低的常规品种，产量一般只是1000至1500公斤/公倾。由于单产低，难于与其它大田作物竞争，面积不断萎缩。因此如何大幅度提高绿豆产量是广大绿豆育种家所必须面临和解决的迫切问题。
杂交优势的利用是提高作物产量的途径之一。杂种优势是生物界的一种普遍现象，一般是指杂种在生长势、生活力、抗逆性、繁殖力、适应性、产量、品质等方面优于其亲本的现象。目前已经有多种作物的杂交种被利用于生产。在天然自交受粉的作物之中，水稻的杂种优势的利用是最好的例子，杂交稻一般比常规稻增产10-20％。中国在1973年就建立起“三系配套”的水稻育种系统，近年来杂交水稻的种植面积一直都超过水稻种植总面积的50％(Cheng et al.,2007)。Chen等(2003)发现利用绿豆品种KPS1与Korea7等不同组合配制的杂交组合后代在产量上最高可得到40％以上的超亲优势。
但是绿豆是严格的闭花授精植物，其花器官为蝶形花，花药和柱头被包裹在龙骨瓣内，阻碍植株之间进行花粉交流，其天然自交率大概只有1.1％(Sangsiri et al.,2007)，这是绿豆杂交种制种过程中的一大障碍。因此，获得能够开花传粉的绿豆植株对绿豆的杂交制种至关重要。
发明内容
发明目的：为解决现有技术中的问题，本发明的目的之一是提供一种基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法，可成功获得开花传粉绿豆；本发明的目的之二是提供相关的DNA片段及其重组载体、表达盒或宿主菌以及dsRNA。
技术方案：本发明所述的基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法，包括对绿豆的cha基因进行RNA干扰，其中RNA干扰的目标区域为cha基因的CDS序列。
进一步的,RNA干扰的目标区域为cha基因的第三外显子。
所述RNA干扰时，通过向绿豆细胞内引入dsRNA对所述的目标区域进行干扰。
所述dsRNA具有相互补的正义链和反义链，其中正义链的序列为SEQ ID NO.3所示。
所述向绿豆细胞内引入dsRNA的方法包括：
(1)针对RNA干扰的目标区域设计DNA片段，所述的DNA片段为
5’-目标序列-连接序列-目标序列的反向互补序列-3’，其中连接序列不与目标序列互补；
(2)将所述的干扰片段连入植物表达载体，获得RNAi载体；
(3)将所述的RNAi载体转化绿豆植株。
步骤(1)中，DNA片段中，所述目标序列的序列如SEQ ID NO.2所示。所述连接序列不与目标序列互补是指连接序列与目标序列无法形成互补的双链结构。通过连接序列，DNA片段能够在细胞内形成颈环结构。所述的连接序列可为PDK intron。
所述DNA片段可采用常规分子生物学方法进行构建。
步骤(2)中，所述的植物表达载体为pART27。
具体的，一种RNAi载体构建方法如下：
(1)设计上游引物5′端包含限制性内切酶KpnⅠ的正向引物
5’-GGCGGTACCGGTTCTCGTCATTGGCTGTG-3’，和包含限制性内切酶XhoⅠ反向引物5’-GGCCTCGAGGCACGTTGCTCTTGTACCCT-3’，以绿豆cDNA或连接SEQ ID NO.2序列的T载体为模板进行扩增得到目标序列，将其连入用KpnⅠ/XhoⅠ双酶切的表达载体
pKANNIBAL中，形成中间载体pKANNIBAL-1；
(2)设计上游引物5′端包含限制性内切酶ClaⅠ的正向引物
5’-GGCATCGATGGTTCTCGTCATTGGCTGTG-3’，和包含限制性内切酶BamHⅠ反向引物5’-GGCGGATCCGCACGTTGCTCTTGTACCCT-3’，以绿豆cDNA或连接SEQ ID NO.2序列的T载体为模板进行扩增得到目标序列的反向互补序列，将其连入经限制性内切酶ClaⅠ/BamHⅠ双酶切后的载体pKANNIBAL-1中，构建中间载体pKANNIBAL-Cha；
(3)用NotⅠ酶切pKANNIBAL-Cha并回收Cha-dsRNA表达框，再利用NotI位点插入到双元表达载体pART27的左右边界之间，构建得到RNAi载体。
步骤(3)中，所述RNAi载体可采用常规方法如采用磁性纳米载体介导将RNAi载体转化绿豆植株，筛选阳性植株，RNAi载体表达的dsRNA可干扰cha基因的表达，引起其表达量下调，使得绿豆的龙骨瓣缺失，柱头、花药外露。
本发明还提供了一种DNA片段，所述的DNA片段为5’-目标序列-连接序列-目标序列的反向互补序列-3’，其中连接序列不与目标序列互补。具体如上所述。
本发明还提供了含有所述的DNA片段的重组载体、表达盒或宿主菌，其中重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。
所述重组克隆载体的基础载体可以为pKANNIBAL，所述重组表达载体的基础载体可以为pART27。
本发明还提供了一种dsRNA，具体如上所述。
本发明还提供了所述的dsRNA，DNA片段，含所述DNA片段的重组载体、表达盒或宿主菌在培育绿豆开花传粉植株中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
有研究发现一个缺失龙骨瓣的绿豆突变体能进行开花传粉，并且通过基因定位得到控制开花传粉的突变基因cha(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，发现该基因编码一个YUCCA蛋白(Chen J,Somta P,Chen X,et al.Gene Mapping of a Mutant Mungbean(Vignaradiata L.)Using New Molecular Markers Suggests a Gene Encoding a YUC4-likeProtein Regulates the Chasmogamous Flower Trait[J].Frontiers in plantscience,2016,7.)。本发明利用RNAi技术对cha基因进行RNA干扰，使该基因的表达水平下调，可以选育得到缺失龙骨瓣且柱头、花药外露的绿豆新种质，有利于花粉的互相传播及杂交制种，为绿豆的杂交种利用打下基础。
附图说明
图1为获得的转基因绿豆与野生型苏绿1号的花器官图片；
图2为获得的转基因绿豆与野生型苏绿1号的花器官各部分结构图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明建议的条件。
实施例1用于对cha基因的进行RNAi的载体构建
以绿豆品种苏绿1号为例。
提取苏绿1号总RNA，逆转录为cDNA。设计引物，例如但不限于：正向引物(SEQ IDNO.4)：5’-GGTTCTCGTCATTGGCTGTG-3’，反向引物(SEQ ID NO.5)：5’-GCACGTTGCTCTTGTACCCT-3’，以cDNA为模板进行PCR扩增获得目的片段(SEQ ID NO.2)；PCR扩增反应体系的总体积为25μL，其中cDNA15ng，10×PCR缓冲液2.5μL，10mmol/L dNTP各0.5μL，20μmol/L正、反向引物各1μL，TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)1μL，余量为ddH2O；扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s，52℃40s，72℃1min，25次循环；72℃10min，4℃保存。
PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测并回收，回收片断与pGEM2-T easyvector连接，经蓝白斑筛选后挑选阳性克隆由上海基康生物技术有限公司测序，经测序后基因序列完全匹配的克隆载体命名为pGEM2-Cha。设计上游引物5′端包含限制性内切酶KpnⅠ的正向引物(SEQ ID NO.6)5’-GGCGGTACCGGTTCTCGTCATTGGCTGTG-3’，和包含限制性内切酶XhoⅠ反向引物(SEQ ID NO.7)5’-GGCCTCGAGGCACGTTGCTCTTGTACCCT-3’，扩增正向插入片断。PCR扩增反应体系的总体积为25μL，其中pGEM2-Cha载体15ng，10×PCR缓冲液2.5μL，10mmol/L dNTP各0.5μL，20μmol/L正、反向引物各1μL，TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)1μL，余量为ddH2O；扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s，52℃40s，72℃1min，25次循环；72℃10min，4℃保存。，2％琼脂糖凝胶电泳检测并回收，回收片断与pGEM2-T easy vector连接，经蓝白斑筛选后挑选阳性克隆由上海基康生物技术有限公司测序，测序正确的质粒经限制性内切酶KpnⅠ/XhoⅠ双酶切后连接于同样用KpnⅠ/XhoⅠ双酶切的表达载体pKANNIBAL中，形成中间载体pKANNIBAL-1。设计上游引物5′端包含限制性内切酶ClaⅠ的正向引物(SEQ IDNO.8)5’-GGCATCGATGGTTCTCGTCATTGGCTGTG-3’，和包含限制性内切酶BamHⅠ反向引物(SEQID NO.9)5’-GGCGGATCCGCACGTTGCTCTTGTACCCT-3’，扩增反向插入片断，PCR扩增反应体系的总体积为25μL，其中pGEM2-Cha载体15ng，10×PCR缓冲液2.5μL，10mmol/L dNTP各0.5μL，20μmol/L正、反向引物各1μL，TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)1μL，余量为ddH2O；扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s，52℃40s，72℃1min，25次循环；72℃10min，4℃保存。2％琼脂糖凝胶电泳检测并回收，回收片断与pGEM2-T easy vector连接，经蓝白斑筛选后挑选阳性克隆由上海基康生物技术有限公司测序，测序正确的质粒经限制性内切酶ClaⅠ/BamHⅠ双酶切后连接于同样用ClaⅠ/BamHⅠ双酶切的表达载体pKANNIBAL-1中，构建中间载体pKANNIBAL-Cha。用NotⅠ酶切pKANNIBAL-Cha并回收Cha-dsRNA表达框，再利用NotI位点插入到双元表达载体pART27的左右边界之间形成Cha基因家族的dsRNA高效表达双元载体pART27-Cha。
实施例2绿豆的遗传转化
参考Zhao等(Zhao X,Meng Z,Wang Y,et al.Pollen magnetofection forgenetic modification with magnetic nanoparticles as gene carriers[J].Natureplants,2017:1.)的方法，利用磁性纳米载体介导将RNAi质粒转化苏绿1号绿豆植株。用超纯水分别将磁性纳米粒子(MNP，具体产品为PolyMag1000，购自Chemicell公司)和质粒稀释至1μg/μl，按体积比1:4混合并在室温中孵育30分钟使MNP-质粒复合体形成。将MNP-质粒复合体加入到1ml花粉培养基(每100ml含15g蔗糖，0.03g Ca(NO3)2·4H2O，0.01g H3BO3，水为溶剂)之中，得MNP-质粒复合体悬浮液。
清晨从绿豆花器官中收集得到100mg的花粉于培养皿中，加入MNP-质粒复合体悬浮液使花粉充分浸润。盖上培养皿，置于MagnetoFACTOR-24磁板(购自Chemicell公司)上0.5小时进行花粉磁转化。然后，用移液器小心去除上层的水，将磁转化的花粉置于滤纸上，30℃干燥15至30分钟。收集干燥后的磁转化花粉。
将绿豆花器官去雄，授予磁转化的花粉。10天后，收获成熟的种子。将种子种于含有50μg/ml卡那霉素的Murashige&Skoog(MS)培养基上，长成带有1对真叶的幼苗后移载至花盆。长出3对真叶后收取叶子提取DNA进行PCR鉴定。令阳性转化植株继续生长至开药，观察得到如图1、图2所示的花器官,龙骨瓣和翼瓣缺失且柱头、花药外露。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1206
<212> DNA
<213> 绿豆(Vigna radiata Linn. Wilczek.)
<400> 1
atgggttctt gcaaacccca acaagaacat gttcatggac ctatcatcat aggtgccggt 60
ccttcaggcc tagccgtggc tgcgtgtctc tcggagcaca aagtcccttt cgtgattctt 120
gagagaagca actgcatagc ctctctttgg caacacaaaa cctacgaccg tctcaaactc 180
cacctcccaa agcagttctg cgagcttccc ttgaaaggtt ttccccacaa cttccccaag 240
taccccacaa agtaccagtt catatcctac atggagtcct acgcctcaca cttcaacatc 300
caccccaggt tcaaccaaac agtcgaaact gctcactttg ataaagcctc tcagctttgg 360
ctcgttagga ctcagcactg tcagcttctc tctccttggc tcgtcgtggc caccggggag 420
aatgctgagc ctgtgcttcc tagaattcat ggcatggacc atttctctgg ctccattgct 480
cacaccagtg tctacaagtc tggctctgag tacacaaacc agaaggttct cgtcattggc 540
tgtggcaatt caggaatgga agttagctta gacctttgca gacacaatgc ctccccttac 600
atggttgcaa ggaacacagt gcatgtcctt cctagggaga tgtttggctt ctcaactttt 660
ggcatagcca tggctcttta caagtggttt cccatcaaag ttgtagacaa aattctctta 720
cttgtgacca acttcatgtt gggaaacaca aatcactatg gcatcaaaag gcctaaaaca 780
ggcccaatag agctgaaact agccacaggg aaaaccccag tccttgatgt gggtcaagtt 840
gcacagatca aatgtggcaa cataaaggtg atggaaggtg tgaaggagat aactagaaaa 900
ggtgcgaaat ttatggatgg acaagaaaag gaatttgatg ctataatatt ggcaacaggg 960
tacaagagca acgtgcctgc ttggcttaag ggttgtgatt ttttcactga ggatggaatg 1020
ccgaaaacac cctttcccca tgggtggaaa ggggagcagg gattgtatac ggtggggttc 1080
accagaagag gcattcaagg aacatcttgt gatgcaatca agatcgctga agacatagcc 1140
tcgcagtgga gaaccgtaga gaacaagaat caatgcaatt cacatatcat ccttctcact 1200
tcataa 1206
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<212> DNA
<213> 绿豆(Vigna radiata Linn. Wilczek.)
<400> 2
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tggcttctca acttttggca tagccatggc tctttacaag tggtttccca tcaaagttgt 180
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tgatgtgggt caagttgcac agatcaaatg tggcaacata aaggtgatgg aaggtgtgaa 360
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<213> 绿豆(Vigna radiata Linn. Wilczek.)
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caaugccucc ccuuacaugg uugcaaggaa cacagugcau guccuuccua gggagauguu 120
uggcuucuca acuuuuggca uagccauggc ucuuuacaag ugguuuccca ucaaaguugu 180
agacaaaauu cucuuacuug ugaccaacuu cauguuggga aacacaaauc acuauggcau 240
caaaaggccu aaaacaggcc caauagagcu gaaacuagcc acagggaaaa ccccaguccu 300
ugaugugggu caaguugcac agaucaaaug uggcaacaua aaggugaugg aaggugugaa 360
ggagauaacu agaaaaggug cgaaauuuau ggauggacaa gaaaaggaau uugaugcuau 420
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<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggcggatccg cacgttgctc ttgtaccct 29

Claims (9)

1.一种基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法，其特征在于，包括对绿豆的cha基因进行RNA干扰，其中RNA干扰的目标区域为该基因的CDS序列。
2.根据权利要求1所述的基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法，其特征在于，RNA干扰的目标区域为cha基因的第三外显子。
3.根据权利要求1或2所述的基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法，其特征在于，通过向绿豆细胞内引入dsRNA对所述的目标区域进行干扰，其中dsRNA正义链具有SEQID NO.3所示的序列，反义链与正义链互补。
4.根据权利要求3所述的基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法，其特征在于，向绿豆细胞内引入dsRNA的方法包括：
(1)针对RNA干扰的目标区域设计DNA片段，所述的DNA片段为5’-目标序列-连接序列-目标序列的反向互补序列-3’，其中连接序列不与目标序列互补；
(2)将所述的干扰片段连入植物表达载体，获得RNAi载体；
(3)将所述的RNAi载体转化绿豆植株。
5.根据权利要求4所述的基于RNAi技术选育绿豆开花传粉植株的方法，其特征在于，所述的植物表达载体为pART27。
6.一种dsRNA，其特征在于，其中正义链具有SEQ ID NO.3所示的序列，反义链与正义链互补。
7.一种DNA片段，其特征在于，所述的DNA片段为5’-目标序列-连接序列-目标序列的反向互补序列-3’，其中连接序列不与目标序列互补，所述目标序列如SEQ ID NO.2所示。
8.含有权利要求7所述的DNA片段的重组载体、表达盒或宿主菌，其中重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。
9.根据权利要求6所述的dsRNA、根据权利要求7所述的DNA片段、权利要求8所述的重组载体、表达盒或宿主菌在培育绿豆开花传粉植株中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105002194A (zh) * 2014-06-17 2015-10-28 国家林业局桉树研究开发中心 一种桉树tps基因、rna干扰载体及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JINGBIN CHEN等: ""Gene Mapping of a Mutant Mungbean (Vigna radiata L.) Using New Molecular Markers Suggests a Gene Encoding a YUC4-like Protein Regulates the Chasmogamous Flower Trait"", 《FRONTIERS IN PLANT SCIENCE》 *
NCBI: ""PREDICTED: Vigna radiata var. radiata probable indole-3-pyruvate monooxygenase YUCCA4 (LOC106764471)，mRNA"", 《GENBANK DATABASE》 *

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