JP2001515702A - 作物植物の大規模突然変異誘発法 - Google Patents
作物植物の大規模突然変異誘発法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、作物植物中の突然変異体の迅速かつ大規模な産生を可能にする。これは、同じ種の市販の植物と交配することができるミニ植物を使用することにより達成される。ミニ栽培品種中で突然変異を誘導し、次に得られる突然変異植物集団中で突然変異体を同定する。目的の突然変異遺伝子は、選択された突然変異ミニ植物と市販の栽培品種を交配することにより市販の栽培品種中に遺伝子移入することができる。ランダムＴ−ＤＮＡまたはトランスポゾン挿入事象を含有するミニ作物の植物集団を使用し、可動性ＤＮＡ接種マーカー遺伝子挿入についてこの集団をスクリーニングすることにより、逆向き遺伝学を行うことができる。この作製体から得られる突然変異を、選択マーカー遺伝子の発現について迅速にスクリーニングし、これらの形質転換体中のスクリーニング可能なマーカー遺伝子に機能的に結合したプロモーターをクローン化する。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、植物遺伝学の分野に属し、作物植物の突然変異誘発、遺伝子同定、
および遺伝子機能の解析のための改良法に関する。本発明は、任意の植物種にお
いて有用であり、トマトでの使用を本明細書に例示する
および遺伝子機能の解析のための改良法に関する。本発明は、任意の植物種にお
いて有用であり、トマトでの使用を本明細書に例示する
【０００２】 （発明の背景） 高等植物のゲノムは、３０，０００〜５０，０００個の遺伝子を有すると推定
されている。機能が割り当てられているのはわずか数百の植物遺伝子である。遺
伝子機能を確認するのに、新しい遺伝子の単離およびこれらの新たに単離された
遺伝子の突然変異がしばしば必要である。バイオテクノロジーによる作物の改良
は、新たに単離された遺伝子の詳細な性状解析に依存する。
されている。機能が割り当てられているのはわずか数百の植物遺伝子である。遺
伝子機能を確認するのに、新しい遺伝子の単離およびこれらの新たに単離された
遺伝子の突然変異がしばしば必要である。バイオテクノロジーによる作物の改良
は、新たに単離された遺伝子の詳細な性状解析に依存する。
【０００３】 アラビドプシス（Arabidopsis）モデル系は、過去１０年間の植物分子生物学 の顕著な進展に大きく貢献してきた。アラビドプシス（Arabidopsis）の使用が 成功した大きな理由は、その小ささ、短い生活環および比較的小さいゲノムであ
る（リュートウィラー（Leutwiler）ら、１９８４）。さらにアラビドプシス（A
rabidopsis）は、外来ＤＮＡで容易に形質転換可能である（ベクトールド（Bech
told）ら、１９９３）。これらの特徴は、目的の形質を制御する種々の遺伝子の
突然変異体の大きな集団をスクリーニングすることにより、アラビドプシス（Ar
abidopsis）で発現される任意の形質の遺伝的分析を容易にする。メタンスルホ ン酸エチル（ＥＭＳ）、高速ニュートロン衝撃、Ｔ−ＤＮＡ挿入、およびトラン
スポゾン標識により突然変異誘発させた植物集団は、植物成長とゲノム形質の遺
伝的制御を分析するための手段として、植物生物学者にとって非常に有用である
ことが証明された（コンクズ（Koncz）ら、１９９２）。遺伝的解析のためのモ デルとしてアラビドプシス（Arabidopsis）を利用が非常に大きいにもかかわら ず、この種で得られた知見は、他の農学的に重要な作物種に必ずしもいつも応用
できるわけではない。例えばアラビドプシス（Arabidopsis）は長角果タイプの 果実を有し、従ってこれはアブラナ科（Brassicaceae）のメンバーの果実成長の
良好なモデル種であるが、多肉質の液果タイプの果実を産生する植物にとっては
有用ではない。
る（リュートウィラー（Leutwiler）ら、１９８４）。さらにアラビドプシス（A
rabidopsis）は、外来ＤＮＡで容易に形質転換可能である（ベクトールド（Bech
told）ら、１９９３）。これらの特徴は、目的の形質を制御する種々の遺伝子の
突然変異体の大きな集団をスクリーニングすることにより、アラビドプシス（Ar
abidopsis）で発現される任意の形質の遺伝的分析を容易にする。メタンスルホ ン酸エチル（ＥＭＳ）、高速ニュートロン衝撃、Ｔ−ＤＮＡ挿入、およびトラン
スポゾン標識により突然変異誘発させた植物集団は、植物成長とゲノム形質の遺
伝的制御を分析するための手段として、植物生物学者にとって非常に有用である
ことが証明された（コンクズ（Koncz）ら、１９９２）。遺伝的解析のためのモ デルとしてアラビドプシス（Arabidopsis）を利用が非常に大きいにもかかわら ず、この種で得られた知見は、他の農学的に重要な作物種に必ずしもいつも応用
できるわけではない。例えばアラビドプシス（Arabidopsis）は長角果タイプの 果実を有し、従ってこれはアブラナ科（Brassicaceae）のメンバーの果実成長の
良好なモデル種であるが、多肉質の液果タイプの果実を産生する植物にとっては
有用ではない。
【０００４】 一方、トマト（リコペルシコン・エスクレンツム（Lycopersicon esculentum ））は、多肉質の液果タイプの果実を産生する作物種の良好なモデルである。ト
マトは遺伝的によく知られている。トマトは、数百のマッピングされた形質と分
子マーカーを含有する比較的小さな二倍体ゲノム（ｎ＝１２、Ｃ＝１pg）を有す
る（タンスクレイ（Tanskley）、１９９３）。トマトは、外来ＤＮＡで形質転換
することができる（マコーミック（McCormick）ら、１９８６）。さらにこれは 、新鮮野菜マーケットならびに食物加工産業の最も重要な作物の１つである（ヒ
レ（Hille）ら、１９８９；リック（Rick）とヨーダー（Yoder）、１９８８）。
マトは遺伝的によく知られている。トマトは、数百のマッピングされた形質と分
子マーカーを含有する比較的小さな二倍体ゲノム（ｎ＝１２、Ｃ＝１pg）を有す
る（タンスクレイ（Tanskley）、１９９３）。トマトは、外来ＤＮＡで形質転換
することができる（マコーミック（McCormick）ら、１９８６）。さらにこれは 、新鮮野菜マーケットならびに食物加工産業の最も重要な作物の１つである（ヒ
レ（Hille）ら、１９８９；リック（Rick）とヨーダー（Yoder）、１９８８）。
【０００５】 トマト遺伝学をさらに進展させるための大きな障害は、遺伝子同定に必要な大
きな突然変異体集団がないことである。トマトの有用な突然変異体集団は、各ト
マト遺伝子について少なくとも１つの突然変異体対立遺伝子を含有するであろう
。そのような集団は、この作物の飽和突然変異誘発を達成することを可能にする
であろう。突然変異トマト植物を産生するための技術は存在するが、これらの技
術を充分に大規模に応用して、ゲノムが突然変異体で飽和されている集団を得る
ことは、時間と空間の制約のために、現在は不可能である。これらの同じ制約の
ため、他の農作物の研究も限定される。
きな突然変異体集団がないことである。トマトの有用な突然変異体集団は、各ト
マト遺伝子について少なくとも１つの突然変異体対立遺伝子を含有するであろう
。そのような集団は、この作物の飽和突然変異誘発を達成することを可能にする
であろう。突然変異トマト植物を産生するための技術は存在するが、これらの技
術を充分に大規模に応用して、ゲノムが突然変異体で飽和されている集団を得る
ことは、時間と空間の制約のために、現在は不可能である。これらの同じ制約の
ため、他の農作物の研究も限定される。
【０００６】 突然変異トマト植物は、ＥＭＳ（ヒルデリング（Hildering）とベルカーク（V
erkerk）、１９６５；シェーンメーカーズ（Shoenmakers）ら、１９９１；ウィ スマン（Wisman）ら、１９９１）、Ｘ線（ヒルデリング（Hildering）とベルカ ーク（Verkerk）、１９６５）、または高速ニュートロン（ベルカーク（Verkerk
）、１９７１）のようなＤＮＡ障害物質を使用して産生されているが、アラビド
プシス（Arabidopsis）での同様の試みと比較すると、はるかに限定されている 。トマトジェネティックリソースセンター（Tomato Genetic Resource Center）
から入手できる数百の突然変異トマト株が報告されているが、新しい遺伝子の突
然変異のスクリーニングに利用可能な、Ｍ１植物の大きい集団由来の突然変異誘
発したＭ２種子のストックはない。
erkerk）、１９６５；シェーンメーカーズ（Shoenmakers）ら、１９９１；ウィ スマン（Wisman）ら、１９９１）、Ｘ線（ヒルデリング（Hildering）とベルカ ーク（Verkerk）、１９６５）、または高速ニュートロン（ベルカーク（Verkerk
）、１９７１）のようなＤＮＡ障害物質を使用して産生されているが、アラビド
プシス（Arabidopsis）での同様の試みと比較すると、はるかに限定されている 。トマトジェネティックリソースセンター（Tomato Genetic Resource Center）
から入手できる数百の突然変異トマト株が報告されているが、新しい遺伝子の突
然変異のスクリーニングに利用可能な、Ｍ１植物の大きい集団由来の突然変異誘
発したＭ２種子のストックはない。
【０００７】 形質転換法はいまだに手間がかかるため、Ｔ−ＤＮＡ標識による挿入突然変異
誘発は、トマトでは現実的ではない。一方トランスポゾン標識は、トマトや他の
農作物種の突然変異誘発および遺伝子同定において有望なアプローチである。Ａ
ｃ／Ｄｓ輸送可能成分ファミリーは、トマトにおいて活性であり（ヨーダー（Yo
der）ら、１９８８）、この種のＡｃ／Ｄｓ転位のパターンは、報告されている （キャロル（Carroll）ら、１９９５；オズボーン（Osborne）ら、１９９１；ロ
メンス（Rommens）ら、１９９２；ヨーダー（Yoder）ら、１９８８）。トマトゲ
ノム中でマッピングされたＤｓ成分を含有するトマト株が作成されている（クナ
ップ（Knapp）ら、１９９４；トーマス（Thomas）ら、１９９４）。これらの株 は、近くの部位のＡｃ／Ｄｓの選択的挿入の利用を可能にする（ドーナー（Doon
er）とベラチュー（Belachew）、１９８９；ジョーンズ（Jones）ら、１９９０ ）。Ａｃ／Ｄｓ標識系を使用して、クラドスポリウム（Cladosporium）耐性を担
う遺伝子座であるｃｆ９（ジョーンズ（Jones）ら、１９９４）；サイトクロー ムｐ４５０同族体をコードする遺伝子であるｄｗａｒｆ（ビショップ（Bishop）
ら、１９９６）；および葉緑体の成長を制御するｄｃｌ（ケディー（Keddie）ら
、１９９６）のようないくつかの遺伝子を標識および単離した。
誘発は、トマトでは現実的ではない。一方トランスポゾン標識は、トマトや他の
農作物種の突然変異誘発および遺伝子同定において有望なアプローチである。Ａ
ｃ／Ｄｓ輸送可能成分ファミリーは、トマトにおいて活性であり（ヨーダー（Yo
der）ら、１９８８）、この種のＡｃ／Ｄｓ転位のパターンは、報告されている （キャロル（Carroll）ら、１９９５；オズボーン（Osborne）ら、１９９１；ロ
メンス（Rommens）ら、１９９２；ヨーダー（Yoder）ら、１９８８）。トマトゲ
ノム中でマッピングされたＤｓ成分を含有するトマト株が作成されている（クナ
ップ（Knapp）ら、１９９４；トーマス（Thomas）ら、１９９４）。これらの株 は、近くの部位のＡｃ／Ｄｓの選択的挿入の利用を可能にする（ドーナー（Doon
er）とベラチュー（Belachew）、１９８９；ジョーンズ（Jones）ら、１９９０ ）。Ａｃ／Ｄｓ標識系を使用して、クラドスポリウム（Cladosporium）耐性を担
う遺伝子座であるｃｆ９（ジョーンズ（Jones）ら、１９９４）；サイトクロー ムｐ４５０同族体をコードする遺伝子であるｄｗａｒｆ（ビショップ（Bishop）
ら、１９９６）；および葉緑体の成長を制御するｄｃｌ（ケディー（Keddie）ら
、１９９６）のようないくつかの遺伝子を標識および単離した。
【０００８】 逆向き遺伝学は、単離した遺伝子の機能を決定するための効率的な方策である
（ベンソン（Benson）ら、１９９５）。例えばトウモロコシでは、４８，０００
個のランダムに突然変異誘発した植物からの大きな植物集団をスクリーニングす
ることにより、目的の遺伝子の突然変異を同定することができる。原理的に、こ
の突然変異体集団の各植物は、輸送可能成分の挿入により引き起こされる異なる
突然変異を有する。目的の遺伝子中に輸送可能成分の挿入を有する植物は、ポリ
メラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）解析により同定される。トランスポゾンに対応
するヌクレオチド配列を有する第１のプライマー、および目的の遺伝子に対応す
るヌクレオチド配列を有する第２のプライマーは、推定突然変異体から単離した
ＤＮＡとともにＰＣＲ反応で使用される。原理的に、ＰＣＲ産物は、目的の遺伝
子中にトランスポゾンが挿入されている場合のみ産生される。ＰＣＲ反応でそこ
からＰＣＲ産物が産生されるＤＮＡからなる突然変異植物は、植物の栽培と成長
に及ぼす突然変異の作用を調べるために解析され、こうして目的の遺伝子の機能
が確認される。
（ベンソン（Benson）ら、１９９５）。例えばトウモロコシでは、４８，０００
個のランダムに突然変異誘発した植物からの大きな植物集団をスクリーニングす
ることにより、目的の遺伝子の突然変異を同定することができる。原理的に、こ
の突然変異体集団の各植物は、輸送可能成分の挿入により引き起こされる異なる
突然変異を有する。目的の遺伝子中に輸送可能成分の挿入を有する植物は、ポリ
メラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）解析により同定される。トランスポゾンに対応
するヌクレオチド配列を有する第１のプライマー、および目的の遺伝子に対応す
るヌクレオチド配列を有する第２のプライマーは、推定突然変異体から単離した
ＤＮＡとともにＰＣＲ反応で使用される。原理的に、ＰＣＲ産物は、目的の遺伝
子中にトランスポゾンが挿入されている場合のみ産生される。ＰＣＲ反応でそこ
からＰＣＲ産物が産生されるＤＮＡからなる突然変異植物は、植物の栽培と成長
に及ぼす突然変異の作用を調べるために解析され、こうして目的の遺伝子の機能
が確認される。
【０００９】 しかし、多くの作物種で逆向き遺伝学を使用することは、目的の突然変異体を
検出するために成熟するまで栽培させる必要がある数万のＴ−ＤＮＡまたはトラ
ンスポゾン標識植物を産生し収容することは、多大の時間と努力が必要であり、
広大な野外施設が必要なため、非現実的である。従って多くの作物種で逆向き遺
伝学を現実的にするために別の方策が必要である。同様に、プロモーターまたは
エンハンサーのような遺伝子発現を制御するＤＮＡ成分を検出することができる
ＤＮＡ作製体で形質転換される作物植物の大集団をスクリーニングするために、
現実的な方法が必要である。
検出するために成熟するまで栽培させる必要がある数万のＴ−ＤＮＡまたはトラ
ンスポゾン標識植物を産生し収容することは、多大の時間と努力が必要であり、
広大な野外施設が必要なため、非現実的である。従って多くの作物種で逆向き遺
伝学を現実的にするために別の方策が必要である。同様に、プロモーターまたは
エンハンサーのような遺伝子発現を制御するＤＮＡ成分を検出することができる
ＤＮＡ作製体で形質転換される作物植物の大集団をスクリーニングするために、
現実的な方法が必要である。
【００１０】 （発明の要約） 本発明の目的は、ミニ作物植物を使用して突然変異体の同定と性状解析をする
ための改良法を提供することである。
ための改良法を提供することである。
【００１１】 本発明の別の目的は、クローン化されたヌクレオチド配列の性状解析のための
改良法を提供することである。
改良法を提供することである。
【００１２】 本発明のさらに別の目的は、ヌクレオチド配列のクローニングのための改良法
を提供することである。
を提供することである。
【００１３】 これらの目的および他の目的は、所望の形質を有する突然変異ミニ植物の選択
方法であって、 （ａ）ミニ植物は、（ｉ）同じ種の市販の植物に比較してサイズが小さいこと
；（ii）成熟して、同じ種の市販の植物に使用される標準的栽培条件より少なく
とも１０倍高い植物密度で、生きた種子または塊茎を産生すること；および（ii
i）同じ種の市販の植物と交配させることができること、という特徴を有する、 ミニ植物集団を提供する工程； （ｂ）ミニ植物を突然変異誘導物質で処理して突然変異ミニ植物集団を産生す
ることにより、ミニ植物集団中で突然変異ミニ植物を作成する工程；および （ｃ）突然変異ミニ植物集団内で所望の形質を有する突然変異ミニ植物を選択
する工程、 を含んでなる方法を提供することにより達成される。
方法であって、 （ａ）ミニ植物は、（ｉ）同じ種の市販の植物に比較してサイズが小さいこと
；（ii）成熟して、同じ種の市販の植物に使用される標準的栽培条件より少なく
とも１０倍高い植物密度で、生きた種子または塊茎を産生すること；および（ii
i）同じ種の市販の植物と交配させることができること、という特徴を有する、 ミニ植物集団を提供する工程； （ｂ）ミニ植物を突然変異誘導物質で処理して突然変異ミニ植物集団を産生す
ることにより、ミニ植物集団中で突然変異ミニ植物を作成する工程；および （ｃ）突然変異ミニ植物集団内で所望の形質を有する突然変異ミニ植物を選択
する工程、 を含んでなる方法を提供することにより達成される。
【００１４】 本明細書に記載の本発明のすべての面および実施態様において、ミニ植物の集
団は、自然の突然変異または誘導した突然変異（遺伝子操作または植物成長因子
で処理することにより誘導）により作成される、本発明に従って使用されるミニ
植物の例は、特に限定されないが、「マイクロトム（Micro-Tom）」および「マ イクロピーチ（Micro-Peach）」のようなミニトマト栽培品種がある。上記工程 （ｂ）で使用される突然変異誘導物質は、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、
メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）、お
よびブレオマイシン類のような化学突然変異誘発物質でもよい。あるいは突然変
異誘導物質は、ＵＶ、γ線、Ｘ線、および高速ニュートロンのような放射線でも
よい。最後に突然変異誘導物質は、Ｔ−ＤＮＡまたは輸送可能成分（自律性トラ
ンスポゾン、非自律性トランスポゾン、およびトウモロコシＡｃ／Ｄｓ輸送可能
成分のような自律性／非自律性トランスポゾン系よりなる群から選択される）で
ある可動性ＤＮＡ配列でもよい。同じ種の市販の植物は、食物、繊維または花を
産生するのに使用される植物、液果タイプの果実（トマト、ブドウ、プルーン、
ナス、カンキツ類果実、およびリンゴ）を産生する植物、またはナス科（Solana
ceae）の植物（例えば、ジャガイモ）がある。
団は、自然の突然変異または誘導した突然変異（遺伝子操作または植物成長因子
で処理することにより誘導）により作成される、本発明に従って使用されるミニ
植物の例は、特に限定されないが、「マイクロトム（Micro-Tom）」および「マ イクロピーチ（Micro-Peach）」のようなミニトマト栽培品種がある。上記工程 （ｂ）で使用される突然変異誘導物質は、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、
メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）、お
よびブレオマイシン類のような化学突然変異誘発物質でもよい。あるいは突然変
異誘導物質は、ＵＶ、γ線、Ｘ線、および高速ニュートロンのような放射線でも
よい。最後に突然変異誘導物質は、Ｔ−ＤＮＡまたは輸送可能成分（自律性トラ
ンスポゾン、非自律性トランスポゾン、およびトウモロコシＡｃ／Ｄｓ輸送可能
成分のような自律性／非自律性トランスポゾン系よりなる群から選択される）で
ある可動性ＤＮＡ配列でもよい。同じ種の市販の植物は、食物、繊維または花を
産生するのに使用される植物、液果タイプの果実（トマト、ブドウ、プルーン、
ナス、カンキツ類果実、およびリンゴ）を産生する植物、またはナス科（Solana
ceae）の植物（例えば、ジャガイモ）がある。
【００１５】 別の実施態様において本発明は、突然変異ミニ集団を提供し、ここで集団のミ
ニ植物は、以下の特徴を有する：（ｉ）同じ種の市販の植物に比較してサイズが
小さいこと；（ii）成熟して、同じ種の市販の植物に使用される標準的栽培条件
より少なくとも１０倍高い密度で、生きた種子または塊茎を産生すること；（ii
i）同じ種の市販の植物と交配させることができること；および（iv）化学突然 変異誘発物質、放射線、および可動性ＤＮＡ配列よりなる群から選択される物質
により誘導される突然変異を有すること。
ニ植物は、以下の特徴を有する：（ｉ）同じ種の市販の植物に比較してサイズが
小さいこと；（ii）成熟して、同じ種の市販の植物に使用される標準的栽培条件
より少なくとも１０倍高い密度で、生きた種子または塊茎を産生すること；（ii
i）同じ種の市販の植物と交配させることができること；および（iv）化学突然 変異誘発物質、放射線、および可動性ＤＮＡ配列よりなる群から選択される物質
により誘導される突然変異を有すること。
【００１６】 本発明のさらに別の実施態様は、目的の遺伝子中に挿入された可動性ＤＮＡ配
列を含有するミニ植物の同定方法であって、 （ａ）ミニ植物は、（ｉ）同じ種の市販の植物に比較してサイズが小さいこと
；（ii）成熟して、同じ種の市販の植物に使用される標準的栽培条件より少なく
とも１０倍高い植物密度で、生きた種子または塊茎を産生すること；および（ii
i）同じ種の市販の植物と交配させることができること、という特徴を有する、 ミニ植物集団を提供する工程； （ｂ）該植物を可動性ＤＮＡ配列で処理して、ミニ植物集団中で突然変異植物
を作成する工程； （ｃ）可動性ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列に対応する第１のプライマーと、
目的の遺伝子のヌクレオチド配列に対応する第２のプライマーとを使用して、Ｐ
ＣＲにより、該突然変異植物から抽出されるＤＮＡをスクリーニングする工程；
および （ｄ）第１のプライマーと第２のプライマーの存在下でＰＣＲ産物を産生する
ＤＮＡからなるミニ植物を同定する工程、 を含んでなる方法を提供する。
列を含有するミニ植物の同定方法であって、 （ａ）ミニ植物は、（ｉ）同じ種の市販の植物に比較してサイズが小さいこと
；（ii）成熟して、同じ種の市販の植物に使用される標準的栽培条件より少なく
とも１０倍高い植物密度で、生きた種子または塊茎を産生すること；および（ii
i）同じ種の市販の植物と交配させることができること、という特徴を有する、 ミニ植物集団を提供する工程； （ｂ）該植物を可動性ＤＮＡ配列で処理して、ミニ植物集団中で突然変異植物
を作成する工程； （ｃ）可動性ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列に対応する第１のプライマーと、
目的の遺伝子のヌクレオチド配列に対応する第２のプライマーとを使用して、Ｐ
ＣＲにより、該突然変異植物から抽出されるＤＮＡをスクリーニングする工程；
および （ｄ）第１のプライマーと第２のプライマーの存在下でＰＣＲ産物を産生する
ＤＮＡからなるミニ植物を同定する工程、 を含んでなる方法を提供する。
【００１７】 本発明のさらに別の実施態様は、ミニ植物の突然変異体集団の産生方法であっ
て、 （ａ）ミニ植物は、（ｉ）同じ種の市販の植物に比較してサイズが小さいこと
；（ii）成熟して、同じ種の市販の植物に使用される標準的栽培条件より少なく
とも１０倍高い植物密度で、生きた種子または塊茎を産生すること；および（ii
i）同じ種の市販の植物と交配させることができること、という特徴を有する、 ミニ植物集団を提供する工程；および （ｂ）該植物を突然変異誘導物質で処理して突然変異作物栽培品種の突然変異
体集団を産生することにより、ミニ植物集団中で突然変異植物を作成する工程 を含んでなる方法を提供する。
て、 （ａ）ミニ植物は、（ｉ）同じ種の市販の植物に比較してサイズが小さいこと
；（ii）成熟して、同じ種の市販の植物に使用される標準的栽培条件より少なく
とも１０倍高い植物密度で、生きた種子または塊茎を産生すること；および（ii
i）同じ種の市販の植物と交配させることができること、という特徴を有する、 ミニ植物集団を提供する工程；および （ｂ）該植物を突然変異誘導物質で処理して突然変異作物栽培品種の突然変異
体集団を産生することにより、ミニ植物集団中で突然変異植物を作成する工程 を含んでなる方法を提供する。
【００１８】 工程（ｂ）の突然変異誘導物質がＴ−ＤＮＡである時、ミニ植物はアグロバク
テリウム（Agrobacterium）で感染され、こうして各形質転換体が異なるゲノム 位置にＴ−ＤＮＡ挿入体を含有する複数の形質転換体が産生される、工程（ｂ）
の突然変異誘導物質がトランスポゾンである時、突然変異ミニ植物集団は、活性
転位系を含有するミニ植物の子孫から得られる、この活性転位系は、植物本来の
トランスポゾン、または当業者に公知の遺伝子操作技術により植物中に導入され
るトランスポゾン（例えば、自律性トランスポゾン、または非自律性トランスポ
ゾンを含有する植物をトランスポザーゼ源または自律性トランスポゾンを含有す
る植物と交配して得られる輸送可能成分）でもよい。輸送可能成分は、例えばト
ウモロコシＡｃ／Ｄｓトランスポゾン系である。
テリウム（Agrobacterium）で感染され、こうして各形質転換体が異なるゲノム 位置にＴ−ＤＮＡ挿入体を含有する複数の形質転換体が産生される、工程（ｂ）
の突然変異誘導物質がトランスポゾンである時、突然変異ミニ植物集団は、活性
転位系を含有するミニ植物の子孫から得られる、この活性転位系は、植物本来の
トランスポゾン、または当業者に公知の遺伝子操作技術により植物中に導入され
るトランスポゾン（例えば、自律性トランスポゾン、または非自律性トランスポ
ゾンを含有する植物をトランスポザーゼ源または自律性トランスポゾンを含有す
る植物と交配して得られる輸送可能成分）でもよい。輸送可能成分は、例えばト
ウモロコシＡｃ／Ｄｓトランスポゾン系である。
【００１９】 本発明のさらに別の実施態様は、植物遺伝子発現を制御するヌクレオチド配列
の同定方法であって、 （ａ）作物植物のミニ植物をＤＮＡ作製体で形質転換して、ランダムに突然変
異誘発した植物の集団を産生する工程（ここでＤＮＡ作製体は、プロモーターが
欠如しているかまたは最小のプロモーターを含有するスクリーニング可能なマー
カーをコードする遺伝子配列を含み、ミニ植物は、（ｉ）同じ種の市販の植物に
比較してサイズが小さいこと；（ii）成熟して、同じ種の市販の植物に使用され
る標準的栽培条件より少なくとも１０倍高い植物密度で、生きた種子または塊茎
を産生すること；および（iii）同じ種の市販の植物と交配させて、ランダムに 突然変異誘発した植物を産生することができること、という特徴を有する）； （ｂ）ＤＮＡ作製体で形質転換され、スクリーニング可能なマーカーを発現す
る植物集団内でミニ植物を同定する工程；および （ｃ）工程（ｂ）で同定される形質転換したミニ植物から単離される総ＤＮＡ
からのスクリーニング可能なマーカーをコードする遺伝子に機能的に結合したヌ
クレオチド配列をクローン化する工程、 を含んでなる方法を提供する。
の同定方法であって、 （ａ）作物植物のミニ植物をＤＮＡ作製体で形質転換して、ランダムに突然変
異誘発した植物の集団を産生する工程（ここでＤＮＡ作製体は、プロモーターが
欠如しているかまたは最小のプロモーターを含有するスクリーニング可能なマー
カーをコードする遺伝子配列を含み、ミニ植物は、（ｉ）同じ種の市販の植物に
比較してサイズが小さいこと；（ii）成熟して、同じ種の市販の植物に使用され
る標準的栽培条件より少なくとも１０倍高い植物密度で、生きた種子または塊茎
を産生すること；および（iii）同じ種の市販の植物と交配させて、ランダムに 突然変異誘発した植物を産生することができること、という特徴を有する）； （ｂ）ＤＮＡ作製体で形質転換され、スクリーニング可能なマーカーを発現す
る植物集団内でミニ植物を同定する工程；および （ｃ）工程（ｂ）で同定される形質転換したミニ植物から単離される総ＤＮＡ
からのスクリーニング可能なマーカーをコードする遺伝子に機能的に結合したヌ
クレオチド配列をクローン化する工程、 を含んでなる方法を提供する。
【００２０】 スクリーニング可能なマーカーはＧＵＳまたはルシフェラーゼでもよく、可動
性ＤＮＡ配列はＴ−ＤＮＡまたは輸送可能成分でもよく、そして植物遺伝子発現
を含有するヌクレオチド配列は、プロモーターまたはエンハンサーでもよい。
性ＤＮＡ配列はＴ−ＤＮＡまたは輸送可能成分でもよく、そして植物遺伝子発現
を含有するヌクレオチド配列は、プロモーターまたはエンハンサーでもよい。
【００２１】 さらに別の実施態様において本発明は、所望の形質を有する市販の植物の突然
変異体集団を産生する方法であって、 （ａ）本発明の選択方法に従って選択される所望の形質を有する突然変異ミニ
植物を、同じ種の市販の植物と交配させる工程、および （ｂ）市販の親植物に似ており所望の形質を発現する子孫を選択する工程 を含んでなる方法を提供する。
変異体集団を産生する方法であって、 （ａ）本発明の選択方法に従って選択される所望の形質を有する突然変異ミニ
植物を、同じ種の市販の植物と交配させる工程、および （ｂ）市販の親植物に似ており所望の形質を発現する子孫を選択する工程 を含んでなる方法を提供する。
【００２２】 この実施態様に従って、本発明はまた、上記方法により得られる市販の植物の
突然変異体集団を包含する。
突然変異体集団を包含する。
【００２３】 （発明の詳細な説明） 本発明は、突然変異誘発した植物の大規模産生と効率的なスクリーニングを可
能にする。これは、同じ種の市販の栽培品種と交配することができるミニ作物植
物を利用して行われる。ミニ植物で突然変異が誘導され、次に突然変異は突然変
異ミニ植物集団中で同定され、これは効率的に高密度まで成熟させることができ
る。
能にする。これは、同じ種の市販の栽培品種と交配することができるミニ作物植
物を利用して行われる。ミニ植物で突然変異が誘導され、次に突然変異は突然変
異ミニ植物集団中で同定され、これは効率的に高密度まで成熟させることができ
る。
【００２４】 多くの作物種（例えば、トマト）について逆向き遺伝学を試みることの大きな
障害は、大規模な突然変異植物を産生し扱うには多大の時間、努力、およびスペ
ースが必要なことである。本発明は、例えば現状の産生法では現実的ではないよ
うなトランスポゾン突然変異誘発植物の迅速、大規模かつ効率的なスクリーニン
グを可能にする。農業的目的の多くの農作物種（例えば、トマト）の逆向き遺伝
学のために、代表的な植物集団を産生するのに、１００，０００もの異なるトラ
ンスポゾン突然変異誘発植物が必要であると推定される。作物植物中でのそのよ
うな突然変異体のライブラリーの産生は、本発明を用いてミニ植物を使用するこ
とにより行われる。本発明は、管理可能な植え付け領域内で成長した大きな植物
集団中で、目的の標的遺伝子中に挿入されたトランスポゾンを有する株を同定す
ることにより、ほとんどすべての所望の遺伝子の不活性化を可能にする。標的遺
伝子中のトランスポゾン挿入の同定は、標的遺伝子に対応するヌクレオチド配列
を有する１つのプライマーとトランスポゾンに対応するヌクレオチド配列を有す
る第２のプライマーを使用して、ＰＣＲによりトランスポゾン含有植物のプール
をスクリーニングすることにより行われる。ＰＣＲ産物は、目的の遺伝子内にト
ランスポゾンが挿入された植物突然変異体から単離されたＤＮＡ基質からのに産
生される。
障害は、大規模な突然変異植物を産生し扱うには多大の時間、努力、およびスペ
ースが必要なことである。本発明は、例えば現状の産生法では現実的ではないよ
うなトランスポゾン突然変異誘発植物の迅速、大規模かつ効率的なスクリーニン
グを可能にする。農業的目的の多くの農作物種（例えば、トマト）の逆向き遺伝
学のために、代表的な植物集団を産生するのに、１００，０００もの異なるトラ
ンスポゾン突然変異誘発植物が必要であると推定される。作物植物中でのそのよ
うな突然変異体のライブラリーの産生は、本発明を用いてミニ植物を使用するこ
とにより行われる。本発明は、管理可能な植え付け領域内で成長した大きな植物
集団中で、目的の標的遺伝子中に挿入されたトランスポゾンを有する株を同定す
ることにより、ほとんどすべての所望の遺伝子の不活性化を可能にする。標的遺
伝子中のトランスポゾン挿入の同定は、標的遺伝子に対応するヌクレオチド配列
を有する１つのプライマーとトランスポゾンに対応するヌクレオチド配列を有す
る第２のプライマーを使用して、ＰＣＲによりトランスポゾン含有植物のプール
をスクリーニングすることにより行われる。ＰＣＲ産物は、目的の遺伝子内にト
ランスポゾンが挿入された植物突然変異体から単離されたＤＮＡ基質からのに産
生される。
【００２５】 本発明の方法は、食物、繊維または花を産生するために使用される植物を含む
農業的興味のある任意の植物に適している。これらの農作物植物は、特に限定さ
れないが、トマト、ブドウ、カンキツ類果実、プルーン、リンゴ、ナスから選択
される液果タイプの果実；ナス科（Solanaceae）の植物（例えば、ポテト）およ
びトウモロコシなら花および果実木種を含む。
農業的興味のある任意の植物に適している。これらの農作物植物は、特に限定さ
れないが、トマト、ブドウ、カンキツ類果実、プルーン、リンゴ、ナスから選択
される液果タイプの果実；ナス科（Solanaceae）の植物（例えば、ポテト）およ
びトウモロコシなら花および果実木種を含む。
【００２６】 本発明の方法はまた、古典的な品種改良プログラムにおいて商業的価値のある
遺伝子の同定、新しい遺伝子の単離、新しい遺伝子の導入、および組織特異的プ
ロモーターとエンハンサーの単離を促進するであろう。商業的価値のある遺伝子
には、果実の熟成に影響を与える遺伝子、および植物の収率および／または量を
改良する遺伝子がある。単離の標的となる可能性のある新しい遺伝子には、果実
中の糖含量、ミネラル取り込みなどに関連する遺伝子がある。組織特異的プロモ
ーターは、トランスポゾン内で作成される「遺伝子捕捉」法を使用して単離して
もよい。
遺伝子の同定、新しい遺伝子の単離、新しい遺伝子の導入、および組織特異的プ
ロモーターとエンハンサーの単離を促進するであろう。商業的価値のある遺伝子
には、果実の熟成に影響を与える遺伝子、および植物の収率および／または量を
改良する遺伝子がある。単離の標的となる可能性のある新しい遺伝子には、果実
中の糖含量、ミネラル取り込みなどに関連する遺伝子がある。組織特異的プロモ
ーターは、トランスポゾン内で作成される「遺伝子捕捉」法を使用して単離して
もよい。
【００２７】 植物ゲノムへの輸送可能成分のような可動性ＤＮＡ配列の挿入と、標的遺伝子
中に挿入されたトランスポゾンを有する植物の同定とにより、ミニ植物中のラン
ダム突然変異誘発により、ほとんどすべての所望の遺伝子が不活性化される。目
的の挿入突然変異体の同定は、標的遺伝子に対応するヌクレオチド配列を有する
１つのプライマーとトランスポゾンに対応する第２のプライマーを使用して、Ｐ
ＣＲによりトランスポゾン含有植物のプールをスクリーニングすることにより行
われる。ミニ作物植物集団はまた、植物プロモーターの効率的なスクリーニング
と同定に使用される。
中に挿入されたトランスポゾンを有する植物の同定とにより、ミニ植物中のラン
ダム突然変異誘発により、ほとんどすべての所望の遺伝子が不活性化される。目
的の挿入突然変異体の同定は、標的遺伝子に対応するヌクレオチド配列を有する
１つのプライマーとトランスポゾンに対応する第２のプライマーを使用して、Ｐ
ＣＲによりトランスポゾン含有植物のプールをスクリーニングすることにより行
われる。ミニ作物植物集団はまた、植物プロモーターの効率的なスクリーニング
と同定に使用される。
【００２８】 本明細書で使用される用語を以下のように定義する。 ミニ植物、栽培品種または作物は、対応する植物、栽培品種または植物の野生
型作物に比較して著しく小さい全体的サイズまたはバイオマスを有する。ミニ植
物、栽培品種または作物は、成熟するまで栽培させて、対応する野生型植物では
非現実的な植物密度で生存活性のある生殖器官（例えば、果実、種子、塊茎など
）を産生することができる。例えば、ミニ植物、栽培品種、または作物を、同じ
種の市販の植物で使用される標準的栽培条件より、少なくとも１倍、好ましくは
５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、
またはそれ以上の植物密度に、成熟するまで栽培させることができる。野生型植
物を高密度で栽培させることは可能性のあるが、実生または若い植物段階までで
あり、果実、種子または塊茎は産生されない。これに対して本発明のミニ作物は
、成熟した果実、種子、塊茎などが成長するまで高植物密度で栽培し成熟させる
ことができる。
型作物に比較して著しく小さい全体的サイズまたはバイオマスを有する。ミニ植
物、栽培品種または作物は、成熟するまで栽培させて、対応する野生型植物では
非現実的な植物密度で生存活性のある生殖器官（例えば、果実、種子、塊茎など
）を産生することができる。例えば、ミニ植物、栽培品種、または作物を、同じ
種の市販の植物で使用される標準的栽培条件より、少なくとも１倍、好ましくは
５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、
またはそれ以上の植物密度に、成熟するまで栽培させることができる。野生型植
物を高密度で栽培させることは可能性のあるが、実生または若い植物段階までで
あり、果実、種子または塊茎は産生されない。これに対して本発明のミニ作物は
、成熟した果実、種子、塊茎などが成長するまで高植物密度で栽培し成熟させる
ことができる。
【００２９】 トランスポゾン − ゲノム内の異なる位置に移動または「ジャンプ」するこ
とができる天然のＤＮＡ配列。遺伝子中に導入され、その結果遺伝子を破壊する
ことにより、トランスポゾンは遺伝子の突然変異を引き起こす。トランスポゾン
は、細菌、キイロショウジョウバエ（Drosophila）、酵母、線虫、植物、および
哺乳動物で見つかっている。
とができる天然のＤＮＡ配列。遺伝子中に導入され、その結果遺伝子を破壊する
ことにより、トランスポゾンは遺伝子の突然変異を引き起こす。トランスポゾン
は、細菌、キイロショウジョウバエ（Drosophila）、酵母、線虫、植物、および
哺乳動物で見つかっている。
【００３０】 輸送可能成分 − トランスポゾンに対応する。
【００３１】 トランスポザーゼ − トランスポゾンの末端領域、およびトランスポゾンの
切除とゲノム内の他の位置への転位に介在する、自律性トランスポゾンにより発
現されるタンパク質。
切除とゲノム内の他の位置への転位に介在する、自律性トランスポゾンにより発
現されるタンパク質。
【００３２】 自律性トランスポゾン − トランスポザーゼをコードし、その触媒活性につ
いてトランスポザーゼに認識される末端領域を有し、従って自律性に転位する成
分。自律性トランスポゾンにより引き起こされる突然変異は不安定である。自律
性トランスポゾンの例は、トウモロコシのＡｃ（アクチベーター）トランスポゾ
ンである。
いてトランスポザーゼに認識される末端領域を有し、従って自律性に転位する成
分。自律性トランスポゾンにより引き起こされる突然変異は不安定である。自律
性トランスポゾンの例は、トウモロコシのＡｃ（アクチベーター）トランスポゾ
ンである。
【００３３】 非自律性トランスポゾン − トランスポザーゼに認識される末端領域を有す
るがそれをコードしない成分、従って切除とゲノム内の転位のためにはトランス
ポザーゼがｔｒａｎｓで供給されることが必要である。非自律性トランスポゾン
の例は、トウモロコシのＤｓ（解離）トランスポゾンであり、これは自律性（例
えば、Ａｃ）トランスポゾンとともに使用することができる。
るがそれをコードしない成分、従って切除とゲノム内の転位のためにはトランス
ポザーゼがｔｒａｎｓで供給されることが必要である。非自律性トランスポゾン
の例は、トウモロコシのＤｓ（解離）トランスポゾンであり、これは自律性（例
えば、Ａｃ）トランスポゾンとともに使用することができる。
【００３４】 作物のミニ栽培品種は、自然の突然変異体または誘導された突然変異体（目的
の作物植物の遺伝子操作もしくは植物成長因子を用いる処理により誘導される）
から成長させることができる。矮小突然変異体は植物界では普遍的に存在し、多
くの種で見いだされている。
の作物植物の遺伝子操作もしくは植物成長因子を用いる処理により誘導される）
から成長させることができる。矮小突然変異体は植物界では普遍的に存在し、多
くの種で見いだされている。
【００３５】 最も顕著な矮小遺伝子集団の１つは、コムギのｒｈｔ（背が低い）遺伝子であ
る（ゲール（Gale）とヨウセフィアン（Youssefian）、１９８５）。これらの遺
伝子は、ほとんどが緑の革命に関与している。矮小栽培品種のより短い茎に、１
つの植物当たり「負荷」をかけて高収率（より重い穂）にし、植物を背の高い栽
培品種で可能な高さより高密度にし、世界的なコムギの収率を上げることができ
る。野生型コムギの高さは、約１２０〜１４０cmであり、これは１つの矮小化遺
伝子が存在すると９０〜１００cm、２つの矮小化遺伝子が存在すると４０〜６０
cmになる。今日、標準的コムギ栽培品種は、１つまたは２つの矮小化遺伝子を有
する。これらの植物において、背が低いことは他の植物器官（例えば、葉または
穂）の小型化に関連せず、従って大規模な突然変異誘発には有用ではない。しか
し極端に矮小なコムギ植物は、この種の大規模突然変異誘発を促進するのに使用
することができた。
る（ゲール（Gale）とヨウセフィアン（Youssefian）、１９８５）。これらの遺
伝子は、ほとんどが緑の革命に関与している。矮小栽培品種のより短い茎に、１
つの植物当たり「負荷」をかけて高収率（より重い穂）にし、植物を背の高い栽
培品種で可能な高さより高密度にし、世界的なコムギの収率を上げることができ
る。野生型コムギの高さは、約１２０〜１４０cmであり、これは１つの矮小化遺
伝子が存在すると９０〜１００cm、２つの矮小化遺伝子が存在すると４０〜６０
cmになる。今日、標準的コムギ栽培品種は、１つまたは２つの矮小化遺伝子を有
する。これらの植物において、背が低いことは他の植物器官（例えば、葉または
穂）の小型化に関連せず、従って大規模な突然変異誘発には有用ではない。しか
し極端に矮小なコムギ植物は、この種の大規模突然変異誘発を促進するのに使用
することができた。
【００３６】 同様に、矮小化遺伝子が他の穀物（例えば、トウモロコシやイネ）；エンドウ
のようなマメ科植物；コショウ、ナスおよびトマトのような野菜；バラのような
装飾植物；およびオレンジのような木や他のカンキツ類で見つかっている。これ
らの遺伝子の作用様式は異なる。矮小植物、関与する遺伝子、およびその作用様
式のいくつかの例が、最近の総説で報告されている（ヘデン（Hedden）とカミヤ
（Kamiya）、１９９７）。例えば、ある矮小植物は、植物ホルモンの１つ（例え
ば、ジベレリン）の合成に欠陥があり、別の矮小植物はジベレリンを合成するが
これに非感受性である（例えば、ＧＡＩ＝ジベレリン非感受性突然変異体）。し
かし、多くの矮小植物では、作用様式は不明である。そのような矮小植物、また
は操作して植物のサイズを大幅に低下させることができるクローン化遺伝子は、
本発明で任意の作物で特許請求した、以後の大規模突然変異誘発に利用すること
ができる。
のようなマメ科植物；コショウ、ナスおよびトマトのような野菜；バラのような
装飾植物；およびオレンジのような木や他のカンキツ類で見つかっている。これ
らの遺伝子の作用様式は異なる。矮小植物、関与する遺伝子、およびその作用様
式のいくつかの例が、最近の総説で報告されている（ヘデン（Hedden）とカミヤ
（Kamiya）、１９９７）。例えば、ある矮小植物は、植物ホルモンの１つ（例え
ば、ジベレリン）の合成に欠陥があり、別の矮小植物はジベレリンを合成するが
これに非感受性である（例えば、ＧＡＩ＝ジベレリン非感受性突然変異体）。し
かし、多くの矮小植物では、作用様式は不明である。そのような矮小植物、また
は操作して植物のサイズを大幅に低下させることができるクローン化遺伝子は、
本発明で任意の作物で特許請求した、以後の大規模突然変異誘発に利用すること
ができる。
【００３７】 多くの作物で、矮小植物を単離し性状解析するための一般的方法が利用できる
。植物は、全体のサイズに影響を与える単離した遺伝子で形質転換することがで
きる。例えばアラビドプシス（Arabidopsis）から単離されるアペタラ（apetala
）遺伝子を使用して、形質転換したポプラ植物のサイズを変更した。ミニ作物は
、伝統的な品種改良法を使用して作製することができる。栽培品種「マイクロト
ム（Micro-Tom）」の場合は、ｍｉｎａｔｕｒｅとｄｗａｒｆと呼ぶ２つの主要 な遺伝子が、ミニ表現型に関与する。
。植物は、全体のサイズに影響を与える単離した遺伝子で形質転換することがで
きる。例えばアラビドプシス（Arabidopsis）から単離されるアペタラ（apetala
）遺伝子を使用して、形質転換したポプラ植物のサイズを変更した。ミニ作物は
、伝統的な品種改良法を使用して作製することができる。栽培品種「マイクロト
ム（Micro-Tom）」の場合は、ｍｉｎａｔｕｒｅとｄｗａｒｆと呼ぶ２つの主要 な遺伝子が、ミニ表現型に関与する。
【００３８】 ミニ植物のサイズは著しく小さいため、矮小またはミニ栽培品種の植物は、標
準的農場条件下より少なくとも１０倍高い密度で栽培される。これは、狭い領域
での大きな植物集団の解析を促進する。以後の例に記載のようにトマトのミニ栽
培品種である「マイクロトム（Micro-Tom）」の場合は、植物は、標準的農場条 件下の市販の培養物で得られる密度より約２００倍高い密度で栽培される。ミニ
栽培品種で得られた挿入突然変異体を含む新しい突然変異体は、ミニ化遺伝子ま
たはトランス遺伝子を分離することにより、作物との標準的交配により、商業的
バックグランドに移すことができる。
準的農場条件下より少なくとも１０倍高い密度で栽培される。これは、狭い領域
での大きな植物集団の解析を促進する。以後の例に記載のようにトマトのミニ栽
培品種である「マイクロトム（Micro-Tom）」の場合は、植物は、標準的農場条 件下の市販の培養物で得られる密度より約２００倍高い密度で栽培される。ミニ
栽培品種で得られた挿入突然変異体を含む新しい突然変異体は、ミニ化遺伝子ま
たはトランス遺伝子を分離することにより、作物との標準的交配により、商業的
バックグランドに移すことができる。
【００３９】 本発明の方法に従ってミニ栽培品種を得るのに任意の突然変異誘発法が使用で
き、特に限定されないが、当業者に公知の方法を使用する、化学的処理、放射線
照射、または宿主植物からもしくは異種起源からのＴ−ＤＮＡもしくはトランス
ポゾンのＤＮＡ挿入がある。矮小化を引き起こす挿入不活性化は、大きな植物集
団をスクリーニングすることにより達成される。ミニ栽培品種の突然変異体の産
生のための化学的処理は、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メタンスルホン
酸メチル（ＭＭＳ）、メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）、およびブレオマイ
シン類などの突然変異誘発物質を使用して公知の方法により行うことができる。
また、ＵＶ光、Ｘ線および高速ニュートロンを照射する公知の方法によっっても
突然変異を行うことができる（例えば、ペールマン（Poehlman）、１９８７また
はマルムベリ（Malmbery）、１９９３を参照）。
き、特に限定されないが、当業者に公知の方法を使用する、化学的処理、放射線
照射、または宿主植物からもしくは異種起源からのＴ−ＤＮＡもしくはトランス
ポゾンのＤＮＡ挿入がある。矮小化を引き起こす挿入不活性化は、大きな植物集
団をスクリーニングすることにより達成される。ミニ栽培品種の突然変異体の産
生のための化学的処理は、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メタンスルホン
酸メチル（ＭＭＳ）、メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）、およびブレオマイ
シン類などの突然変異誘発物質を使用して公知の方法により行うことができる。
また、ＵＶ光、Ｘ線および高速ニュートロンを照射する公知の方法によっっても
突然変異を行うことができる（例えば、ペールマン（Poehlman）、１９８７また
はマルムベリ（Malmbery）、１９９３を参照）。
【００４０】 可動性ＤＮＡ配列を有する遺伝子の挿入不活性化を実施してもよい。可動性Ｄ
ＮＡ配列はＴ−ＤＮＡまたはトランスポゾンでもよい。
ＮＡ配列はＴ−ＤＮＡまたはトランスポゾンでもよい。
【００４１】 Ｔ−ＤＮＡ突然変異誘発は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を使用し て公知の方法により実施してもよい（ヘーケマ（Hoekema）ら、１９８３；米国 特許第５，１４９，６４５号）。トランスポゾン挿入突然変異誘発は、公知の方
法により行うことができる（フェドロフ（Fedoroff）ら、１９８４；米国特許第
４，７３２，８５６号および第５，０１３，６５８号）。輸送可能成分は、自律
性トランスポゾン、非自律性トランスポゾン、または自律性／非自律性トランス
ポゾン系（例えば、トウモロコシＡｃ／Ｄｓトランスポゾン系)でもよい。
法により行うことができる（フェドロフ（Fedoroff）ら、１９８４；米国特許第
４，７３２，８５６号および第５，０１３，６５８号）。輸送可能成分は、自律
性トランスポゾン、非自律性トランスポゾン、または自律性／非自律性トランス
ポゾン系（例えば、トウモロコシＡｃ／Ｄｓトランスポゾン系)でもよい。
【００４２】 植物の大きい集団好ましくは少なくとも数千の植物を、突然変異体についてス
クリーニングする。突然変異体の同定は視覚的に行い、例えばミニ選択物を同定
することができる。他のタイプの突然変異体を同定するためにさらなる方策を使
用することができる。例えば特に限定されないが、ホルモン、ミネラル、病原体
、除草剤などの特定の形質について、植物生物学で使用される公知の方法により
測定する。
クリーニングする。突然変異体の同定は視覚的に行い、例えばミニ選択物を同定
することができる。他のタイプの突然変異体を同定するためにさらなる方策を使
用することができる。例えば特に限定されないが、ホルモン、ミネラル、病原体
、除草剤などの特定の形質について、植物生物学で使用される公知の方法により
測定する。
【００４３】 目的の特定の遺伝子での挿入事象の同定は、トランスポゾンまたはＴ−ＤＮＡ
のヌクレオチド配列に対応する第１のプライマーと、目的の遺伝子のヌクレオチ
ド配列に対応する第２のプライマーによるＰＣＲスクリーニングを用いて行うこ
とができる。目的の遺伝子は、部分的にまたは全体が配列決定されている単離さ
れた遺伝子でもよい。あるいは目的の遺伝子は、発現された配列標識（ＥＳＴ）
でもよい。ＰＣＲ法は当該分野で公知である。ＰＣＲの一般的な説明は、デリド
ウ（Delidow）ら、１９９３に記載されている。ＰＣＲ法のための適当なオリゴ ヌクレオチドプライマー配列の設計は、リチリック（Rychlick）ら（１９９３）
に記載されている。ＰＣＲ産物の検出法は、アレン（Allen）ら（１９９３）に 記載されている。
のヌクレオチド配列に対応する第１のプライマーと、目的の遺伝子のヌクレオチ
ド配列に対応する第２のプライマーによるＰＣＲスクリーニングを用いて行うこ
とができる。目的の遺伝子は、部分的にまたは全体が配列決定されている単離さ
れた遺伝子でもよい。あるいは目的の遺伝子は、発現された配列標識（ＥＳＴ）
でもよい。ＰＣＲ法は当該分野で公知である。ＰＣＲの一般的な説明は、デリド
ウ（Delidow）ら、１９９３に記載されている。ＰＣＲ法のための適当なオリゴ ヌクレオチドプライマー配列の設計は、リチリック（Rychlick）ら（１９９３）
に記載されている。ＰＣＲ産物の検出法は、アレン（Allen）ら（１９９３）に 記載されている。
【００４４】 第１のプライマーと第２のプライマーを用いてＰＣＲ産物を産生する、そこか
らＤＮＡが単離された植物が、同定される。この植物を解析して、植物の表現型
上のトランスポゾン挿入の作用を調べることができる。
らＤＮＡが単離された植物が、同定される。この植物を解析して、植物の表現型
上のトランスポゾン挿入の作用を調べることができる。
【００４５】 本発明の方法は、成長または疾患耐性遺伝子を含む目的の遺伝子を同定し性状
解析するのに使用することができる。ＰＣＲ解析用のプライマーの設計のために
、目的の遺伝子の充分なヌクレオチド配列が必要である。特定の遺伝子がいった
ん同定されると、これらは植物品種改良で好適な方法により、適当な商業的バッ
クグランドに移すことができる（例えば、ペールマン・ジェイ・エム（Poehlman
JM）、Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆｉｅｌｄ Ｃｒｏｐｓ、ニューヨーク、１９８７ を参照）。使用される具体的な方策は、作物植物に依存する。
解析するのに使用することができる。ＰＣＲ解析用のプライマーの設計のために
、目的の遺伝子の充分なヌクレオチド配列が必要である。特定の遺伝子がいった
ん同定されると、これらは植物品種改良で好適な方法により、適当な商業的バッ
クグランドに移すことができる（例えば、ペールマン・ジェイ・エム（Poehlman
JM）、Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆｉｅｌｄ Ｃｒｏｐｓ、ニューヨーク、１９８７ を参照）。使用される具体的な方策は、作物植物に依存する。
【００４６】 本発明は、作物植物であるトマトの突然変異体ライブラリーを開発するのに使
用した。このライブラリーは、トマト遺伝学の研究と、重要な遺伝子を単離する
能力を大幅に進展させる。この突然変異トマトライブラリーは、元々家庭ガーデ
ニングを目的として品種改良された「マイクロトム（Micro-Tom）」（マイクロ トマト）と呼ぶミニ−矮小−有限リペルシコン・エスクレツム（Lypersicon esc
ulentum）栽培品種に基づく（スコット（Scott）とハーボー（Harbaugh）、１９
８９）。この栽培品種は、高密度（１平方メートル当たり１３５７個の植物）で
栽培でき、そのような高密度でも実を結ぶため、本発明に特に有用である。さら
にこの栽培品種は生活環が短く、種を播いてから７０〜９０日で成熟した果実を
生成し、これが１年に最高４回のスクリーニングを容易にする。これらの性質の
ため、これは大きな突然変異誘発植物集団のスクリーニングの効率的なシステム
であり、トマトでの飽和突然変異誘発を可能にする。
用した。このライブラリーは、トマト遺伝学の研究と、重要な遺伝子を単離する
能力を大幅に進展させる。この突然変異トマトライブラリーは、元々家庭ガーデ
ニングを目的として品種改良された「マイクロトム（Micro-Tom）」（マイクロ トマト）と呼ぶミニ−矮小−有限リペルシコン・エスクレツム（Lypersicon esc
ulentum）栽培品種に基づく（スコット（Scott）とハーボー（Harbaugh）、１９
８９）。この栽培品種は、高密度（１平方メートル当たり１３５７個の植物）で
栽培でき、そのような高密度でも実を結ぶため、本発明に特に有用である。さら
にこの栽培品種は生活環が短く、種を播いてから７０〜９０日で成熟した果実を
生成し、これが１年に最高４回のスクリーニングを容易にする。これらの性質の
ため、これは大きな突然変異誘発植物集団のスクリーニングの効率的なシステム
であり、トマトでの飽和突然変異誘発を可能にする。
【００４７】 さらにこの栽培品種は、容易かつ効率的に形質転換することができる。子葉の
のアグロバクテリウム（Agrobacterium）介在形質転換により、最大８０％の形 質転換頻度が得られ、子葉の接種からトランスジェニック果実の採取までに約１
００日が必要なだけである。さらにこの栽培品種は、２つの主要な遺伝子が標準
的トマト栽培品種と異なるのみである。「マイクロトム（Micro-Tom）」のサイ ズを制御する２つの遺伝子は劣性であるため、Ｆ１世代の標準的バックグランド
で優性形質を解析することができる。劣性遺伝子を標準的バックグランドに移す
ためには、さらに１世代が必要である。従って突然変異またはトランス遺伝子は
、「マイクロトム（Micro-Tom）」遺伝的バックグランドで研究することが便利 であり、必要な場合は、当業者に公知の伝統的品種改良法を使用して、標準的バ
ックグランドに移すことができる。
のアグロバクテリウム（Agrobacterium）介在形質転換により、最大８０％の形 質転換頻度が得られ、子葉の接種からトランスジェニック果実の採取までに約１
００日が必要なだけである。さらにこの栽培品種は、２つの主要な遺伝子が標準
的トマト栽培品種と異なるのみである。「マイクロトム（Micro-Tom）」のサイ ズを制御する２つの遺伝子は劣性であるため、Ｆ１世代の標準的バックグランド
で優性形質を解析することができる。劣性遺伝子を標準的バックグランドに移す
ためには、さらに１世代が必要である。従って突然変異またはトランス遺伝子は
、「マイクロトム（Micro-Tom）」遺伝的バックグランドで研究することが便利 であり、必要な場合は、当業者に公知の伝統的品種改良法を使用して、標準的バ
ックグランドに移すことができる。
【００４８】 我々はまた、Ａｃ／Ｄｓトランスポゾン標識系を、「マイクロピーチ（Micro-
Peach）」と呼ぶ別のミニトマト栽培品種で使用することができることを確認し た。「マイクロピーチ（Micro-Peach）」は、サイズが「マイクロトム（Micro-T
om）」に似ている。しかし「マイクロピーチ（Micro-Peach）」は、「マイクロ トム（Micro-Tom）」の赤い果実色ではなく、桃の果実色をしている。Ａｃ／Ｄ ｓトランスポゾン系は、「マイクロピーチ（Micro-Peach）」中で非常に活性が 高く、大規模な突然変異誘発と逆向き遺伝学をすることができる。
Peach）」と呼ぶ別のミニトマト栽培品種で使用することができることを確認し た。「マイクロピーチ（Micro-Peach）」は、サイズが「マイクロトム（Micro-T
om）」に似ている。しかし「マイクロピーチ（Micro-Peach）」は、「マイクロ トム（Micro-Tom）」の赤い果実色ではなく、桃の果実色をしている。Ａｃ／Ｄ ｓトランスポゾン系は、「マイクロピーチ（Micro-Peach）」中で非常に活性が 高く、大規模な突然変異誘発と逆向き遺伝学をすることができる。
【００４９】 「マイクロトム（Micro-Tom）」を突然変異誘発と逆向き遺伝学のモデル系と して評価するために、この栽培品種の細微条件と形質転換条件を最適化した。次
に９，０００個のＭ１個体から得られた２０，０００個のＥＭＳ−突然変異誘発
Ｍ２植物のスクリーニングを行なった。葉、花、および果実の色または形が変化
した突然変異体が見つかった。Ａｃ／Ｄｓ輸送可能成分エンハンサー捕捉システ
ム（フェドロフ（Fedoroff）とスミス（Smith）、１９９３）と遺伝子捕捉シス テム（スナダレサン（Sunadaresan）ら、１９９５）を「マイクロトム（Micro-T
om）」に導入し、活性があることを確認した。すなわち「マイクロトム（Micro-
Tom）」栽培品種の利用は、トマトの飽和突然変異誘発の目標、または任意の遺 伝子の標識もしくは挿入不活性化の目標を達成するのに使用することができる。
本発明の方法は、遺伝子の迅速で効率的な性状解析を促進するために、目的の植
物種の任意のミニ選択で使用することができる。
に９，０００個のＭ１個体から得られた２０，０００個のＥＭＳ−突然変異誘発
Ｍ２植物のスクリーニングを行なった。葉、花、および果実の色または形が変化
した突然変異体が見つかった。Ａｃ／Ｄｓ輸送可能成分エンハンサー捕捉システ
ム（フェドロフ（Fedoroff）とスミス（Smith）、１９９３）と遺伝子捕捉シス テム（スナダレサン（Sunadaresan）ら、１９９５）を「マイクロトム（Micro-T
om）」に導入し、活性があることを確認した。すなわち「マイクロトム（Micro-
Tom）」栽培品種の利用は、トマトの飽和突然変異誘発の目標、または任意の遺 伝子の標識もしくは挿入不活性化の目標を達成するのに使用することができる。
本発明の方法は、遺伝子の迅速で効率的な性状解析を促進するために、目的の植
物種の任意のミニ選択で使用することができる。
【００５０】 本発明の利点は、１４，０００の個体からなるＥＭＳ突然変異誘発した「マイ
クロトム（Micro-Tom）」から得られるＭ２植物集団が、１００ｍ2のスペースで
のみ栽培したという観察により強調される。さらに、短い６ヶ月間（Ｍ１は春に
栽培し、Ｍ２は同じ年の夏に栽培した）１人の作業を必要としただけでこの集団
が得られた。使用したＥＭＳ突然変異誘発は比較的穏やかであったが、１％未満
のアルビノ植物が見つかったという事実により証明されるように、多数の突然変
異体が回収された。得られたＭ２集団中にさらなる突然変異遺伝子が存在する可
能性が高く、これは他の研究者により今日まで報告された限定された数百のトマ
ト突然変異体に充分匹敵する。
クロトム（Micro-Tom）」から得られるＭ２植物集団が、１００ｍ2のスペースで
のみ栽培したという観察により強調される。さらに、短い６ヶ月間（Ｍ１は春に
栽培し、Ｍ２は同じ年の夏に栽培した）１人の作業を必要としただけでこの集団
が得られた。使用したＥＭＳ突然変異誘発は比較的穏やかであったが、１％未満
のアルビノ植物が見つかったという事実により証明されるように、多数の突然変
異体が回収された。得られたＭ２集団中にさらなる突然変異遺伝子が存在する可
能性が高く、これは他の研究者により今日まで報告された限定された数百のトマ
ト突然変異体に充分匹敵する。
【００５１】 各Ｍ１植物から得られた突然変異表現型を示したすべてのＭ２ファミリーは、
３：１（優性：劣性）比で分離した。これは、本明細書で使用した実験条件下で
「マイクロトム（Micro-Tom）」で、配偶子が突然変異誘発の時に成熟種子の胚 中に存在する単一の細胞から得られることを示唆する。これらのデータは、以前
の報告（ヒルデリング（ヒlderingp）とベルカーク（Verkerk）、１９６５；ベル カーク（Verkerk）、１９７１）に一致し、１〜３つの細胞が、突然変異したト マト植物中で胞子母細胞を発生することを示唆している。
３：１（優性：劣性）比で分離した。これは、本明細書で使用した実験条件下で
「マイクロトム（Micro-Tom）」で、配偶子が突然変異誘発の時に成熟種子の胚 中に存在する単一の細胞から得られることを示唆する。これらのデータは、以前
の報告（ヒルデリング（ヒlderingp）とベルカーク（Verkerk）、１９６５；ベル カーク（Verkerk）、１９７１）に一致し、１〜３つの細胞が、突然変異したト マト植物中で胞子母細胞を発生することを示唆している。
【００５２】 トランスポゾン標識系はトマトですでに報告されている（キャロル（Carrol）
ら１９９５；クナップ（Knapp）ら、１９９４；ロメンス（Rommens）ら、１９９
２；ヨーダー（Yoder）ら、１９８８）が、この植物についてエンハンサーや遺 伝子捕捉システムの文献は無い。しかし本発明において、非連鎖転位の選択のた
めの２つのシステムがトマトに導入され、１つのシステムはＮＡＭ感受性とカナ
マイシン耐性に基づき（スンダレサン（Sundaresan）ら、１９９５）、第２のシ
ステムは切除−挿入選択（フェドロフ（Fedoroff）とスミス（Smith）、１９９ ３）に基づき、これはＤｓ内に含有されるヒグロマイシン耐性の効率的な検出を
利用する。さらに、「マイクロトム（Micro-Tom）」の他の農学的特徴と一緒に 切除マーカーとしてクロロスルフロンに対する耐性を利用して、多数の推定突然
変異体がエンハンサーやプロモーターのスクリーニングについてスクリーニング
され、遺伝子単離について使用することができる。さらに最近報告されたトマト
の体細胞組織の部位選択挿入（クーレイ（Cooley）ら、１９９６）はまた、安定
な胚細胞転位事象について「マイクロトム（Micro-Tom）」で応用することがで きる。この点で、「マイクロトム（Micro-Tom）」で活性があることが証明され たＡｃ／Ｄｓ系はまた、遺伝子ノックアウトまたは挿入不活性化により、逆向き
遺伝学に寄与する。
ら１９９５；クナップ（Knapp）ら、１９９４；ロメンス（Rommens）ら、１９９
２；ヨーダー（Yoder）ら、１９８８）が、この植物についてエンハンサーや遺 伝子捕捉システムの文献は無い。しかし本発明において、非連鎖転位の選択のた
めの２つのシステムがトマトに導入され、１つのシステムはＮＡＭ感受性とカナ
マイシン耐性に基づき（スンダレサン（Sundaresan）ら、１９９５）、第２のシ
ステムは切除−挿入選択（フェドロフ（Fedoroff）とスミス（Smith）、１９９ ３）に基づき、これはＤｓ内に含有されるヒグロマイシン耐性の効率的な検出を
利用する。さらに、「マイクロトム（Micro-Tom）」の他の農学的特徴と一緒に 切除マーカーとしてクロロスルフロンに対する耐性を利用して、多数の推定突然
変異体がエンハンサーやプロモーターのスクリーニングについてスクリーニング
され、遺伝子単離について使用することができる。さらに最近報告されたトマト
の体細胞組織の部位選択挿入（クーレイ（Cooley）ら、１９９６）はまた、安定
な胚細胞転位事象について「マイクロトム（Micro-Tom）」で応用することがで きる。この点で、「マイクロトム（Micro-Tom）」で活性があることが証明され たＡｃ／Ｄｓ系はまた、遺伝子ノックアウトまたは挿入不活性化により、逆向き
遺伝学に寄与する。
【００５３】 以下の例は例示のために提供され、決して本発明の請求の範囲を限定するもの
と考えてはならない。開示された態様には種々の変更が可能であり、そのような
変更は、本発明の請求の範囲内に含まれることは当業者には明らかであろう。本
明細書に記載したすべての文献および特許出願は、本発明が関する分野の技術レ
ベルを示すものである。本明細書に記載のすべての文献および特許出願は、各文
献または特許出願が、具体的かつ個別にその全体が取り込まれたものとして、本
明細書の一部として参照される。
と考えてはならない。開示された態様には種々の変更が可能であり、そのような
変更は、本発明の請求の範囲内に含まれることは当業者には明らかであろう。本
明細書に記載したすべての文献および特許出願は、本発明が関する分野の技術レ
ベルを示すものである。本明細書に記載のすべての文献および特許出願は、各文
献または特許出願が、具体的かつ個別にその全体が取り込まれたものとして、本
明細書の一部として参照される。
【００５４】 （例） 例１．栽培環境と遺伝子構成
【００５５】 （ａ）方法：「マイクロトム（Micro-Tom）」植物種子を播き、苗床トレイま たは鉢で果実が熟すまで栽培した。植物密度の実験について、各処理は、異なる
根の容積での栽培に対応する。そのために植物を１３、３３、９０、または２０
０mlの市販の区画化した苗床トレイ中または４６５ml容量の鉢中で育てた。各処
理は二重測定で行い、それぞれ８４個（１３ml処理）、７２個（３３ml）、６３
個（９０ml）、５０個（２００）ml、および１５個（４６５ml）の植物からなり
、各形質について分析した。
根の容積での栽培に対応する。そのために植物を１３、３３、９０、または２０
０mlの市販の区画化した苗床トレイ中または４６５ml容量の鉢中で育てた。各処
理は二重測定で行い、それぞれ８４個（１３ml処理）、７２個（３３ml）、６３
個（９０ml）、５０個（２００）ml、および１５個（４６５ml）の植物からなり
、各形質について分析した。
【００５６】 （ｂ）結果：種々のサイズの根の区画を有する苗床トレイ中で、種子から果実
が熟するまで「マイクロトム（Micro-Tom）」植物を育てて、植物の成長ならび に果実と種子の成熟に及ぼす密度の効果を測定した。１００〜１３５７植物／ｍ 2 （４６５〜１３mlの範囲の根の容積に等しい）の密度を試験した。異なる栽培 条件に対する「マイクロトム（Micro-Tom）」の応答を図１に示す。試験した栽 培形質は、括弧内に示す値の範囲（最初−最大）で各四角中に示す。各形質はこ
の形質の最大値のパーセントとして示し、根の容積（下のスケール）または植物
密度（上のスケール）の関数として示す。以下の形質を測定した：開花までの日
数（播いて開花までの平均日数）；熟すまでの日数（播いてから熟すまでの平均
日数）；植物の高さ（土壌の表面から第１花序までの高さ（cm））；葉の数（主
茎上の葉の数）；植物の収率（植物当たりの総果実質量（ｇ））；果実の数（植
物当たりの果実の数）；果実の質量（果実の平均質量（ｇ））；および種子の数
（植物当たりの種子の平均数）。誤差棒は、小さすぎるため記載していない。
が熟するまで「マイクロトム（Micro-Tom）」植物を育てて、植物の成長ならび に果実と種子の成熟に及ぼす密度の効果を測定した。１００〜１３５７植物／ｍ 2 （４６５〜１３mlの範囲の根の容積に等しい）の密度を試験した。異なる栽培 条件に対する「マイクロトム（Micro-Tom）」の応答を図１に示す。試験した栽 培形質は、括弧内に示す値の範囲（最初−最大）で各四角中に示す。各形質はこ
の形質の最大値のパーセントとして示し、根の容積（下のスケール）または植物
密度（上のスケール）の関数として示す。以下の形質を測定した：開花までの日
数（播いて開花までの平均日数）；熟すまでの日数（播いてから熟すまでの平均
日数）；植物の高さ（土壌の表面から第１花序までの高さ（cm））；葉の数（主
茎上の葉の数）；植物の収率（植物当たりの総果実質量（ｇ））；果実の数（植
物当たりの果実の数）；果実の質量（果実の平均質量（ｇ））；および種子の数
（植物当たりの種子の平均数）。誤差棒は、小さすぎるため記載していない。
【００５７】 一部の形質は、植物密度にほとんど影響を受けなかった。例えば種子を播いて
から開花までの日数は３７〜４０日の範囲であり、種子を播いてから果実が熟す
るまでの日数は７５〜８２日の範囲であった。対照の標準的有限トマト栽培品種
（ｃｖ．ＵＣ８２）を同様の条件で育てると、高密度（４１２〜１３５７植物／
ｍ2）では果実ができず、低密度（１００〜２２６植物／ｍ2）では一部の植物で
のみ果実ができた。他の形質（例えば、植物の収率、植物当たりの果実の数、ま
たは種子の数）は、植物密度の変化に対して直線的に応答し、実験で得られた最
小値と最大値の間には１０倍以上の差があった。平均果実質量と植物の高さの形
質は、密度に対する応答が小さく、最小値と最大値では２倍の差であった。
から開花までの日数は３７〜４０日の範囲であり、種子を播いてから果実が熟す
るまでの日数は７５〜８２日の範囲であった。対照の標準的有限トマト栽培品種
（ｃｖ．ＵＣ８２）を同様の条件で育てると、高密度（４１２〜１３５７植物／
ｍ2）では果実ができず、低密度（１００〜２２６植物／ｍ2）では一部の植物で
のみ果実ができた。他の形質（例えば、植物の収率、植物当たりの果実の数、ま
たは種子の数）は、植物密度の変化に対して直線的に応答し、実験で得られた最
小値と最大値の間には１０倍以上の差があった。平均果実質量と植物の高さの形
質は、密度に対する応答が小さく、最小値と最大値では２倍の差であった。
【００５８】 種々の密度レベルで育てた成熟植物を、図２Ａと２Ｂに示す。図２Ａは、根の
区画が１３ml（左上）、３３ml（右上）、９０ml（左下）、および２００ml（右
下）を有する苗床トレイで育てた「マイクロトム（Micro-Tom）」植物を示す。 図２Ｂは、９０mlの区画で育てた野生型「マイクロトム（Micro-Tom）」の成熟 植物をスケール棒とともに示す。植物は５〜６mlの高さ（根は含まない）で、果
実の直径は１．５〜２cmである。「マイクロトム（Micro-Tom）」植物は、苗床 中で２２６植物／ｍ2の密度で育てた。「マイクロトム（Micro-Tom）」では、す
べての植物器官が、釣り合ってサイズが低下している（種子は例外であり、ほぼ
正常の大きさである）。これは、植物の全体のサイズと比較すると外観がコンパ
クトで大きな葉を持つ他のトマト矮小突然変異体と対照的である。
区画が１３ml（左上）、３３ml（右上）、９０ml（左下）、および２００ml（右
下）を有する苗床トレイで育てた「マイクロトム（Micro-Tom）」植物を示す。 図２Ｂは、９０mlの区画で育てた野生型「マイクロトム（Micro-Tom）」の成熟 植物をスケール棒とともに示す。植物は５〜６mlの高さ（根は含まない）で、果
実の直径は１．５〜２cmである。「マイクロトム（Micro-Tom）」植物は、苗床 中で２２６植物／ｍ2の密度で育てた。「マイクロトム（Micro-Tom）」では、す
べての植物器官が、釣り合ってサイズが低下している（種子は例外であり、ほぼ
正常の大きさである）。これは、植物の全体のサイズと比較すると外観がコンパ
クトで大きな葉を持つ他のトマト矮小突然変異体と対照的である。
【００５９】 これらの結果は、矮小栽培品種「マイクロトム（Micro-Tom）」は、本発明に 従って１３５７植物／ｍ2の密度でルーチンに育てることができることを証明し ている。
【００６０】 「マイクロトム（Micro-Tom）」をＵＣ８２（有限栽培品種）およびＶＦ８６ （非有限栽培品種）と交配した。両方の交配のＦ１植物は、高さが「高い」親と
非常によく似ており、「マイクロトム（Micro-Tom）」型に関与する遺伝子は劣 性であることを示している。ＵＣ８２との交配からのＦ２子孫では、広い範囲の
栽培環境表現型があった。１７６個のＦ２植物のうちの６個は明らかに「マイク
ロトム（Micro-Tom）」タイプではなく、これは変更遺伝子の可能な追加の作用 を有する２つの主要な劣性遺伝子により制御されていることを示唆している。「
マイクロトム（Micro-Tom）」の系統（スコット（Scott）とハーボー（Harbaugh
）、１９８９）に基づき、ｄｗａｒｆとｍｉｎｉａｔｕｒｅは、「マイクロトム
（Micro-Tom）」表現型に関与する２つの遺伝子であるようである。
非常によく似ており、「マイクロトム（Micro-Tom）」型に関与する遺伝子は劣 性であることを示している。ＵＣ８２との交配からのＦ２子孫では、広い範囲の
栽培環境表現型があった。１７６個のＦ２植物のうちの６個は明らかに「マイク
ロトム（Micro-Tom）」タイプではなく、これは変更遺伝子の可能な追加の作用 を有する２つの主要な劣性遺伝子により制御されていることを示唆している。「
マイクロトム（Micro-Tom）」の系統（スコット（Scott）とハーボー（Harbaugh
）、１９８９）に基づき、ｄｗａｒｆとｍｉｎｉａｔｕｒｅは、「マイクロトム
（Micro-Tom）」表現型に関与する２つの遺伝子であるようである。
【００６１】 これらの結果は、矮小栽培品種「マイクロトム（Micro-Tom）」は、市販のト マト栽培品種と容易に交配させることができることを示している。
【００６２】 例２．ＥＭＳ突然変異誘発 （ａ）方法：ＥＭＳ実験について、植物を例１に記載のように栽培したが、植
物は、温室の代わりにワイズマンインスチチュートオブサイエンス（Weizmann I
nstitute of Science）（レホヴォト（Rehovot）、イスラエル）のネットハウス
で栽培した。
物は、温室の代わりにワイズマンインスチチュートオブサイエンス（Weizmann I
nstitute of Science）（レホヴォト（Rehovot）、イスラエル）のネットハウス
で栽培した。
【００６３】 １５，０００個の「マイクロトム（Micro-Tom）」種子についてＥＭＳ突然変 異誘発を行なった。突然変異誘発を行なった種子と突然変異誘発した種子から発
芽した植物を、Ｍ１世代と呼ぶ。種子をシャーレ中のワットマン紙上に９時間浸
し、非緩衝化０．７％ＥＭＳ（シグマ（Sigma））溶液１５０mlを含有する三角 フラスコに移し、静かに攪拌しながら室温（２２℃）で１６時間インキュベート
した。突然変異誘発した種子を充分洗浄し、ファンで乾燥し、同じ日に実生トレ
イに播いた。対照群と比較して、突然変異誘発した実生は成長が遅れ、発芽の割
合は約２５％低下していた。約１０％のＭ１植物は不稔性であった。Ｍ２種子は
、９０００個のＭ１植物から採取した。７０個のＭ１植物から、Ｍ２種子を各植
物から１つずつ採取し、子孫の列中の各Ｍ１植物について１０〜２０個のＭ２植
物を育てた。残りのＭ２種子をバルクで採取し、各Ｍ１植物から１つの果実をプ
ールした。バルク採取物から約２０，０００個のＭ２種子を播き、１４，０００
個の果実産生Ｍ２植物が得られた。Ｍ３種子をバルクで採取した。
芽した植物を、Ｍ１世代と呼ぶ。種子をシャーレ中のワットマン紙上に９時間浸
し、非緩衝化０．７％ＥＭＳ（シグマ（Sigma））溶液１５０mlを含有する三角 フラスコに移し、静かに攪拌しながら室温（２２℃）で１６時間インキュベート
した。突然変異誘発した種子を充分洗浄し、ファンで乾燥し、同じ日に実生トレ
イに播いた。対照群と比較して、突然変異誘発した実生は成長が遅れ、発芽の割
合は約２５％低下していた。約１０％のＭ１植物は不稔性であった。Ｍ２種子は
、９０００個のＭ１植物から採取した。７０個のＭ１植物から、Ｍ２種子を各植
物から１つずつ採取し、子孫の列中の各Ｍ１植物について１０〜２０個のＭ２植
物を育てた。残りのＭ２種子をバルクで採取し、各Ｍ１植物から１つの果実をプ
ールした。バルク採取物から約２０，０００個のＭ２種子を播き、１４，０００
個の果実産生Ｍ２植物が得られた。Ｍ３種子をバルクで採取した。
【００６４】 （ｂ）結果：Ｍ１集団（処理世代）では、約１％の植物が斑入り葉緑素を示し
た。
た。
【００６５】 図２Ｃに示すように、Ｍ２集団では、全部で１４，０００個の植物を苗床トレ
イ中で栽培し、突然変異表現型についてスクリーニングした。図２Ｄ〜Ｈは、突
然変異体表現型を有するＥＭＳ生成したＭ２植物を示す。この集団から１１１個
の葉緑素突然変異体（アルビノ、黄色（キサントフィル様）および薄緑色の葉を
含む）を見つけた。図２Ｇは、葉緑素突然変異体表現型（黄色の葉）を有するＭ
２植物を示す。葉の形、花（花弁）および果実の色素が変化した植物も観察され
た。野生型の丸い形の果実と比較して、６つの植物はすべての果実で果実の形が
変化していた（カキ型（図２ｄ）とナシ型（図２Ｅ）のような表現型を含む）。
楕円形の果実を有する植物も、細長い葉を有した（図２Ｆ）。
イ中で栽培し、突然変異表現型についてスクリーニングした。図２Ｄ〜Ｈは、突
然変異体表現型を有するＥＭＳ生成したＭ２植物を示す。この集団から１１１個
の葉緑素突然変異体（アルビノ、黄色（キサントフィル様）および薄緑色の葉を
含む）を見つけた。図２Ｇは、葉緑素突然変異体表現型（黄色の葉）を有するＭ
２植物を示す。葉の形、花（花弁）および果実の色素が変化した植物も観察され
た。野生型の丸い形の果実と比較して、６つの植物はすべての果実で果実の形が
変化していた（カキ型（図２ｄ）とナシ型（図２Ｅ）のような表現型を含む）。
楕円形の果実を有する植物も、細長い葉を有した（図２Ｆ）。
【００６６】 個々のＭ１植物から得られる７０個のＭ２ファミリーを、突然変異体について
スクリーニングした。５個のファミリーで突然変異表現型が観察され、これらは
いつも３：１に分離した。葉のアントシアニン（紫）色素について分離したその
ようなファミリーの１つ：図２Ｈに示すこのファミリーは、単一のＭ２植物から
得られ、アントシアニンについて３：１に分離した。
スクリーニングした。５個のファミリーで突然変異表現型が観察され、これらは
いつも３：１に分離した。葉のアントシアニン（紫）色素について分離したその
ようなファミリーの１つ：図２Ｈに示すこのファミリーは、単一のＭ２植物から
得られ、アントシアニンについて３：１に分離した。
【００６７】 例３．「マイクロトム（Micro-Tom）」におけるトランスポゾン標識とエンハン サー捕捉
【００６８】 （ａ）方法：「マイクロトム（Micro-Tom）」植物を、以下の作製体を用いて 前述のように形質転換した。次にトランスジェニック植物を、温室内で例１に示
すように栽培した。
すように栽培した。
【００６９】 （１）作製体：エンハンサー捕捉（フェドロフ（Fedoroff）とスミス（Smith ）、１９９３）について使用した作製体Ｂａｍ３５Ｓ−ＡｃとＤｓ３７８−ＧＵ
Ｓを、ニナ・フェドロフ（Nina Fedoroff）から得た。遺伝子捕捉とエンハンサ ー捕捉に使用した作製体ＤｓＧとＤｓＥ（スンダレサン（Sundaresan）ら、１９
９５）は、それぞれベンカテサン・スンダレサン（Venkatesan Sundaresan）か ら得た。これらの作製体は図３に示し、以下に説明する。
Ｓを、ニナ・フェドロフ（Nina Fedoroff）から得た。遺伝子捕捉とエンハンサ ー捕捉に使用した作製体ＤｓＧとＤｓＥ（スンダレサン（Sundaresan）ら、１９
９５）は、それぞれベンカテサン・スンダレサン（Venkatesan Sundaresan）か ら得た。これらの作製体は図３に示し、以下に説明する。
【００７０】 Ａｃに類似の配列を灰色で示し、末端反転繰り返し配列を灰色の矢印で示す。
作製体は、各Ｔ−ＤＮＡの右（ＲＢ）の境界と左（ＬＢ）の境界がある。β−グ
ルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）はＤｓ３７８−ＧＵＳ中のＡｃウィークプロモ
ーターに、ＤｓＥ中の３５Ｓ最小の〜１から〜４６プロモーター領域（黒四角）
か、またはＤｓＧ中の３つのアクセプタースプライス部位が続くアラビドプシス
（Arabidopsis）イントロン（黒四角）に融合している（スンダレサン（Sundare
san）ら、１９９５）。カナマイシンに対する耐性（Ｋａｎr）またはヒグロマイ
シンに対する耐性（Ｈｙｇr）は、それぞれネオマイシンホスホトランスフェラ ーゼまたはアミノシクリトールホスホトランスフェラーゼ遺伝子により与えられ
る。ナフタレンアセトアミドに対する感受性（ＮＡＭs）は、インドールヒドロ ラーゼ遺伝子により与えられる。
作製体は、各Ｔ−ＤＮＡの右（ＲＢ）の境界と左（ＬＢ）の境界がある。β−グ
ルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）はＤｓ３７８−ＧＵＳ中のＡｃウィークプロモ
ーターに、ＤｓＥ中の３５Ｓ最小の〜１から〜４６プロモーター領域（黒四角）
か、またはＤｓＧ中の３つのアクセプタースプライス部位が続くアラビドプシス
（Arabidopsis）イントロン（黒四角）に融合している（スンダレサン（Sundare
san）ら、１９９５）。カナマイシンに対する耐性（Ｋａｎr）またはヒグロマイ
シンに対する耐性（Ｈｙｇr）は、それぞれネオマイシンホスホトランスフェラ ーゼまたはアミノシクリトールホスホトランスフェラーゼ遺伝子により与えられ
る。ナフタレンアセトアミドに対する感受性（ＮＡＭs）は、インドールヒドロ ラーゼ遺伝子により与えられる。
【００７１】 Ｄｓ移動性は、Ｄｓ含有植物（ＤｓＧ、ＤｓＥおよびＤｓ３７８−ＧＵＳ）を
Ｂａｍ３５Ｓ−Ａｃで形質転換したトランスポザーゼ産生植物と交配することに
より行われる。この作製体中でＡｃトランスポザーゼは、５’末端領域がユニー
クなＢａｍＨＩ水まで欠失しているＡｃ成分に融合した３５Ｓプロモーターの制
御下で産生される。クロロスルフロン耐性（Ｃｈｌr）は、Ｄｓ３７８−ＧＵＳ 含有作製体からＤｓ成分を切除し、ＧＵＳ含有作製体から突然変異アセト乳酸シ
ンターゼ遺伝子を活性化し、アラビドプシス（Arabidopsis）から突然変異アセ ト乳酸シンターゼ遺伝子を活性化することにより、得られる（フェドロフ（Fedo
roff）とスミス（Smith）、１９９３）。Ｂａｍ３５Ｓ−ＡｃとＤｓ３７８−Ｇ ＵＳとの交配のＦ１中のＤｓ３７８−ＧＵＳの切除により切除指紋（Ｅｘ１とＥ
ｘ２）が得られ、プライマーｐｒ１とｐｒ２で増幅した。Ｄｓ３７８−ＧＵＳの
両側に位置する配列を上記Ｅｘ１とＥｘ２に示す。下線を引いた配列は、Ｄｓ３
７８−ＧＵＳが得られる元々のｗｘ−ｍ７トウモロコシ対立遺伝子中の宿主複製
フランキングＡｃ挿入部位を示す。
Ｂａｍ３５Ｓ−Ａｃで形質転換したトランスポザーゼ産生植物と交配することに
より行われる。この作製体中でＡｃトランスポザーゼは、５’末端領域がユニー
クなＢａｍＨＩ水まで欠失しているＡｃ成分に融合した３５Ｓプロモーターの制
御下で産生される。クロロスルフロン耐性（Ｃｈｌr）は、Ｄｓ３７８−ＧＵＳ 含有作製体からＤｓ成分を切除し、ＧＵＳ含有作製体から突然変異アセト乳酸シ
ンターゼ遺伝子を活性化し、アラビドプシス（Arabidopsis）から突然変異アセ ト乳酸シンターゼ遺伝子を活性化することにより、得られる（フェドロフ（Fedo
roff）とスミス（Smith）、１９９３）。Ｂａｍ３５Ｓ−ＡｃとＤｓ３７８−Ｇ ＵＳとの交配のＦ１中のＤｓ３７８−ＧＵＳの切除により切除指紋（Ｅｘ１とＥ
ｘ２）が得られ、プライマーｐｒ１とｐｒ２で増幅した。Ｄｓ３７８−ＧＵＳの
両側に位置する配列を上記Ｅｘ１とＥｘ２に示す。下線を引いた配列は、Ｄｓ３
７８−ＧＵＳが得られる元々のｗｘ−ｍ７トウモロコシ対立遺伝子中の宿主複製
フランキングＡｃ挿入部位を示す。
【００７２】 （２）形質転換：以下の最適化プロトコールを使用して、「マイクロトム（Mi
cro-Tom）」を作製体Ｄｓ３７８−ＧＵＳ、Ｂａｍ３５Ｓ−Ａｃ、ＤｓＥ、およ びＤｓＧを形質転換した。０．２μg/mlの２，４−Ｄとタバコフィーダー細胞層
（ホーシュ（Horsch）ら、１９８５）を補足したＫＣＭＳ培地（フィラティ（Fi
llati）ら、１９８７）を含有するプレートを、弱い光の条件下で２５℃で２４ 時間インキュベートした。７日目の実生の子葉を葉柄の近くと先端で切断し、プ
レートの上に置き、弱い光の条件下で２５℃で２４時間インキュベートした。同
時培養で使用したアグロバクテリウム（Agrobacterium）株ＬＢＡ４４０４の濃 度は、５×１０7〜９×１０7cfu/mlであった（ＯＤ０．４〜０．５に相当する）
。プレインキュベーションと同じ条件下で同時培養を行い、４８時間継続した。
次に子葉を、１００μg/mlのカナマイシンと４００μg/mlのカルベニシリンを含
有する２Ｚ培地（フィラティ（Fillati）ら、１９８７）に移し、次に２００μg
/mlのカルベニシリンを含有する１Ｚ培地に再度２〜３週間移した。次に芽を子 葉から切除し、２μg/ml ＩＢＡ、５０μg/mlカナマイシン、および１００μg/
mlカルベニシリンを補足した根付け培地（ＭＳＳＶ）（フィラティ（Fillati） ら、１９８７）に移した。１〜３週間後に根の付いた実生が現れ、次に温室に移
した。
cro-Tom）」を作製体Ｄｓ３７８−ＧＵＳ、Ｂａｍ３５Ｓ−Ａｃ、ＤｓＥ、およ びＤｓＧを形質転換した。０．２μg/mlの２，４−Ｄとタバコフィーダー細胞層
（ホーシュ（Horsch）ら、１９８５）を補足したＫＣＭＳ培地（フィラティ（Fi
llati）ら、１９８７）を含有するプレートを、弱い光の条件下で２５℃で２４ 時間インキュベートした。７日目の実生の子葉を葉柄の近くと先端で切断し、プ
レートの上に置き、弱い光の条件下で２５℃で２４時間インキュベートした。同
時培養で使用したアグロバクテリウム（Agrobacterium）株ＬＢＡ４４０４の濃 度は、５×１０7〜９×１０7cfu/mlであった（ＯＤ０．４〜０．５に相当する）
。プレインキュベーションと同じ条件下で同時培養を行い、４８時間継続した。
次に子葉を、１００μg/mlのカナマイシンと４００μg/mlのカルベニシリンを含
有する２Ｚ培地（フィラティ（Fillati）ら、１９８７）に移し、次に２００μg
/mlのカルベニシリンを含有する１Ｚ培地に再度２〜３週間移した。次に芽を子 葉から切除し、２μg/ml ＩＢＡ、５０μg/mlカナマイシン、および１００μg/
mlカルベニシリンを補足した根付け培地（ＭＳＳＶ）（フィラティ（Fillati） ら、１９８７）に移した。１〜３週間後に根の付いた実生が現れ、次に温室に移
した。
【００７３】 （３）選択マーカーとＧＵＳレポーター。形質転換に必要なカナマイシン選択
と捕捉系で使用したＧＵＳレポーター以外に、多くのマーカーを使用して転位事
象について選択した（フェドロフ（Fedoroff）とスミス（Smith）、１９９３； スンダレサン（Sunadaresan）ら、１９９５）。このために、以下の化合物の１ つまたは組合せを補足した０．８％寒天含有ニチュ（Nitsh）培地中で、滅菌し た種子発芽させ成長させた：２０μg/mlのヒグロマイシン（カルビオケム（Calb
iochem））；０．２５μg/mlのナフタレンアセトアミド（ＮＡＭ、シグマ（Sigm
a））；および１００p.p.b.または２p.m.のクロロスルフロン（ヂュポン（DuPon
t））。ジェファーソン（Jefferson）（１９８７）に従ってＧＵＳ染色を行い、
ベックマン（Beeckman）とイングラー（Engler）（１９９４）に従って組織の清
掃を行なった。
と捕捉系で使用したＧＵＳレポーター以外に、多くのマーカーを使用して転位事
象について選択した（フェドロフ（Fedoroff）とスミス（Smith）、１９９３； スンダレサン（Sunadaresan）ら、１９９５）。このために、以下の化合物の１ つまたは組合せを補足した０．８％寒天含有ニチュ（Nitsh）培地中で、滅菌し た種子発芽させ成長させた：２０μg/mlのヒグロマイシン（カルビオケム（Calb
iochem））；０．２５μg/mlのナフタレンアセトアミド（ＮＡＭ、シグマ（Sigm
a））；および１００p.p.b.または２p.m.のクロロスルフロン（ヂュポン（DuPon
t））。ジェファーソン（Jefferson）（１９８７）に従ってＧＵＳ染色を行い、
ベックマン（Beeckman）とイングラー（Engler）（１９９４）に従って組織の清
掃を行なった。
【００７４】 （４）ＤＮＡ解析。デラポルタ（Dellaporta）法（デラポルタ（Dellaporta）
ら、１９８３）に従って、フェノールクロロホルム抽出を追加して、若い葉から
ＤＮＡを抽出した。製造業者の勧める条件に従ってプロメガ（Promega）のＴａ ｑポリメラーゼを使用して、ＭＪサーマルサイクラー中で２．５mM ＭｇＣｌ2 、および２００μＭ ｄＮＴＰを用いて、ＰＣＲ反応を行なった。以下のプログ
ラムを使用した：９４℃で変性２分、そして９４℃で１分、５５℃で４５分、７
２℃で１分を３０サイクル、最後に７２℃で５分を１工程。Ｄｓ切除産物を増幅
するのに使用したプライマーは：ｐｒ２、５’ＧＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＴＴＧＴ
ＧＣＧＴＣ３’（これは、３５Ｓプロモーター中の配列に相補的である）および
ｐｒ１、５’ＧＧＡＴＧＡＴＴＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡ３’（これは、ＡＬＳ
遺伝子中の配列に相補的である）（図３）。切除生成物の予測されたサイズ（約
３２２塩基対）のバンドをアガロースゲルから抽出し、製造業者の説明書に従っ
てゲンクリーン（GenClean）を使用してＤＮＡを精製した。これらのＰＣＲ産物
をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ（Promega））中にクローン化し、Ｔ７また はＳＰ６プライマーを使用して配列決定した。サザン解析のために、２μgのゲ ノムＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化し、０．８％アガロースゲルで分画し、ＭＳＩ から購入したニトロセルロース膜に移した。製造業者の説明書に従ってハイブリ
ダイゼーションを行なった。１kbの内部ＧＵＳ断片をＰＣＲで増幅し、ランダム
プライミング法（フェインバーグ（Feinberg）とフォーベルスタイン（Vogelste
rin）、１９８３））により放射能標識し、Ｄｓ検出のためのプローブとして使 用した。
ら、１９８３）に従って、フェノールクロロホルム抽出を追加して、若い葉から
ＤＮＡを抽出した。製造業者の勧める条件に従ってプロメガ（Promega）のＴａ ｑポリメラーゼを使用して、ＭＪサーマルサイクラー中で２．５mM ＭｇＣｌ2 、および２００μＭ ｄＮＴＰを用いて、ＰＣＲ反応を行なった。以下のプログ
ラムを使用した：９４℃で変性２分、そして９４℃で１分、５５℃で４５分、７
２℃で１分を３０サイクル、最後に７２℃で５分を１工程。Ｄｓ切除産物を増幅
するのに使用したプライマーは：ｐｒ２、５’ＧＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＴＴＧＴ
ＧＣＧＴＣ３’（これは、３５Ｓプロモーター中の配列に相補的である）および
ｐｒ１、５’ＧＧＡＴＧＡＴＴＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡ３’（これは、ＡＬＳ
遺伝子中の配列に相補的である）（図３）。切除生成物の予測されたサイズ（約
３２２塩基対）のバンドをアガロースゲルから抽出し、製造業者の説明書に従っ
てゲンクリーン（GenClean）を使用してＤＮＡを精製した。これらのＰＣＲ産物
をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ（Promega））中にクローン化し、Ｔ７また はＳＰ６プライマーを使用して配列決定した。サザン解析のために、２μgのゲ ノムＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化し、０．８％アガロースゲルで分画し、ＭＳＩ から購入したニトロセルロース膜に移した。製造業者の説明書に従ってハイブリ
ダイゼーションを行なった。１kbの内部ＧＵＳ断片をＰＣＲで増幅し、ランダム
プライミング法（フェインバーグ（Feinberg）とフォーベルスタイン（Vogelste
rin）、１９８３））により放射能標識し、Ｄｓ検出のためのプローブとして使 用した。
【００７５】 （ｂ）結果：作製体Ｄｓ３７８−ＧＵＳ、Ｂａｍ３５Ｓ−Ａｃ、ＤｓＥ、およ
びＤｓＧを、前記したように「マイクロトム（Micro-Tom）」に形質転換した。
びＤｓＧを、前記したように「マイクロトム（Micro-Tom）」に形質転換した。
【００７６】 これらの作製体は、カナマイシンに対する耐性を与えるＮＰＴII遺伝子を含有
する。Ｔ−ＤＮＡの存在を検出し、Ｄｓ３７８−ＧＵＳ中のドナー部位に対する
Ｄｓ成分をマッピングするために、またはＤｓＥとＤｓＧを用いる非連鎖転位事
象の選択のために、ＮＰＴIIを形質転換マーカーとして使用することができる。
この遺伝子の１つの利点は、全トマト植物中の非破壊レポーターとしてのその使
用である。前記したように（ウェイデ（Weide）ら、１９８９）連続３日間３０ ０μg/mlのカナマイシンで、最も成長段階で「マイクロトム（Micro-Tom）」植 物を噴霧することは、これらを破壊せずにカナマイシン感受性植物を同定するこ
とを可能にする。このような植物中で、苗条の先端近くの若い葉は、図４に示す
ように噴霧後まもなく白くなる。図４Ａは、３００μg/lのカナマイシンを３回 噴霧処理（１日１回）後の、３週令の「マイクロトム（Micro-Tom）」植物を示 す。Ｂａｍ３５Ｓ−Ａｃ（上のパネル）で形質転換したカナマイシン耐性植物を
、同じ週令の感受性の植物である野生型（下のパネル）と比較した。感受性植物
中で苗条で白色の葉が出現する。最終的に、これらの葉は死滅するが、次に現れ
る葉は、緑色であり、植物は生き続ける。
する。Ｔ−ＤＮＡの存在を検出し、Ｄｓ３７８−ＧＵＳ中のドナー部位に対する
Ｄｓ成分をマッピングするために、またはＤｓＥとＤｓＧを用いる非連鎖転位事
象の選択のために、ＮＰＴIIを形質転換マーカーとして使用することができる。
この遺伝子の１つの利点は、全トマト植物中の非破壊レポーターとしてのその使
用である。前記したように（ウェイデ（Weide）ら、１９８９）連続３日間３０ ０μg/mlのカナマイシンで、最も成長段階で「マイクロトム（Micro-Tom）」植 物を噴霧することは、これらを破壊せずにカナマイシン感受性植物を同定するこ
とを可能にする。このような植物中で、苗条の先端近くの若い葉は、図４に示す
ように噴霧後まもなく白くなる。図４Ａは、３００μg/lのカナマイシンを３回 噴霧処理（１日１回）後の、３週令の「マイクロトム（Micro-Tom）」植物を示 す。Ｂａｍ３５Ｓ−Ａｃ（上のパネル）で形質転換したカナマイシン耐性植物を
、同じ週令の感受性の植物である野生型（下のパネル）と比較した。感受性植物
中で苗条で白色の葉が出現する。最終的に、これらの葉は死滅するが、次に現れ
る葉は、緑色であり、植物は生き続ける。
【００７７】 ヒグロマイシン耐性遺伝子は、図４Ｂに示すようにＤｓ３７８−ＧＵＳの存在
を示す。Ｄｓ３７８−ＧＵＳで形質転換した植物は２０μg/mlのヒグロマイシン
に耐性（図４Ｂ、左）であり、野生型「マイクロトム（Micro-Tom）」は感受性 （図４Ｂ、下左）である。
を示す。Ｄｓ３７８−ＧＵＳで形質転換した植物は２０μg/mlのヒグロマイシン
に耐性（図４Ｂ、左）であり、野生型「マイクロトム（Micro-Tom）」は感受性 （図４Ｂ、下左）である。
【００７８】 インドール酢酸ヒドロラーゼ（ｉａａＨ）遺伝子は、ＮＡＭに対する感受性を
与える。図４Ｃに示すように、感受性植物は、根の基部にカルス様組織を発生し
、発芽後約３週間で死滅する。Ｂａｍ３５Ｓ−Ａｃで形質転換した植物は、０．
２５μg/mlナフタレンアセトアミドに感受性（図４Ｃ、左）であり、野生型は耐
性（図４Ｃ、右）である。ＮＡＭ感受性は、Ｂａｍ３５Ｓ−Ａｃに対して選択す
るために陰性選択マーカーとして使用することができ、従って新しい挿入体を安
定化し、ＤｓＥとＤｓＧ中のドナー部位に対して選択する。
与える。図４Ｃに示すように、感受性植物は、根の基部にカルス様組織を発生し
、発芽後約３週間で死滅する。Ｂａｍ３５Ｓ−Ａｃで形質転換した植物は、０．
２５μg/mlナフタレンアセトアミドに感受性（図４Ｃ、左）であり、野生型は耐
性（図４Ｃ、右）である。ＮＡＭ感受性は、Ｂａｍ３５Ｓ−Ａｃに対して選択す
るために陰性選択マーカーとして使用することができ、従って新しい挿入体を安
定化し、ＤｓＥとＤｓＧ中のドナー部位に対して選択する。
【００７９】 ＡＬＳ遺伝子は、図４Ｄに示すように、非切除Ｄｓ成分を有する植物中の１０
０ppbクロロスルフロンに対して低い耐性を与え、Ｄｓが切除される植物中の２p
pmクロロスルフロンに対する耐性を与える。１００ppbクロロスルフロンで育て た野生型植物は感受性（図４Ｄ、左）であり、Ｄｓ３７８−ＧＵＳで形質転換し
た植物は低い耐性（図４Ｄ、真ん中）である。
０ppbクロロスルフロンに対して低い耐性を与え、Ｄｓが切除される植物中の２p
pmクロロスルフロンに対する耐性を与える。１００ppbクロロスルフロンで育て た野生型植物は感受性（図４Ｄ、左）であり、Ｄｓ３７８−ＧＵＳで形質転換し
た植物は低い耐性（図４Ｄ、真ん中）である。
【００８０】 転位選択に使用したマーカー選択の結果を図４に示す。Ｆ１（Ｄｓ×トランス
ポザーゼ）植物のＸ−Ｇｌｕｃ染色は、青い部分を示す（図４Ｅ〜Ｆ）。１０日
令のＦ１実生の根の青色（図４Ｅ）から明らかなように、ＤｓＧ中のプロモータ
ーのないＧＵＳレポーター遺伝子は活性化された、開花の２週間後で直径１cmの
若い果実は、ＧＵＳ活性について染色された（図４Ｆ、上）。野生型またはＢａ
ｍ３５Ｓ−Ａｃ親のような陰性対照植物中では、ＧＵＳ活性は得られなかった（
図４Ｆ、上）。Ｆ１果実の一部でＧＵＳが活性化された（図４Ｆ、下）。
ポザーゼ）植物のＸ−Ｇｌｕｃ染色は、青い部分を示す（図４Ｅ〜Ｆ）。１０日
令のＦ１実生の根の青色（図４Ｅ）から明らかなように、ＤｓＧ中のプロモータ
ーのないＧＵＳレポーター遺伝子は活性化された、開花の２週間後で直径１cmの
若い果実は、ＧＵＳ活性について染色された（図４Ｆ、上）。野生型またはＢａ
ｍ３５Ｓ−Ａｃ親のような陰性対照植物中では、ＧＵＳ活性は得られなかった（
図４Ｆ、上）。Ｆ１果実の一部でＧＵＳが活性化された（図４Ｆ、下）。
【００８１】 すなわち、アラビドプシス（Arabidopsis）についてすでに記載した選択特徴 （フェドロフ（Fedoroff）とスミス（Smith）、１９９３；スンダレサン（Sunad
aresan）ら、１９９５）はまた、「マイクロトム（Micro-Tom）」に応用でき、 従ってトランスポゾン標識系のために使用することができる。連鎖転位事象が最
もしばしば回収される、Ｄｓの非連鎖および安定化転位を作成する方策、および
切除と再挿入の選択の方策は、すでに記載されており比較される（スンダレサン
（Sunadaresan）ら、１９９６）。
aresan）ら、１９９５）はまた、「マイクロトム（Micro-Tom）」に応用でき、 従ってトランスポゾン標識系のために使用することができる。連鎖転位事象が最
もしばしば回収される、Ｄｓの非連鎖および安定化転位を作成する方策、および
切除と再挿入の選択の方策は、すでに記載されており比較される（スンダレサン
（Sunadaresan）ら、１９９６）。
【００８２】 Ｄｓ３７８−ＧＵＳとＢａｍ３５Ｓ−Ａｃ作製体を使用して、切除／再挿入シ
ステムの新しい特徴が、カナマイシン感受性植物を同定しレスキューする能力か
ら得られる（図４Ａ）。Ｄｓ３７８−ＧＵＳとＢａｍ３５Ｓ−Ａｃを有する親の
間の交配後に、ヒグロマイシン耐性とカナマイシン感受性についてＦ２植物を選
択すると、図４Ｄに示すように非連鎖の安定化転位事象の選択を可能にする。胚
性Ｄｓ切除事象が起きたＦ２植物（Ｂａｍ３５Ｓ−Ａｃ×Ｄｓ３７８−ＧＵＳ）
は、クロロスルフロンに対して充分耐性である（図４Ｄ，右）。これはフェドロ
フ（Fedoroff）とスミス（Smith）（１９９３）により開発されたシステムをト マトに応用することを可能にする。この２重システムは、連鎖および非連鎖転位
の選択に適している。
ステムの新しい特徴が、カナマイシン感受性植物を同定しレスキューする能力か
ら得られる（図４Ａ）。Ｄｓ３７８−ＧＵＳとＢａｍ３５Ｓ−Ａｃを有する親の
間の交配後に、ヒグロマイシン耐性とカナマイシン感受性についてＦ２植物を選
択すると、図４Ｄに示すように非連鎖の安定化転位事象の選択を可能にする。胚
性Ｄｓ切除事象が起きたＦ２植物（Ｂａｍ３５Ｓ−Ａｃ×Ｄｓ３７８−ＧＵＳ）
は、クロロスルフロンに対して充分耐性である（図４Ｄ，右）。これはフェドロ
フ（Fedoroff）とスミス（Smith）（１９９３）により開発されたシステムをト マトに応用することを可能にする。この２重システムは、連鎖および非連鎖転位
の選択に適している。
【００８３】 トマトでのこのシステムの使用は、まずＨｙｇrとＫａｎs植物の選択が関与し
、これは、非連鎖の安定な転位事象の同定を可能にする。この群の植物について
、空のドナー部位を含むＴ−ＤＮＡは分離するため、ＮＡＭ選択は必要ではなく
、クロロスルフロンは使用すべきではない。第２にＨｙｇrとＫａｎs植物の間の
クロロスルフロンの耐性の植物の選択は、連鎖転位事象の同定を可能にする。こ
の群の植物は、Ａｃが近くに転位する自然の傾向のために、かつ前記した非連鎖
転位事象（Ｈｙｇr、Ｋａｎs、およびＣｈｌs植物）の一部のために、濃縮され る。
、これは、非連鎖の安定な転位事象の同定を可能にする。この群の植物について
、空のドナー部位を含むＴ−ＤＮＡは分離するため、ＮＡＭ選択は必要ではなく
、クロロスルフロンは使用すべきではない。第２にＨｙｇrとＫａｎs植物の間の
クロロスルフロンの耐性の植物の選択は、連鎖転位事象の同定を可能にする。こ
の群の植物は、Ａｃが近くに転位する自然の傾向のために、かつ前記した非連鎖
転位事象（Ｈｙｇr、Ｋａｎs、およびＣｈｌs植物）の一部のために、濃縮され る。
【００８４】 「マイクロトム（Micro-Tom）」に導入されるＡｃ／Ｄｓ系の活性を、Ｄｓ切 除指紋を配列決定することによりＤｓ３７８−ＧＵＳとＢａｍ３５Ｓ−Ａｃで別
々に形質転換したトランスジェニック植物の間の交配のＦ１植物中で確認した。
図３でＤｓ３７８−ＧＵＳの下に示すこれらの指紋は、Ａｃ／Ｄｓについて予測
されるものに典型的である。分析した４つのクローンのうちの３つは、トウモロ
コシのｗｘ−ｍ７対立遺伝子またはアラビドプシス（Arabidopsis）（シー・ウ ェイル（C. Weil）、私信）およびタバコ（ゴルブノバ（Gorbunova）とレビイ（
Levy）、１９９７；シャレブ（Shalev）とレビイ（Levy）、１９９７）中のＡｃ
により生成されたものと同じ好適な指紋（ＧＣ反転）を有していた。これらの結
果は、すでにスコット（Scott）ら（１９９６）が記載しているように、優先的 指紋生成が種に非依存性であることを示唆する。さらにＤｓＧ×Ｂａｍ３５Ｓ−
Ａｃの根（図４Ｅ）、葉（示していない）、またはＤｓ３７８−ＧＵＳ×Ｂａｍ
３５Ｓ−Ａｃの若い果実（図４Ｆ）中に見いだされるＧＵＳ染色パターンは、植
物成長過程での遺伝子中またはその近くのＤｓの再組み込みを示した。弱いＡｃ
プロモーターを有するＤｓ３７８−ＧＵＳ親では、若い果実の未成熟な種子中で
のみ弱いＧＵＳ活性が検出された。
々に形質転換したトランスジェニック植物の間の交配のＦ１植物中で確認した。
図３でＤｓ３７８−ＧＵＳの下に示すこれらの指紋は、Ａｃ／Ｄｓについて予測
されるものに典型的である。分析した４つのクローンのうちの３つは、トウモロ
コシのｗｘ−ｍ７対立遺伝子またはアラビドプシス（Arabidopsis）（シー・ウ ェイル（C. Weil）、私信）およびタバコ（ゴルブノバ（Gorbunova）とレビイ（
Levy）、１９９７；シャレブ（Shalev）とレビイ（Levy）、１９９７）中のＡｃ
により生成されたものと同じ好適な指紋（ＧＣ反転）を有していた。これらの結
果は、すでにスコット（Scott）ら（１９９６）が記載しているように、優先的 指紋生成が種に非依存性であることを示唆する。さらにＤｓＧ×Ｂａｍ３５Ｓ−
Ａｃの根（図４Ｅ）、葉（示していない）、またはＤｓ３７８−ＧＵＳ×Ｂａｍ
３５Ｓ−Ａｃの若い果実（図４Ｆ）中に見いだされるＧＵＳ染色パターンは、植
物成長過程での遺伝子中またはその近くのＤｓの再組み込みを示した。弱いＡｃ
プロモーターを有するＤｓ３７８−ＧＵＳ親では、若い果実の未成熟な種子中で
のみ弱いＧＵＳ活性が検出された。
【００８５】 最後に、図５に示すように、Ｄｓ３７８−ＧＵＳ×Ｂａｍ３５Ｓ−Ａｃの交配
の子孫であるクロロスルフロンとヒグロマイシン耐性Ｆ２植物のサザンブロット
解析により転位を確認した。ゲノムＤＮＡを：Ｄｓ３７８−ＧＵＳ作製体につい
てホモ接合性のトランスジェニック植物（レーンａ）；Ｂａｍ３５Ｓ−ＧＵＳ作
製体についてホモ接合性のトランスジェニック植物（レーンｂ）；これらの２つ
の植物の間の交配のＦ１植物（レーンｃ）；および２ppmクロロスルフロンとヒ グロマイシンに対して耐性である誘導したＦ２植物（レーンｄ〜ｌ）から抽出し
た。ＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化し、０．８％アガロースゲルでかけ、ナイロン 膜に移し、内部の１kbＧＵＳプローブにハイブリダイズさせた。矢印は、Ｂａｍ
３５Ｓ−ＧＵＳからの８kbのバンドを示す。
の子孫であるクロロスルフロンとヒグロマイシン耐性Ｆ２植物のサザンブロット
解析により転位を確認した。ゲノムＤＮＡを：Ｄｓ３７８−ＧＵＳ作製体につい
てホモ接合性のトランスジェニック植物（レーンａ）；Ｂａｍ３５Ｓ−ＧＵＳ作
製体についてホモ接合性のトランスジェニック植物（レーンｂ）；これらの２つ
の植物の間の交配のＦ１植物（レーンｃ）；および２ppmクロロスルフロンとヒ グロマイシンに対して耐性である誘導したＦ２植物（レーンｄ〜ｌ）から抽出し
た。ＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化し、０．８％アガロースゲルでかけ、ナイロン 膜に移し、内部の１kbＧＵＳプローブにハイブリダイズさせた。矢印は、Ｂａｍ
３５Ｓ−ＧＵＳからの８kbのバンドを示す。
【００８６】 ＨｉｎｄIIIで消化したＤｓ含有親Ｄｓ３７８−ＧＵＳからのＤＮＡを処理す ると、Ｄｓの５’末端とＧＵＳ遺伝子の５’の間の結合が切断され、左の境界近
くでＴ−ＤＮＡを切断しない（図３）。Ｄｓ内に存在するＧＵＳプローブは、Ｄ
ｓ親について単一の８kbのバンドを明らかにし（レーンａ）、単一のＴ−ＤＮＡ
コピーがゲノム内に挿入されることを示している。トランスポザーゼ親では予測
されたように、ハイブリダイゼーションは得られなかった（レーンｂ）。Ｆ２親
は変動するハイブリダイゼーションパターン（図５、レーンｄ〜ｌ）を示し、新
しい位置での成分切除と再挿入を示していた。Ｄｓ３７８−ＧＵＳとＢａｍ３５
Ｓ−Ａｃの交配からのＦ２植物の解析は、クロロスルフロン耐性について試験し
た２２個の植物のうち、ヒグロマイシン含有培地上でインキュベートすると激し
く根が成長することにより証明されるように、１１個がヒグロマイシン耐性であ
った。これは、切除したＡｃの喪失の割合を約５０％にし、これはトウモロコシ
（ドーナー（Dooner）とベラチュー（Belachew）、１９８９；グリーンブラット
（Greenblatt）、１９８４；マクリントック（McClintock９、１９５６）、タバ
コ（ジョーンズ（Jones）ら、１９９０）およびアラビドプシス（Arabidopsis）
（アルトマン（Altmann）ら、１９９２）について既に報告した数字と似ている 。
くでＴ−ＤＮＡを切断しない（図３）。Ｄｓ内に存在するＧＵＳプローブは、Ｄ
ｓ親について単一の８kbのバンドを明らかにし（レーンａ）、単一のＴ−ＤＮＡ
コピーがゲノム内に挿入されることを示している。トランスポザーゼ親では予測
されたように、ハイブリダイゼーションは得られなかった（レーンｂ）。Ｆ２親
は変動するハイブリダイゼーションパターン（図５、レーンｄ〜ｌ）を示し、新
しい位置での成分切除と再挿入を示していた。Ｄｓ３７８−ＧＵＳとＢａｍ３５
Ｓ−Ａｃの交配からのＦ２植物の解析は、クロロスルフロン耐性について試験し
た２２個の植物のうち、ヒグロマイシン含有培地上でインキュベートすると激し
く根が成長することにより証明されるように、１１個がヒグロマイシン耐性であ
った。これは、切除したＡｃの喪失の割合を約５０％にし、これはトウモロコシ
（ドーナー（Dooner）とベラチュー（Belachew）、１９８９；グリーンブラット
（Greenblatt）、１９８４；マクリントック（McClintock９、１９５６）、タバ
コ（ジョーンズ（Jones）ら、１９９０）およびアラビドプシス（Arabidopsis）
（アルトマン（Altmann）ら、１９９２）について既に報告した数字と似ている 。
【００８７】 例４．ミニ植物栽培品種における逆向き遺伝学 トランスポゾン含有植物の集団を産生するために、ミニトマト栽培品種の「マ
イクロトム（Micro-Tom）」が選択した。「マイクロトム」は、例３に記載され る形質転換方法により、図３に図示されるプラスミドＢａｍ３５Ｓ−Ａｃで形質
転換した。形質転換体は、プラスミドＢａｍ３５Ｓ−Ａｃについてホモ接合性で
あり、かつトランスポザーゼ活性を発現する初代親植物（株Ｒ２−１−１）を産
生するために自家受粉させた。図３に示したプラスミドＤｓ３７８−ＧＵＳ、お
よび図６に示したＤｓ−ＬＵＣは、例３に記載されるように「マイクロトム」に
形質転換された。形質転換体は、Ｔ−ＤＮＡ中にドナーＤｓを含有する一連の植
物を生じさせるように自家受粉させた。Ｆ１種子を産生させるために、トランス
ポザーゼとＤｓ植物を交雑させた。Ｆ１植物は、選択なしに成長させ、Ｆ２種子
を産生させるために自家受粉させた。Ｆ２種子は、例３に記載されるように、ク
ロロスルフロン（chlorosulfuron）、ヒグロマイシンおよびＮＡＭを含有する寒
天に基づく培地中でＦ２実生を成長させることにより、安定な転位事象について
選択した。独立した転位事象に対応するＦ２植物を成長させて、優性突然変異に
ついてスクリーニングした。Ｆ２植物を自家受粉させて、各ファミリーが、単一
のＦ２植物に由来する１２個のＦ３植物からなるＦ３ファミリーを、劣性突然変
異についてスクリーニングした。
イクロトム（Micro-Tom）」が選択した。「マイクロトム」は、例３に記載され る形質転換方法により、図３に図示されるプラスミドＢａｍ３５Ｓ−Ａｃで形質
転換した。形質転換体は、プラスミドＢａｍ３５Ｓ−Ａｃについてホモ接合性で
あり、かつトランスポザーゼ活性を発現する初代親植物（株Ｒ２−１−１）を産
生するために自家受粉させた。図３に示したプラスミドＤｓ３７８−ＧＵＳ、お
よび図６に示したＤｓ−ＬＵＣは、例３に記載されるように「マイクロトム」に
形質転換された。形質転換体は、Ｔ−ＤＮＡ中にドナーＤｓを含有する一連の植
物を生じさせるように自家受粉させた。Ｆ１種子を産生させるために、トランス
ポザーゼとＤｓ植物を交雑させた。Ｆ１植物は、選択なしに成長させ、Ｆ２種子
を産生させるために自家受粉させた。Ｆ２種子は、例３に記載されるように、ク
ロロスルフロン（chlorosulfuron）、ヒグロマイシンおよびＮＡＭを含有する寒
天に基づく培地中でＦ２実生を成長させることにより、安定な転位事象について
選択した。独立した転位事象に対応するＦ２植物を成長させて、優性突然変異に
ついてスクリーニングした。Ｆ２植物を自家受粉させて、各ファミリーが、単一
のＦ２植物に由来する１２個のＦ３植物からなるＦ３ファミリーを、劣性突然変
異についてスクリーニングした。
【００８８】 既知のヌクレオチド配列（標的）中へのＤｓ挿入を含有する突然変異ミニ植物
を同定した。ＤＮＡは、Ｆ２植物の葉から抽出した。トランスポゾンＤｓのヌク
レオチド配列に対応する第１のプライマー、および標的ヌクレオチド配列のヌク
レオチド配列に対応する第２のプライマーでスクリーニングすることにより、こ
れらのＤＮＡ試料をＰＣＲに付した。第１のプライマーおよび第２のプライマー
によりＰＣＲ産物を産生する植物を同定し分析して、植物の表現型に及ぼす、目
的のヌクレオチド配列中へのトランスポゾン挿入の効果を決定した。
を同定した。ＤＮＡは、Ｆ２植物の葉から抽出した。トランスポゾンＤｓのヌク
レオチド配列に対応する第１のプライマー、および標的ヌクレオチド配列のヌク
レオチド配列に対応する第２のプライマーでスクリーニングすることにより、こ
れらのＤＮＡ試料をＰＣＲに付した。第１のプライマーおよび第２のプライマー
によりＰＣＲ産物を産生する植物を同定し分析して、植物の表現型に及ぼす、目
的のヌクレオチド配列中へのトランスポゾン挿入の効果を決定した。
【００８９】 例５：Ｄｓ−ルシフェラーゼ Ｄｓ−ルシフェラーゼと呼ばれる遺伝子捕捉のためのＤＮＡ作成体を、図６に
示す。Ａｃに類似した配列は灰色で示され、末端反転繰り返しは灰色の矢印で示
す。作成体は、これらの各Ｔ−ＤＮＡの右（ＲＢ）および左（ＬＢ）境界が両側
に位置する。ルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）は、ヌクレオチド１〜２５２のＡ
ｃ左末端に融合させる。この領域は、末端反転繰り返しを含有するが、プロモー
ターを欠いている。カナマイシン（Ｋａｎr）またはヒグロマイシンに対する耐 性は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはアミノシクリトールホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子により与えられ、クロロスルフロン耐性（クロロスル
フロンr）は、Ｄｓ３７８−ＧＵＳ含有作成体からのＤｓ成分の切除、および３ ５Ｓプロモーターによるアラビドプシス（Arabidopsis）（フェデロフ（Federof
f）とスミス（Smith）、１９９３）からの突然変異アセト乳酸シンターゼ遺伝子
の活性化により得られる。ＢＡＲ遺伝子は、除草剤のバスタ（Basta）に対する 耐性を与える。
示す。Ａｃに類似した配列は灰色で示され、末端反転繰り返しは灰色の矢印で示
す。作成体は、これらの各Ｔ−ＤＮＡの右（ＲＢ）および左（ＬＢ）境界が両側
に位置する。ルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）は、ヌクレオチド１〜２５２のＡ
ｃ左末端に融合させる。この領域は、末端反転繰り返しを含有するが、プロモー
ターを欠いている。カナマイシン（Ｋａｎr）またはヒグロマイシンに対する耐 性は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはアミノシクリトールホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子により与えられ、クロロスルフロン耐性（クロロスル
フロンr）は、Ｄｓ３７８−ＧＵＳ含有作成体からのＤｓ成分の切除、および３ ５Ｓプロモーターによるアラビドプシス（Arabidopsis）（フェデロフ（Federof
f）とスミス（Smith）、１９９３）からの突然変異アセト乳酸シンターゼ遺伝子
の活性化により得られる。ＢＡＲ遺伝子は、除草剤のバスタ（Basta）に対する 耐性を与える。
【００９０】 プラスミドＤｓ−ルシフェラーゼは、以下のように作成した：Ｄｓ３７８−Ｇ
ＵＳ中のＤｓ成分（図３）を、Ａｃ境界の間にルシフェラーゼとカナマイシン耐
性遺伝子を両方を含有する、上述した図６に示すＤｓ成分により置換した。次に
３５Ｓプロモーター−Ｄｓ−ＡＬＳ Ａｓｐ７１８断片を、二元ベクターＳＬＪ
５２５（英国、ノリッジのジョナサン・ジョーンズ博士（Dr. Jonathan Jones）
から得た）中にクローン化した。プラスミドＤｓ−ルシフェラーゼを、図３に記
載したミニトマト栽培品種「マイクロトム（Micro-Tom）」に形質転換した。
ＵＳ中のＤｓ成分（図３）を、Ａｃ境界の間にルシフェラーゼとカナマイシン耐
性遺伝子を両方を含有する、上述した図６に示すＤｓ成分により置換した。次に
３５Ｓプロモーター−Ｄｓ−ＡＬＳ Ａｓｐ７１８断片を、二元ベクターＳＬＪ
５２５（英国、ノリッジのジョナサン・ジョーンズ博士（Dr. Jonathan Jones）
から得た）中にクローン化した。プラスミドＤｓ−ルシフェラーゼを、図３に記
載したミニトマト栽培品種「マイクロトム（Micro-Tom）」に形質転換した。
【００９１】 Ｄｓ−ルシフェラーゼの独立した転位を含有する全体で１，０００個の植物を
栽培した。実生、花および果実のような植物器官を、ルシフェラーゼ発現につい
てスクリーニングした。スクリーニングは、１mMルシフェリンで植物組織を噴霧
し、続いて全くの暗闇でイメージングさせることにより行った。イメージングは
、超低光シグナルを検出することができる冷却ＣＣＤプリンストンインストルメ
ント（Princeton Instrument）カメラにより行った。暗闇で輝く、すなわち種々
の組織でルシフェラーゼを発現する１００個の植物を、図７に図示すように検出
した。スクリーニングした１，０００個の植物の中で、１個の植物が、普通条件
下で実生中でルシフェラーゼを発現したが、冷却処理により抑制された（図７、
下のパネル）。非常に特異的な型のプロモーターまたはエンハンサーを検出する
ために、変異体の大きな集団をスクリーニングする必要がある。
栽培した。実生、花および果実のような植物器官を、ルシフェラーゼ発現につい
てスクリーニングした。スクリーニングは、１mMルシフェリンで植物組織を噴霧
し、続いて全くの暗闇でイメージングさせることにより行った。イメージングは
、超低光シグナルを検出することができる冷却ＣＣＤプリンストンインストルメ
ント（Princeton Instrument）カメラにより行った。暗闇で輝く、すなわち種々
の組織でルシフェラーゼを発現する１００個の植物を、図７に図示すように検出
した。スクリーニングした１，０００個の植物の中で、１個の植物が、普通条件
下で実生中でルシフェラーゼを発現したが、冷却処理により抑制された（図７、
下のパネル）。非常に特異的な型のプロモーターまたはエンハンサーを検出する
ために、変異体の大きな集団をスクリーニングする必要がある。
【００９２】 （参考文献） Allen et al. (1993)「ポリメラーゼチェイン反応の使用および増幅産物の検 出」, Methods in Molecular Blology, Vol 15: PCR Protocols: Current Metho
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【図１】 図１は、異なる栽培条件に対する「マイクロトム（Micro-Tom）」の応答を示 す。
【図２】 図２は、「マイクロトム（Micro-Tom）」野生型と突然変異表現型を示す。
【図３】 図３は、「マイクロトム（Micro-Tom）」に形質転換された作製体の略図を示 す。
【図４】 図４は、転位選択に使用されるマーカーを含有する植物の選択の結果を示す。
【図５】 図５は、クロロスルフロン耐性（Ｃｈｌr）およびヒグロマイシン耐性（Ｈｙ ｇr）植物のサザンブロットの結果を示す。
【図６】 図６は、プラスミドＤｓ−ルシフェラーゼ（Ｄｓ−ＬＵＣ）の略図を示す。
【図７】 図７は、種々の植物器官で発現される遺伝子中へのＤｓ−ルシフェラーゼ（Ｄ
ｓ−ＬＵＣ）挿入の結果を示す。
ｓ−ＬＵＣ）挿入の結果を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月１３日（２０００．３．１３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７４】 （４）DNA解析。デポルタ（Dellaporta）法（デラポルタ（Dellaporta）ら、 １９８３）に従って、フェノールクロロホルム抽出を追加して、若い葉からＤＮ
Ａを抽出した。製造業者の勧める条件に従ってプロメガ（Promega）のＴａｑポ リメラーゼを使用して、ＭＪサーマルサイクラー中で２．５mM ＭｇＣｌ2、お よび２００μＭ ｄＮＴＰを用いて、ＰＣＲ反応を行なった。以下のプログラム
を使用した：９４℃で変性２分、そして９４℃で１分、５５℃で４５分、７２℃
で１分を３０サイクル、最後に７２℃で５分を１工程。Ｄｓ切除産物を増幅する
のに使用したプライマーは：ｐｒ２、５’ＧＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＴＴＧＴＧＣ
ＧＴＣ３’（配列番号１）（これは、３５Ｓプロモーター中の配列に相補的であ
る）およびｐｒ１、５’ＧＧＡＴＧＡＴＴＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡ３’（配列
番号２）（これは、ＡＬＳ遺伝子中の配列に相補的である）（図３）。切除生成
物の予測されたサイズ（約３２２塩基対）のバンドをアガロースゲルから抽出し
、製造業者の説明書に従ってゲンクリーン（GenClean）を使用してＤＮＡを精製
した。これらのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ（Promega））中 にクローン化し、Ｔ７またはＳＰ６プライマーを使用して配列決定した。サザン
解析のために、２μgのゲノムＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化し、０．８％アガロー
スゲルで分画し、ＭＳＩから購入したニトロセルロース膜に移した。製造業者の
説明書に従ってハイブリダイゼーションを行なった。１kbの内部ＧＵＳ断片をＰ
ＣＲで増幅し、ランダムプライミング法（フェインバーグ（Feinberg）とフォー
ベルスタイン（Vogelsterin）、１９８３））により放射能標識し、Ｄｓ検出の ためのプローブとして使用した。
Ａを抽出した。製造業者の勧める条件に従ってプロメガ（Promega）のＴａｑポ リメラーゼを使用して、ＭＪサーマルサイクラー中で２．５mM ＭｇＣｌ2、お よび２００μＭ ｄＮＴＰを用いて、ＰＣＲ反応を行なった。以下のプログラム
を使用した：９４℃で変性２分、そして９４℃で１分、５５℃で４５分、７２℃
で１分を３０サイクル、最後に７２℃で５分を１工程。Ｄｓ切除産物を増幅する
のに使用したプライマーは：ｐｒ２、５’ＧＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＴＴＧＴＧＣ
ＧＴＣ３’（配列番号１）（これは、３５Ｓプロモーター中の配列に相補的であ
る）およびｐｒ１、５’ＧＧＡＴＧＡＴＴＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡ３’（配列
番号２）（これは、ＡＬＳ遺伝子中の配列に相補的である）（図３）。切除生成
物の予測されたサイズ（約３２２塩基対）のバンドをアガロースゲルから抽出し
、製造業者の説明書に従ってゲンクリーン（GenClean）を使用してＤＮＡを精製
した。これらのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ（Promega））中 にクローン化し、Ｔ７またはＳＰ６プライマーを使用して配列決定した。サザン
解析のために、２μgのゲノムＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化し、０．８％アガロー
スゲルで分画し、ＭＳＩから購入したニトロセルロース膜に移した。製造業者の
説明書に従ってハイブリダイゼーションを行なった。１kbの内部ＧＵＳ断片をＰ
ＣＲで増幅し、ランダムプライミング法（フェインバーグ（Feinberg）とフォー
ベルスタイン（Vogelsterin）、１９８３））により放射能標識し、Ｄｓ検出の ためのプローブとして使用した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 レビイ、アブラハム、エイ イスラエル国 レホボト、ネベ メツ ４、 ワイツマン インスチチュート オ ブ サイエンス (72)発明者 マイスナー、ラファエル イスラエル国 レホボト、モルデイ ハゲ タオト 10 (72)発明者 エルキンド、ヨナタン イスラエル国 レホボト、シムヒ ストリ ート ７ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AA03 AD14 CA06 CA08 CA10 CB02 CD03 CD06 CD10 4B024 AA08 AA11 CA01 CA20 DA01 FA02 FA06 FA10 GA11 GA17 GA25
Claims (44)
- 【請求項１】 所望の形質を有する突然変異ミニ植物の選択方法であって、 （ａ）ミニ植物は、（ｉ）同じ種の市販の植物に比較してサイズが小さいこと
；（ii）成熟して、同じ種の市販の植物に使用される標準的栽培条件より少なく
とも１０倍高い植物密度で、生きた種子または塊茎を産生すること；および（ii
i）同じ種の市販の植物と交配させることができること、という特徴を有する、 ミニ植物集団を提供する工程； （ｂ）ミニ植物を突然変異誘導物質で処理して突然変異ミニ植物集団を産生す
ることにより、ミニ植物集団中で突然変異ミニ植物を作成する工程；および （ｃ）突然変異ミニ植物集団内で所望の形質を有する突然変異ミニ植物を選択
する工程、 を含んでなる上記方法。 - 【請求項２】 ミニ植物の集団は、自然の突然変異または誘導した突然変異
（遺伝子操作または植物成長因子で処理することにより誘導）により作成される
、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 ミニ植物はミニトマト栽培品種である、請求項２記載の方法
。 - 【請求項４】 食物、繊維、または花を産生するのに、同じ種の市販の植物
が使用される、請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 同じ種の市販の植物は、液果タイプの果実またはナス科（So
lanaceae）の植物を産生する植物である、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 市販の植物は、トマト、ブドウ、プルーン、ナス、カンキツ
類果実、リンゴから選択される液果タイプの果実を産生する、請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】 工程（ｂ）の突然変異誘導物質は、メタンスルホン酸エチル
（ＥＭＳ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（
ＭＮＵ）、およびブレオマイシン類よりなる群から選択される化学突然変異誘発
物質である、請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 工程（ｂ）の突然変異誘導物質は、ＵＶ、γ線、Ｘ線、およ
び高速ニュートロンよりなる群から選択される放射線である、請求項１記載の方
法。 - 【請求項９】 工程（ｂ）の突然変異誘導物質は、Ｔ−ＤＮＡおよび輸送可
能成分よりなる群から選択される可動性ＤＮＡ配列である、請求項１記載の方法
。 - 【請求項１０】 輸送可能成分は、自律性トランスポゾン、非自律性トラン
スポゾン、および自律性／非自律性トランスポゾン系よりなる群から選択される
、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 輸送可能成分は、トウモロコシＡｃ／Ｄｓ輸送可能成分で
ある、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 請求項１〜１１までのいずれか１項に記載の方法により選
択される、突然変異ミニ植物。 - 【請求項１３】 ミニ植物はミニトマト栽培品種である、請求項１２記載の
突然変異ミニ植物。 - 【請求項１４】 集団のミニ植物は、以下の特徴を有する突然変異ミニ植物
集団：（ｉ）同じ種の市販の植物に比較してサイズが小さいこと；（ii）成熟し
て、同じ種の市販の植物に使用される標準的栽培条件より少なくとも１０倍高い
密度で、生きた種子または塊茎を産生すること；（iii）同じ種の市販の植物と 交配させることができること；および（iv）化学突然変異誘発物質、放射線、お
よび可動性ＤＮＡ配列よりなる群から選択される物質により誘導される突然変異
を有すること。 - 【請求項１５】 食物、繊維、または花を産生するのに、同じ種の市販の植
物が使用される、請求項１４記載の突然変異ミニ植物集団。 - 【請求項１６】 同じ種の市販の植物は、液果タイプの果実またはナス科（
Solanaceae）の植物を産生する植物である、請求項１５記載の突然変異ミニ植物
集団。 - 【請求項１７】 市販の植物は、トマト、ブドウ、プルーン、ナス、カンキ
ツ類果実、リンゴから選択される液果タイプの果実を産生する、請求項１６記載
の突然変異ミニ植物集団。 - 【請求項１８】 目的の遺伝子中に挿入された可動性ＤＮＡ配列を含有する
ミニ植物の同定方法であって、 （ａ）ミニ植物は、（ｉ）同じ種の市販の植物に比較してサイズが小さいこと
；（ii）成熟して、同じ種の市販の植物に使用される標準的栽培条件より少なく
とも１０倍高い植物密度で、生きた種子または塊茎を産生すること；および（ii
i）同じ種の市販の植物と交配させることができること、という特徴を有する、 ミニ植物集団を提供する工程； （ｂ）該植物を可動性ＤＮＡ配列で処理して、ミニ植物集団中で突然変異植物
を作成する工程；そして （ｃ）可動性ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列に対応する第１のプライマーと、
目的の遺伝子のヌクレオチド配列に対応する第２のプライマーとを使用して、Ｐ
ＣＲにより、突然変異植物から抽出されるＤＮＡをスクリーニングする工程；お
よび （ｄ）第１のプライマーと第２のプライマーの存在下でＰＣＲ産物を産生する
ＤＮＡからなるミニ植物を同定する工程、 を含んでなる上記方法。 - 【請求項１９】 ミニ植物はミニトマト栽培品種である、請求項１８記載の
方法。 - 【請求項２０】 可動性ＤＮＡ配列は、Ｔ−ＤＮＡまたは輸送可能成分より
なる群から選択される、請求項１８記載の方法。 - 【請求項２１】 輸送可能成分は、トウモロコシＡｃ／Ｄｓ輸送可能成分で
ある、請求項２０記載の方法。 - 【請求項２２】 ミニ植物の突然変異体集団の産生方法であって、 （ａ）ミニ植物は、（ｉ）同じ種の市販の植物に比較してサイズが小さいこと
；（ii）成熟して、同じ種の市販の植物に使用される標準的栽培条件より少なく
とも１０倍高い植物密度で、生きた種子または塊茎を産生すること；および（ii
i）同じ種の市販の植物と交配させることができること、という特徴を有する、 ミニ植物集団を提供する工程；および （ｂ）該植物を突然変異誘導物質で処理して、ミニ作物栽培品種の突然変異体
集団を産生することにより、ミニ植物集団中で突然変異植物を作成する工程 を含んでなる上記方法。 - 【請求項２３】 ミニ植物の集団は、自然の突然変異または誘導した突然変
異（遺伝子操作または植物成長因子で処理することにより誘導）により作成され
る、請求項２２記載の方法。 - 【請求項２４】 工程（ｂ）の突然変異誘導物質は、メタンスルホン酸エチ
ル（ＥＭＳ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、メチル−Ｎ−ニトロソ尿素
（ＭＮＵ）、およびブレオマイシン類よりなる群から選択される化学突然変異誘
発物質である、請求項２２記載の方法。 - 【請求項２５】 工程（ｂ）の突然変異誘導物質は、ＵＶ、γ線、Ｘ線、お
よび高速ニュートロンよりなる群から選択される放射線である、請求項２２記載
の方法。 - 【請求項２６】 工程（ｂ）の突然変異誘導物質は、Ｔ−ＤＮＡまたは輸送
可能成分よりなる群から選択される可動性ＤＮＡ配列である、請求項２２記載の
方法。 - 【請求項２７】 突然変異誘導物質はＴ−ＤＮＡであり、ミニ植物はアグロ
バクテリウム（Agrobacterium）で感染され、こうして各形質転換体が異なるゲ ノム位置にＴ−ＤＮＡ挿入体を含有する複数の形質転換体が産生される、請求項
２６記載の方法。 - 【請求項２８】 突然変異誘導物質はトランスポゾンであり、突然変異ミニ
植物集団は、活性転位系を含有するミニ植物の子孫から得られる、請求項２６記
載の方法。 - 【請求項２９】 活性転位系は、植物本来のトランスポゾン、または遺伝子
操作技術により植物中に導入されるトランスポゾンである、請求項２８記載の方
法。 - 【請求項３０】 活性転位系は、自律性トランスポゾンと、非自律性トラン
スポゾンを含有する植物をトランスポザーゼ源または自律性トランスポゾンを含
有する植物と交配して得られる輸送可能成分とから選択される、請求項２９記載
の方法。 - 【請求項３１】 輸送可能成分はトウモロコシＡｃ／Ｄｓトランスポゾン系
を含む、請求項２９記載の方法。 - 【請求項３２】 ミニ植物はミニトマト栽培品種である、請求項２２〜３１
に記載の方法。 - 【請求項３３】 植物遺伝子発現を制御するヌクレオチド配列の同定方法で
あって、 （ａ）ミニ植物をＤＮＡ作製体で形質転換して、ランダムに突然変異誘発した
植物の集団を産生する工程（ここでＤＮＡ作製体は、プロモーターが欠如してい
るかまたは最小のプロモーターを含有するスクリーニング可能なマーカーをコー
ドする遺伝子配列を含み、該遺伝子配列は可動性ＤＮＡ配列の境界内にクローン
化され、該ミニ植物は、（ｉ）同じ種の市販の植物に比較してサイズが小さいこ
と；（ii）成熟して、同じ種の市販の植物に使用される標準的栽培条件より少な
くとも１０倍高い植物密度で、生きた種子または塊茎を産生すること；および（
iii）同じ種の市販の植物と交配させて、ランダムに突然変異誘発した植物を産 生することができること、という特徴を有する）； （ｂ）該ＤＮＡ作製体で形質転換され、該スクリーニング可能なマーカーを発
現する植物集団内でミニ植物を同定する工程；および （ｃ）工程（ｂ）で同定されるミニ植物から単離される総ＤＮＡからのスクリ
ーニング可能なマーカーをコードする遺伝子に機能的に結合したヌクレオチド配
列をクローン化する工程、 を含んでなる上記方法。 - 【請求項３４】 スクリーニング可能なマーカーはＧＵＳとルシフェラーゼ
から選択される、請求項３３記載の方法。 - 【請求項３５】 可動性ＤＮＡ配列はＴ−ＤＮＡまたは輸送可能成分である
、請求項３３または３４記載の方法。 - 【請求項３６】 植物遺伝子発現を制御するヌクレオチド配列は、プロモー
ターまたはエンハンサーである、請求項３３記載の方法。 - 【請求項３７】 所望の形質を有する市販の植物の突然変異体集団を産生す
る方法であって、 （ａ）所望の形質を有する請求項１記載の方法に従って選択される突然変異ミ
ニ植物を、同じ種の市販の植物と交配させる工程、および （ｂ）市販の親植物に似ており所望の形質を発現する子孫を選択する工程 を含んでなる上記方法。 - 【請求項３８】 食物、繊維、または花を産生するのに、市販の植物が使用
される、請求項３７記載の方法。 - 【請求項３９】 市販の植物は、液果タイプの果実またはナス科（Solanace
ae）の植物を産生する植物である、請求項３８記載の方法。 - 【請求項４０】 市販の植物は、トマト、ブドウ、プルーン、ナス、カンキ
ツ類果実、リンゴから選択される液果タイプの果実を産生する、請求項３９記載
の方法。 - 【請求項４１】 請求項３７記載の方法により産生される所望の形質を有す
る市販の植物。 - 【請求項４２】 食物、繊維、または花を産生するのに使用される、請求項
４１記載の市販の植物。 - 【請求項４３】 液果タイプの果実またはナス科（Solanaceae）の植物を産
生する、請求項４２記載の市販の植物。 - 【請求項４４】 市販の植物は、トマト、ブドウ、プルーン、ナス、カンキ
ツ類果実、リンゴから選択される液果タイプの果実を産生する、請求項４３記載
の方法。
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