JP3283850B2 - 花成制御遺伝子と花成制御方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物の花成制御遺
伝子および該遺伝子の発現を制御することによる植物の
花成を制御する方法に関する。さらに、本発明は、該遺
伝子の発現を制御することにより野生型植物体と比較し
て花成の時期が改変されたトランスジェニック植物体お
よびその作出に関する。

【０００２】

【従来の技術】世界的な食糧問題を解決するために、バ
イオテクノロジーの手法を用いた食料増産技術の開発が
望まれている。主要な食料の一つである農作物の中で、
穀物は、植物の種子であり、また野菜の一部はその果実
を利用するため、これらの植物における生産性の増大に
とって、植物の生長を調節するための花成の制御は重要
なキーテクノロジーとなる。一方、葉や根などの栄養器
官を利用する野菜の場合は、栄養器官の生長の停止を防
ぐために、花成を抑制することが生産性増大につながる
ことが多い。また、多くの農作物では環境に対する遺伝
的な花成挙動の種における特異性により、栽培適地が制
限されているため、花成の制御によりこのような性質を
改変することができれば、栽培適地の拡大につながる可
能性がある。

【０００３】シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）
やキンギョソウ（Antirrhinum majas）といったモデル
植物を用いた分子遺伝学的研究において、花芽分裂組織
のアイデンティティー決定や、花器官の形態形成に関す
る遺伝子が多数単離されている。これらの遺伝子のう
ち、LEAFYまたは、APETALA−１遺伝子を、シロイヌナズ
ナやポプラに導入し、強制的に発現させることによって
花成を早めることが可能なことが知られているが、これ
らの技術は、用いた遺伝子が、花芽形成すなわち栄養生
長から生殖生長への変換に関わる根源的な遺伝子ではな
いため、それらの遺伝子のみで花成を任意に制御できる
ものではない。またこれらの遺伝子機能の抑制を行う
と、変異体の形質から明らかなように、花序の形態が変
化してしまい、花成の抑制を行うことはできない。

【０００４】一方、シロイヌナズナでは、発芽直後に花
成が起こるembryonic flower変異体が知られている（Su
ngら(1992), Science, vol.258:p1645-）。この変異体
では発芽後、一定期間の栄養生長を維持する遺伝子の機
能が損なわれていると考えられる。この遺伝子の発現に
より、野生型シロイヌナズナでは、花成が抑制されてい
ると考えられる。この遺伝子については、染色体上の大
まかな位置は報告されている（Yangら(1995), Dev. Bio
l., vol.169:p421-）ものの、その結果は、遺伝子の単
離に資するには程遠いものであった。もちろん、該遺伝
子は未だ単離されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】花成を制御する根源的
な遺伝子が単離できれば、これを人為的に制御すること
によって花成の時期の任意な制御が可能となる。本発明
はこのような技術的背景に基づきなされたものであり、
その目的は、花成制御遺伝子を単離し、これを導入した
トランスジェニック植物を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意検討を重ねた結果、花成制御遺伝子
の機能が損なわれたことにより発芽直後に花成が起こる
突然変異体シロイヌナズナを分離し、この変異の原因と
なる単一の遺伝子を、広大な染色体領域において同定
し、単離することに成功した。また、得られた遺伝子を
シロイヌナズナに導入し発現させることにより、この遺
伝子が花成を抑制する機能を有することを確認し、これ
らの知見に基づき本発明を完成した。

【０００７】また、シロイヌナズナ花成制御遺伝子の配
列を基に、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術を
用いて、任意の植物種から単離される花成制御遺伝子
が、シロイヌナズナ超早期花成変異体の変異を相補して
花成を抑制し、茎葉の正常な分化を誘導する機能を有し
ていることを見出した。すなわち、本発明は、広く植物
に存在する新規な花成制御遺伝子、該遺伝子がコードす
る花成制御活性を有する蛋白質、該遺伝子の発現が改変
されたトランスジェニック植物およびその作出、並びに
該遺伝子の発現を制御することによる、植物の花成の時
期を任意に制御する方法に関し、より具体的には、 （１） 配列番号：１に示されたアミノ酸配列からなる
花成抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 （２） 配列番号：１に示されたアミノ酸配列の幾つか
のアミノ酸残基について、欠失、置換、付加および／ま
たは挿入の変化が生じたアミノ酸配列からなり、かつ花
成抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 （３） 配列番号：２に示された塩基配列のコード領域
を含む、（１）に記載のＤＮＡ。 （４） 配列番号：２に示された塩基配列からなるＤＮ
Ａと50℃で6×SSC、0.1％SDS溶液においてハイブリダイ
ズし、かつ花成抑制活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ。 （５） 配列番号：８に示されたアミノ酸配列からなる
花成抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 （６） 配列番号：８に示されたアミノ酸配列の幾つか
のアミノ酸残基について、欠失、置換、付加および／ま
たは挿入の変化が生じたアミノ酸配列からなり、かつ花
成抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 （７） 配列番号：９に示された塩基配列のコード領域
を含む、（５）に記載のＤＮＡ。 （８） 配列番号：９に示された塩基配列からなるＤＮ
Ａと50℃で6×SSC、0.1％SDS溶液においてハイブリダイ
ズし、かつ花成抑制活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ。 （９） ジンクフィンガー構造を有するタンパク質をコ
ードする、（１）〜（８）のいずれかに記載のＤＮＡ。 （１０） （１）〜（９）のいずれかに記載のＤＮＡを
含む発現カセットを含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子。 （１１） 以下のi)〜iii)の構成要素を含む発現カセッ
トを含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子。 i) 植物細胞内で転写可能なプロモーター、 ii) 該プロモーターにアンチセンス方向で結合した
（１）〜（９）のいずれかに記載のＤＮＡ、および選択
的に、 iii) ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関
し、植物で機能するシグナル。 （１２） （１０）に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子が
導入された形質転換細胞。 （１３） （１１）に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子が
導入されたトランスジェニック植物細胞。 （１４） （１３）に記載のトランスジェニック植物細
胞を含むトランスジェニック植物体。 （１５） （１４）に記載のトランスジェニック植物体
の作製方法であって、 （ａ）（１１）に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子を植物
細胞に導入する工程、および （ｂ）該植物細胞を再生する工程、を含む方法。 （１６） （１）〜（９）のいずれかに記載のＤＮＡの
転写産物の全体に相補的なアンチセンスＲＮＡをコード
するＤＮＡ。

【０００８】なお、本発明において「発現カセット」と
は、遺伝子とその発現を保証する構成要素からなるDNA
分子を指す。典型的には、(i)宿主内で構造遺伝子を発
現させるためのプロモーター、(ii)構造遺伝子、(iii)
必要に応じてターミネーターを含むDNA分子である。該
プロモーターは、宿主に応じて変動する。例えば、組換
え蛋白質を微生物内で生産するためには、これら微生物
内での発現を保証するプロモーターを用いる。また、例
えば、トランスジェニック植物の作出のためには、植物
細胞内での発現を保証するプロモーターを用いる。「発
現カセットを含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子」としては、
典型的には、発現カセットを含むベクターが挙げられ
る。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明は、植物において花成を制
御する新規な蛋白質および該蛋白質をコードするDNAを
提供する。本発明者らにより単離された、シロイヌナズ
ナ由来の「MPC1」cDNAの塩基配列を配列番号：２に、ゲ
ノムDNAの塩基配列を配列番号：３に示す。また、これ
らcDNAやゲノムDNAによりコードされるシロイヌナズナ
由来の「MPC1」蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：1に
示す。本発明者らにより単離された、イネ由来の「O_S-M
PC1」cDNAの塩基配列を配列番号：9に、ゲノムDNAの塩
基配列を配列番号：10に示す。また、これらcDNAやゲノ
ムDNAによりコードされるイネ由来の「O_S-MPC1」蛋白質
のアミノ酸配列を配列番号：8に示す。

【００１０】本発明者らにより見出されたシロイヌナズ
ナ由来の「MPC1」遺伝子は、その変異により植物におい
て正常な花成制御能を消失させ、発芽直後に植物を花成
に至らしめる（超早期花成変異）。本発明者らは、「mp
c1」変異植物体において、「MPC1」ゲノムDNA（配列番
号：３）のヌクレオチド番号5039位の塩基グアニンのア
デニンへの置換を見出している(実施例１)。この塩基置
換によって「MPC1」蛋白質の541番目のアミノ酸残基以
降が翻訳されなくなることから、この変異点以降のアミ
ノ酸配列の欠失が、「MPC1」蛋白質の正常な花成制御機
能、すなわち花成抑制機能を損なわせて、植物体を超早
期花成に至らしめるものと考えられる。この現象は、植
物におけるアンチセンスDNAの導入および発現による、
「MPC1」蛋白質の発現抑制によっても誘導された（実施
例２）。また、該シロイヌナズナcDNAに有意な相同性を
示すcDNAとして本発明者らにより見出されたイネ由来の
「O_S-MPC1」cDNAもまた、シロイヌナズナの超早期花成
変異を相補した（実施例５）。従って、これら蛋白質
は、広く植物に存在し、その花成の時期を制御する蛋白
質であると考えられる。

【００１１】シロイヌナズナをはじめとする多くの植物
においては、発芽後、一定期間の栄養生長を経て、花成
が起こり生殖生長を行う。これら本発明の遺伝子は栄養
生長の維持に必須であり、この遺伝子の発現量によっ
て、栄養生長から生殖生長への変換、すなわち花成が制
御されていると考えられる。従って、本発明の遺伝子の
発現を人為的に制御することで、植物における花成の時
期を改変し、これにより例えば、有用植物の生産性の向
上などを図ることができる。

【００１２】このような目的に利用しうるDNAとして
は、上記のシロイヌナズナ由来の「MPC1」またはイネ由
来の「O_S-MPC1」タンパク質をコードするDNAに限られな
い。これら蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードする
他のDNAを用いることが可能である。

【００１３】このようなDNAとしては、例えば、シロイ
ヌナズナ由来の「MPC1」またはイネ由来の「O_S-MPC1」
蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：1、配列番号：8で表
されるアミノ酸配列）と実質的に同一なアミノ酸配列を
有する蛋白質をコードするDNAが挙げられる。ここで
「実質的に同一なアミノ酸配列」とは、対照となるアミ
ノ酸配列の幾つかのアミノ酸残基について、欠失、置
換、付加および／または挿入等の変化が生じた配列であ
って、対照アミノ酸配列から成る蛋白質と同一な作用効
果、即ち、植物の花成制御活性を有する蛋白質を構成す
るアミノ酸配列をいう。幾つかのアミノ酸残基について
欠失、置換、付加等の変化を起こさせることは、例え
ば、部位特異的変異誘発法（Kunkelら(1985), Proc. Na
tl. Acad. Sci.USA, vol.82:p488-）により行うことが
できる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じ
うる。

【００１４】本発明者らが見出したシロイヌナズナとイ
ネの花成制御活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を比較
したところ、特にジンクフィンガーモチーフを含む領域
及びC末端側の酸性アミノ酸クラスターを含む領域にお
いて高い相同性が見出された。ジンクフィンガー、また
はジンクフィンガー構造とは、蛋白質の一部が亜鉛（Z
n）をキレートした状態で折りたたまれて指のように突
出した構造をとったもので、該蛋白質が核酸や他の蛋白
質と結合する場合に重要な働きをすると考えられている
（Roosenfeldら (1993), J.Biomol.Struct.Dyn.,Vol.1
1:p557-）。ジンクフィンガー構造をとり得るアミノ酸
配列をジンクフィンガーモチーフと呼び、いくつかのタ
イプが知られているが、本発明者らが見出したシロイヌ
ナズナ由来の「MPC1」及びイネ由来の「Os-MPC1」蛋白
質には、Cys2-His2（C2H2）タイプのジンクフィンガー
が、それぞれ306番目から327番目までのアミノ酸配列、
及び310番目から331番目までのアミノ酸配列として認め
られる。これらモチーフは、例えば京都大学化学研究所
がインターネットを通じて提供している「ゲノムネッ
ト」（http://www.genome.ad.jp/）の「MOTIF」等のプ
ログラムによって同定することができる。酸性アミノ酸
クラスターは、ある種の転写制御蛋白質に認められ、転
写の活性化に重要な働きをしている場合がある（田村隆
明著「転写制御のメカニズム」（実験医学バイオサイエ
ンス）1995年刊 羊土社）。このような酸性アミノ酸ク
ラスターは、シロイヌナズナ由来の「MPC1」蛋白質及び
イネ由来の「Os-MPC1」蛋白質において、それぞれ503番
目から520番目までのアミノ酸配列、及び488番目から50
5番目までのアミノ酸配列として認められる。これらジ
ンクフィンガーモチーフを含む領域や酸性アミノ酸クラ
スターを含む領域は、これら蛋白質の機能発現、すなわ
ち植物の花成制御に重要な役割を担う可能性が有り、こ
れらシロイヌナズナやイネ以外の植物に由来する花成制
御関連蛋白質においても、これら領域において高い相同
性が保持されていることが期待される。

【００１５】従って、本発明におけるシロイヌナズナ由
来の「MPC1」またはイネ由来の「O_S-MPC1」蛋白質のア
ミノ酸配列（配列番号：1、配列番号：8で表されるアミ
ノ酸配列）と実質的に同一なアミノ酸配列を有する蛋白
質としては、好ましくは、ジンクフィンガーモチーフを
含む領域およびＣ末端側の酸性アミノ酸クラスターを含
む領域を有する実質的に同一なアミノ酸配列から成る蛋
白質である。

【００１６】具体的には、配列番号：１に示されたアミ
ノ酸配列（シロイヌナズナ）のうち、２７８番目から３
４８番目までのアミノ酸配列、および４６５番目から６
０７番目のアミノ酸配列に対し、それぞれ５０％以上、
及び６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む花成
制御活性を有するタンパク質、または配列番号：８に示
されたアミノ酸配列（イネ）のうち、２８２番目から３
５２番目までのアミノ酸配列、および４５０番目から５
９２番目のアミノ酸配列に対し、それぞれ５０％以上、
及び６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む花成
制御活性を有するタンパク質が挙げられる。

【００１７】蛋白質が花成制御活性を有するか否かにつ
いては、例えば、超早期花成変異体植物に該蛋白質をコ
ードするDNAを導入することにより評価することができ
る。即ち、例えば、シロイヌナズナの「mpc1」のような
超早期花成変異体植物に、被検蛋白質をコードするDNA
を導入し、これを発現させる。これにより実施例５に示
したように、超早期花成変異を相補して正常な茎葉を分
化すれば、用いたDNAは、花成制御活性を有する蛋白質
をコードすると判定できる。このようなDNAは、シロイ
ヌナズナ由来の「MPC1」またはイネ由来の「O_S-MPC1」
蛋白質（配列番号：1、配列番号：8）と同等の機能を有
する蛋白質をコードすると考えられる。

【００１８】また、シロイヌナズナ由来の「MPC1」また
はイネ由来の「O_S-MPC1」タンパク質と機能的に同等な
蛋白質をコードする他のDNAは、配列番号：１または８
に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の全部ま
たは一部をプローブに用いるハイブリダイゼーション技
術（Southern(1975), J. Mol. Biol., vol.98:p503-，
Sambrookら（1989), Molecular Cloning; Cold Spring
Harbor Laboratory Press)を利用して選択することがで
きる。プローブに用いる「MPC1」または「O_S-MPC1」DNA
の部分配列は、少なくとも14以上のヌクレオチド配列で
ある。ハイブリダイゼーションの方法としては、具体的
には、例えばGeneImageシステム（アマシャム社製）を
利用することが可能であり、製品プロトコールに従っ
て、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行
った後、50℃で6×SSC，0.1％SDS溶液で洗浄後、ハイブ
リダイゼーションしたDNAを選択することができる。あ
るいはまた「MPC1」または「O_S-MPC1」蛋白質を構成す
るアミノ酸配列をコードするDNAに特異的にハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたPCR
技術（島本功、佐々木卓治 監修、「植物のPCR実験プロ
トコール」（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ2）
秀潤社 1995年4月発行）を利用して、他の植物からシ
ロイヌナズナ由来の「MPC1」またはイネ由来の「O_S-MPC
1」蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするDNAを単
離することも可能である。

【００１９】このようなハイブリダイゼーション技術や
PCR技術により得られるDNAによりコードされる花成制御
蛋白質は、シロイヌナズナ由来の「MPC1」またはイネ由
来の「O_S-MPC1」蛋白質と高い相同性を有すると考えら
れる。高い相同性とは、これら蛋白質の少なくとも一方
のアミノ酸との比較において45％以上の相同性、好まし
くは60％以上の相同性、さらに好ましくは75％以上の相
同性、さらに好ましくは90%以上の相同性、さらに好ま
しくは95％以上の相同性を指す。ただし、得られるDNA
によっては、コードするアミノ酸の複数の残基が欠失・
付加・置換された結果として上記蛋白質のアミノ酸配列
との相同性が45％以下となることがあるが、なお、花成
制御蛋白質の機能に必須な領域を保持し、同等の花成制
御活性を有する蛋白質をコードしていることも想定され
る。上記したように、特にジンクフィンガーモチーフ領
域およびＣ末端側の酸性アミノ酸クラスターを含む領域
において高い相同性を有することが、タンパク質の機能
において重要であると考えられる。

【００２０】２種以上の遺伝子について、それらの塩基
配列、またはそれらがコードする蛋白質のアミノ酸配列
の相同性を決定するためには、例えば、DNASIS（日立ソ
フトエンジニアリング）等の遺伝子解析用ソフトウェア
を用いることができる。該ソフトウェアでは、２種の遺
伝子間で、相同性を２次元イメージとしてプロットする
「ホモロジープロット」、ギャップを考慮して配列を並
べる「マキシマムマッチング」の各プログラムが相同性
の算定に利用可能である（Needleman,S.B.ら (1970)、
J.Mol.Biol.,Vol48:p443-）。３種以上の配列について
は「マルチプルアラインメント」プログラムを利用し
て、相同な領域が分かるように配列を並べることができ
る（Waterman,M.S. (1986),Nucleic Acid Research,Vol
14:p9095-）。

【００２１】ハイブリダイゼーション技術やPCR技術を
利用してこのようなDNAを単離するための植物として
は、シロイヌナズナやイネ以外に、例えば、トウモロコ
シ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ジャガイモ、タバ
コ、サトウダイコン、サトウキビ、ナタネ、ダイズ、ヒ
マワリ、ワタ、オレンジ、ブドウ、モモ、ナシ、リン
ゴ、ウメ、トマト、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、ニ
ンジン、カボチャ、キュウリ、メロン、パセリ、ラン、
キク、ユリ、サフラン、マツ、ユーカリ、アカシヤ、ポ
プラ、スギ、ヒノキ、タケ、イチイなどが挙げられる
が、これらのみに制限されない。実際に、本発明者ら
は、上述のハイブリダイゼーション技術やPCR技術を駆
使して、サトウダイコンから、シロイヌナズナ由来の
「MPC1」またはイネ由来の「O_S-MPC1」蛋白質と実質的
に同一な蛋白質をコードする花成制御遺伝子を単離する
ことに成功した（実施例６）。

【００２２】本発明の花成制御蛋白質は、組換え蛋白質
として、また、天然の蛋白質として調製することが可能
である。組換え蛋白質として調製する場合は、例えば大
腸菌を宿主とした発現システムとして、グルタチオン‐
Sトランスフェラーゼとの融合蛋白質として発現させる
方法(Smith, D.B.ら(1988)、Gene Vol67:p32-)や、ヒス
チジンタグのついた融合蛋白質として発現させる方法
（中村研三ら監修、「植物の蛋白質実験プロトコール」
（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ9）秀潤社1998
年4月発行）が利用できる。これらのシステムでは、融
合蛋白質として大腸菌で発現させた目的蛋白質をグルタ
チオンまたは金属イオンをリガンドとしたアフィニティ
ークロマトグラフィーにより精製した後、適当なプロテ
アーゼ処理を行うことにより目的蛋白質のみを切り出す
ことが可能である。天然の蛋白質として調製する場合
は、植物材料からの一般的な蛋白質の調製方法（中村研
三ら監修、「植物の蛋白質実験プロトコール」（細胞工
学別冊、植物細胞工学シリーズ9）秀潤社1998年4月発
行）に従う。

【００２３】上記の方法で調製した組換え型または天然
型の花成制御蛋白質を用いて、これらに対するポリクロ
ーナル抗体またはモノクローナル抗体を作成することが
できる（中村研三ら監修、「植物の蛋白質実験プロトコ
ール」（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ9）秀潤
社1998年4月発行）。ポリクローナル抗体の作成は、例
えば以下に示すような方法で行うことができる。すなわ
ち、調製した蛋白質またはその部分断片を適当なアジュ
バントと混合してマウス等の実験動物に腹腔内または皮
下注射することにより免疫し、以後１〜４週間おきに、
好ましくは１〜2週間おきに追加免疫を２〜１０回程度
行う。4週目以降に採血し、血清を得て抗体としての力
価を例えばウエスタンブロッティング等により確認し、
種々の実験等に用いる。

【００２４】モノクローナル抗体の作成に当たっては、
ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）と、上記の方法で免疫し
たマウスなどの実験動物より得た脾細胞を融合し、目的
の抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする。
ハイブリドーマを適当な培地中で培養し、その培地上清
から所望のモノクローナル抗体を得ることができる。大
量の抗体を得るためにはハイブリドーマを腹水化するこ
とが挙げられるが、この場合例えばヌードマウスにハイ
ブリドーマを移植し、増殖させ、該動物の腹水中に産生
されたモノクローナル抗体を回収して得ることができ
る。

【００２５】本発明における、植物の花成の制御は、植
物において上記の花成制御蛋白質をコードするDNAの発
現を増強または抑制することにより行なう。具体的に
は、該DNAが導入されたトランスジェニック植物や該DNA
に対するアンチセンスDNAが導入されたトランスジェニ
ック植物を作成する。この際、該DNAやアンチセンスDNA
を適当な誘導性プロモーターの制御下に配置することに
より、花成の促進または抑制の度合いを微妙に調節し、
花成時期を自在に制御することができる。

【００２６】これらDNAを植物細胞内で発現させるため
には、(ｉ)植物細胞内で転写可能なプロモーター、(ii)
プロモーターの下流にセンス方向またはアンチセンス方
向に連結した本発明の花成制御蛋白質をコードするDNA
の全部または一部、(iii)必要に応じて該遺伝子ＤＮＡ
の下流に連結された転写産物の安定化に必要なポリアデ
ニレーション部位を含むターミネーター配列、を含む発
現カセットを含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子を植物細胞に
導入する。

【００２７】ここで「花成制御蛋白質をコードするDNA
の一部」とは、植物細胞内における発現により花成制御
機能を果たし得る、完全な花成制御蛋白質をコードする
DNAの一部を指す。 このような組換え二本鎖ＤＮＡ分
子もまた本発明の対象である。該組換え二本鎖ＤＮＡ分
子は、上記の構成要素の他に、その5’及び／または3’
側に宿主植物細胞への伝達、該細胞内での維持に必要な
DNA配列を有していてもよい。

【００２８】発現カセットは、挿入されている本発明の
花成制御蛋白質をコードするDNAを恒常的または誘導的
に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的
に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カ
リフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（Odell
ら(1985), Nature, vol.313:p810-）、イネのアクチン
プロモーター（Zhangら(1991), Plant Cell, vol.3:p11
55-）などが挙げられる。また、誘導的に発現させるた
めのプロモーターとしては、例えば糸状菌・細菌・ウイ
ルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、
特定の化合物の散布などの外因によって発現することが
知られているプロモーターなどが挙げられる。このよう
なプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイ
ルスの感染や侵入によって発現するイネのキチナーゼ遺
伝子のプロモーター（Xuら(1996), Plant Mol. Biol.,
vol.30:p387-)やタバコのPR蛋白質遺伝子のプロモータ
ー（Ohshimaら(1990), Plant Cell, vol.2:p95-)、低温
によって誘導されるイネの「lip19」遺伝子のプロモータ
ー（Aguanら(1993), Mol. Gen. Genet., vol.240:p1
-）、高温によって誘導されるシロイヌナズナの「HSP1
8.2」遺伝子のプロモーター（Yoshidaら(1995), Appl.
Microbiol. Biotechnol., vol.44(3-4):p466-）、乾燥
によって誘導されるイネの「rab」遺伝子のプロモータ
ー（Yamaguchi-Shinozakiら(1990), Plant Mol. Biol.,
vol.14(1):p29-）、紫外線によって誘導されるパセリ
のカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-Le
fertら(1989), EMBO J., vol.8:p651-)、嫌気的条件で
誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ
遺伝子のプロモーター（Walkerら(1987), Proc. Natl.
Acad.Sci. USA vol.84:p6624-）などが挙げられる。ま
たイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのPR
蛋白質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の
化合物によって、イネの「rab」遺伝子プロモーターは
植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導され
る。

【００２９】組み換えDNA分子の植物への導入に備える
ために、大腸菌の複製シグナル及び形質転換された細菌
の細胞を選抜するためのマーカー遺伝子を含むクローニ
ングベクターが数多く利用できる。このようなベクター
の例には、pBR322、pUC系、M13mp系、などがある。適当
な制限酵素切断部位で、目的の配列をベクターに導入す
ることができる。得られたプラスミドDNAの特徴を明ら
かにするため、制限酵素切断部位分析、ゲル電気泳動、
およびその他の生化学的−分子生物学的方法が一般に用
いられる。各々の操作を終えた後、プラスミドDNAを切
断して、別のDNAに結合させることができる。各プラス
ミドDNAの配列を、同じプラスミドまたは別のプラスミ
ド中にクローニングすることができる。

【００３０】本発明の花成制御蛋白質をコードするDNA
の全部、例えば、配列番号：２に示したシロイヌナズナ
由来の「MPC1」cDNAの全領域をこれらプロモーターの下
流にセンス方向に連結した場合は、用いたプロモーター
の性質に従って、花成制御遺伝子を恒常的または誘導的
に発現させることが可能である。これにより植物細胞内
の花成制御蛋白質の活性が恒常的または誘導的に向上
し、その結果、植物体において花成の遅延または抑制を
恒常的または誘導的に引き起こすことが可能となる。

【００３１】一方、花成制御蛋白質をコードするDNAの
全部もしくは一部、例えば、配列番号：２に示したシロ
イヌナズナ由来の「MPC1」cDNAの全領域または一部領域
を上記プロモーターの下流にアンチセンス方向に連結し
た場合は、用いたプロモーターの性質に従って、「MPC
1」cDNAの転写産物に相補的なアンチセンスRNAを恒常的
または誘導的に発現させることが可能である。これによ
り植物細胞内において本発明の花成制御蛋白質の発現
が、恒常的または誘導的阻害され、その結果、植物体に
おいて花成の促進を恒常的または誘導的に引き起こすこ
とが可能となる。用いるアンチセンスDNAは、内在の花
成制御蛋白質の発現を抑制し得る限り、内在性花成制御
蛋白質遺伝子の転写産物に完全に相補的なアンチセンス
RNAをコードしていなくともよい。

【００３２】また、植物においては、例えば恒常的で強
い発現を引き起こすプロモーターの下流に遺伝子をセン
ス方向に連結した場合、導入された遺伝子と内在する該
遺伝子の双方の発現が抑制されることがある（Montgome
ry (1998)ら、Trends Genet.,14, 255-）。これは、コ
サプレッションと呼ばれる現象であるが、本発明の花成
制御遺伝子の場合においても、例えば配列番号：２に示
したシロイヌナズナ由来の「MPC1」cDNAの全領域を35S
プロモーターの下流にセンス方向に連結した場合は、コ
サプレッションによって、植物細胞において内在の花成
制御蛋白質の発現が阻害され、その結果、植物体におい
て花成の促進を引き起こすことが可能となる。

【００３３】また、本発明の花成制御蛋白質をコードす
るDNAの一部、例えば、配列番号：2に示した「MPC1」cD
NAの一部の領域を上記プロモーターの下流にセンス方向
に連結した場合、用いたプロモーターの性質に従って、
不完全な花成制御蛋白質を恒常的または誘導的に発現さ
せることが可能である。細胞内に不完全な花成制御蛋白
質が恒常的または誘導的に蓄積した場合、正常な花成制
御蛋白質機能を阻害すると考えられ、その結果、植物体
において花成の促進を恒常的または誘導的に引き起こす
ことが可能となる。

【００３４】このように野生型植物体と比較して花成が
改変された植物体を作出する対象植物としては、双子葉
植物であっても単子葉植物であってもよい。特に重要な
植物は、穀類（例えば、ライムギ、コムギ、トウモロコ
シ、オオムギ、イネなど）、果実類（例えば、オレン
ジ、ブドウ、モモ、ナシ、リンゴ、ウメなど）、野菜類
（トマト、ハクサイ、キャベツ、ダイコンニンジン、カ
ボチャ、ジャガイモ、キュウリ、メロン、パセリな
ど）、観賞植物（ラン、キク、ユリ、サフランなど）、
またはその他の経済的に重要な工芸作物（例えば、タバ
コ、サトウダイコン、サトウキビ、ナタネ、ダイズ、ヒ
マワリ、ワタなど）、および開花年限の長い林木（例え
ば、パルプ材として用いられるユーカリ、アカシヤ、ポ
プラや、木材として用いられるスギ、ヒノキ、マツ、タ
ケ、イチイなど）などの植物である。

【００３５】様々な手法を、植物宿主細胞の中に発現カ
セットを導入するために用いることができる。これらの
手法には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツ
メファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)または、
アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizo
genes）を用いたT-DNAによる植物細胞の形質転換、プロ
トプラストへの直接導入(インジェクション法、エレク
トロポレーション法など)、パーティクルガン法などの
方法が挙げられるが、これらに制限されない。

【００３６】プロトプラストへの直接導入では、特別に
必要とされるベクターはない。例えば、pUC誘導体のよ
うな単純なプラスミドを用いることができる。目的の遺
伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他のDNA配
列が必要になることもある。例えばTiまたはRiプラスミ
ドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、TiおよびRi
プラスミドのT-DNA領域の少なくとも右の端の配列、大
抵は両側の端の配列を、導入されるべき遺伝子の隣接領
域となるように接続しなければならない。

【００３７】アグロバクテリウム属菌を形質転換に用い
る場合には、導入すべき発現カセットを、特別のプラス
ミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクター
の中にクローニングする必要がある。中間ベクターはア
グロバクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベク
ターは、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレー
ションによってアグロバクテリウム属菌の中に移行され
る。中間ベクターは、T-DNAの配列と相同な領域をもつ
ため、相同的組換えによって、アグロバクテリウム属菌
のTiまたはRiプラスミド中に取り込まれる。宿主として
使われるアグロバクテリウム属菌には、vir領域が含ま
れている必要がある。通常TiまたはRiプラスミドにvir
領域が含まれており、その働きにより、T-DNAを植物細
胞に移行させることができる。一方、バイナリーベクタ
ーはアグロバクテリウム属菌の中で複製、維持され得る
ので、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーシ
ョン法によってアグロバクテリウム属菌中に取り込まれ
ると、宿主のvir領域の働きによって、バイナリーベク
ター上のT-DNAを植物細胞に移行させることができる。

【００３８】なお、このようにして得られた中間ベクタ
ーまたはバイナリーベクター、及びこれを含む大腸菌や
アグロバクテリウム属菌等の微生物も本発明の対象であ
る。

【００３９】形質転換された植物細胞は、再生過程を経
ることにより植物体に変換することができる。再生の方
法は植物細胞の種類により異なるが、例えばイネではFu
jimuraら（Fujimuraら(1995), Plant Tissue Culture L
ett., vol.２:p74-）の方法、トウモロコシでは、Shill
itoら（Shillitoら(1989), Bio/Technology, vol.7:p58
1-）の方法、ジャガイモでは、Visserら（Visserら(198
9), Theor. Appl. Genet., vol.78:p594-）の方法、シ
ロイヌナズナではAkamaらの方法（Akamaら(1992), Plan
t Cell Rep., vol.12:p7-）が挙げられる。これらの方
法により作出された植物体またはその繁殖媒体（例えば
種子、塊茎、切穂など）から得た植物体は野生型の植物
体と比較して本発明の花成制御蛋白質の発現が変化し、
これにより花成の挙動が変化する。このようにして得ら
れたトランスジェニック植物は本発明の対象である。

【００４０】

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものでは
ない。なお、DNAの切断、連結、大腸菌の形質転換、遺
伝子の塩基配列決定、ハイブリダイゼーション等一般の
遺伝子組換えに必要な方法は、特に記載のない限り、各
操作に使用する市販の試薬、機器装置等に添付されてい
る説明書や、実験書（例えば「Molecular Cloning（Sam
brookら(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s）」）に基本的に従った。また、シロイヌナズナの寒
天培地や土壌を用いた育成、交配操作、ゲノムDNAの調
製、遺伝学的解析などは、特に記載のない限り、実験書
（例えば「モデル植物の実験プロトコール」島本功、岡
田清孝 監修 秀潤社 細胞工学別冊 植物細胞工学シ
リーズ41996年4月発行）に基本的に従った。

【００４１】[実施例１] シロイヌナズナの花成制御遺
伝子「MPC1」の単離 シロイヌナズナより花成制御遺伝子をクローニングする
ために、まず、子葉展開直後に花が咲く変異体（以下、
超早期花成変異体と称する）の単離を試みた。化学変異
剤EMSを用いて変異処理したシロイヌナズナ（品種：ラ
ンズバーグ）のM2（変異処理した種子を播いて得られた
個体の自殖後代種子）を用意し、寒天培地（1/2 B5培地
（Gamborgら(1968), Exp. Cell Res., vol.50:p151
-）、1％ショ糖、0.8％寒天）上に播種し、発芽した実
生の形態を観察することでスクリーニングした。約5万
個体を10ロットにわけ、スクリーニングした結果、１種
類の超早期花成変異体を得ることができた。この変異体
を「mpc1」と命名した。「mpc1」は、植物体が十分に成
熟しないうちに花をつけるため、花に稔性がなく、系統
を維持することができない。そこで、変異体が得られた
ロットより5000個体を栽培し、各個体ごとに種子（M3）
を得た。これらを個別に播種し、実生を観察すること
で、超早期花成変異を分離するヘテロ系統を得た。「mp
c1」変異は、M3世代で1/4の割合で変異個体を分離する
こと、また野生型との交配によって得られたF2世代にお
いても1/4の割合で変異個体が分離することから、劣性
の1因子による変異であることがわかった。ヘテロ系統
を野生型のランズバーグと2回戻し交雑し、得られた後
代系統を用いて、野生型のコロンビア品種と交配した。
その結果、得られたF2世代の各個体より常法に従いDNA
を抽出し、これらを材料として、RFLP(Restriction Fra
gmentLength Polymorphism)マーカー（Liuら(1996), Pl
ant J., vol.10(4):p733-）、CAPS(Co-dominant cleave
d Amplified polymorphism Sequences)マーカー（Konie
nczmyら(1993), Plant J., vol.4:p403-）及びマイク
ロサテライトマーカー（Bellら(1944), Genomics, vol.
19:p137-）を用いてそれらのマーカーと変異形質との連
鎖度を解析することで、変異の原因遺伝子を染色体上に
マップした。目的遺伝子は、第5染色体の公知のDNAマー
カーmi2（Lister & Dean(1995), WeedsWorld, vol.2
(i):p23-, http://nasc.life.nott.ac.uk:8300/）とDs3
89-14（Smithら(1996), Plant J., vol.10(4):p721-）
の間にマップされた。この染色体領域をカバーするDNA
断片を単離するために、CIC-YACライブラリー（Creusot
ら(1995), Plant J., vol.8 :p763-）、P1ライブラリー
（Liuら(1995), Plant J., vol.7:p351-）、及びTACラ
イブラリー（劉ら（1995）、第18回日本分子生物学会年
会）を上記の２マーカーを用いてスクリーニングし、DN
Aクローン群を得た。さらに得られたクローンより、DNA
断片を調製し、新規にDNAマーカーを作成して、順次、
詳細な遺伝子の染色体マッピングとDNAクローンのスク
リーニングを繰り返した。その結果、目的遺伝子の位置
をマーカー16EB53とZ11-1の間に絞り込んだ。なお、こ
れらマーカーは、ゲノムDNAからPCRにより増幅して得る
ことができる。すなわち、16EB53では、合成オリゴヌク
レオチドプライマー「GGATCCGAAC CCGACTCGGT ACC」
（配列番号：４）および「GCTTATGGAT GTGGACTCTC TAA
C」（配列番号：５）を用いたPCRにより、また、z11-1
では、合成オリゴヌクレオチドプライマー「AGGTCCTACA
ACTACAACAG TT」（配列番号：６）および「GAGGAAGCTA
GTATTCTCTT TG」（配列番号：７）を用いたPCRにより
得られる。マーカー16EB53とZ11-1の間の染色体領域
は、図1に示される4種のTACクローン（11K22、22K2、19
A20及び20I12）のDNAコンティグで表される。これらTAC
クローンは、約70から100kbの長さを有する。これらク
ローンを各々変異個体にアグロバクテリウム・ツメファ
シエンス菌を介して導入したところ、20I12を除く他の3
クローンが導入された場合に野生型への復帰が認められ
た(遺伝子導入方法及び導入処理した植物の培養に関し
ては実施例2に詳述）。これら3クローンの共通領域の約
50kbをプローブとしてシロイヌナズナのcDNAライブラリ
ー(Newmanら(1994), Plant Pysiol., vol.106:p1241-）
をスクリーニングしたところ、6種の遺伝子cDNAが得ら
れた。これら遺伝子の位置をDNAコンティグ上にマップ
した。更に、遺伝子導入による変異復帰におけるそれぞ
れの遺伝子の寄与の有無が確認できるように、クローン
を制限酵素によって完全または部分分解し、サブクロー
ン化した。これらのサブクローンの遺伝子導入結果によ
り、変異復帰能を有する1個の遺伝子を同定した。この
結果から、この遺伝子が超早期花成変異「mpc1」の原因
遺伝子、すなわち花成制御遺伝子「MPC1」であると結論
された。このゲノム領域及びcDNAクローンの塩基配列解
析の結果、「MPC1」構造遺伝子は、21個のイントロンで
分断された22個のエクソンを有し、その間は5580bpに亘
ることが明らかとなった。これによりコードされる蛋白
質は、611個のアミノ酸残基からなる分子量69.5kDaの蛋
白質であり、そのアミノ酸配列中には、ある種の核酸結
合蛋白質を特徴づけるC2H2タイプのジンクフィンガー
（Rosenfeldら(1993), J. Biomol. Struct. Dyn., vol.
11:p557-）、及び転写因子の転写活性化ドメインに見ら
れるような酸性アミノ酸クラスターが認められた。これ
らはそれぞれ、配列番号：１において、306番目から327
番目のアミノ酸配列、及び503番目から520番目までのア
ミノ酸配列として認められる。

【００４２】DDBJ/EMBL/GenBankデーターベースを用い
たホモロジー検索の結果、部分的に相同性の認められる
配列は検出されたが、いずれも機能未知の断片的配列で
あった。具体的には、イネの部分cDNA配列（EST C7261
6）ならびにシロイヌナズナのゲノム一次構造配列（Z97
342）である。このシロイヌナズナの相同性を示す配列
は、本発明の「MPC1」遺伝子とは異なる染色体上に位置
しており、「MPC1」遺伝子の第5エクソンから第１０エ
クソンに相当する領域が明らかに失われている点で、
「MPC1」遺伝子とは大きく異なるが、本発明の遺伝子が
欠失して派生したものと思われ、元来、花成に関係した
遺伝子であった可能性も類推される。この結果から、本
発明の遺伝子と相同でかつ機能の特定された遺伝子は見
出されていない。すなわち本発明の遺伝子は、これまで
に報告のない新規な遺伝子である。また、「mpc1」変異
体のこの遺伝子の塩基配列を解析したところ、配列番
号：3に示すヌクレオチド番号5039の塩基グアニンがア
デニンに置換し、コーディングフレーム中に終止コドン
を生じる塩基置換変異が１箇所見出された。この塩基置
換により「mpc1」変異体では、「MPC1」蛋白質の541番
目以下のアミノ酸配列を欠く不完全な蛋白質が発現する
ものと考えられる。この蛋白質は花成制御機能を部分的
に、または完全に失っており、その結果、栄養生長の維
持を達成できないため、植物体が超早期花成に至るもの
と考えられる。

【００４３】[実施例２] 遺伝子導入による開花誘導 シロイヌナズナ花成制御遺伝子「MPC1」のcDNAの一部を
用いて、アンチセンス遺伝子の構築を行った。配列表の
配列番号：2に示すcDNAのヌクレオチド番号1650のBamHI
制限サイトからヌクレオチド番号1984のSphI制限サイト
までの配列を制限酵素による切断で分取した。この分取
断片部の転写物の相補配列を転写させるために、バイナ
リーベクターpBI121（Jeffersonら(1987), EMBO J., vo
l.6:p3901-）の35Sプロモーター下流にあるXbaI制限サ
イトを切断、平滑末端化し、上記分取断片のSphI制限末
端を平滑化して連結、BamHI制限末端をベクターのBamHI
制限サイトに連結して、アンチセンス遺伝子とした。ア
ンチセンス遺伝子を導入した形質転換シロイヌナズナを
アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を介した遺伝
子導入法によって作成した。まず、上記アンチセンス遺
伝子発現ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス菌にエレクトロポレーション法を用いて移行させ
た。上記発現ベクターは、マーカーとして、カナマイシ
ン耐性遺伝子を有している。アンチセンス遺伝子発現ベ
クターDNAを10％グリセロール溶液に懸濁したアグロバ
クテリウム・ツメファシエンス菌体と混合し、1mm幅の
キュベット電極中で、25μF・600Ω・1.8kV設定にて電気
パルスを印可した後、25μg/mlのカナマイシンと50μg/
mlのリファンピシンを添加したＬＢ寒天培地（1％バク
トトリプトン，0.5％酵母抽出物，0.5％塩化ナトリウ
ム，1.2％バクトアガー）上で、28℃，2日間培養して、
カナマイシン耐性の付与されたアグロバクテリウム・ツ
メファシエンス菌のコロニーを選抜した。次いで、この
アンチセンス遺伝子を有するアグロバクテリウム・ツメ
ファシエンス菌を50μg/mlのリファンピシンと25μg/ml
のカナマイシンを添加したＬＢ液体培地（1％バクトト
リプトン，0.5％酵母抽出物，0.5％塩化ナトリウム）
で、28℃，16時間培養した培養液を用意した。シロイヌ
ナズナは、種子を1％アンチホルミンで滅菌した後、1％
ショ糖と0.4％ゲランガムを添加したＭＳ寒天培地（Mur
ashige & Skoog(1962), Physiol. Plant, vol.15:p473
-）に播種して、25℃，14日間生育させた。生育させた
シロイヌナズナは、胚軸部を切り出して、CIM培地（0.5
mg/l 2,4D、0.05mg/l カイネチン、2％グルコース、0.
4％ゲランガムを添加したB5寒天培地（Gamborgら(196
8), Exp. Cell Res., vol.50:p151-））に置床し、25
℃，6日間暗所で培養した。この胚軸を、上記のアンチ
センス遺伝子を有するアグロバクテリウム・ツメファシ
エンス菌培養液と混和した後、再度CIM培地に置いて、2
5℃，2日間暗所で共培養して感染を行わせた。除菌のた
めに胚軸は、150mg/lのクラフォランと2％グルコースを
含むB5液体培地中で5時間振とう洗浄した。洗浄後の胚
軸は、形質転換植物を分化させ、選抜するために、SIM
培地（2mg/l ゼラチン、0.2mg/l IBA、150mg/l クラフ
ォラン、50μg/ml カナマイシン、2％グルコース、0.4
％ゲランガムを含むB5寒天培地）に1週間ごとに植え継
いだ。当該アンチセンス遺伝子を発現させている35Sプ
ロモーターは、恒常的発現プロモーターとして知られて
いる。その結果として、継代培養4週目には、胚軸から
直接に雌蕊を分化させることができた。

【００４４】[実施例３] イネにおける花成制御遺伝子
「Os-MPC1」の単離 シロイヌナズナの花成制御遺伝子「MPC1」の配列をプロ
ーブに用いて、DDBJ/EMBL/GenBankデーターベースを対
象にしたホモロジー検索を行なった結果、部分的に相同
性の認められるイネの部分cDNA配列（EST C72616）が検
出された。この機能未知遺伝子の全cDNA配列の単離を行
なった。データーベース上の部分cDNA配列をハイブリダ
イゼーションのプローブに用いて、イネ未熟種子由来の
cDNAライブラリーをスクリーニングし、１種のcDNAクロ
ーンを得た。取得したクローンのcDNAの塩基配列を決定
したところ、2248bpからなり、コードされる蛋白質は、
604個のアミノ酸残基からなる分子量68.6kDaの蛋白質で
あった。cDNAの塩基配列を配列番号：９に、cDNAにコー
ドされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：８に示す。
この蛋白質のアミノ酸配列は、シロイヌナズナの「MPC
1」蛋白質のアミノ酸配列と61％が同一であり、有意な
相同性を示すことから、この遺伝子はイネにおけるシロ
イヌナズナ「MPC1」に対応する遺伝子であると考えら
れ、「O_S-MPC1」と命名した。「O_S-MPC1」蛋白質には、
「MPC1」と同様のジンクフィンガーモチーフ及び酸性ア
ミノ酸クラスターが見いだされた。これらはそれぞれ、
配列番号：８において、310番目から331番目のアミノ酸
配列、及び488番目から505番目までのアミノ酸配列とし
て認められる。

【００４５】[実施例４] イネ「Os-MPC1」遺伝子の染
色体マッピング 「Os-MPC1」遺伝子の3'側の一部に由来する染色体DNA断
片をイネ系統「アソミノリ」と「IR24」からPCRにより
増幅した。増幅には、合成オリゴヌクレオチドプライマ
ー「GACGAGAAAC TTATTATGCA TATG」（配列番号：10）お
よび「GGTCTTGATA CTGCTCTACA GTTATG」（配列番号：1
1）を用いた。この結果得られた約1.3kbの長さの増幅遺
伝子断片は、制限酵素SspIで切断した場合、「アソミノ
リ」と「IR24」の系統間で切断パターンが異なるRFLP
（restriction fragment lengthpolymorphism）を示
した。このRFLPを用いれば、イネにおいて既に作成され
ているRFLP地図との対応付けにより、「Os-MPC1」遺伝
子の染色体上での座位の決定が可能である。イネ「アソ
ミノリ」と「IR24」の交配後代植物から作成されたRI
（Recombinant Inbred）系統群（Tsunematsuら(1993),
Rice Genetics Newsletter, vol.10:p89-）の染色体DN
Aを材料にして、「Os-MPC1」遺伝子断片と、既に座位の
決定されているRFLPマーカーとの組み換え価を算出し
て、「Os-MPC1」遺伝子座の決定を行なった。解析の結
果、「Os-MPC1」遺伝子は、イネの第9染色体の末端、公
知のC152マーカーの近傍に位置づけられた。これまで、
イネにおける遺伝学的な研究では、第9染色体末端に開
花を制御する遺伝子の存在は認められていない。この点
からも、「Os-MPC1」遺伝子は、新規な遺伝子であり、
かつ従来の技術では検出困難であった根源的な花成制御
遺伝子であることが示唆される。

【００４６】[実施例５] イネ「Os-MPC1」遺伝子によ
るシロイヌナズナ超早期花成変異の相補 単離したイネ「Os-MPC1」遺伝子の花成制御機能の検証
を行なった。「Os-MPC1」cDNAをまず、3’端のベクター
連結部に存在するNotI制限サイトで切断し平滑末端化、
更に５’非翻訳領域に存在するNheI制限サイトで切断
し、ベクターを除くcDNA配列のみを分取した。一方、バ
イナリーベクターpBI121（Jeffersonら(1987), EMBO
J., vol.6:p3901-）の35Sプロモーター下流にあるSmaI
制限サイトを切断し、上記分取cDNA断片の平滑化した3'
端と連結、更にベクター中のSmaI制限サイト上流のXbaI
制限サイトを切断して、分取cDNA断片のNheI制限サイト
に連結し、「Os-MPC1」遺伝子の発現ベクターとした。
同発現ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス菌に組み込んで、同菌をシロイヌナズナの超早期花
成変異体の根切片に感染させることにより、「Os-MPC
1」遺伝子を導入した（遺伝子導入方法及び導入処理し
た植物の培養に関しては実施例２に詳述）。遺伝子導入
処理を行なうこと無しに、超早期花成変異体の根を培養
し、個体分化を試みた場合、変異の影響で直接的な花芽
の分化のみが観察されるのに対して、「Os-MPC1」遺伝
子を導入した場合は、変異が相補され、茎葉が分化し個
体生育することを確認した。この結果は、「Os-MPC1」
遺伝子がイネにおける花成制御遺伝子であることを機能
的に実証し得たのみならず、本発明の「花成制御遺伝
子」が広範な植物種で共通に機能する普遍性を有するこ
とを示している。

【００４７】[実施例６] 各種植物からの花成制御遺伝
子の単離 シロイヌナズナの「MPC1」遺伝子とイネの「Os-MPC1」
遺伝子によってコードされるアミノ酸の配列を比較し、
花成制御蛋白質に共通した類似性が認められるアミノ酸
配列の中から、2ヶ所を選び出した。具体的には、配列
番号：1に示されるアミノ酸番号484から490までの「Lys
Arg Gln Phe Phe His Ser」（配列番号：12）ならびに
配列番号：1に示すアミノ酸番号558から563までの「Trp
Ala CysGlu Ala Phe」（配列番号：13）である。次
に、配列番号：12のアミノ酸配列を基に4種類の合成オ
リゴヌクレオチドプライマーKR1「AAGCGGCAAT TTTAYCAY
TC」（配列番号：14）、KR2「AAGCGGCAGT TCTAYCAYTC」
（配列番号：15）、KR3「AAGCGGCAGT TCTAYCAYAG」（配
列番号：16）、およびKR4「AAGCGGCAAT TTTAYCAYAG」
（配列番号：17）を、配列番号：13のアミノ酸配列を基
に２種類の合成オリゴヌクレオチドプライマーWA1「AAT
ACCTCAC ANGCCCA」（配列番号：18）、およびWA2「AATA
CTTCGC ANGCCCA」（配列番号：19）を作成した。これら
KR1〜KR4のプライマーとWA1〜WA2のプライマーを組み合
わせた合計8とおりのPCRをイネ（品種：日本晴）ならび
にサトウダイコン（品種：シュガーマンゴールド）の染
色体DNAを鋳型として行なった。これら増幅断片のそれ
ぞれについて、塩基配列を決定して、既知の花成制御遺
伝子との比較を行なった。その結果、サトウダイコンに
おいては、KR1とWA2のプライマーを組み合わせたPCRで
増幅された1216bpの断片がサトウダイコン花成制御遺伝
子の一部であることが明らかとなった。このサトウダイ
コン遺伝子断片の塩基配列を配列番号：20に示した。同
遺伝子断片においては、アミノ酸をコードする塩基配列
が3ヶ所のイントロンによって分断され、その位置は、
シロイヌナズナ「MPC1」遺伝子と同一であった。また、
イネにおいては、KR2とWA2のフ゜ライマーを組み合わせたPCR
で増幅される断片がイネ花成制御遺伝子「Os-MPC1」の
一部であることが明らかとなった。これら増幅遺伝子断
片を用いれば、ライブラリークローンのスクリーニング
もしくはPCR技術、その他の方法により、同遺伝子の全長
をクローニングすることは、比較的容易に実施できる。
上述の方法によれば、イネやサトウダイコンのみならず
広範な植物種から花成制御遺伝子を取得することが可能
となる。

【００４８】

【発明の効果】本発明により、植物の花成を抑制する新
規な遺伝子が提供された。この遺伝子を他の植物に導入
して発現させることにより、当該植物の花成を抑制また
は促進するといった制御が可能となった。穀類や野菜で
は、花成を制御することで早生や晩生といった多様な品
種の作出が可能となり、栽培適地の拡大、収量増加、高
付加価値作物の供給といった農業上重要な価値を生ず
る。特にハクサイなどの葉茎菜類およびダイコンなどの
根菜類では、抽苔、開花による品質低下が問題となるた
め、作型が限られているのが現状であり、花成抑制によ
り栽培期間・栽培適地の拡大によってもたらされる効果
は大きい。食味がよい、耐病性が強いなどの優れた形質
をもつ品種において、任意な花成制御が可能となればそ
のインパクトは大きいと考えられる。果樹においても花
芽形成の促進により生産性を向上させる、また開花時期
を変化させることで端境期の生産、出荷が可能になると
いった効果が期待される。林木では、開花年限の短縮に
より世代更新の促進を図る他、着花を阻止することで栄
養増殖の促進、もしくは花粉の飛散による人体へのアレ
ルギー反応誘発の解消といった経済的社会的な効果が期
待できる。

【００４９】 SEQUENCE LISTING <110> MITSUI CHEMISTRY CO.,LTD. <120> A GENE FOR FLORAL REGURATION AND METHODS FOR CONTROL OF FLOWERING <130> M4-101DP1 <140> <141> <150> JP 1998-180065 <151> 1998-06-26 <160> 22 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 611 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> ZN_FING <222> (306)..(327) <400> 1 Met Cys His Glu Asp Ser Arg Leu Arg Ile Ser Glu Glu Glu Glu Ile 1 5 10 15 Ala Ala Glu Glu Ser Leu Ala Ala Tyr Cys Lys Pro Val Glu Leu Tyr 20 25 30 Asn Ile Ile Gln Arg Arg Ala Ile Arg Asn Pro Leu Phe Leu Gln Arg 35 40 45 Cys Leu His Tyr Lys Ile Glu Ala Lys His Lys Arg Arg Ile Gln Met 50 55 60 Thr Val Phe Leu Ser Gly Ala Ile Asp Ala Gly Val Gln Thr Gln Lys 65 70 75 80 Leu Phe Pro Leu Tyr Ile Leu Leu Ala Arg Leu Val Ser Pro Lys Pro 85 90 95 Val Ala Glu Tyr Ser Ala Val Tyr Arg Phe Ser Arg Ala Cys Ile Leu 100 105 110 Thr Gly Gly Leu Gly Val Asp Gly Val Ser Gln Ala Gln Ala Asn Phe 115 120 125 Leu Leu Pro Asp Met Asn Arg Leu Ala Leu Glu Ala Lys Ser Gly Ser 130 135 140 Leu Ala Ile Leu Phe Ile Ser Phe Ala Gly Ala Gln Asn Ser Gln Phe 145 150 155 160 Gly Ile Asp Ser Gly Lys Ile His Ser Gly Asn Ile Gly Gly His Cys 165 170 175 Leu Trp Ser Lys Ile Pro Leu Gln Ser Leu Tyr Ala Ser Trp Gln Lys 180 185 190 Ser Pro Asn Met Asp Leu Gly Gln Arg Val Asp Thr Val Ser Leu Val 195 200 205 Glu Met Gln Pro Cys Phe Ile Lys Leu Lys Ser Met Ser Glu Glu Lys 210 215 220 Cys Val Ser Ile Gln Val Pro Ser Asn Pro Leu Thr Ser Ser Ser Pro 225 230 235 240 Gln Gln Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Glu Glu Val Gly Ser Thr Glu 245 250 255 Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Phe Ser Tyr Asn Asp Ile Ser Ser Ser Ser 260 265 270 Leu Leu Gln Ile Ile Arg Leu Arg Thr Gly Asn Val Val Phe Asn Tyr 275 280 285 Arg Tyr Tyr Asn Asn Lys Leu Gln Lys Thr Glu Val Thr Glu Asp Phe 290 295 300 Ser Cys Pro Phe Cys Leu Val Lys Cys Ala Ser Phe Lys Gly Leu Arg 305 310 315 320 Tyr His Leu Pro Ser Thr His Asp Leu Leu Asn Phe Glu Phe Trp Val 325 330 335 Thr Glu Glu Phe Gln Ala Val Asn Val Ser Leu Lys Thr Glu Thr Met 340 345 350 Ile Ser Lys Val Asn Glu Asp Asp Val Asp Pro Lys Gln Gln Thr Phe 355 360 365 Phe Phe Ser Ser Lys Lys Phe Arg Arg Arg Arg Gln Lys Ser Gln Val 370 375 380 Arg Ser Ser Arg Gln Gly Pro His Leu Gly Leu Gly Cys Glu Val Leu 385 390 395 400 Asp Lys Thr Asp Asp Ala His Ser Val Arg Ser Glu Lys Ser Arg Ile 405 410 415 Pro Pro Gly Lys His Tyr Glu Arg Ile Gly Gly Ala Glu Ser Gly Gln 420 425 430 Arg Val Pro Pro Gly Thr Ser Pro Ala Asp Val Gln Ser Cys Gly Asp 435 440 445 Pro Asp Tyr Val Gln Ser Ile Ala Gly Ser Thr Met Leu Gln Phe Ala 450 455 460 Lys Thr Arg Lys Ile Ser Ile Glu Arg Ser Asp Leu Arg Asn Arg Ser 465 470 475 480 Leu Leu Gln Lys Arg Gln Phe Phe His Ser His Arg Ala Gln Pro Met 485 490 495 Ala Leu Glu Gln Val Leu Ser Asp Arg Asp Ser Glu Asp Glu Val Asp 500 505 510 Asp Asp Val Ala Asp Phe Glu Asp Arg Arg Met Leu Asp Asp Phe Val 515 520 525 Asp Val Thr Lys Asp Glu Lys Gln Met Met His Met Trp Asn Ser Phe 530 535 540 Val Arg Lys Gln Arg Val Leu Ala Asp Gly His Ile Pro Trp Ala Cys 545 550 555 560 Glu Ala Phe Ser Arg Leu His Gly Pro Ile Met Val Arg Thr Pro His 565 570 575 Leu Ile Trp Cys Trp Arg Val Phe Met Val Lys Leu Trp Asn His Gly 580 585 590 Leu Leu Asp Ala Arg Thr Met Asn Asn Cys Asn Thr Phe Leu Glu Gln 595 600 605 Leu Gln Ile 610 <210> 2 <211> 2280 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (310)..(2142) <220> <221> misc_feature <222> (1650)..(1655) <223> BamHI recognition site <220> <221> misc_feature <222> (1984)..(1989) <223> SphI recognition site <400> 2 aagataattt ctcacaatta gggttttttt tttcttctga gttaactgtt ccatctccat 60 cctaatcttc accttctcct tgatttcgag atctctgtca atttgttgaa tctgttcttt 120 atctaattag ctcaactccg agtctttgct ggattttgaa gcttttgtag ctgaagcaaa 180 tttgtaatct gtgatggtgt atgcactgat tctgggtatg gtattgtact ctaggatctc 240 gtagcgagaa tgccaggcat tcctcttgtt agtcgtgaaa cctcttcttg ttcaagaagc 300 acagagcag atg tgc cat gaa gac tcc cgt ctg cgt att tcg gaa gag gag 351 Met Cys His Glu Asp Ser Arg Leu Arg Ile Ser Glu Glu Glu 1 5 10 gag att gct gct gaa gag agc ttg gct gcc tat tgc aag cct gtt gaa 399 Glu Ile Ala Ala Glu Glu Ser Leu Ala Ala Tyr Cys Lys Pro Val Glu 15 20 25 30 ctc tac aat atc att caa cgc cgt gct att agg aat ccc ttg ttt ctt 447 Leu Tyr Asn Ile Ile Gln Arg Arg Ala Ile Arg Asn Pro Leu Phe Leu 35 40 45 cag cga tgt ttg cat tat aag att gag gca aaa cat aaa agg aga ata 495 Gln Arg Cys Leu His Tyr Lys Ile Glu Ala Lys His Lys Arg Arg Ile 50 55 60 caa atg act gta ttc ctc tcg ggc gct ata gat gct ggg gta caa act 543 Gln Met Thr Val Phe Leu Ser Gly Ala Ile Asp Ala Gly Val Gln Thr 65 70 75 caa aaa tta ttc cct ctg tat att ttg ttg gca aga ctc gtt tct cct 591 Gln Lys Leu Phe Pro Leu Tyr Ile Leu Leu Ala Arg Leu Val Ser Pro 80 85 90 aag cct gtc gct gag tat tct gca gta tat agg ttc agt cga gca tgt 639 Lys Pro Val Ala Glu Tyr Ser Ala Val Tyr Arg Phe Ser Arg Ala Cys 95 100 105 110 atc cta act ggt gga ttg ggg gtt gat gga gtt agt caa gcc caa gcc 687 Ile Leu Thr Gly Gly Leu Gly Val Asp Gly Val Ser Gln Ala Gln Ala 115 120 125 aac ttt ctt ctc cct gat atg aat aga ctc gca ttg gag gca aaa tca 735 Asn Phe Leu Leu Pro Asp Met Asn Arg Leu Ala Leu Glu Ala Lys Ser 130 135 140 gga tca ctc gct atc ttg ttt atc agc ttt gct ggt gcg caa aat tct 783 Gly Ser Leu Ala Ile Leu Phe Ile Ser Phe Ala Gly Ala Gln Asn Ser 145 150 155 caa ttt ggc att gat tca ggc aag att cat tca gga aat ata gga gga 831 Gln Phe Gly Ile Asp Ser Gly Lys Ile His Ser Gly Asn Ile Gly Gly 160 165 170 cat tgt tta tgg agc aaa ata cct ctg caa tca ctg tat gcg tcg tgg 879 His Cys Leu Trp Ser Lys Ile Pro Leu Gln Ser Leu Tyr Ala Ser Trp 175 180 185 190 cag aaa tca cca aac atg gac ttg gga cag aga gta gac aca gtc tct 927 Gln Lys Ser Pro Asn Met Asp Leu Gly Gln Arg Val Asp Thr Val Ser 195 200 205 ctt gtt gaa atg cag cct tgc ttc ata aag cta aag tcc atg agt gag 975 Leu Val Glu Met Gln Pro Cys Phe Ile Lys Leu Lys Ser Met Ser Glu 210 215 220 gaa aag tgt gtc tcg att cag gtg ccc agc aat cca ctc acc tcg agc 1023 Glu Lys Cys Val Ser Ile Gln Val Pro Ser Asn Pro Leu Thr Ser Ser 225 230 235 tct ccg cag caa gtg caa gtc acc ata tct gca gaa gaa gtt ggg tca 1071 Ser Pro Gln Gln Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Glu Glu Val Gly Ser 240 245 250 acg gaa aaa tct cct tat agt tca ttt tca tat aat gac atc tct tcc 1119 Thr Glu Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Phe Ser Tyr Asn Asp Ile Ser Ser 255 260 265 270 tct tcc ttg ttg caa att atc agg ttg aga aca gga aat gta gtt ttc 1167 Ser Ser Leu Leu Gln Ile Ile Arg Leu Arg Thr Gly Asn Val Val Phe 275 280 285 aac tac aga tac tat aac aac aaa ttg cag aag act gaa gta act gaa 1215 Asn Tyr Arg Tyr Tyr Asn Asn Lys Leu Gln Lys Thr Glu Val Thr Glu 290 295 300 gac ttt tct tgt cca ttc tgc tta gta aaa tgt gcc agt ttc aag ggc 1263 Asp Phe Ser Cys Pro Phe Cys Leu Val Lys Cys Ala Ser Phe Lys Gly 305 310 315 ctg aga tat cac ttg cca tca acc cac gat ctc ctc aat ttc gag ttt 1311 Leu Arg Tyr His Leu Pro Ser Thr His Asp Leu Leu Asn Phe Glu Phe 320 325 330 tgg gta act gaa gaa ttt cag gcg gta aat gtc tcc ctc aag act gag 1359 Trp Val Thr Glu Glu Phe Gln Ala Val Asn Val Ser Leu Lys Thr Glu 335 340 345 350 aca atg ata tcc aag gtt aat gag gat gac gtt gac cca aag cag caa 1407 Thr Met Ile Ser Lys Val Asn Glu Asp Asp Val Asp Pro Lys Gln Gln 355 360 365 act ttc ttt ttt tct tcc aaa aaa ttc aga cgg agg agg caa aag agt 1455 Thr Phe Phe Phe Ser Ser Lys Lys Phe Arg Arg Arg Arg Gln Lys Ser 370 375 380 cag gta cgg agc tca agg caa ggg cct cat ctt gga tta ggt tgc gag 1503 Gln Val Arg Ser Ser Arg Gln Gly Pro His Leu Gly Leu Gly Cys Glu 385 390 395 gtg cta gat aag act gat gat gct cat tct gtt aga agt gag aag agc 1551 Val Leu Asp Lys Thr Asp Asp Ala His Ser Val Arg Ser Glu Lys Ser 400 405 410 cga ata cca cct gga aag cat tac gaa aga att ggg ggt gct gag tct 1599 Arg Ile Pro Pro Gly Lys His Tyr Glu Arg Ile Gly Gly Ala Glu Ser 415 420 425 430 ggt caa aga gtt cct cct ggc acg agt cct gca gac gtg caa tca tgt 1647 Gly Gln Arg Val Pro Pro Gly Thr Ser Pro Ala Asp Val Gln Ser Cys 435 440 445 ggg gat cca gat tat gtg cag tcg ata gct gga agt aca atg ttg cag 1695 Gly Asp Pro Asp Tyr Val Gln Ser Ile Ala Gly Ser Thr Met Leu Gln 450 455 460 ttt gca aaa acg agg aaa ata tct ata gaa cgg tcg gac ttg agg aac 1743 Phe Ala Lys Thr Arg Lys Ile Ser Ile Glu Arg Ser Asp Leu Arg Asn 465 470 475 cga agc ctc ctt cag aag aga cag ttc ttc cac tct cat cga gct cag 1791 Arg Ser Leu Leu Gln Lys Arg Gln Phe Phe His Ser His Arg Ala Gln 480 485 490 ccc atg gct cta gaa caa gta ctt tcg gac cgg gat agt gaa gat gaa 1839 Pro Met Ala Leu Glu Gln Val Leu Ser Asp Arg Asp Ser Glu Asp Glu 495 500 505 510 gtt gat gat gat gtg gca gat ttt gaa gat aga agg atg ctc gat gat 1887 Val Asp Asp Asp Val Ala Asp Phe Glu Asp Arg Arg Met Leu Asp Asp 515 520 525 ttc gtt gat gtg act aaa gat gag aaa cag atg atg cac atg tgg aac 1935 Phe Val Asp Val Thr Lys Asp Glu Lys Gln Met Met His Met Trp Asn 530 535 540 tcg ttt gtg agg aag cag cga gta tta gca gat ggt cac att cca tgg 1983 Ser Phe Val Arg Lys Gln Arg Val Leu Ala Asp Gly His Ile Pro Trp 545 550 555 gca tgc gag gca ttc tca aga ttg cac gga ccc atc atg gtt cga aca 2031 Ala Cys Glu Ala Phe Ser Arg Leu His Gly Pro Ile Met Val Arg Thr 560 565 570 ccg cac ttg att tgg tgc tgg aga gtg ttt atg gtg aaa ctg tgg aac 2079 Pro His Leu Ile Trp Cys Trp Arg Val Phe Met Val Lys Leu Trp Asn 575 580 585 590 cac ggt ctt ctt gat gcc cga acc atg aac aac tgt aat acc ttt ctc 2127 His Gly Leu Leu Asp Ala Arg Thr Met Asn Asn Cys Asn Thr Phe Leu 595 600 605 gaa cag ctc caa att tgaaaaccca agaaatcatt aatttaagta gaaaaacaaa 2182 Glu Gln Leu Gln Ile 610 gaaagacaag agaagaagag ttttgggttc tcatttaact acttttggtg ttttaagaga 2242 aagaggagca tatttatgca tgaaaaaaaa aaaaaaaa 2280 <210> 3 <211> 5580 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> intron <222> (162)..(267) <220> <221> intron <222> (394)..(565) <220> <221> CDS <222> (588)..(713) <220> <221> intron <222> (714)..(930) <220> <221> CDS <222> (931)..(986) <220> <221> intron <222> (987)..(1132) <220> <221> CDS <222> (1133)..(1247) <220> <221> intron <222> (1248)..(1344) <220> <221> CDS <222> (1345)..(1504) <220> <221> intron <222> (1505)..(1596) <220> <221> CDS <222> (1597)..(1647) <220> <221> intron <222> (1648)..(1854) <220> <221> CDS <222> (1855)..(1994) <220> <221> intron <222> (1995)..(2197) <220> <221> CDS <222> (2198)..(2260) <220> <221> intron <222> (2261)..(2350) <220> <221> CDS <222> (2351)..(2472) <220> <221> intron <222> (2473)..(2714) <220> <221> CDS <222> (2715)..(2779) <220> <221> intron <222> (2780)..(2870) <220> <221> CDS <222> (2871)..(2930) <220> <221> intron <222> (2931)..(3038) <220> <221> CDS <222> (3039)..(3092) <220> <221> intron <222> (3093)..(3174) <220> <221> CDS <222> (3175)..(3234) <220> <221> intron <222> (3235)..(3654) <220> <221> CDS <222> (3656)..(3701) <220> <221> intron <222> (3702)..(3784) <220> <221> CDS <222> (3785)..(3885) <220> <221> intron <222> (3886)..(4052) <220> <221> CDS <222> (4053)..(4272) <220> <221> intron <222> (4273)..(4428) <220> <221> CDS <222> (4429)..(4477) <220> <221> intron <222> (4478)..(4552) <220> <221> CDS <222> (4553)..(4636) <220> <221> intron <222> (4637)..(4982) <220> <221> CDS <222> (4983)..(5062) <220> <221> intron <222> (5063)..(5265) <220> <221> CDS <222> (5266)..(5355) <220> <221> intron <222> (5356)..(5445) <220> <221> CDS <222> (5446)..(5542) <400> 3 aagataattt ctcacaatta gggttttttt tttcttctga gttaactgtt ccatctccat 60 cctaatcttc accttctcct tgatttcgag atctctgtca atttgttgaa tctgttcttt 120 atctaattag ctcaactccg agtctttgct ggattttgaa ggtcaccact gttcaagttt 180 acattttttt tcctgctaat cgcttgatac ccgtttctgc tgttgtggga tttattgggt 240 ttttcttctt tacgattttt gttgcagctt ttgtagctga agcaaatttg taatctgtga 300 tggtgtatgc actgattctg ggtatggtat tgtactctag gatctcgtag cgagaatgcc 360 aggcattcct cttgttagtc gtgaaacctc ttcgtaagtc tcatgaacaa cctaatgctt 420 ctataatgtc tctgcagcat tgtgtaactt tatactgttt ctcttatgta taagctgagg 480 aatcctagta attcaaactt atcaaatttt tattttgttg tggggttgct tacaattttg 540 gttgcgtatg atggtgaaat cacagttgtt caagaagcac agagcag atg tgc cat 596 Met Cys His 1 gaa gac tcc cgt ctg cgt att tcg gaa gag gag gag att gct gct gaa 644 Glu Asp Ser Arg Leu Arg Ile Ser Glu Glu Glu Glu Ile Ala Ala Glu 5 10 15 gag agc ttg gct gcc tat tgc aag cct gtt gaa ctc tac aat atc att 692 Glu Ser Leu Ala Ala Tyr Cys Lys Pro Val Glu Leu Tyr Asn Ile Ile 20 25 30 35 caa cgc cgt gct att agg aat gtatgtcttc cttcctacct tttttagaca gaat 747 Gln Arg Arg Ala Ile Arg Asn 40 atgtttagtt atgacttatg agctcagctg atatatcaca tgtattggtt tacttttgag 807 ttttgacaat gaaaatttac atgaaaatgt agtttgagtt gacttcattt ggtataagca 867 agtatgtgtt gtcttgctat gcagtccatc ctaatcattt ctctctctct gtctcccctg 927 tag ccc ttg ttt ctt cag cga tgt ttg cat tat aag att gag gca aaa 975 Pro Leu Phe Leu Gln Arg Cys Leu His Tyr Lys Ile Glu Ala Lys 45 50 55 cat aaa agg ag gtaagctttt tttttttcct tcctttctct gttcagaatc tccatt 1032 His Lys Arg Arg 60 acttttgggt aactattaca ctatacctta gtaattcatt ccggacttga atgctttcta 1092 agttttcgga tagttatcaa tatatattac tgctttgcag a ata caa atg act gta 1148 Ile Gln Met Thr Val 65 ttc ctc tcg ggc gct ata gat gct ggg gta caa act caa aaa tta ttc 1196 Phe Leu Ser Gly Ala Ile Asp Ala Gly Val Gln Thr Gln Lys Leu Phe 70 75 80 cct ctg tat att ttg ttg gca aga ctc gtt tct cct aag cct gtc gct 1244 Pro Leu Tyr Ile Leu Leu Ala Arg Leu Val Ser Pro Lys Pro Val Ala 85 90 95 gag gtatgcattt gaacctcaga cagatttgca ttgatcttta ttatttgtaa cttacc 1303 Glu tattctttgc taacattttt cttgaaattc tcaaattata g tat tct gca gta tat 1359 Tyr Ser Ala Val Tyr 100 agg ttc agt cga gca tgt atc cta act ggt gga ttg ggg gtt gat gga 1407 Arg Phe Ser Arg Ala Cys Ile Leu Thr Gly Gly Leu Gly Val Asp Gly 105 110 115 120 gtt agt caa gcc caa gcc aac ttt ctt ctc cct gat atg aat aga ctc 1455 Val Ser Gln Ala Gln Ala Asn Phe Leu Leu Pro Asp Met Asn Arg Leu 125 130 135 gca ttg gag gca aaa tca gga tca ctc gct atc ttg ttt atc agc ttt g 1504 Ala Leu Glu Ala Lys Ser Gly Ser Leu Ala Ile Leu Phe Ile Ser Phe 140 145 150 gtgattaaga ctgactgtgt acaaaattat ataaagacat ttatatatgt acagtattca 1564 gataaactga tcacataatt ttcttcttgt ag ct ggt gcg caa aat tct caa 1616 Ala Gly Ala Gln Asn Ser Gln 155 ttt ggc att gat tca ggc aag att cat tca g gtacttccat ttcttcattg a 1668 Phe Gly Ile Asp Ser Gly Lys Ile His Ser 160 165 tataacattc taatattgaa aagttatgta tctttgggca ttaccaattt tccatgtaat 1728 agtatggaaa atctcagtcc tatttattaa caaaagaatt agggattctt tgactccaat 1788 tataagagtt tctgaaagtc ttttttttca ttaactctta ccatcggaag cgtttttttc 1848 tgccag ga aat ata gga gga cat tgt tta tgg agc aaa ata cct ctg caa 1898 Gly Asn Ile Gly Gly His Cys Leu Trp Ser Lys Ile Pro Leu Gln 170 175 180 tca ctg tat gcg tcg tgg cag aaa tca cca aac atg gac ttg gga cag 1946 Ser Leu Tyr Ala Ser Trp Gln Lys Ser Pro Asn Met Asp Leu Gly Gln 185 190 195 200 aga gta gac aca gtc tct ctt gtt gaa atg cag cct tgc ttc ata aag g 1995 Arg Val Asp Thr Val Ser Leu Val Glu Met Gln Pro Cys Phe Ile Lys 205 210 215 taaacactat tgcccaagtc ttcctcttgt tctatgactt tatgctccct gtattgaaat 2055 aaggactgtg tattgaactt cttttgttat ttgaaaaagt aaattggaag taattgctac 2115 tgtgaatttt atttttgcca ttagttttca gtcttgatta tttaaatgaa aatattacgg 2175 tataacttgt ccattgctgc ag cta aag tcc atg agt gag gaa aag tgt gtc 2227 Leu Lys Ser Met Ser Glu Glu Lys Cys Val 220 225 tcg att cag gtg ccc agc aat cca ctc acc tcg gtaactttgc acactttgct 2280 Ser Ile Gln Val Pro Ser Asn Pro Leu Thr Ser 230 235 atacttccat acattattct gaaatatcat gtaatcatat tcttacaatt cttacacttc 2340 ttatttgaag agc tct ccg cag caa gtg caa gtc acc ata tct gca gaa 2389 Ser Ser Pro Gln Gln Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Glu 240 245 250 gaa gtt ggg tca acg gaa aaa tct cct tat agt tca ttt tca tat aat 2437 Glu Val Gly Ser Thr Glu Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Phe Ser Tyr Asn 255 260 265 gac atc tct tcc tct tcc ttg ttg caa att atc ag gtaatcttca gtttagt 2489 Asp Ile Ser Ser Ser Ser Leu Leu Gln Ile Ile Arg 270 275 ctgcaatttc ttctgcgctc tcagatttct tgcctcatct cattatgatt ttttgtaatt 2549 gtataaaata tattggccgg tctgctatct cccttaatat atagttggca gttttcttga 2609 attgtgactg tcctcctctt ttatggggat tatacaagtc gttacgtaca actaaaaatg 2669 tccatctcgt taagttgact ctataccact acattcattg catag g ttg aga aca 2724 Leu Arg Thr 280 gga aat gta gtt ttc aac tac aga tac tat aac aac aaa ttg cag aag 2772 Gly Asn Val Val Phe Asn Tyr Arg Tyr Tyr Asn Asn Lys Leu Gln Lys 285 290 295 act gaa g gtaactagta ttattttaac ctgtttcata cccatgtgtg tctatatttc 2829 Thr Glu atccgttacc ctaacctgtt acgtatatgt ttgctatgtg tcttgcag ta act gaa 2885 Val Thr Glu 300 gac ttt tct tgt cca ttc tgc tta gta aaa tgt gcc agt ttc aag gtgga 2935 Asp Phe Ser Cys Pro Phe Cys Leu Val Lys Cys Ala Ser Phe Lys 305 310 315 ctttcatttc cattctcatt catcctctta gtcaaagata cagctgtagt gactagtctt 2995 tgtagtgatg caatcttttc tttttctccc aatcatgttg tag ggc ctg aga tat 3050 Gly Leu Arg Tyr 320 cac ttg cca tca acc cac gat ctc ctc aat ttc gag ttt tgg gttgtagct 3101 His Leu Pro Ser Thr His Asp Leu Leu Asn Phe Glu Phe Trp 325 330 335 ttaaaattca gttaacctgt ttgatctttt ttttttattt tgtgggtgcc actaatctgc 3161 tttacttggt tag gta act gaa gaa ttt cag gcg gta aat gtc tcc ctc 3210 Val Thr Glu Glu Phe Gln Ala Val Asn Val Ser Leu 340 345 aag act gag aca atg ata tcc aag gttagaacat cttgtttgtt cgatttatgt 3264 Lys Thr Glu Thr Met Ile Ser Lys 350 355 tcattagttt ctctgctgta tatcttatag gctgtaacaa attcattttt catttaaact 3324 aatatcctcc atgggttgtt gacttttgtg tggttaaata agggaactgg aatctttagt 3384 tgctatttgt cacactatga tccttgctat tgtccttaat agcgtgatga gaataaactc 3444 aaaatgacat cgctgttctg tttacttttt gtggccatga gaccgtcaaa gctcgactgt 3504 agaataaagt cctggattat ataggagtgt caaatctaat tgaagtagtt ggttctacaa 3564 tatattctat gtctttgtag tttttcctat ttgatgatta ctcttagcac agttttctaa 3624 atgttaatgt tcattaaaaa atctgctcag gtt aat gag gat gac gtt gac cca 3678 Val Asn Glu Asp Asp Val Asp Pro 360 aag cag caa act ttc ttt ttt tc gtaagttatc tggcctatat gttgcctttt 3731 Lys Gln Gln Thr Phe Phe Phe Ser 365 370 attatctttc cagcatctgt gtgagaccat aaaaattctt caatatgtga cag t tcc 3788 Ser aaa aaa ttc aga cgg agg agg caa aag agt cag gta cgg agc tca agg 3836 Lys Lys Phe Arg Arg Arg Arg Gln Lys Ser Gln Val Arg Ser Ser Arg 375 380 385 caa ggg cct cat ctt gga tta ggt tgc gag gtg cta gat aag act gat g 3885 Gln Gly Pro His Leu Gly Leu Gly Cys Glu Val Leu Asp Lys Thr Asp 390 395 400 gtatgtgttt gactgaaatg acagttaatt ggatttgtag tattggcttc ttttgtgatg 3945 agagcctgtc ttagttgtat attttacgag tattttactt tgttatgtgc aattttgcat 4005 gcaacaacgt tggatcattt ggcacagctt tttattctta ctttcag at gct cat 4060 Asp Ala His 405 tct gtt aga agt gag aag agc cga ata cca cct gga aag cat tac gaa 4108 Ser Val Arg Ser Glu Lys Ser Arg Ile Pro Pro Gly Lys His Tyr Glu 410 415 420 aga att ggg ggt gct gag tct ggt caa aga gtt cct cct ggc acg agt 4156 Arg Ile Gly Gly Ala Glu Ser Gly Gln Arg Val Pro Pro Gly Thr Ser 425 430 435 cct gca gac gtg caa tca tgt ggg gat cca gat tat gtg cag tcg ata 4204 Pro Ala Asp Val Gln Ser Cys Gly Asp Pro Asp Tyr Val Gln Ser Ile 440 445 450 455 gct gga agt aca atg ttg cag ttt gca aaa acg agg aaa ata tct ata 4252 Ala Gly Ser Thr Met Leu Gln Phe Ala Lys Thr Arg Lys Ile Ser Ile 460 465 470 gaa cgg tcg gac ttg agg aa gtatgtttga cttccttttg tcgttctatc ctctt 4307 Glu Arg Ser Asp Leu Arg Asn 475 cttcaattta tatttaacta catatggttc atgcatgaaa aattgtgtcc tagttttata 4367 acaagtagct tgttaatccc aaatgatgtg agtgagtttt tcaaattttt tcctcctcca 4427 g c cga agc ctc ctt cag aag aga cag ttc ttc cac tct cat cga gct 4474 Arg Ser Leu Leu Gln Lys Arg Gln Phe Phe His Ser His Arg Ala 480 485 490 cag gtgatctttt ttctttagct ctcttgcttt tgaagattgc aattgatttt gacttt 4533 Gln gctatgtgta ctatcgcag ccc atg gct cta gaa caa gta ctt tcg gac cgg 4585 Pro Met Ala Leu Glu Gln Val Leu Ser Asp Arg 495 500 505 gat agt gaa gat gaa gtt gat gat gat gtg gca gat ttt gaa gat aga 4633 Asp Ser Glu Asp Glu Val Asp Asp Asp Val Ala Asp Phe Glu Asp Arg 510 515 520 agg gtatgttttt gaatttaata ttttcaccgc atcagtagtt gggtagaata aagctc 4692 Arg agtagttggg tagatatatg tttcatgtga aagggaaagg aatattgaag actgggcatg 4752 ggcaaacgtt aggagcaata ttgtaatggt tcagagatca atagaaaata tgtgagcaag 4812 cctcacggtt tgatatggaa cagtagaacc agatcattag tgcttatata acactcatta 4872 aaagacgaag tgtgtccgtt tgtactcgat tctaacatag ttgattctaa catagtttgt 4932 ctgattctcc atatagtgaa taacgttatt tcctattact attctttcag atg ctc 4988 Met Leu gat gat ttc gtt gat gtg act aaa gat gag aaa cag atg atg cac atg 5036 Asp Asp Phe Val Asp Val Thr Lys Asp Glu Lys Gln Met Met His Met 525 530 535 540 tgg aac tcg ttt gtg agg aag cag cg gtatgtctta tctcttttca gtacatgt 5090 Trp Asn Ser Phe Val Arg Lys Gln Arg 545 cacgtggagt tttccagtat aaacatttag agtcgcgcat gtaaaggttg tggataattc 5150 ctgcctgggt tcttctggtt aaaaaaaaaa aactgaacaa ttagataaca tacgcatcca 5210 tgttctctga ctcattataa gcattacctt gacagtggtt ttggaccctt tgcag a 5266 gta tta gca gat ggt cac att cca tgg gca tgc gag gca ttc tca aga 5314 Val Leu Ala Asp Gly His Ile Pro Trp Ala Cys Glu Ala Phe Ser Arg 550 555 560 565 ttg cac gga ccc atc atg gtt cga aca ccg cac ttg att tg gtaattcaac 5365 Leu His Gly Pro Ile Met Val Arg Thr Pro His Leu Ile Trp 570 575 tctcatttct tccattgttt tttccagtgt atcggagaag aaagcggttt tgttgataaa 5425 agtgagcttt ttttgtgtag g tgc tgg aga gtg ttt atg gtg aaa ctg tgg 5476 Cys Trp Arg Val Phe Met Val Lys Leu Trp 580 585 aac cac ggt ctt ctt gat gcc cga acc atg aac aac tgt aat acc ttt 5524 Asn His Gly Leu Leu Asp Ala Arg Thr Met Asn Asn Cys Asn Thr Phe 590 595 600 605 ctc gaa cag ctc caa att tgaaaaccca agaaatcatt aatttaagta gaaaaaca 5580 Leu Glu Gln Leu Gln Ile 610 611 <210> 4<211> 23<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description
of Artificial Sequence:ArtificiallySynthesized Oligonucleotide Primer Se
quence<400> 4ggatccgaac ccgactcggt acc
23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Oligonucleotide Primer Sequence <400> 5 gcttatggat gtggactctc taac 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Oligonucleotide Primer Sequence <400> 6 aggtcctaca actacaacag tt 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Oligonucleotide Primer Sequence <400> 7 gaggaagcta gtattctctt tg 22 <210> 8 <211> 604 <212> PRT <213> Oryza sativa <220> <221> ZN_FING <222> (310)..(335) <400> 8 Met Cys Arg His Gln Pro Arg Ala Arg Leu Ser Pro Asp Glu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Ala Glu Glu Ser Phe Ala Leu Tyr Cys Lys Pro Val Glu Leu Tyr 20 25 30 Asn Ile Ile Gln Arg Arg Ser Ile Lys Asn Pro Ala Phe Leu Gln Arg 35 40 45 Cys Leu Leu Tyr Lys Ile His Ala Arg Arg Lys Lys Arg Ser Leu Ile 50 55 60 Thr Ile Ser Leu Ser Gly Gly Thr Asn Lys Glu Leu Arg Ala Gln Asn 65 70 75 80 Ile Phe Pro Leu Tyr Val Leu Leu Ala Arg Pro Thr Asn Asn Val Ser 85 90 95 Leu Glu Gly His Ser Pro Ile Tyr Arg Phe Ser Arg Ala Cys Leu Leu 100 105 110 Thr Ser Phe His Glu Phe Gly Asn Lys Asp Tyr Thr Glu Ala Thr Phe 115 120 125 Val Ile Pro Asp Val Lys Asn Leu Ala Thr Ser Arg Ala Cys Ser Leu 130 135 140 Asn Ile Ile Leu Ile Ser Cys Gly Arg Ala Glu Gln Thr Phe Asp Asp 145 150 155 160 Asn Asn Cys Ser Gly Asn His Val Glu Gly Ser Thr Leu Gln Lys Leu 165 170 175 Glu Gly Lys Cys Phe Trp Gly Lys Ile Pro Ile Asp Leu Leu Ala Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Asn Cys Val Ser Leu Ser Leu Gly His Thr Val Glu Met 195 200 205 Ser Ser Thr Val Glu Met Thr Pro Ser Phe Leu Glu Pro Lys Phe Leu 210 215 220 Glu Asp Asp Ser Cys Leu Thr Phe Cys Ser Gln Lys Val Asp Ala Thr 225 230 235 240 Gly Ser Phe Gln Leu Gln Val Ser Ile Ser Ala Gln Glu Ala Gly Ala 245 250 255 Lys Asp Met Ser Glu Ser Pro Tyr Ser Val Tyr Ser Tyr Asn Asp Val 260 265 270 Pro Pro Ser Ser Leu Thr His Ile Ile Arg Leu Arg Ser Gly Asn Val 275 280 285 Leu Phe Asn Tyr Lys Tyr Tyr Asn Asn Thr Met Gln Lys Thr Glu Val 290 295 300 Thr Glu Asp Phe Ser Cys Pro Phe Cys Leu Val Pro Cys Gly Ser Phe 305 310 315 320 Lys Gly Leu Gly Cys His Leu Asn Ala Ser His Asp Leu Phe His Tyr 325 330 335 Glu Phe Trp Ile Ser Glu Glu Cys Gln Ala Val Asn Val Ser Leu Lys 340 345 350 Thr Asp Ser Trp Arg Thr Glu Leu Leu Ala Glu Gly Val Asp Pro Arg 355 360 365 His Gln Thr Phe Ser Tyr Arg Ser Arg Phe Lys Lys Arg Lys Arg Val 370 375 380 Glu Ile Ser Ser Asp Lys Ile Arg His Val His Pro His Ile Val Asp 385 390 395 400 Ser Gly Ser Pro Glu Asp Ala Gln Ala Gly Ser Glu Asp Asp Tyr Val 405 410 415 Gln Arg Glu Asn Gly Ser Ser Val Ala His Ala Ser Val Asp Pro Ala 420 425 430 Asn Ser Leu His Gly Ser Asn Leu Ser Ala Pro Thr Val Leu Gln Phe 435 440 445 Gly Lys Thr Arg Lys Leu Ser Val Glu Arg Ala Asp Pro Arg Asn Arg 450 455 460 Gln Leu Leu Gln Lys Arg Gln Phe Phe His Ser His Arg Ala Gln Pro 465 470 475 480 Met Ala Trp Ser Lys Val Phe Ser Asp Arg Asp Ser Glu Asp Glu Val 485 490 495 Asp Asp Asp Ile Ala Asp Phe Glu Asp Arg Arg Met Leu Asp Asp Phe 500 505 510 Val Asp Val Thr Lys Asp Glu Lys Leu Ile Met His Met Trp Asn Ser 515 520 525 Phe Val Arg Lys Gln Arg Val Leu Ala Asp Gly His Ile Pro Trp Ala 530 535 540 Cys Glu Ala Phe Ser Gln Phe His Gly Gln Glu Leu Val Gln Asn Pro 545 550 555 560 Ala Leu Leu Trp Cys Trp Arg Phe Phe Met Val Lys Leu Trp Asn His 565 570 575 Ser Leu Leu Asp Ala Arg Ala Met Asn Ala Cys Asn Thr Ile Leu Glu 580 585 590 Gly Tyr Leu Asn Gly Ser Ser Asp Pro Lys Lys Asn 595 600 <210> 9 <211> 2248 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (86)..(1897) <220> <221> misc_feature <222> (36)..(41) <223> NheI recognition site <400> 9 cgccgatccc catccctccc gcgagcagga gcagggctag ccgtcgttcc tcctgctgct 60 tccgccgcat ccatcctgat accag atg tgc cgc cac cag cca agg gct cgg 112 Met Cys Arg His Gln Pro Arg Ala Arg 1 5 ctc tct ccc gat gag cag ctt gca gct gaa gaa agc ttc gca tta tac 160 Leu Ser Pro Asp Glu Gln Leu Ala Ala Glu Glu Ser Phe Ala Leu Tyr 10 15 20 25 tgc aag ccg gtc gag ttg tat aat atc att cag cgc cga tcc att aaa 208 Cys Lys Pro Val Glu Leu Tyr Asn Ile Ile Gln Arg Arg Ser Ile Lys 30 35 40 aat cct gct ttt ctt caa aga tgc ctt ctt tac aag att cac gca aga 256 Asn Pro Ala Phe Leu Gln Arg Cys Leu Leu Tyr Lys Ile His Ala Arg 45 50 55 cgg aag aag agg agc ctg ata acc ata tca ctt tct gga ggc aca aat 304 Arg Lys Lys Arg Ser Leu Ile Thr Ile Ser Leu Ser Gly Gly Thr Asn 60 65 70 aaa gaa ctg cgg gca caa aat atc ttt cct ctt tat gtt ctg tta gct 352 Lys Glu Leu Arg Ala Gln Asn Ile Phe Pro Leu Tyr Val Leu Leu Ala 75 80 85 aga cct act aat aat gtt tca ctt gaa ggg cat tct ccg ata tat cga 400 Arg Pro Thr Asn Asn Val Ser Leu Glu Gly His Ser Pro Ile Tyr Arg 90 95 100 105 ttc agt cgt gct tgt ttg ttg act tct ttt cat gaa ttt gga aat aaa 448 Phe Ser Arg Ala Cys Leu Leu Thr Ser Phe His Glu Phe Gly Asn Lys 110 115 120 gac tac act gaa gca aca ttc gtc att cct gat gtg aag aac tta gca 496 Asp Tyr Thr Glu Ala Thr Phe Val Ile Pro Asp Val Lys Asn Leu Ala 125 130 135 acc tcc cga gct tgc agc ctt aat att atc ctt atc agc tgt gga cga 544 Thr Ser Arg Ala Cys Ser Leu Asn Ile Ile Leu Ile Ser Cys Gly Arg 140 145 150 gct gag caa act ttt gat gac aat aac tgt tct ggg aac cat gtg gaa 592 Ala Glu Gln Thr Phe Asp Asp Asn Asn Cys Ser Gly Asn His Val Glu 155 160 165 ggc tct act ctc caa aag ctt gaa ggg aag tgt ttc tgg ggt aaa ata 640 Gly Ser Thr Leu Gln Lys Leu Glu Gly Lys Cys Phe Trp Gly Lys Ile 170 175 180 185 cca atc gat ctt ctt gct tca tct ttg gga aat tgt gtg agc tta agt 688 Pro Ile Asp Leu Leu Ala Ser Ser Leu Gly Asn Cys Val Ser Leu Ser 190 195 200 ttg gga cat acc gtg gaa atg tct tcc acg gtt gag atg acc cca agc 736 Leu Gly His Thr Val Glu Met Ser Ser Thr Val Glu Met Thr Pro Ser 205 210 215 ttc tta gag cca aaa ttt ctg gag gat gac agt tgc ttg aca ttt tgc 784 Phe Leu Glu Pro Lys Phe Leu Glu Asp Asp Ser Cys Leu Thr Phe Cys 220 225 230 tct cag aag gtt gat gct act ggt tca ttt caa ctg caa gtt agc ata 832 Ser Gln Lys Val Asp Ala Thr Gly Ser Phe Gln Leu Gln Val Ser Ile 235 240 245 tct gct caa gag gct ggt gca aaa gac atg tcc gag tct cct tat agt 880 Ser Ala Gln Glu Ala Gly Ala Lys Asp Met Ser Glu Ser Pro Tyr Ser 250 255 260 265 gtt tat tca tat aat gat gtg cca cct tcg tca ttg aca cat att ata 928 Val Tyr Ser Tyr Asn Asp Val Pro Pro Ser Ser Leu Thr His Ile Ile 270 275 280 agg ttg aga tct ggc aat gtg ctt ttt aac tac aaa tac tac aat aat 976 Arg Leu Arg Ser Gly Asn Val Leu Phe Asn Tyr Lys Tyr Tyr Asn Asn 285 290 295 act atg caa aaa acc gaa gtc act gaa gat ttt tct tgc cca ttt tgc 1024 Thr Met Gln Lys Thr Glu Val Thr Glu Asp Phe Ser Cys Pro Phe Cys 300 305 310 ttg gta cca tgt ggc agc ttt aag ggt cta gga tgt cac cta aac gca 1072 Leu Val Pro Cys Gly Ser Phe Lys Gly Leu Gly Cys His Leu Asn Ala 315 320 325 tcg cat gac ctt ttc cat tat gag ttt tgg ata tct gaa gag tgc cag 1120 Ser His Asp Leu Phe His Tyr Glu Phe Trp Ile Ser Glu Glu Cys Gln 330 335 340 345 gct gtt aat gtt agt ctg aag act gat tct tgg aga aca gag ctt ttg 1168 Ala Val Asn Val Ser Leu Lys Thr Asp Ser Trp Arg Thr Glu Leu Leu 350 355 360 gct gag gga gtt gat cca aga cat caa aca ttt tcg tac cgc tca aga 1216 Ala Glu Gly Val Asp Pro Arg His Gln Thr Phe Ser Tyr Arg Ser Arg 365 370 375 ttt aag aag cgt aaa agg gtg gaa atc tca agt gat aaa att agg cat 1264 Phe Lys Lys Arg Lys Arg Val Glu Ile Ser Ser Asp Lys Ile Arg His 380 385 390 gta cat cca cat att gtg gat tca gga tca cct gaa gat gcc cag gca 1312 Val His Pro His Ile Val Asp Ser Gly Ser Pro Glu Asp Ala Gln Ala 395 400 405 gga tct gaa gac gat tac gtg cag agg gaa aat ggt agt tct gta gca 1360 Gly Ser Glu Asp Asp Tyr Val Gln Arg Glu Asn Gly Ser Ser Val Ala 410 415 420 425 cac gct tct gtt gat cct gct aat tca tta cac ggt agc aat ctt tca 1408 His Ala Ser Val Asp Pro Ala Asn Ser Leu His Gly Ser Asn Leu Ser 430 435 440 gca cca aca gtg tta cag ttt ggg aag aca aga aag ctg tct gtt gaa 1456 Ala Pro Thr Val Leu Gln Phe Gly Lys Thr Arg Lys Leu Ser Val Glu 445 450 455 cga gct gat ccc aga aat cgg cag ctc cta caa aaa cgc cag ttc ttt 1504 Arg Ala Asp Pro Arg Asn Arg Gln Leu Leu Gln Lys Arg Gln Phe Phe 460 465 470 cat tct cac agg gct caa cca atg gca tgg agc aaa gtt ttc tca gat 1552 His Ser His Arg Ala Gln Pro Met Ala Trp Ser Lys Val Phe Ser Asp 475 480 485 cgt gat agt gaa gat gaa gtt gat gat gac att gct gat ttt gaa gat 1600 Arg Asp Ser Glu Asp Glu Val Asp Asp Asp Ile Ala Asp Phe Glu Asp 490 495 500 505 aga aga atg ctt gat gat ttt gtt gat gtt aca aaa gac gag aaa ctt 1648 Arg Arg Met Leu Asp Asp Phe Val Asp Val Thr Lys Asp Glu Lys Leu 510 515 520 att atg cat atg tgg aat tca ttt gtt cgg aaa caa agg gta cta gcg 1696 Ile Met His Met Trp Asn Ser Phe Val Arg Lys Gln Arg Val Leu Ala 525 530 535 gat ggc cat att ccc tgg gca tgc gaa gca ttc tcg cag ttt cat gga 1744 Asp Gly His Ile Pro Trp Ala Cys Glu Ala Phe Ser Gln Phe His Gly 540 545 550 caa gaa ctt gta caa aat cca gct cta cta tgg tgt tgg agg ttt ttt 1792 Gln Glu Leu Val Gln Asn Pro Ala Leu Leu Trp Cys Trp Arg Phe Phe 555 560 565 atg gtc aaa ctc tgg aac cac agt cta ctg gat gcg cga gcc atg aat 1840 Met Val Lys Leu Trp Asn His Ser Leu Leu Asp Ala Arg Ala Met Asn 570 575 580 585 gcc tgc aac aca att ctt gaa ggc tac ctg aac gga agc tcg gat cca 1888 Ala Cys Asn Thr Ile Leu Glu Gly Tyr Leu Asn Gly Ser Ser Asp Pro 590 595 600 aag aaa aat tgacgcatac aaatcattgg ccaacctgta gagtaaaatg 1937 Lys Lys Asn cacttgtact ggttctggcc attccaatag tttgttttgt ttttggaaaa aaagatgtct 1997 gaagaattga aagctaacat gtgttttgga gggaagaaaa ttgaaggctg gggcggtcat 2057 tgtttcattt agaactcttc tcgattctat ttattgtaat tgatgttact cataactgta 2117 gagcagtatc aagaccaaac tgtaatgata tggttagcaa tatttacata aaagtttatt 2177 ttgtttgttg tttagcaccg tgggcagaca atttaattcc tatgcaggcc ctttttcatc 2237 gtcaaaaaaa a 2248 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Oligonucleotide Primer Sequence <400> 10 gacgagaaac ttattatgca tatg 24 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Oligonucleotide Primer Sequence <400> 11 ggtcttgata ctgctctaca gttatg 26 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 12 Lys Arg Gln Phe Phe His Ser 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 13 Trp Ala Cys Glu Ala Phe 1 5 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Oligonucleotide Primer Sequence <400> 14 aagcggcaat tttaycaytc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Oligonucleotide Primer Sequence <400> 15 aagcggcagt tctaycaytc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Oligonucleotide Primer Sequence <400> 16 aagcggcagt tctaycayag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Oligonucleotide Primer Sequence <400> 17 aagcggcaat tttaycayag 20 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Oligonucleotide Primer Sequence <400> 18 aatacctcac angccca 17 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Oligonucleotide Primer Sequence <400> 19 aatacttcgc angccca 17 <210> 20 <211> 1216 <212> DNA <213> Beta vulgaris <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Oligonucleotide Primer "KR1" Sequence <220> <221> CDS <222> (21)..(33) <220> <221> intron <222> (34)..(694) <220> <221> CDS <222> (695)..(778) <220> <221> intron <222> (779)..(951) <220> <221> CDS <222> (952)..(1031) <220> <221> intron <222> (1032)..(1174) <220> <221> CDS <222> (1175)..(1199) <220> <221> misc_feature <222> (1200)..(1216) <223> Oligonucleotide Primer "WA2" Sequence <400> 20 aagcggcaat tttatcattc t cac aga gct cag gtaatcaact gcagaagtca tat 56 His Arg Ala Gln 1 cgtgttatgc tgatgtctga actcctataa tataacagtt gttgactctt tgtttcctat 116 agtagttgtc ttgatggttg atcaaatttt gacaacattt cagcattctt aaacatcttt 176 tcattatttt ttatttacaa agagtagtaa ttcaagcacc ataagaaaca ctgatcaata 236 gtttcttgca agttcttgaa cacttaataa gcagaggggt acttttaaat attcagcatt 296 tgtttgataa tctcaggtgt tttggacttg ctatatgtac ctgatgacac cgctttagtt 356 tcaactagga tatggcgcta aatgggggaa aattgataaa gtcgagtagc aaaaatgatt 416 aggattttaa cgtggtgttt ctccttttct ctctcaagtt cattgtggtg tgccatctat 476 agaaatgtct cgggttgtac tttttctatg gaaatgcagg cgtcgtttca gagtttgttc 536 tctgcttctc tcaatagtca attcagataa gccactttca ctgcaacctt gactgctact 596 cttggacttc aaattctagt cctctttgtc tttgtatcat tcttcaattt ttccaattga 656 tgatgctgat tttgaaaaac tcctctttgc acccgaag cca atg gct ctg gat caa 712 Pro Met Ala Leu Asp Gln 5 10 gta ttg tca gac agg gat agt gag gat gaa gtg gat gat gat att gct 760 Val Leu Ser Asp Arg Asp Ser Glu Asp Glu Val Asp Asp Asp Ile Ala 15 20 25 gct ctt gaa gat aga agg gtacgtttgg ttattttcca aattttttga gttgcttg 816 Ala Leu Glu Asp Arg Arg 30 cgtgattaac aatttttgat ctagtaatgg ttcttgcttc tagccaagtc tttgaatttc 876 taatgtaata gttatctttt tcttgagtgc attttgctaa ctaaaccgtg tatggtacct 936 tgccttgtgc tgcag atg ctt gat gat ttt gtg gat gta agc aaa gac gaa 987 Met Leu Asp Asp Phe Val Asp Val Ser Lys Asp Glu 35 40 aaa cac cta atg cat cta tgg aac tca ttt gta aaa aag caa ag gtagac 1037 Lys His Leu Met His Leu Trp Asn Ser Phe Val Lys Lys Gln Arg 45 50 55 tttgttatgc aattgtcccg tttgtttaat ttctttctcc attgtgaatg cttgcgtagt 1097 gtgctcccga agtatttttg atggcgctta cctgtggttg tttggctttg tgtaatgttt 1157 ccatttttgt gcaccag g gtt ttg gct gat ggt cat gtt ccc tgggcatgcg a 1211 Val Leu Ala Asp Gly His Val Pro 60 65 67 agtatt 1216

【図面の簡単な説明】

【図１】 シロイヌナズナの「MPC1」遺伝子を含む染色
体領域のDNAクローン群とマーカー16EB53，z11-1の位置関係
を示す図である。図中、白抜きの矢印は「MPC1」遺伝子
の位置と向きを表す。

【符号の説明】

11K22： DNAクローンを表す。 22K2： DNAクローンを表す。 19A20： DNAクローンを表す。 20I12： DNAクローンを表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 平塚 純造 千葉県茂原市東郷1144番地 三井化学株 式会社内 (72)発明者 三輪 龍士 東京都千代田区猿楽町１丁目５番18号 千代田本社ビル３Ｆ 三井化学プラテッ ク株式会社内 (72)発明者 高橋 滋 千葉県茂原市東郷1144番地 三井化学株 式会社内 (56)参考文献 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６［１ ］（1994）ｐ．75−83

Claims (16)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１に示されたアミノ酸配列か
   らなる花成抑制活性を有するタンパク質をコードするＤ
   ＮＡ。
2. 【請求項２】 配列番号：１に示されたアミノ酸配列の
   幾つかのアミノ酸残基について、欠失、置換、付加およ
   び／または挿入の変化が生じたアミノ酸配列からなり、
   かつ花成抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮ
   Ａ。
3. 【請求項３】 配列番号：２に示された塩基配列のコー
   ド領域を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号：２に示された塩基配列からな
   るＤＮＡと50℃で6×SSC、0.1％SDS溶液においてハイブ
   リダイズし、かつ花成抑制活性を有するタンパク質をコ
   ードするＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列番号：８に示されたアミノ酸配列か
   らなる花成抑制活性を有するタンパク質をコードするＤ
   ＮＡ。
6. 【請求項６】 配列番号：８に示されたアミノ酸配列の
   幾つかのアミノ酸残基について、欠失、置換、付加およ
   び／または挿入の変化が生じたアミノ酸配列からなり、
   かつ花成抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮ
   Ａ。
7. 【請求項７】 配列番号：９に示された塩基配列のコー
   ド領域を含む、請求項５に記載のＤＮＡ。
8. 【請求項８】 配列番号：９に示された塩基配列からな
   るＤＮＡと50℃で6×SSC、0.1％SDS溶液においてハイブ
   リダイズし、かつ花成抑制活性を有するタンパク質をコ
   ードするＤＮＡ。
9. 【請求項９】 ジンクフィンガー構造を有するタンパク
   質をコードする、請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮ
   Ａ。
10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮ
    Ａを含む発現カセットを含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子。
11. 【請求項１１】 以下のi)〜iii)の構成要素を含む発現
    カセットを含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子。 i) 植物細胞内で転写可能なプロモーター、 ii) 該プロモーターにアンチセンス方向で結合した請求
    項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡ、および選択的に、 iii) ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関
    し、植物で機能するシグナル。
12. 【請求項１２】 請求項１０に記載の組換え二本鎖ＤＮ
    Ａ分子が導入された形質転換細胞。
13. 【請求項１３】 請求項１１に記載の組換え二本鎖ＤＮ
    Ａ分子が導入されたトランスジェニック植物細胞。
14. 【請求項１４】 請求項１３に記載のトランスジェニッ
    ク植物細胞を含むトランスジェニック植物体。
15. 【請求項１５】 請求項１４に記載のトランスジェニッ
    ク植物体の作製方法であって、 （ａ）請求項１１に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子を植
    物細胞に導入する工程、および （ｂ）該植物細胞を再生する工程、を含む方法。
16. 【請求項１６】 請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮ
    Ａの転写産物の全体に相補的なアンチセンスＲＮＡをコ
    ードするＤＮＡ。