CN106232822A - 耐旱性植物和相关构建体及涉及编码dtp4多肽的基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供用于提供胁迫耐受性的分离的多核苷酸和多肽及重组DNA构建体、连同包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)、以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接至在植物中有功能的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DTP4多肽。

Description

耐旱性植物和相关构建体及涉及编码DTP4多肽的基因的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2013年12月30日的美国临时申请61/921754的权益，其全部内容以引用方式并入本文。
对以电子方式提交的序列表的引用
通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表提交，该文件名称为20141218_BB1672PCT_SequenceListing，创建日期为2014年12月18日，文件大小为1,461千字节，并且该文件与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明领域涉及植物育种和遗传学，尤其是涉及在植物中用于赋予耐旱性的重组DNA构建体。
背景技术
非生物胁迫是世界范围内作物损失的主要原因，它引起主要作物超过50％的平均产量损失(Boyer，J.S.(1982)Science 218：443-448；Bray，E.A.等人(2000)，Biochemistryand Molecular Biology of Plants，由Buchannan，B.B.等人编辑，Amer.Soc.PlantBiol.，第1158-1203页)。在多种非生物胁迫中，干旱是限制世界范围内作物产量的主要因素。在不同发育阶段使植物暴露于水限制环境似乎活化了多个生理和发育变化。了解干旱胁迫感应、转导和耐受性的基本生物化学和分子机制是生物学上的主要挑战。已经出版了对非生物胁迫响应的分子机制和干旱胁迫耐受性的基因调控网络的综述(Valliyodan，B.和Nguyen，H.T.，(2006)Curr.Opin.Plant Biol.9：189-195；Wang，W.等人(2003)，Planta218：1-14)；Vinocur，B.和Altman，A.(2005)Curr.Opin.Biotechnol.16：123-132；Chaves，M.M.和Oliveira，M.M.(2004)J.Exp.Bot.55：2365-2384；Shinozaki，K.等人(2003)，Curr.Opin.Plant Biol.6：410-417；Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(2005)Trends Plant Sci.10：88-94)。
可限制作物产量的另一种非生物胁迫是低氮胁迫。植物的氮吸收在它们的生长中起到重要作用(Gallais等人，J.Exp.Bot.55(396)：295-306(2004))。植物从环境中的无机氮合成氨基酸。因此，氮肥已经成为提高栽培植物如玉米和大豆的产量的有力工具。如果能提高植物的氮同化能力，那么也可预期植物生长和产量的提高。概括地说，具有更好的氮利用效率(NUE)的植物品种是所期望的。
发明内容
本公开包括：
本公开的一个实施方案是在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。在一个实施方案中，所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出产量、生物量或两者的提高。在一个实施方案中，所述植物在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的所述对照植物进行比较时表现出产量、生物量或两者的所述提高。
本公开的一个实施方案也包括本文公开的植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体，该构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121 123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性，并且其中由所述种子产生的植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型的提高：干旱胁迫耐受性、三重胁迫耐受性、渗透胁迫耐受性、氮胁迫耐受性、分蘖数、产量和生物量。
本公开的一个实施方案是提高植物中的胁迫耐受性的方法，其中胁迫选自：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控序列的多核苷酸，其中多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性；(b)由(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及(c)获取来源于(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出对至少一个选自下列的胁迫的提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。
本公开也包括选择具有提高的胁迫耐受性的植物的方法，其中胁迫选自：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫，该方法包括：(a)获取转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，该构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性；(b)使部分(a)的转基因植物在其中该多核苷酸得以表达的条件下生长；以及(c)选择在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有提高的胁迫耐受性的部分(b)的转基因植物，其中胁迫选自；干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。
本公开的一个实施方案是选择产量、生物量或两者发生改变的植物的方法，该方法包括：(a)获取转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，该构建体包含可操作地连接至至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性；(b)使部分(a)的转基因植物在其中该多核苷酸得以表达的条件下生长；以及(c)选择在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出产量、生物量或两者的改变的部分(b)的转基因植物。在一个实施方案中，所述选择步骤(c)包括确定(b)的转基因植物在水限制条件下与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出产量、生物量或两者的改变。在一个实施方案中，所述改变为提高。
本公开也包括分离的多核苷酸，其包含：(a)编码具有胁迫耐受性活性的多肽的核苷酸序列，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫，并且其中多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131132，135，627或628进行比较时具有至少95％的序列同一性；或者(b)(a)的核苷酸序列的全长互补序列。该多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628。在一个实施方案中，核苷酸序列包含SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122。
本公开也包括包含重组DNA构建体的植物或种子，其中重组DNA构建体包含本文公开的任何多核苷酸，其中多核苷酸可操作地连接至至少一个异源调控序列。
在另一个实施方案中，植物在其基因组中包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的内源多核苷酸，其中所述内源多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含异源调控元件的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。
一个实施方案是提高作物植物中至少一个选自下列的表型的方法：三重胁迫耐受性、干旱胁迫耐受性、氮胁迫耐受性、渗透胁迫耐受性、ABA响应、分蘖数、产量和生物量，该方法包括提高作物植物中羧酸酯酶的表达。在一个实施方案中，作物植物是玉米。在一个实施方案中，羧酸酯酶在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性。在一个实施方案中，当利用SEQ ID NO：18，29，33，45，47，53，55，61，64，65，77，78，101，103，105，107，111，115，131，132，135，137，139，141，144，433，559和604制备的概形隐马尔可夫模型(Profile Hidden Markov Model)进行查询时，羧酸酯酶提供1E-15或更小的E-值评分，该查询使用hmmsearch算法进行，其中Z参数设为10亿。
另一个实施方案是制备在与对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型的植物的方法：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量，该方法包括以下步骤：将重组DNA构建体引入到植物中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性。
另一个实施方案是制备表现出至少一个选自下列的表型的植物的方法：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量，其中该方法包括由包含重组DNA构建体的种子生长植物，其中重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性，其中该植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量。
另一个实施方案是制备种子的方法，该方法包括以下步骤：(a)使第一植物与第二植物杂交，其中第一植物和第二植物中的至少一个包含重组DNA构建体，其中该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性；以及(b)选择杂交步骤(a)的种子，其中该种子包含重组DNA构建体。由部分(b)的种子生长的植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量。
在一个实施方案中，从种子生产油或种子副产物、或两者的方法包括从种子提取油或种子副产物、或两者，该种子包含重组DNA构建体，其中该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性。在一个实施方案中，种子获取自包含重组DNA构建体并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型的植物：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量。在一个实施方案中，油或种子副产物、或两者，包含重组DNA构建体。
在另一个实施方案中，本公开包括本公开的任何方法，其中植物选自：
拟南芥属(Arabidopsis)、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
在另一个实施方案中，本公开涉及包含本公开的可操作地连接至至少一个异源调控序列的任何分离多核苷酸的重组DNA构建体、以及包含该重组DNA构建体的细胞、微生物、植物和种子。细胞可为真核细胞如酵母、昆虫或植物细胞，或者原核细胞如细菌细胞。
在另一个实施方案中，植物在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18进行比较时具有至少95％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量。
在另一个实施方案中，一种方法制备在与对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型的植物：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量，该方法包括以下步骤：将重组DNA构建体引入到植物中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18进行比较时具有至少95％的序列同一性。
附图和序列表简述
由下列的“具体实施方式”及构成本申请的一部分的附图和序列表可以更完全地理解本公开。
图1A-图1G示出在ABA敏感性测定中测试的DTP4多肽(SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，99，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627和628)的比对。在给定位点与共有序列(SEQ ID NO：630)的残基相同的残基在框中框出，如果一个残基在所有序列中相同，显示该残基，示出共有序列(SEQID NO：630)，否则用句点表示。
图1C示出氧负离子洞(用星号表示)的保守关键残基，图1D示出保守亲核弯头，图1D、1F和1G也用阴影框示出催化三联体Ser-His-Asp。这些一起形成多肽的三级结构。
图2示出图1A-1G中显示的DTP4多肽的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异度值。
图3示出用于筛选具有提高耐旱性的植物的处理时间表。
图4示出在1μM ABA的ABA响应分析中的pBC-yellow-At5g62180转基因和wt col-0拟南芥属(Arabidopsis)品系的发芽响应百分比。
图5示出用编码拟南芥属(Arabidopsis)前导基因At5g62180的pCV-DTP4转化的玉米品系的产量分析。
图6A和图6B分别示出在不同的四组分浓度下wt拟南芥属(Arabidopsis)植物和At5g62180转基因品系(品系ID 64)的10天分析中的％发芽，％绿度和％出真叶。0％四组分示为GM(生长培养基)。
图7是示出wt和At5g62180转基因品系在60％、65％和70％四组分浓度下48小时后的％发芽的图。
图8示出ABA-根分析的示意图。
图9示出不同ABA浓度对wt和At5g62180品系的作用。
图10示出用编码拟南芥属(Arabidopsis)前导基因At5g62180的pCV-DTP4ac转化的玉米品系在干旱胁迫下的第1年田间测试的产量分析。
图10A示出7个不同位置的产量分析，这些位置根据经受的胁迫进行分类。
图10B示出通过胁迫水平分组的所有位置的产量分析。
图11示出用编码拟南芥属(Arabidopsis)前导基因At5g62180的pCV-DTP4ac转化的玉米品系的农学特性分析。
图11A示出用编码拟南芥属(Arabidopsis)前导基因At5g62180的pCV-DTP4ac转化的玉米品系的穗高(EARHT)和植株高度(PLANTHT)分析。
图11B示出用编码拟南芥属(Arabidopsis)前导基因At5g62180的pCV-DTP4ac转化的玉米品系的热致脱落时间(TTSHD)、根倒伏或茎倒伏分析。
图12示出在ABA-响应分析中，在1μM ABA(图12A)和2μM ABA(图12B)下，过表达本文公开的一些DTP4多肽的拟南芥属(Arabidopsis)转基因植物与wt col-0拟南芥属(Arabidopsis)品系相比的发芽响应百分比。图12C示出如表8所示的一些其它DTP4多肽在1μMABA下的发芽响应百分比。
图13示出在如表9所示的ABA-响应分析中，在1μM ABA下，过表达本文公开的一些DTP4多肽的拟南芥属(Arabidopsis)转基因植物与wtcol-0拟南芥属(Arabidopsis)品系相比的绿子叶响应百分比。
图14示出用编码拟南芥属(Arabidopsis)前导基因At5g62180的pCV-DTP4ac转化的玉米品系在干旱胁迫下的第2年田间测试的产量分析。
图14A示出8个“无胁迫”位置的产量分析。
图14B示出5个“中度胁迫”位置的产量分析。
图14C示出5个“重度胁迫”位置的产量分析。
图14D示出通过干旱胁迫水平分组的所有位置的产量分析，并且最后一列示出所有位置的产量分析，无论其胁迫水平如何。
图15示出用编码拟南芥属(Arabidopsis)前导基因At5g62180的pCV-DTP4ac转化的玉米品系在低氮胁迫下的产量分析。
图16A示出用编码DTP4多肽的pCV-CXE8ac转化的玉米品系在不同干旱胁迫位置的产量分析，该多肽为AT-CXE8(At2g45600；SEQ ID NO：64)。
图16B示出用编码DTP4多肽的pCV-CXE8ac转化的玉米品系在通过不同干旱胁迫水平分组的所有位置的产量分析，该多肽为AT-CXE8(At2g45600；SEQ ID NO：64)。
图17示出在生长阶段V9通过质谱分析检测转基因玉米叶片中的DTP4蛋白。值为4个田间小区平行测定的平均值和标准误差。
图18示出在无胁迫和干旱胁迫条件下，用编码拟南芥属(Arabidopsis)前导基因AT-DTP4(At5g62180)的pCV-DTP4ac转化的玉米植物与不包含拟南芥属(Arabidopsis)基因的玉米植物相比的分蘖数。
图19示出在0μM和10μM ABA下，用编码拟南芥属(Arabidopsis)前导基因AT-DTP4(At5g62180)的pCV-DTP4ac转化的玉米植物对ABA的根和苗生长响应。该图表示在不同的两天完成的两个不同实验。
图20示出用编码拟南芥属(Arabidopsis)前导基因AT-DTP4(At5g62180)的pCV-DTP4ac转化的玉米植物中响应三重胁迫的叶片面积。该图表示在处理后(DAT)0、3和6天的叶片面积。
图21示出用编码拟南芥属(Arabidopsis)前导基因AT-DTP4(At5g62180)的pCV-DTP4ac转化的玉米植物中响应渗透胁迫的发芽响应百分比。该图表示在不同的两天完成的两个不同实验。
图22示出在透明高管分析中用编码拟南芥属(Arabidopsis)前导基因AT-DTP4(At5g62180)的pCV-DTP4ac转化的玉米植物的苗生长响应。
图23示出在大肠杆菌中表达的AT-DTP4融合蛋白的酯酶活性，其用p-硝基苯基乙酸酯作为底物。
图24示出显示DTP4多肽的系统发育树。
SEQ ID NO：1是来自pHSbarENDs2激活标记载体的4x35S增强子元件的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是attP1位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3是attP2位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是attL1位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：5是attL2位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6带有5’UTR和来自玉米(Zea mays)的第一内含子的遍在蛋白启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：7是来自马铃薯(Solanum tuberosum)的PinII终止子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：8是attR1位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：9是attR2位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：10是attB1位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：11是attB2位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12是At5g62180-5′attB正向引物的核苷酸序列，其包含attB1序列，用于扩增At5g62180蛋白-编码区。
SEQ ID NO：13是At5g62180-3’attB反向引物的核苷酸序列，其包含attB2序列，用于扩增At5g62180蛋白-编码区。
SEQ ID NO：14是VC062引物的核苷酸序列，其包含T3启动子和attB1位点，用于扩增克隆进II SK(+)载体(Stratagene)的cDNA插入序列。
SEQ ID NO：15是VC063引物的核苷酸序列，其包含T7启动子和attB2位点，用于扩增克隆进II SK(+)载体(Stratagene)的cDNA插入序列。
SEQ ID NO：16对应于NCBI GI No.30697645，它是来自编码拟南芥属(Arabidopsis)DTP4多肽的基因座At5g62180的cDNA序列。
SEQ ID NO：17对应于来自编码拟南芥属(Arabidopsis)DTP4多肽的基因座At5g62180的CDS序列。
SEQ ID NO：18对应于由SEQ ID NO：17编码的At5g62180的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19对应于具有替代密码子的At5g62180的序列。
表1示出获取自编码来自玉米(Zea mays)、草香碗蕨(Dennstaedtiapunctilobula)、刺田菁(Sesbania bispinosa)、三齿蒿(Artemisia tridentata)、宝盖草(Lamium amplexicaule)、花菱草(Eschscholzia californica)、宿根亚麻(Linumperenne)、莫愁菊(Delosperma nubigenum)、皱叶椒草(Peperomia caperata)、海韭菜(Triglochin maritime)、吊兰(Chlorophytum comosum)、大花美人蕉(Canna xgeneralis)的DTP4多肽的cDNA克隆的核苷酸序列SEQ ID NO。
也示出由cDNA编码的对应氨基酸序列的SEQ ID NO。
表2示出来自公开数据库的更多DTP4多肽的SEQ ID NO。
表1
编码DTP4多肽的cDNA
*“全长插入序列”(“FIS”)是整个cDNA插入序列的序列。
SEQ ID NO：62是编码AT-CXE8多肽的核苷酸序列；对应于At2g45600基因座(拟南芥(Arabidopsis thaliana))。
SEQ ID NO：63是带有替代密码子的AT-CXE8核苷酸序列。
SEQ ID NO：64是对应于NCBI GI No.75318485(AT-CXE8)的氨基酸序列，其由SEQID NO：62和63中给定的序列编码；(拟南芥(Arabidopsis thaliana))。
SEQ ID NO：65是对应于NCBI GI No.75318486(AT-CXE9)的氨基酸序列，其由基因座At2g45610.1(拟南芥(Arabidopsis thaliana))编码。
SEQ ID NO：66是对应于NCBI GI No.75335430(AT-CXE18)的氨基酸序列，其由基因座At5g23530.1(拟南芥(Arabidopsis thaliana))编码。
SEQ ID NO：67是对应于来自Michigan State University Rice GenomeAnnotation Project Osa1 release 6的稻(粳稻(japonica))预测蛋白的基因座LOC_Os08g43430.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：68是对应于来自Michigan State University Rice GenomeAnnotation Project Osa1 release 6的稻(粳稻(japonica))预测蛋白的基因座LOC_Os03g14730.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：69是对应于来自Michigan State University Rice GenomeAnnotation Project Osa1 release 6的稻(粳稻(japonica))预测蛋白的基因座LOC_Os07g44890.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：70是对应于来自Michigan State University Rice GenomeAnnotation Project Osa1 release 6的稻(粳稻(japonica))预测蛋白的基因座LOC_Os07g44860.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：71是对应于来自Michigan State University Rice GenomeAnnotation Project Osa1 release 6的稻(粳稻(japonica))预测蛋白的基因座LOC_Os07g44910.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：72是对应于来自US Department of energy Joint GenomeInstitute的高粱JGI基因序列1.4版的高粱(Sorghum bicolor)预测蛋白Sb07g025010.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：73是对应于来自US Department of energy Joint GenomeInstitute的高粱JGI基因序列1.4版的高粱(Sorghum bicolor)预测蛋白Sb01g040930.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：74是对应于来自US Department of energy Joint GenomeInstitute的大豆JGI Glyma1.01基因序列的预测编码序列的大豆(栽培大豆(Glycinemax))预测蛋白Glyma20g29190.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：75是对应于来自US Department of energy Joint GenomeInstitute的大豆JGI Glyma1.01基因序列的预测编码序列的大豆(栽培大豆(Glycinemax))预测蛋白Glyma20g29200.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：76是对应于来自US Department of energy Joint GenomeInstitute的大豆JGI Glyma1.01基因序列的预测编码序列的大豆(栽培大豆(Glycinemax))预测蛋白Glyma16g32560.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：77是对应于来自US Department of energy Joint GenomeInstitute的大豆JGI Glyma1.01基因序列的预测编码序列的大豆(栽培大豆(Glycinemax))预测蛋白Glyma07g09040.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：78是对应于来自US Department of energy Joint GenomeInstitute的大豆JGI Glyma1.01基因序列的预测编码序列的大豆(栽培大豆(Glycinemax))预测蛋白Glyma07g09030.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：79是对应于来自US Department of energy Joint GenomeInstitute的大豆JGI Glyma1.01基因序列的预测编码序列的大豆(栽培大豆(Glycinemax))预测蛋白Glyma03g02330.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：80是对应于来自US Department of energy Joint GenomeInstitute的大豆JGI Glyma1.01基因序列的预测编码序列的大豆(栽培大豆(Glycinemax))预测蛋白Glyma09g27500.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：81是如美国专利US7915050(拟南芥(Arabidopsis thaliana))的SEQID NO：12所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO：82是对应于NCBI GI No.194704970(玉米(Zea mays))的氨基酸序列。
SEQ ID NO：83是如美国专利公布US20120216318(玉米(Zea mays))的SEQ ID NO：260345所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO：84是对应于NCBI GI No.195636334(玉米(Zea mays))的氨基酸序列。
SEQ ID NO：85是如美国专利公布US20120216318的SEQ ID NO：331675所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO：86是对应于NCBI GI No.194707422(玉米(Zea mays))的氨基酸序列。
SEQ ID NO：87是如美国专利US8343764(玉米(Zea mays))的SEQ ID NO：7332所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO：88是对应于NCBI GI No.223948401(玉米(Zea mays))的氨基酸序列。
SEQ ID NO：89是如美国专利US7569389(玉米(Zea mays))的SEQ ID NO：16159所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO：90是对应于NCBI GI No.23495723(水稻(Oryza sativa))的氨基酸序列。
SEQ ID NO：91是如美国专利公布US20120017292(玉米(Zea mays))的SEQ ID NO：50819所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO：92是对应于NCBI GI No.215768720(水稻(Oryza sativa))的氨基酸序列。
SEQ ID NO：93是如美国专利US8362325(高粱(Sorghum bicolor))的SEQ ID NO：10044所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO：114是来自番木瓜(Carica papaya)的DTP4多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO：115是由如SEQ ID NO：114(番木瓜(Carica papaya))所示的核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：116是来自山嵛菜(Eutrema salsugineum)的多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO：117是由如SEQ ID NO：116(山嵛菜(Eutrema salsugineum))所示的核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：118是来自甘蓝型油菜(Brassica napus)和甘蓝(Brassicaoleracea)序列(Bn-Bo)的组装重叠群的核苷酸序列。
SEQ ID NO：119是由如SEQ ID NO：118所示的核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：120是来自甘蓝型油菜(Brassica napus)和甘蓝(Brassicaoleracea)序列(Bole-someBnap)的组装重叠群的核苷酸序列。
SEQ ID NO：121是由如SEQ ID NO：120所示的核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：122是来自甘蓝型油菜(Brassica napus)的EST的组装重叠群的核苷酸序列。
SEQ ID NO：123是由如SEQ ID NO：122所示的核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：124是来自甜橙(Citrus sinensis)和克莱门柚(Citrus clementina)的EST的组装重叠群的核苷酸序列。
SEQ ID NO：125是来自甜橙(Citrus sinensis)和克莱门柚(Citrus clementina)的DTP4多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：126是来自萝卜(Raphanus sativus)的DTP4多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：127是来自琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)的DTP4多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：128是来自无苞芥(Olimarabidopsis pumila)的DTP4多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：129是来自荠菜(Capsella rubella)的DTP4多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：130是来自荠菜(Capsella rubella)的DTP4多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：131是来自大白菜(Brassica rapa subsp.pekinensis)的DTP4多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：132是来自大白菜(Brassica rapa subsp.pekinensis)的DTP4多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：133是来自桃(Prunus persica)的DTP4多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：134和135是来自葡萄(Vitis vinifera)的2个DTP4同源物的氨基酸序列。
SEQ ID NO：136是葡萄(Vitis vinifera)DTP4多肽的核苷酸序列，命名为GSVIVT01027568001(unique_1)。
SEQ ID NO：137是葡萄(Vitis vinifera)DTP4多肽(GSVIVT01027568001；unique_1)的DTP4多肽序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：138是葡萄(Vitis vinifera)DTP4同源物的核苷酸序列，命名为GSVIVT01027566001(unique_2)。
SEQ ID NO：139是葡萄(Vitis vinifera)DTP4多肽(GSVIVT01027566001；unique_2)的DTP4多肽序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：140是葡萄(Vitis vinifera)DTP4同源物的核苷酸序列，命名为GSVIVT01027569001(unique_3)。
SEQ ID NO：141是葡萄(Vitis vinifera)DTP4多肽(GSVIVT01027569001；unique_3)的DTP4多肽序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：142-149是来自毛果杨(Populus trichocarpa)的DTP4多肽序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：627是由基因座At1g49660(AT-CXE5)(拟南芥(Arabidopsisthaliana))编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：628是由基因座At5g16080(AT-CXE17)(拟南芥(Arabidopsisthaliana))编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：629是在大肠杆菌(E.coli)中过表达的AT-DTP4融合蛋白的序列。
SEQ ID NO：630是获取自图1给定的序列比对的共有序列。
表2
DTP4多肽
本申请随附的序列说明和序列表符合美国联邦法规37 C.F.R.§1.821-1.825中关于专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的指导规则。
序列表以单个字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如IUPAC-IUBMB标准所规定，该标准如Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)和Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)所述，它们引入本文以供参考。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37℃.F.R.§1.822中所列出的规则。
具体实施方式
本文列出的每个参考文献的公开内容以引用方式全文并入本文。
本文中和随附的权利要求书中所用名词形式上为单数，但包括复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。因此，例如，提及“一株植物”包括多株此类植物，提及“一个细胞”包括提及一个或多个细胞以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。
如本文所用：
术语“AT-DTP4”一般是指由拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因座At5g62180编码的拟南芥(Arabidopsis thaliana)蛋白。术语“AT-DTP4”、“AT-CXE20”、“AT-羧酸酯酶”和“AT-羧酸酯酶20”在本文中可互换使用。“DTP4多肽”在本文中是指AT-DTP4多肽及其同源物或来自其它生物体的直系同源物。术语Zm-DTP4和Gm-DTP4分别指与AT-DTP4同源的玉米(Zea mays)和栽培大豆(Glycine max)蛋白。
如本文所述的术语DTP4多肽是指在说明书的表1和表2中给定的任何DTP4多肽。
术语DTP4多肽也涵盖下述多肽，其中该多肽当利用SEQ ID NO：18，29，33，45，47，53，55，61，64，65，77，78，101，103，105，107，111，115，131，132，135，137，139，141，144，433，559和604制备的概形隐马尔可夫模型(Profile Hidden Markov Model)进行查询时提供1E-15或更小的E-值评分，该查询使用hmmsearch算法进行，其中Z参数设为10亿。术语DTP4多肽本文也指下述多肽，其中该多肽当使用表18中提供的概形隐马尔可夫模型(ProfileHidden Markov Model)进行查询时提供1E-15或更小的E-值评分。
Nakajima等人(Plant Journal(2006)46，880-889)已经示出AT-DTP4多肽序列与赤霉素受体具有同源性，在重组AT-DTP4多肽中未检出GA结合能力。
基于系统发育分析，Marshall等人已经鉴定了由At5g62180编码为羧酸酯酶(CXE)的蛋白。通过RT-PCR表达分析，at-cxe20显示在几乎所有拟南芥属(Arabidopsis)组织中表达(Marshall等人，J Mol Evol(2003)57：487-500)。
羧酸酯酶的主要特征是保守的催化三联体。该活性位点由丝氨酸(被保守的共有序列G-X-S-X-G包围)、谷氨酸(或较少出现的天冬氨酸)和组氨酸(Marshall等人，J MolEvol(2003)57：487-500)构成。这些残基散布在整个氨基酸序列一级结构中，但是在三级结构中会聚在一起形成电荷中继体系，产生能够结合底物的亲核丝氨酸。另一个重要的结构基序是氧负离子洞，它涉及在水解期间稳定底物-酶中间体。氧负离子洞通过三个小氨基酸形成：两个甘氨酸残基通常位于b-链3和a-螺旋1之间，并且第三个残基位于紧接催化丝氨酸残基的位置(Marshall等人，J Mol Evol(2003)57：487-500)。
At-CXE20多肽具有保守的“亲核弯头”(GxSxG)，其带有独特的构象以活化亲核残基S166，在S166-H302-D272的保守催化三联体和带有保守残基G88-G89-G90的“氧负离子洞”用于稳定带负电荷的过渡态。
这些保守位点和残基中的一些在比对图(图1)中示出。
酯酶是部分α/β水解酶_3重折叠(Pfam结构域PF07859)，其形成预期为作物植物提供耐旱性和/或提高的产量的水解酶基团。
术语“单子叶植物”和“单子叶的植物”在本文中可互换使用。本公开的单子叶植物包括禾本科植物。
术语“双子叶植物”和“双子叶的植物”在本文中可互换使用。本公开的双子叶植物包括以下家族：十字花科植物(Brassicaceae)、豆科植物(Leguminosae)和茄科植物(Solanaceae)。
术语“全长互补序列”和“全长的互补序列”在本文中可互换使用，指给定核苷酸序列的互补序列，其中互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。
“表达序列标签”(“EST”)是得自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获取。将完整的cDNA插入序列称为“全长插入序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由选自，但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)，该序列能得自FIS或重叠群。
“性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理学、形态学、生物化学、或物理学特征。在一些情况下，这种特征是人眼可见的，例如种子或植物大小，或者能够通过生物化学技术测量，例如检测种子或叶片的蛋白质、淀粉、或油含量，或者通过观察代谢或生理过程，如通过测量缺水耐受性或特定盐或糖浓度的耐受性，或者通过观察一个或多个基因的表达水平，或者通过农学观察如渗透胁迫耐受性或产量。术语“性状”与术语“表型”在本文中可互换使用。
“农学特性”是可测量的参数，包括但不限于非生物胁迫耐受性、绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、叶片数、分蘖数、生长速率、首次花粉脱落时间、首次吐丝时间、雌雄穗开花间隔(AS1)、茎直径、根构造、滞绿、相对水含量、水利用、水利用效率；主植株、分蘖、主穗、主植株和分蘖或芯的干重；籽粒行数、总植株重量、籽粒重量、籽粒数、耐盐性、叶绿素含量、黄酮醇含量、黄叶数、低温胁迫下的早期幼苗活力和出苗。这些农学特性可能在植物发育的任何阶段进行测量。可在胁迫或非胁迫条件下测量这些农学特性中的一种或多种，并且可显示本文公开的重组构建体的过表达的改变。
本文的“分蘖数”是指植物上的平均分蘖数。分蘖定义为已经发育并具有能够散落花粉的雄穗的次生茎(美国专利7,723,584)。
在单子叶植物中分蘖是承穗枝。每株植物的分蘖数是许多主要谷类作物如稻和小麦中决定产量的关键因素，因此通过增加分蘖数，有可能提高主要谷类作物如稻、小麦和大麦的产量。
非生物胁迫可为选自下列的至少一个条件：干旱、缺水、水涝、高光照强度、高温、低温、高盐、黄化、落叶、重金属毒性、缺氧、营养物质缺乏、营养物质过多、UV辐照、大气污染(例如臭氧)和暴露于诱发产生活性氧物质(ROS)的化学物质(例如百草枯)。
植物的“提高的胁迫耐受性”相对于参比植物或对照植物进行测量，它是植物在胁迫条件下存活较长时间，并且相对于在相似胁迫条件下生长的参比或对照植物基本上不表现出相同程度的生理或物理退化的性状。
具有“提高的胁迫耐受性”的植物可表现出对一种或多种不同的胁迫条件的提高的耐受性。
多肽的“胁迫耐受性”指在转基因植物中过表达多肽赋予转基因植物相对于参比植物或对照植物增加的胁迫耐受性。
具有某种活性的多肽，如具有一种或多于一种选自下列的活性的多肽：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数；指示多肽在植物中的过表达赋予该植物相对于参比或对照植物的对应表型。例如过表达具有“改变的ABA响应活性”的多肽的植物在与对照或参比植物进行比较时将表现出“改变的ABA响应”的表型。
能够测量增加的生物量，例如测量植株高度、植物总叶片面积、植物鲜重、植物干重或植物种子产量与对照植物相比的增加。
提高植物生物量或植物尺寸的能力将具有若干个重要的商业应用。可生成产量较高的作物品种，产生较高的产量，例如在其中营养组织部分用作食物、生物燃料或以上两种用途的植物中。
增大的叶片尺寸可受到特别的关注。增加叶片生物质可以用于增加植物衍生的药用或工业产品的生产。总植物光合作用的提高通常通过增加植物叶片面积来完成。附加的光合作用能力可用于提高特定植物组织来源的产量，包括叶片、根、果实或种子、或者允许植物在较低光强度下或高光强度下生长。
另一种组织(例如根组织)的生物量的改变可用于改善植物在严酷环境条件下生长的能力，包括干旱或营养缺乏条件，因为较大的根系可较好的获取水或营养物质或吸收水或营养物质。
对于一些观赏植物，将高度期望提供较大品种的能力。对于包括果树、产木材树木、或者观赏或防风树木和灌木在内的多种植物，尺寸增加以产量提高或防护效果改善的形式提供改善的有益效果。
玉米丝生长和吐丝对在干旱条件下决定产量具有相当大的重要性(Fuad-Hassan等人，2008，Plant Cell Environ.31：1349-1360)。当在开花前土壤缺水时，吐丝到壳外被延迟而开花很大程度上不受影响，导致提高的雌雄穗开花间隔(ASI)(Edmeades等人，2000，Physiology and Modeling Kernel set in Maize(M.E.Westgate&K.Boote编辑；CSSA(Crop Science Society of America)特刊号29.Madison，WI：CSSA，43-73)。选择降低的ASI已经成功地用于提高玉米的耐旱性(Edmeades等人，1993，Crop Science 33：1029-1035；Bolanos&Edmeades 1996 Field Crops Research 48：65-80；Bruce等人，2002，J.Exp.Botany 53：13-25)。
本文所用的用于描述热时间的术语包括“生长度日”(GDD)、“生长度单位”(GDU)和“热单位”(HU)。
“转基因”一般是指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用，术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)变更。
“基因组”应用于植物细胞时，不仅涵盖细胞核内存在的染色体DNA，也涵盖细胞的亚细胞组分(例如线粒体、质体)中存在的细胞器DNA。
“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、植物繁殖体、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。
“繁殖体”包括减数分裂和能够繁殖新植株的有丝分裂的所有产物，包括但不限于种子、孢子和用作营养繁殖器官的植物部分如球茎、块茎、匍匐枝、或纤匐枝。繁殖体也包括其中植物的一部分接枝到不同植物的另一部分(甚至不同物种的一部分)上以形成活体植物的接枝。繁殖体也包括通过克隆或将减数分裂产物聚集在一起、或使减数分裂产物一起形成胚芽或受精卵(天然存在的或人工干预形成的)而产生的所有植物和种子。
“子代”包含植物的任何后续各代。
“转基因植物”包括指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内，使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独地或者作为重组DNA构建体的一部分整合到基因组中。
对基因改善种质的商业开发也已经进展到将多个性状引入作物植物的阶段，常称为基因叠加方法。在这种方法中，可将赋予感兴趣的不同特性的多个基因引入植物。基因叠加可通过多种方法完成，包括但不限于共转化、再转化和用不同转基因杂交品系。
“转基因植物”也包括在它们的基因组内包含多于一个异源多核苷酸的植物。每个异源多核苷酸可赋予转基因植物不同的性状。
与序列有关的“异源”是指该序列源于外来物种，或者，如果源于同一物种的话，则是通过蓄意人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰得到的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”被互换使用，并且指作为单-链或双-链的RNA或DNA的聚合物，其任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以其5′-单磷酸盐的形式存在)用如下的单字母代码指代：“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“I”指肌苷，并且“N”指任何核苷酸U”。
“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可以包括如下修饰，包括但不限于：糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“信使RNA(mRNA)”指没有内含子且可被细胞翻译成蛋白质的RNA。
“cDNA”一般指与mRNA模板互补且用反转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的，或者可用DNA聚合酶I从Klenow片段转化成双链形式。
“编码区”一般是指编码蛋白或多肽的信使RNA部分(或另一个核酸分子如DNA分子的对应部分)。“非编码区”一般是指不是编码区的信使RNA或其它核酸分子的所有部分，包括但不限于例如启动子区域、5′非翻译区(“UTR”)、3′UTR、内含子和终止子。术语“编码区”和“编码序列”在本文中可互换使用。术语“非编码区”和“非编码序列”在本文中可互换使用。
“成熟”蛋白一般是指翻译后加工的多肽；即，初级翻译产物中存在的任何原肽或前肽被移除的多肽。
“前体”蛋白一般是指mRNA翻译的初级产物；即，原肽和前肽仍然存在。原肽和前肽可以是但不限于胞内定位信号。
“分离的”一般是指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获取分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
如本文所用，术语非基因组核酸序列或非基因组核酸分子一般是指与天然或基因组核酸序列相比在核酸序列中具有一个或多个改变的核酸分子。在一些实施方案中，天然或基因组核酸分子的改变包括但不限于：由于遗传密码的简并性导致的核酸序列改变；为在植物中表达而对核酸序列进行的密码子优化；与天然或基因组序列相比，为了引入至少一个氨基酸置换、插入、缺失和/或添加而发生的核酸序列中的改变；移除一个或多个与基因组核酸序列相关的内含子；插入一个或多个异源内含子；一个或多个与基因组核酸序列相关联的上游或下游调控区的缺失；插入一个或多个异源上游或下游调控区；与基因组核酸序列相关联的5’和/或3’非翻译区的缺失；以及插入异源5’和/或3’非翻译区。
“重组的”一般是指序列的两个本来分开的区段例如通过化学合成人工组合在一起，或者通过遗传工程技术对核酸的分离的区段进行操纵。“重组体”也包括细胞或载体，它们已经通过引入异源核酸进行了修改，或者来源于进行如此修改的细胞，但是不涵盖由自然发生事件(例如自发突变、自然转化/转导/转座)改变的细胞或载体，例如那些无蓄意的人为干预产生的细胞或载体。
“重组DNA构建体”一般是指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可以包含源自不同来源的调节序列和编码序列，或者源自相同来源、但是以不同于自然界中正常存在的方式排列的调节序列和编码序列。术语“重组DNA构建体”和“重组构建体”在本文中可互换使用。
术语“入门克隆”和“入门载体”在本文中可互换使用。
“调节序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列)并且影响相关联编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷化作用识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。
“启动子”一般是指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
“在植物中有功能的启动子”是能够在植物细胞中控制转录而无论其来源是否为植物细胞的启动子。
“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，但是也可以在一种特定细胞中表达的启动子。
“发育调控启动子”一般是指其活性由发育事件决定的启动子。
“可操作地连接”一般是指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
“表达”一般是指功能产物的产生。例如核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
“表型”是指细胞或生物体的可检测的特征。
在将核酸片段(例如，重组DNA构建体/表达构建体)插入细胞中的语境中，“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指代将核酸片段掺入到真核或原核细胞中，其中该核酸片段可掺入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
“转化细胞”是已经将核酸片段(如重组DNA构建体)引入其中的任何细胞。
如本文所用，“转化”一般是指稳定转化和瞬时转化。
“稳定转化”一般是指将核酸片段引入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。
“瞬时转化”一般指将核酸片段引入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。
“等位基因”是基因的占据染色体上特定基因座的几种另类形式之一。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座处存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座处存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。
“叶绿体转运肽”是与蛋白质共同被翻译，并将该蛋白质导向叶绿体或导向该蛋白质在其中被生成的细胞中的其它质体类型的氨基酸序列(Lee等人(2008)Plant Cell 20：1603-1622)。术语“叶绿体转运肽”和“质体转运肽”在本文中可互换使用。“叶绿体转运序列”一般是指编码叶绿体转运肽的核苷酸序列。“信号肽”是一种与蛋白质共同被翻译并将蛋白导向分泌系统的氨基酸序列(Chrispeels(1991)Ann.Rev.Plant Phys.PlantMol.Biol.42：21-53)。如果将蛋白导向液泡，可另外加上液泡靶向信号(同上)，或者如果将蛋白导向内质网，可加上内质网驻留信号(同上)。如果将蛋白导向细胞核，将移除任何存在的信号肽并用核定位信号替代(Raikhel(1992)Plant Phys.100：1627-1632)。“线粒体信号肽”是指导前体蛋白质导进入线粒体中的氨基酸序列(Zhang和Glaser(2002)，TrendsPlant Sci 7：14-21)。
序列比对和同一性百分数计算可用多种被设计用于检测同源序列的比较方法来确定，包括但不限于生物信息学计算软件包(Inc.，Madison，WI)的程序。除非另行指出，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp(1989)，CABIOS.5：151-153)，采用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)执行。使用Clustal V方法进行蛋白质序列的逐对比对和同一性百分数计算的默认参数是KTUPLE＝1、空位罚分＝3，窗口＝5，对角线保存(DIAGONALS SAVED)＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2、空位罚分＝5，窗口＝4，对角线保存＝4。在用Clustal V程序进行序列比对后，可能通过观察同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异度”值；除非另行指出，本文提供并受本文权利要求书保护的同一性百分比和趋异度是以该方式计算。
另选地，可使用Clustal W比对方法。Clustal W比对方法(由Higgins和Sharp描述于CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992))可见于生物信息学计算软件包(Inc.，Madison，Wis.)的MegAlignTM v6.1程序。用于多重比对的默认参数对应于空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.2，延迟发散序列(Delay Divergent Sequences)＝30％，DNA转换权重(DNA TransitionWeight)＝0.5，蛋白质权重矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet Series，DNA权重矩阵(DNA Weight Matrix)＝IUB。用于逐对比对的默认参数为Alignment＝Slow-Accurate，空位罚分＝10.0，空位长度＝0.10，蛋白质权重矩阵＝Gonnet 250并且DNA权重矩阵＝IUB。在用Clustal W程序进行序列比对后，可能通过观察同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异度”值。
本文所用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的，在以下文献中有更完全的描述：Sambrook，J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文中为“Sambrook”)。
本文所述载体的完整序列及附图(例如pHSbarENDs2、pDONRTM/Zeo、pDONRTM221、pBC-yellow、PHP27840、PHP23236、PHP10523、PHP23235和PHP28647)在PCT公开WO/2012/058528中给出，其内容以引用方式并入本文。
现在来看实施方案：
实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、用于提供耐旱性的重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组DNA构建体的方法。
分离的多核苷酸和多肽：
本公开包括以下分离的多核苷酸和多肽：
分离的多核苷酸，其包含：(i)编码多肽的核酸序列，该多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V或Clustal W比对方法在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628以及它们的组合进行比较时具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列，其中该全长互补序列和(i)的核酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。任一上述分离的多核苷酸可用于本公开的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。多肽优选DTP4多肽。多肽优选地具有胁迫耐受性活性，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、渗透胁迫和氮胁迫。多肽也可具有至少一个选自下列的活性：羧酸酯酶、提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。
一种分离的多肽，其具有的氨基酸序列基于Clustal V或Clustal W比对方法在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628以及它们的组合进行比较时具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性。多肽优选DTP4多肽。多肽优选地具有胁迫耐受性活性，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、渗透胁迫和氮胁迫。多肽也可具有至少一个选自下列的活性：羧酸酯酶、提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。
一种分离的多核苷酸，其包含(i)核酸序列，该序列基于Clustal V或Clustal W比对方法在与SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122以及它们的组合进行比较时具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。任一上述分离的多核苷酸可用于本公开的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。分离的多核苷酸优选地编码DTP4多肽。多肽优选地具有胁迫耐受性活性，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、渗透胁迫和氮胁迫。多肽也可具有至少一个选自下列的活性：羧酸酯酶、提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。
包含核苷酸序列的分离的多核苷酸，其中该核苷酸序列在严格条件下与包含SEQID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122的全长互补序列的DNA分子是可杂交的。分离的多核苷酸优选地编码DTP4多肽。多肽优选地具有胁迫耐受性活性，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、渗透胁迫和氮胁迫。
包含核苷酸序列的分离的多核苷酸，其中该核苷酸序列通过至少一个选自下列的方法改变一个或多个核苷酸而来源于SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122；所述方法选自缺失、取代、添加和插入。分离的多核苷酸优选地编码DTP4多肽。多肽优选地具有胁迫耐受性活性，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、渗透胁迫和氮胁迫。多肽也可具有至少一个选自下列的活性；羧酸酯酶、提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。
包含核苷酸序列的分离的多核苷酸，其中该核苷酸序列对应于SEQ ID NO；16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122的等位基因。
在任何前文实施方案中，DTP4多肽可为表1和表2中给定的任何DTP4多肽。
在任何前文实施方案中，DTP4多肽可由表1和表2中给定的任何核苷酸序列编码。
应当理解，本领域的技术人员将会知道，本公开不仅仅涵盖特定的示例性序列。在给定位点产生化学等同的氨基酸，但不影响编码多肽的功能特性的核酸片段变化是本领域熟知的。例如，疏水氨基酸丙氨酸的密码子可被编码另一个疏水性较小的残基例如甘氨酸，或疏水性较大的残基例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码子取代。类似地，还可预期一个带负电的残基置换为另一个，例如天冬氨酸置换为谷氨酸，或一个带正电的残基置换为另一个，例如赖氨酸置换为精氨酸的变化产生功能等同的产物。还可预期使多肽分子的N-端和C-端部分改变的核苷酸变化不会改变多肽的活性。每个所推荐的改变均在本领域的常规技术内，正如确定编码产物的生物活性的保留。
本公开的蛋白质也可为包含氨基酸序列的蛋白质，该氨基酸序列包含在如SEQ IDNO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸。取代可以是保守的，意指某氨基酸残基被另一个具有类似物理和化学特性的残基替代。保守取代的非限制性示例包括含脂族基团氨基酸残基例如Ile、Val、Leu或Ala之间的替代，以及极性残基之间的替代，例如Lys-Arg、Glu-Asp或Gln-Asn替代。
来源于氨基酸缺失、取代、插入和/或添加的蛋白质可在编码其野生型蛋白质的DNA受到例如已知的定点诱变时制备(参见例如Nucleic Acid Research 10(20)：6487-6500(1982)(《核酸研究》，第10卷，第20期，第6487-6500页，1982年)，该文献全文据此以引用方式并入)。如本文所用，术语“一个或多个氨基酸”旨在意指可通过定点诱变缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸的可能数量。
定点诱变可以例如如下使用与待突变的单链噬菌体DNA互补，不同的是具有特定错配(即，所需突变)的合成寡核苷酸引物实现。也就是说，上述合成寡核苷酸用作引起互补链通过噬菌体合成的引物，然后所得的双链DNA用于转化宿主细胞。将转化细胞培养物置于琼脂上，从而允许噬菌斑从含噬菌体的单个细胞形成。因此，理论上，50％的新菌落包含突变为单链的噬菌体，而其余50％具有原始序列。在允许与具有上述所需突变的DNA完全相同的DNA杂交，但不与具有原始链的DNA杂交的温度下，允许所得的噬菌斑与通过激酶处理标记的合成探针杂交。随后，拾取与探针杂交的噬菌斑并培养以收集其DNA。
允许生物活性肽例如酶的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加，同时保持其活性的技术包括上述定点诱变，以及其它技术，例如用诱变剂处理基因的那些，以及其中基因选择性裂解以移除、取代、插入或添加所选的一个或多个核苷酸然后连接的那些。
本公开的蛋白质也可为由核酸编码的蛋白质，该核酸包含在SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列。核苷酸缺失、取代、插入和/或添加可通过定点诱变或上述其它技术实现。
本公开的蛋白质也可为由核酸编码的蛋白质，该核酸包含在严格条件下与SEQ IDNO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122的核苷酸序列的互补链可杂交的核苷酸序列。
术语“在严格条件下”意指两个序列在中等或高度严格条件下杂交。更具体地讲，本领域的普通技术人员可以例如根据DNA的长度容易地确定中等严格条件。基本条件在Sambrook等人，Molecular Cloning：Laboratory Manual，第三版，第6和第7章，ColdSpring Harbor Laboratory Press，2001年中示出，并且包括使用硝化纤维过滤器的预洗涤溶液5xSSC，0.5％SDS。1.0mM EDTA(pH8.0)，约50％甲酰胺、2xSSC至6xSSC，约40-50℃的杂交条件(或其它类似杂交溶液，例如Stark溶液，约50％甲酰胺、约42℃)以及例如约40-60℃，0.5-6xSSC，0.1％SDS的洗涤条件。优选地，中等严格条件包括在约50℃和6xSSC下杂交(和洗涤)。本领域的技术人员也可以例如根据DNA的长度容易地确定高度严格条件。
一般来讲，此类条件包括与中等严格条件相比，在较高温度和/或较低盐浓度下杂交和/或洗涤(例如在约65℃，6xSSC至0.2xSSC，优选地6xSSC，更优选地2xSSC，最优选地0.2xSSC下杂交)。例如，高度严格条件可包括如上所定义的杂交，并且在大约65-68℃、0.2xSSC、0.1％SDS下洗涤。在杂交和洗涤缓冲液中SSPE(1xSSPE为0.15M NaCl、10mMNaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)可代替SSC(1xSSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后进行洗涤15分钟。
使用商购获得的杂交试剂盒也是可能的，其不使用放射性物质作为探针。具体示例包括用ECL直接标记和检测体系(Amersham)。严格条件包括例如使用包括在试剂盒中的杂交缓冲液在42℃下杂交4小时，该缓冲液补充有5％(w/v)阻断试剂和0.5M NaCl，并且在0.4％SDS，0.5xSSC中55℃下洗涤20分钟两次，在2xSSC中室温下洗涤5分钟一次。
在本公开中包括的DTP4多肽也是那些当利用SEQ ID NO：118，29，33，45，47，53，55，61，64，65，77，78，101，103，105，107，111，115，131，132，135，137，139，141 144，433，559和604制备的概形隐马尔可夫模型(Profile Hidden Markov Model)(概形HMM)进行查询时，具有1E-15或更小的E-值评分的多肽；该查询使用hmmsearch算法进行，其中Z参数设为10亿。
在一个实施方案中，E-值评分可为1E-15、1E-25、1E-35、1E-45、1E-55、1E-65、1E-70、1E-75、1E-80或1E-85。
术语“概形HMM”或“HMM概形”在本文中可互换使用，在本文用作多序列比对或者甚至单序列的统计学模型。他们收集关于每列比对的保守程度、以及哪个残基可能是保守的位点特异性信息(Krogh等人，1994，J.Md.Biol.，235：1501-1531；Eddy，1998，Curr.Opin.Struct.Biol.，6：361-365.；Durbin等人，Probabilistic Models of Proteinsand Nucleic Acids.Cambridge University Press，Cambridge UK.(1998)；Eddy，SeanR.，2010年3月，HMMER User′s Guide Version 3.0，Howard Hughes Medical Institute，Janelia Farm Research Campus，Ashburn VA，USA；美国专利公布US20100293118；美国专利US8,623,623)。
术语“E-值”或“预期值(E)”是提供匹配可能发生的概率的参数。它提供序列匹配的统计学显著性。E-值越低，hit越显著。当匹配评分(5)提高时，它指数级降低。
Z参数是指设置用于E-值计算的数据库大小的能力(Eddy，Sean R.，March 2010，HMMER User′s Guide Version 3.0，Howard Hughes Medical Institute，Janelia FarmResearch Campus，Ashburn VA，10USA)。
重组DNA构建体和抑制DNA构建体：
在一个实施方案中，本公开包括重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。
在一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中多核苷酸包含(i)核酸序列，其编码的氨基酸序列基于Clustal V或Clustal W比对方法在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628以及它们的组合进行比较时具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。多肽可具有至少一个选自下列的活性：羧酸酯酶、提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。
在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(i)核酸序列，该核酸序列基于Clustal V或Clustal W比对方法在与SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122以及它们的组合进行比较时具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。
在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DTP4多肽。DTP4多肽优选地具有胁迫耐受性活性，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、渗透胁迫和氮胁迫。多肽可具有至少一个选自下列的活性：羧酸酯酶、提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。
在本文给定的任何实施方案中，DTP4多肽可选自在表1和表2中列出的任何多肽。
DTP4多肽可来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、栽培大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine sofa)、短绒野大豆(Glycinetomentella)、水稻(Oryza sativa)、甘蓝型油菜(Brassica napus)、高粱(Sorghumbicolor)、甘蔗(Saccharum officinarum)、小麦(Triticum aestivum)、或本文公开的任何植物物种。
在一个实施方案中，重组构建体包含多核苷酸，其中多核苷酸可操作地连接至异源启动子，并且编码具有至少一种选自下列的活性的多肽：羧酸酯酶、提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数，其中该多肽当利用SEQ ID NO：18，29，33，45，47，53，55，61，64，65，77，78，101，103，105，107，111，115，131，132，135，137，139，141，144，433，559和604制备的概形隐马尔可夫模型(Profile Hidden Markov Model)进行查询时提供1E-15或更小的E-值评分，该查询使用hmmsearch算法进行，其中Z参数设为10亿。
在另一方面，本公开包括抑制DNA构建体。
抑制DNA构建体可包含至少一个异源调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，其可操作地连接至(a)全部或61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列部分的以下序列：(i)编码多肽的核酸序列，该多肽具有的氨基酸序列具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性(基于同一性)，这是基于Clustal V或Clustal W比对方法，在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628以及它们的组合进行比较时的结果，或(ii)(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；或(b)来源于感兴趣的靶基因的全部或部分有义链或反义链的区域，所述区域具有的核酸序列基于Clustal V或Clustal W比对方法，在与所述区域源自的所述全部或部分有义链或反义链进行比较时具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性，并且其中所述感兴趣的靶基因编码DTP4多肽，或(c)全部或部分以下序列：(i)具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性的核酸序列，这是基于Clustal V或Clustal W比对方法，在与SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122以及它们的组合进行比较时的结果，或(ii)(c)(i)的核酸序列的全长互补序列。抑制DNA构建体可包含共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、产生双链RNA的构建体、RNAi构建体或小RNA构建体(例如siRNA构建体或miRNA构建体)。
应当理解，本领域的技术人员将会知道，本公开不仅仅涵盖特定的示例性序列。在给定位点产生化学等同的氨基酸，但不影响编码多肽的功能特性的核酸片段变化是本领域熟知的。例如，疏水氨基酸丙氨酸的密码子可被编码另一个疏水性较小的残基例如甘氨酸，或疏水性较大的残基例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码子取代。类似地，还可预期一个带负电的残基置换为另一个，例如天冬氨酸置换为谷氨酸，或一个带正电的残基置换为另一个，例如赖氨酸置换为精氨酸的变化产生功能等同的产物。还可预期使多肽分子的N-端和C-端部分改变的核苷酸变化不会改变多肽的活性。每个所推荐的改变均在本领域的常规技术内，正如编码产物的生物活性的保留的确定。
“抑制DNA构建体”是这样的重组DNA构建体，其在转化或稳定整合到植物的基因组中时导致植物中靶基因的“沉默”。靶基因对于植物可为内源的或转基因的。如本文相对于靶基因所用的“沉默”一般是指对由靶基因表达的mRNA或蛋白/酶的水平和/或酶活性或蛋白功能的水平的抑制。在本文中可互换使用的术语“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”并无特定机制，并且包括但不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNA的方法。
抑制DNA构建体可包含源自所关注的靶基因的区域，并且可包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的全部或部分核酸序列。取决于所要采用的方法，该区域可与感兴趣基因的全部或部分有义链(或反义链)100％相同或者不到100％相同(例如至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％相同)。
抑制DNA构建体可包含感兴趣基因的全部或部分有义链(或反义链)的100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个连续核苷酸、以及它们的组合。
抑制DNA构建体是本领域熟知的，易于在选择所关注的靶基因后进行构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更一般地，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体诸如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。
基因表达的抑制也可通过使用人工miRNA前体、核糖酶构建体及基因破坏来实现。可使用修饰过的植物miRNA前体，其中前体已经经修饰以用设计生成引导感兴趣的核苷酸序列的miRNA的序列取代miRNA编码区。使用转座元件或诱发位点特异性突变的化学剂可实现基因破坏。
“反义抑制”一般是指产生能够抑制靶基因或靶基因产物的表达的反义RNA转录物。“反义RNA”一般是指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并且能阻断靶分离核酸片段的表达的RNA转录物(美国专利5,107,065)。反义RNA的互补性可存在于特定基因转录物的任何部分，即在5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或者编码序列。
“共抑制”一般是指产生能够抑制靶基因或靶基因产物的表达的有义RNA转录物。“有义”RNA一般是指包括该mRNA并且可在细胞内或者在体外被翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，植物中的共抑制构建体的设计是通过聚焦与天然mRNA具有同源性的核酸序列在有义取向上的过表达，使得所有与过表达序列具有同源性的RNA减少(参见Vaucheret等人，Plant J.16：651-659(1998)；和Gura，Nature 404：804-808(2000))。
另一种变型描述了植物病毒序列用于指导近端mRNA编码序列的抑制的用途(PCT公布WO 98/36083，公布于1998年8月20日)。
RNA干扰一般是指由短干扰RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性的转录后基因沉默的过程(Fire等人，Nature 391：806(1998)。植物中的相应过程通常称作转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，而在真菌中也称作压制(quelling)。转录后基因沉默的过程被认为是用于阻止外来基因的表达的进化上保守的细胞防御机制，并且通常由不同的植物区系和门共有(Fire等人，Trends Genet.15：358(1999))。
小RNA在控制基因表达中起到重要作用。包括开花在内的许多发育过程的调节是由小RNA控制的。现在可以通过使用能在植物中产生小RNA的转基因构建体来工程改变植物基因的基因表达。
小RNA似乎是通过与互补的RNA或DNA靶序列的碱基配对发挥作用的。当与RNA结合时，小RNA引起该靶序列的RNA切割或翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据认为小RNA能介导该靶序列的DNA甲基化。这些事件的结果是，无论具体的机制如何，基因表达都被抑制。
微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物中鉴定出的非编码RNA(Lagos-Quintana等人，Science 294：853-858(2001)，Lagos-Quintana等人，Curr.Biol.12：735-739(2002)；Lau等人，Science 294：858-862(2001)；Lee和Ambros，Science 294：862-864(2001)；Llave等人，Plant Cell 14：1605-1619(2002)；Mourelatos等人，Genes Dev.16：720-728(2002)；Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495(2002)；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-1626(2002))。它们是由大小为大约70至200nt的较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。
微RNA(miRNA)看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调节靶基因。看来似乎miRNA可能以至少两种途径进入靶基因调控：(1)翻译抑制；和(2)RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA与在动物中RNA干扰(RNAi)期间以及在植物中转录后基因沉默(PTGS)期间产生的21-25nt短干扰RNA(siRNA)类似，并且可能整合进与在RNAi情况中观察到的复合物类似或相同的RNA-诱导的沉默复合物(RISC)内。
术语“miRNA-星序列”和“miRNA*序列”在本文中可互换使用，并且它们是指与miRNA序列高度互补的miRNA前体中的序列。miRNA和miRNA*序列形成miRNA前体发夹结构的茎区域部分。
在一个实施方案中，提供了一种抑制靶序列的方法，该方法包括将编码与靶序列基本上互补的miRNA的核酸构建体引入细胞。在一些实施方案中，miRNA包含约19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA包含21个核苷酸。在一些实施方案中，核酸构建体编码miRNA。在一些实施方案中，核酸构建体编码可形成双链RNA或包含miRNA的发夹结构的多核苷酸前体。
在一些实施方案中，核酸构建体包含修饰的内源植物miRNA前体，其中前体已经经修饰以用设计生成引导靶序列的miRNA的序列取代内源miRNA编码区。植物miRNA前体可为全长的，可包含全长前体的片段。在一些实施方案中，内源性植物miRNA前体来自双子叶植物或单子叶植物。在一些实施方案中，内源性miRNA前体来自拟南芥属(Arabidopsis)、番茄、玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗或柳枝稷。
在一些实施方案中，miRNA模板(即，编码miRNA的多核苷酸)及由此得到的miRNA可包含一些相对于靶序列的错配。在一些实施方案中，miRNA模板与靶序列相比具有＞1个核苷酸错配，例如miRNA模板与靶序列相比可具有1、2、3、4、5、或更多个错配。错配程度也可通过测定miRNA模板与靶序列的互补序列的百分比同一性进行描述。例如miRNA模板在与靶序列的互补序列进行比较时可具有包括约至少70％，75％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的百分比同一性。
在一些实施方案中，miRNA模板(即，编码miRNA的多核苷酸)及由此获得的miRNA相对于miRNA-*序列可包含一些错配。在一些实施方案中，miRNA模板与miRNA-*序列相比具有＞1个核苷酸错配，例如miRNA模板与miRNA-*序列相比可具有1、2、3、4、5、或更多个错配。错配程度也可通过测定miRNA模板与miRNA-*序列的互补序列的百分比同一性进行描述。例如miRNA模板在与miRNA-*序列的互补序列进行比较时可具有包括约至少70％，75％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的百分比同一性。
调控序列：
本公开的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)可包含至少一个调控序列。
调控序列可为启动子。
多个启动子可用于本公开的重组DNA构建体。可根据所需结果来选择启动子，并且可包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或其它启动子。
造成基因在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。
虽然候选基因当通过组成型启动子驱动表达时可预测其效应，但候选基因在35S或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫特异启动子可消除不需要的效应但保留增强胁迫耐受性的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效应(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)。
适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括例如WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的Rsyn7启动子和其它组成型启动子的核心启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))；稻肌动蛋白(McElroy等人，Plant Cell 2：163-171(1990))；遍在蛋白(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)以及Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689(1992))；pEMU(Last等人，Theor.Appl.Genet.81：581-588(1991))；MAS(Velten等人，EMBO J.3：2723-2730(1984))；ALS启动子(美国专利5,659,026)、组成型合成核心启动子SCP1(国际公布03/033651)等。其它组成型启动子包括例如以下美国专利中讨论的那些：美国专利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611。
在选择启动子用于本公开方法时，可能期望使用组织特异性启动子或发育调控启动子。
组织特异性启动子或发育调控启动子是这样的DNA序列：该序列调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本公开的方法中。
可使用的种子或胚芽特异性启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂启动子(Kti3、Jofuku和Goldberg，Plant Cell 1：1079-1093(1989))、马铃薯块茎特异蛋白启动子(patatin启动子)(马铃薯块茎)(Rocha-Sosa，M.等人(1989)，EMBO J.8：23-29)、convicilin启动子、豌豆球蛋白启动子和豆球蛋白启动子(豌豆子叶)(Rerie，W.G.等人(1991)，Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等人(1990)，Planta 180：461-470；Higgins，T.J.V.等人(1988)，Plant.Mol.Biol.11：683-695)、玉米蛋白启动子(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等人(1988)，EMBO J.7：1249-1255)、菜豆蛋白启动子(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等人(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324)、植物血球凝集素启动子(菜豆子叶)(Voelker，T.等人(1987)，EMBO J.6：3571-3577)、B-伴球蛋白启动子和大豆球蛋白启动子(大豆子叶)(Chen，Z-L等人(1988)，EMBO J.7：297-302)、谷蛋白启动子(大米胚乳)、大麦醇溶蛋白启动子(大麦胚乳)(Marris，C.等人(1988)，PlantMol.Biol.10：359-366)、麦谷蛋白启动子和麦醇溶蛋白启动子(小麦胚乳)(Colot，V.等人(1987)，EMBO J.6：3559-3564)和甘薯贮藏蛋白启动子(甘薯块根)(Hattori，T.等人(1990)，Plant Mol.Biol.14：595-604)。可操作地连接至嵌合基因构建体中的异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。此类示例包括在拟南芥(Arabidopsis)和甘蓝型油菜(Brassica napus)种子中表达脑啡肽的拟南芥(Arabidopsis thaliana)2S种子储藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等人，Bio/Technology 7：L929-932(1989))、表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子(Riggs等人，Plant Sci.63：47-57(1989))、以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(Colot等人，EMBO J 6：3559-3564(1987))。胚乳优选的启动子包括在例如US8,466,342；US7,897,841；和US7,847,160中描述的那些启动子。
诱导型启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境信号、激素信号、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操作地连接的DNA序列。诱导型启动子或调控启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。
使用的启动子包括以下启动子：1)胁迫诱导型RD29A启动子(Kasuga等人(1999)，Nature Biotechnol.17：287-91)；2)大麦启动子B22E；B22E的表达是发育中的玉米籽粒中的柄所特异性的(“Primary Structure of a Novel Barley Gene DifferentiallyExpressed in Immature Aleurone Layers(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结构)”.Klemsdal，S.S.等人，Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16(1991))；和3)玉米启动子Zag2(“Identification and molecular characterization of ZAG1，the maizehomolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS(ZAG1拟南芥花同源异形基因AGAMOUS的玉米同源物的鉴定和分子表征)”，Schmidt，R.J.等人，Plant Cell 5(7)：729-737(1993)；“Structural characterization，chromosomal localization andphylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-box genes frommaize(两对来自玉米的AGAMOUS样MADS-box基因的结构表征、染色体定位及系统发育评价)”，Theissen等人，Gene 156(2)：155-166(1995)；NCBI GenBank登录号X80206))。Zag2转录物可在授粉前5天至授粉后(“DAP”)7至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序的心皮中表达，Ciml对发育中的玉米籽粒的籽仁而言是特异性的。Ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被检测到。其它可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。
使用的启动子也包括以下启动子：Zm-GOS2(用于“来自水稻(Oryza sativa)的基因的玉米启动子”，US公布号US2012/0110700 Sb-RCC(用于根特异性表达的根皮层细胞描绘蛋白的高粱启动子)、Zm-ADF4(US7902428；用于肌动蛋白解聚因子的玉米启动子)、Zm-FTM1(US7842851；用于开花转换MADSs的玉米启动子)启动子。
用于调控核苷酸序列在植物中表达的其它启动子是茎特异性启动子。此类茎特异性启动子包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号EF030816；Abrahams等人，PlantMol.Biol.27：513-528(1995))和S2B启动子(GenBank登录号EF030817)等，它们以引用方式并入本文。
启动子可以完全源自天然基因，或由源自天然存在的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成DNA片段。
在一个实施方案中，至少一个调控元件可为可操作地连接至至少一个增强子元件的内源启动子；例如35S、nos或ocs增强子元件。
使用的启动子可包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶启动子、遍在蛋白启动子、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合成酶启动子、R-等位基因启动子、维管组织优选的启动子S2A(Genbank登录号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)、以及来自玉米(Zea mays)的组成型启动子GOS2。其它启动子包括根优选的启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CR1BIO启动子(WO06055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790；GI No.1063664)，
本公开的重组DNA构建体也可包括其它调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本公开的另一个实施方案中，本公开的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。
本文公开的启动子可与它们自己的内含子或与任何异源内含子一起使用以驱动转基因的表达。
内含子序列可加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。在动物和植物表达构建体中的转录单位中包含可剪接的内含子，已证实在mRNA水平上和蛋白质水平上都能增加基因表达最高达1000倍。Buchman和Berg，Mol.CellBiol.8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1：1183-1200(1987)。
“转录终止子”、“终止序列”或“终止子”是指位于蛋白编码序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化识别序列和其它编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的序列。多腺苷酸化信号通常以影响添加多腺苷酸串至mRNA前体3′末端为特征。不同的3′非编码序列的用途由Ingelbrecht，I.L.等人，Plant Cell 1：671-680(1989)例举。具有“终止子活性”的多核苷酸序列一般是指当可操作地连接至待表达的第二多核苷酸序列的3’末端时，能够终止从第二多核苷酸序列的转录并促进信使RNA的有效3’末端加工、导致添加多聚A尾的多核苷酸序列。转录终止是通过RNA聚合酶的RNA合成终止并且加工信使RNA和酶从DNA模板上释放的过程。
RNA转录物的不正确终止可能影响RNA的稳定性，并且从而可能影响蛋白表达。转基因表达的变化性有时归因于终止效率的变化性(Bieri等人，(2002)Molecular Breeding10：107-117)。
使用的终止子的示例包括但不限于PinII终止子、SB-GKAF终止子(美国专利61/514055)、Actin终止子、Os-Actin终止子、Ubi终止子、Sb-Ubi终止子、Os-Ubi终止子。
任何植物都可选择用来鉴定将用于本公开的重组DNA构建体和其它组合物(例如转基因植物、种子和细胞)及方法的调控序列和DTP4多肽基因。用于分离基因和调控序列并用于本公开的组合物及方法的合适植物的示例将包括但不限于苜蓿、苹果、杏、拟南芥属、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔类、克莱门氏小柑橘类、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、大蕉、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柳枝稷、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。
组合物：
本公开的组合物包括包含重组DNA构建体的转基因微生物、细胞、植物和种子。细胞可为真核细胞如酵母、昆虫或植物细胞，或者原核细胞如细菌细胞。
本公开的组合物是其基因组中包含本公开的任何重组DNA构建体(包括任何抑制DNA构建体)(例如上文所讨论的任何一种构建体)的植物。组合物也包括任何植物的子代，以及获取自植物或其子代的任何种子，其中子代或种子在其基因组中包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交种和近交系。
在杂交种子繁殖的作物中，可将成熟的转基因植物进行自花传粉以产生纯合的近交植物。近交植物产生含有新引入的重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的种子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性(例如，任选地在胁迫条件下提高的农学特性)的植物，或者用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而产生将表现出这种改变的农学特性的植物。种子可为玉米种子。胁迫条件可选自干旱胁迫、三重胁迫和渗透胁迫。
植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如玉米或大豆植物。植物也可为向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗或柳枝稷。植物可为杂交植物或近交植物。
重组DNA构建体可稳定地整合进植物的基因组中。
具体实施方案包括但不限于以下实施方案：
1.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V或Clustal W比对方法在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。在与对照植物进行比较时，该植物还可表现出至少一种农学特性的改变。
植物可表现出的至少一种农学特性的改变选自：非生物胁迫耐受性、绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、叶片数、分蘖数、生长速率、首次花粉脱落时间、首次吐丝时间、雌雄穗开花间隔(AS)、茎直径、根构造、滞绿、相对水含量、水利用、水利用效率、主植株、分蘖、主穗、主植株和分蘖或芯的干重；籽粒行数、总植株重量、籽粒重量、籽粒数、耐盐性、叶绿素含量、黄酮醇含量、黄叶数、低温胁迫下的早期幼苗活力和出苗。这些农学特性可能在植物发育的任何阶段进行测量。可在胁迫或非胁迫条件下测量这些农学特性中的一种或多种，并且可显示本文公开的重组构建体的过表达的改变。
2.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DTP4多肽，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。在与对照植物进行比较时，该植物还可表现出至少一种农学特性的改变。
3.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DTP4多肽，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。
4.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米、稻、或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，其中核苷酸序列为：(a)在严格条件下与包含SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122的全长互补序列的DNA分子是可杂交的；或者(b)通过至少一个选自下列的方法改变一个或多个核苷酸而来源于SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122：所述方法选自：缺失、取代、添加和插入；并且其中所述植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。在与对照植物进行比较时，该植物还可表现出至少一种农学特性的改变。
5.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V或Clustal W比对方法在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。
6.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米、稻、或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，其中核苷酸序列为：(a)在严格条件下与包含SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122的全长互补序列的DNA分子是可杂交的；或者(b)通过至少一个选自下列的方法改变一个或多个核苷酸而来源于SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122：所述方法选自：缺失、取代、添加和插入；并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。
7.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V或Clustal W比对方法在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。在与对照植物进行比较时，该植物还可表现出产量、生物量或两者的增加。
8.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，该重组DNA构建体包含其中可操作地连接至异源启动子的多核苷酸，并且编码具有至少一种选自下列的活性的多肽：羧酸酯酶，提高的三重胁迫耐受性，提高的干旱胁迫耐受性，提高的氮胁迫耐受性，提高的渗透胁迫耐受性，改变的ABA响应，改变的根构造，提高的分蘖数，其中该多肽当利用SEQ ID NO：18，29，33，45，47，53，55，61，64，65，77，78，101，103，105，107，111，115，131，132，135，137，139，141，144，433，559和604制备的概形隐马尔可夫模型(Profile Hidden Markov Model)进行查询时提供1E-15或更小的E-值评分，该查询使用hmmsearch算法进行，其中Z参数设为10亿，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性，提高的干旱胁迫耐受性，提高的氮胁迫耐受性，提高的渗透胁迫耐受性，改变的ABA响应，改变的根构造，提高的分蘖数。在与对照植物进行比较时，该植物还可表现出产量、生物量或两者的增加。多肽可具有1E-15、1E-25、1E-35、1E-45、1E-55、1E-65、1E-70、1E-75、1E-80和1E-85的E-值评分。
9.在其基因组中包含抑制DNA构建体的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，该抑制DNA构建体包含可操作地连接至来源于感兴趣的靶基因的全部或部分有义链或反义链区域的至少一个异源调控元件，所述区域具有的核酸序列基于Clustal V或Clustal W比对方法，在与所述区域所来源的所述全部或部分有义链或反义链进行比较时具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性，并且其中所述感兴趣的靶基因编码DTP4多肽，并且其中所述植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。
10.在其基因组中包含抑制DNA构建体的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，该抑制DNA构建体包含至少一个异源调控元件，其可操作地连接至以下序列的全部或部分：(a)编码多肽的核酸序列，该多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性，或(b)(a)的核酸序列的全长互补序列，并且其中所述植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。
11.在其基因组中包含多核苷酸(任选内源多核苷酸)的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，该多核苷酸可操作地连接至至少一个异源调控元件，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V或Clustal W比对方法在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含重组调控元件的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。至少一个异源调控元件可包含增强子序列或相同或不同的增强子序列的多聚体。至少一个异源调控元件可包含一个、两个、三个或四个拷贝的CaMV 35S增强子。
12.在本文所述的实施方案中的植物的任何子代、在本文所述的实施方案中的植物的任何种子、在本文所述的实施方案中的植物的子代的任何种子、以及来自在本文所述的实施方案中的任何上述植物及其子代的细胞。
在本文所述的任何实施方案中，植物可表现出的至少一种农学特性的改变选自：非生物胁迫耐受性、绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、叶片数、分蘖数、生长速率、首次花粉脱落时间、首次吐丝时间、雌雄穗开花间隔(ASI)、茎直径、根构造、滞绿、相对水含量、水利用、水利用效率、主植株、分蘖、主穗、主植株和分蘖或芯的干重；籽粒行数、总植株重量、籽粒重量、籽粒数、耐盐性、叶绿素含量、黄酮醇含量、黄叶数、低温胁迫下的早期幼苗活力和出苗。这些农学特性可能在植物发育的任何阶段进行测量。可在胁迫或非胁迫条件下测量这些农学特性中的一种或多种，并且可显示本文公开的重组构建体的过表达的改变。
在本文所述的任何实施方案中，DTP4多肽可来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zea mays)、栽培大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)、短绒野大豆(Glycine tomentella)、水稻(Oryza sativa)、甘蓝型油菜(Brassica hapus)、高粱(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharum officinarum)、小麦(Triticum aestivum)、或本文公开的任何其它植物物种。
在本文所述的任何实施方案中，重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)可包含至少在植物中有功能的启动子作为调控序列。
在本文所述的任何实施方案中或本公开的任何其它实施方案中，至少一种农学特性的改变为增加或减少。
在本文所述的任何实施方案中，植物在至少一种胁迫条件下与不包含所述重组DNA构建体(或所述抑制DNA构建体)的对照植物进行比较时可表现出至少一种农学特性的改变。至少一种胁迫条件可选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。
在一个实施方案中，“产量”可通过多种方法进行测试，包括例如测试重量、种子重量、每株植物种子数、每单位面积种子数(即，每英亩的种子数或种子重量)、每英亩蒲式耳数、每英亩公吨数、每英亩吨数、每公顷千克数。
在本文所述的任何实施方案中，植物可表现出相对于对照植物更少的产量损失，例如在水限制条件下的产量损失减少至少25％，至少20％，至少15％，至少10％或至少5％，或者在不限制水条件下相对于对照植物将具有提高的产量，例如产量提高至少5％，至少10％，至少15％，至少20％或至少25％。
在本文所述的任何实施方案中，植物可表现出相对于对照植物更少的产量损失，例如在胁迫条件下的产量损失减少至少25％，至少20％，至少15％，至少10％或至少5％，或者在非胁迫条件下相对于对照植物将具有提高的产量，例如产量提高至少5％，至少10％，至少15％，至少20％或至少25％。胁迫可选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。
如本文所用，术语“胁迫耐受性”或“胁迫抗性”一般是指植物在胁迫条件下生长的能力的量度，该胁迫条件将对相同物种的“非胁迫耐受性”植物的生长、活力、产量和大小造成不利影响。胁迫耐受性植物在胁迫条件下比相同物种的非胁迫耐受性植物生长得更好。例如与相同物种和/或品种的植物相比，当遭受对相同物种的另一株植物的生长造成不利影响的胁迫条件时具有提高的生长速率的植物将称为胁迫耐受性植物。具有“提高的胁迫耐受性”的植物可表现出对一种或多种不同的胁迫条件的提高的耐受性。
植物的“提高的胁迫耐受性”相对于参比植物或对照植物进行测量，它是植物在胁迫条件下存活较长时间，并且相对于在相似胁迫条件下生长的参比或对照植物基本上不表现出相同程度的生理或物理退化的性状。在其基因组中包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体的转基因植物通常相对于参比或对照植物表现出提高的胁迫耐受性，该参比或对照植物在其基因组中不包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体。
“干旱”一般是指植物可利用的水不足，尤其是当时间延长时，能够引起植物损伤或阻止其正常发育(例如限制植物生长或种子产量)。“水限制条件”一般是指其中水量不足以维持最佳的植物生长及发育的植物生长环境。术语“干旱”和“水限制条件”在本文中可互换使用。
“耐旱性”指植物在干旱条件下存活较长时间并且基本上不表现出生理或物理退化的性状。
多肽的“耐旱活性”指在转基因植物中过表达多肽赋予转基因植物相对于参比植物或对照植物增加的耐旱性。
植物的“耐旱性提高”相对于参比植物或对照植物进行测量，它是植物在干旱条件下存活较长时间，并且相对于在相似干旱条件下生长的参比或对照植物基本上不表现出相同程度的生理或物理退化的性状。在其基因组中包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体的转基因植物通常相对于参比或对照植物表现出提高的耐旱性，该参比或对照植物在其基因组中不包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体。
如本文所用，“三重胁迫”一般是指通过组合干旱胁迫、高温胁迫和高光照胁迫对植物施加的非生物胁迫。
术语“热胁迫”和“温度胁迫”在本文中可互换使用，并且定义为其中环境温度足够热并且时间足够长，使得它们引起对植物功能或发育的损伤，这种损伤可能是可逆的或不可逆的损伤。“高温”可为“高空气温度”或“高土壤温度”、“高日间温度”或“高夜间温度、或多于一种这些温度的组合。
在本公开的一个实施方案中，环境温度可在30℃至36℃的范围内。在本公开的一个实施方案中，高温胁迫持续时间可在1-16小时的范围内。
“高光照强度”和“高辐射率”及“光照胁迫”在本文中可互换使用，并且是指通过使植物遭受足够高的光照强度足够长的时间来施加的胁迫，它们引起植物的光抑制损伤。
在本公开的一个实施方案中，光照强度可在250μE至450μE的范围内。在本发明的一个实施方案中，高光照强度胁迫的持续时间可在12-16小时的范围内。
“三重胁迫耐受性”是植物在干旱、高温和高光照强度的组合胁迫条件下存活较长时间并且基本上不表现出生理或物理退化的性状。
“百草枯”是一种除草剂，对植物施加氧化胁迫。百草枯是一种双吡啶除草剂，通过截断PSI处的电子传输链的电子发挥作用。这一反应导致产生双吡啶基团，其易于与双氧反应，从而产生过氧化物。植物的百草枯耐受性已经与氧自由基的清除能力相关联(Lannelli，M.A.等人，(1999)J Exp Botany，Vol.50，No.333，第523-532页)。已经报道百草枯抗性植物也对其它氧化胁迫具有较高的耐受性。
“百草枯胁迫”定义为通过使植物遭受0.03至0.3μM浓度范围的百草枯而施加的胁迫。
多种不利的环境条件如干旱、盐胁迫、以及使用除草剂促进植物细胞中的活性氧物质(ROS)的过度产生。据信ROS如单态氧、过氧化物基团、过氧化氢(H2O2)和羟基基团是导致迅速细胞损伤的主要因素，这是由于它们与膜脂质、蛋白和DNA的高度反应性(Mittler，R.(2002)Trends Plant Sci Vol.7 No.9)。
具有“三重胁迫耐受性活性”的多肽指在转基因植物中过表达多肽赋予转基因植物相对于参比植物或对照植物提高的三重胁迫耐受性。具有“百草枯胁迫耐受性活性”的多肽指在转基因植物中过表达多肽赋予转基因植物相对于参比植物或对照植物提高的百草枯胁迫耐受性。
在其基因组中包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体的转基因植物通常相对于参比或对照植物表现出提高的胁迫耐受性，该参比或对照植物在其基因组中不包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体。
术语“发芽百分比”和“出苗百分比”在本文中可互换使用，并且是指发芽的种子在与测试的种子总数相比时的百分比。
如本文所用，“发芽”一般是指萌发幼根。
如本文所用，术语“幼根”一般是指植物的胚根，并且是胚轴的末端部分。它向下生长至土壤中，并且是发芽期间种子萌发的幼苗的第一部分。
胁迫范围和胁迫响应取决于使用的不同植物，即，它例如在植物如小麦和植物如拟南芥属(Arabidopsis)之间发生变化。
渗透定义为水从低溶质浓度向高溶质浓度的浓度梯度的运动。
如本文所定义的溶液“渗透压”定义为体系中的溶质施加的压力。具有较高溶质浓度的溶液将具有较高的渗透压。所有溶质表现出渗透压。渗透压随着溶质浓度的提高而提高。
250mM NaCl(氯化钠)施加的渗透压为1.23MPa(兆帕斯卡)(Werner，J.E.等人，(1995)Physiologia Plantarum 93：659-666)。
如本文所用，术语“渗透胁迫”一般是指与高浓度渗透物相关联的或由其诱发的、并且导致细胞的细胞内或细胞外环境的渗透势能扰动的任何胁迫。如本文所用，术语“渗透胁迫”一般是指当细胞、组织、种子、器官或整株植物的细胞外环境的渗透势能提高并且水势能降低、并且阻止水吸收的物质(渗透物)持续施用于细胞、组织、种子、器官或整株植物时，所施加的胁迫。
对于渗透胁迫分析，如本文使用的术语“四组分”是指赋予渗透胁迫的四种成分。如本文所用，“四组分分析”或“四组分培养基”将因此包含赋予渗透胁迫的四种成分，例如氯化钠、山梨醇、甘露糖醇和PEG。
培养基溶液的渗透压提高将导致渗透势能提高。诱发渗透胁迫的条件的示例包括但不限于盐分、干旱、高温、低温和冰冻。
在本公开的一个实施方案中，使植物遭受渗透胁迫的培养基渗透压为0.4-1.23MPa。在本公开的其它实施方案中，使植物遭受渗透胁迫的培养基渗透压为0.4MPa，0.5MPa，0.6MPa，0.7MPa，0.8MPa，0.9MPa，1MPa，1.1MPa，1.2MPa或1.23MPa。在本公开的其它实施方案中，使植物遭受渗透胁迫的培养基渗透压为至少0.4MPa，0.5MPa，0.6MPa，0.7MPa，0.8MPa，0.9MPa，1MPa，1.1MPa，1.2MPa或1.23MPa。在本公开的另一个实施方案中，使植物遭受渗透胁迫的培养基渗透压为1.23MPa。
“氮限制条件”或“低氮胁迫”指其中可用氮总量(例如来自硝酸盐、氨、或其它已知氮源的氮)不足以维持植物的最佳生长和发育的条件。本领域的技术人员将会识别其中总可用氮足以维持植物最佳生长和发育的条件。本领域的技术人员将会识别什么组成足够量的总可用氮，什么组成用于向植物提供氮的土壤、培养基和肥料输入。取决于许多因素，氮限制条件将发生变化，包括但不限于特定的植物和环境条件。
脱落酸(ABA)是一种植物激素，已知涉及于重要的植物生理功能如获得胁迫响应和耐旱性及低温耐受性、以及种子成熟、休眠、发芽等中(M.Koornneef等人，PlantPhysiol.Biochem.36：83(1998)；J.Leung&J.Giraudat，Annu.Rev.Plant.Physiol.Plant.Mol.Biol.49：199(1998))。认为遭受环境胁迫如干旱和低温胁迫的植物由于体内合成ABA而获得了适应环境胁迫的能力，ABA引起植物细胞内的多种变化。已经鉴定了ABA诱导的多个基因。这说明ABA诱导的对不利环境条件的耐受性是一种复杂的多基因事件。
术语“改变的ABA响应”和“改变的ABA敏感性”在本文中可互换使用，并且如本文所用，这些术语是指在与对照植物进行比较时表现出改变的ABA诱导响应的植物或植物部分，并且包括对ABA的超敏感性和低敏感性。
植物对ABA的“超敏感性”或“提高的响应”是指植物在比对照植物更低的ABA浓度下表现出ABA诱导的表型，或者当经受与对照植物相同的ABA浓度时表现出比对照植物更高的响应程度。
植物对ABA的“低敏感性”或“降低的响应”是指植物在比对照植物更高的ABA浓度下表现出ABA诱导的表型，或者当经受与对照植物相同的ABA浓度时表现出比对照植物更低的响应程度。
对ABA的敏感性可在不同的植物发育阶段进行评估。示例包括但不限于发芽、子叶伸展、绿子叶、第一真叶伸展、改变的根生长速率或在幼苗阶段的发育停止。此外，观察到敏感性的ABA浓度以依赖物种的方式发生变化。例如转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)将在比芸苔属或大豆中观察到的浓度更低的浓度下展示敏感性。
术语“绿度百分比”或“％绿度”在本文中是指具有完全绿叶的幼苗的百分比，其中该百分比相对于待测试幼苗的总数进行计算。本文提及的“绿度百分比”记录为具有绿叶的幼苗与具有黄色、褐色或紫色叶片的幼苗相比较的百分比。“绿度百分比”可在单子叶植物幼苗的1-叶或2-叶阶段记录，其中第一和第二叶片是真叶。如本文所用，“绿度百分比”可在双子叶植物幼苗的3-叶或4-叶阶段记录，其中两片叶片是子叶叶片，并且第三和第四叶片是真叶。为了计算双子叶植物幼苗的％绿度，不认为在任何第四叶片上具有任何黄色或褐色条痕的任何幼苗是绿色的。为了计算单子叶植物幼苗的％绿度，不认为在任何第一或第二叶片上具有任何黄色或褐色条痕的任何幼苗是绿色的。在本公开的一个实施方案中，“绿度百分比”在当所有幼苗经受渗透胁迫时进行计算。
如本文所用，“真叶”是指植物或幼苗的非子叶的叶片。
术语“出叶百分比”或“％出叶”在本文中是指具有完全伸展的1-、2-或3-真叶的幼苗的百分比，其中该百分比相对于待测试幼苗的总数进行计算。“出叶百分比”可在双子叶植物幼苗的完全伸展的前两片真叶出现时记录。“出叶百分比”可在单子叶植物幼苗的完全伸展的前两片真叶(1-或2-真叶)出现时记录。在本公开的一个实施方案中，“出叶百分比”在当所有幼苗经受渗透胁迫时进行计算。
本领域的普通技术人员熟悉模拟干旱条件并评价植物耐旱性的规程，该植物已经遭受了模拟的或天然存在的干旱条件。例如，技术人员可通过向植物提供比正常需求较少的水或在一定时期内不提供水来模拟干旱条件，并且技术人员可通过寻找在生理和/或物理条件上的差异来评价耐旱性，包括但不限于活力、生长、大小、或根长、或具体地讲叶片颜色或叶片面积大小。用于评价耐旱性的其它技术包括测量叶绿素荧光、光合作用速率和换气速率。
干旱胁迫实验可涉及慢性胁迫(即缓慢干燥)和/或可涉及两种急性胁迫(即突然除去水)，它们由一天或两天的恢复分开。慢性胁迫可持续8-10天。急性胁迫可持续3-5天。在对转基因植物和相关对照植物进行干旱胁迫以及良好灌溉的处理期间可测量以下变量：
变量“％面积chg_慢性开始-急性2(％area chg_start chronic-acute2)”是介于慢性胁迫第一天和第二次急性胁迫那一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度。
变量“％面积chg_慢性开始-慢性结束(％area chg_start chronic-endchronic)”是介于慢性胁迫第一天和慢性胁迫最后一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度。
变量“％面积chg_慢性开始-收获(％area chg_start chronic-harvest)”是介于慢性胁迫第一天和收获那一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度。
变量“％面积chg_慢性开始-恢复24小时(％area chg_start chronic-recovery24hr)”是介于慢性胁迫第一天和恢复24小时(急性胁迫2之后24小时)之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量。
变量“psii_急性1(psii_acute1)”是在第一次急性胁迫末期的光系统II(PSII)效率的量度。它提供对PSII天线吸光效率的评估，并且直接涉及叶片内部的二氧化碳同化。
变量“psii_急性2(psii_acute2)”是在第二次急性胁迫末期的光系统II(PSII)效率的量度。它提供对PSII天线吸光效率的评估，并且直接涉及叶片内部的二氧化碳同化。
变量“fv/fm_急性1(fv/fm_acute1)”是在第一次急性胁迫末期的最佳量子产率(Fv/Fm)的量度-(最大和最小荧光之间的可变荧光差值/最大荧光)。
变量“fv/fm_急性2(fv/fm_acute2)”是在第二次急性胁迫末期的最佳量子产率(Fv/Fm)的量度-(最大和最小荧光之间的可变荧光差值/最大荧光)。
变量“叶片卷曲_收获(leaf rolling_harvest)”是在收获日的顶部图像对侧面图像的比率的量度。
变量“叶片卷曲_恢复24小时(leaf rolling_recovery24hr)”是恢复24小时的顶部图像对侧面图像的比率的量度。
变量“比生长速率(SGR)”指植物总表面积经过单独一天的变化(通过Lemna TecInstrument测量)(Y(t)＝Y0*er*t)。Y(t)＝Y0*er*t等同于Y/Δt的％变化，其中各个术语含义如下：Y(t)＝t时的总表面积；Y0＝初始总表面积(估计值)；r＝比生长速率天数-1，并且t＝种植后的天数(“DAP”)。
变量“苗干重”是将苗置于104℃烘箱96小时后的苗重量的量度。
变量“苗鲜重”是从植物切除后立即称重的苗重量的量度。
下文示例描述一些用于模拟干旱条件和/或评价耐旱性的代表性规程和技术。
也可通过在田间测试中在模拟的或天然存在的干旱条件下(例如通过测量与非干旱条件下相比，在干旱条件下基本等同的产量，或测量与对照或参比植物相比，在干旱条件下更少的产量损失)，植物保持足够产量(至少75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的产量)的能力来评价耐旱性。
当评估或测量其中利用了对照植物的本公开任何实施方案(例如，如本文所述的组合物或方法)中的转基因植物的农学特性或表型时，本领域的普通技术人员将很容易认识到要利用的合适对照或参比植物。例如通过如下非限制性示例来说明：
1.转化过的植物的子代，该转化过的植物对于重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)来说是半合子的，使得该子代分离成包含或不包含该DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株：包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代将通常相对于不包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代来进行测量(即，不包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代是对照或参比植株)。
2.重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)基因渗入至近交系中，例如在玉米中，或基因渗入进品种中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或品种品系进行测量(即，亲本近交系或品种品系是对照或参比植物)。
3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照植物或参比植物)。
4.包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植物：该植物可以相对于这样的对照植物进行评估或测量，该对照植物不包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)，但具有与该植物相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植物相比较，核遗传物质具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性)。存在许多可用于分析、比较和表征植物遗传背景的基于实验室的技术；其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、随意引物聚合酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性和也称为微卫星的简单序列重复(SSR)。
此外，本领域的普通技术人员将容易认识到，评估或测量转基因植物的农学特性或表型时合适的对照或参比植物将不包括先前已经针对所需的农学特性或表型，通过诱变或转化而选择的植物。
方法：
方法包括但不限于：用于提高植物耐旱性的方法、用于提高植物三重胁迫耐受性的方法、用于提高植物渗透胁迫耐受性的方法、用于提高植物氮胁迫耐受性的方法、用于评价植物耐旱性的方法、用于评价植物三重胁迫耐受性的方法、用于评价植物渗透胁迫耐受性的方法、用于评价植物氮胁迫耐受性的方法、用于改变植物中的ABA响应的方法、用于增加植物分蘖数的方法、用于改变植物根构造的方法、用于评价植物中改变的ABA响应的方法、用于改变植物农学特性的方法、用于测定植物农学特性改变的方法和用于制备种子的方法。植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如玉米或大豆植物。植物也可为向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗或高粱。种子可为玉米或大豆种子，例如玉米杂交种子或玉米近交种子。
方法包括但不限于以下方法：
转化细胞(或微生物)的方法，包括用本公开的任何分离的多核苷酸或重组DNA构建体转化细胞(或微生物)。也包括通过这种方法转化的细胞(或微生物)。在具体实施方案中，细胞是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或原核，例如细菌细胞。微生物可为农杆菌属(Agrobacterium)，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。
生产转基因植物的方法，其包括用本公开的任何分离的多核苷酸或重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)来转化植物细胞并由转化过的植物细胞中再生转基因植物。本公开也涉及由该方法制备的转基因植物，以及从这种转基因植物中获取的转基因种子。通过这种方法获取的转基因植物可用于本公开的其它方法。
用于从细胞或细胞培养基中分离本公开多肽的方法，其中细胞包含具有本公开多核苷酸的重组DNA构建体，该多核苷酸可操作地连接至至少一个异源调控序列，并且其中转化的宿主细胞在适于重组DNA构建体表达的条件下生长。
改变宿主细胞中本公开多肽的表达水平的方法，该方法包括：(a)用本公开的重组DNA构建体转化宿主细胞；以及(b)在适于表达重组DNA构建体的条件下培养转化过的细胞，其中重组DNA构建体的表达导致转化过的宿主细胞中的本公开多肽的含量改变。
提高植物中的胁迫耐受性的方法，其中胁迫选自：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V或Clustal W比对方法在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性；以及(b)在步骤(a)后由可再生的植物细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，并且在与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的胁迫耐受性，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。该方法可进一步包括(c)获取来源于转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体并且在与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的胁迫耐受性，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。
提高胁迫耐受性的方法，其中胁迫选自：干旱胁迫、三重胁迫和渗透胁迫，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，其中核苷酸序列是：(a)在严格条件下与包含SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122的全长互补序列的DNA分子是可杂交的；或者(b)通过至少一个选自下列的方法改变一个或多个核苷酸而来源于SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122，所述方法选自：缺失、取代、添加和插入；以及(b)在步骤(a)后由可再生的植物细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，并且在与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的胁迫耐受性，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。该方法可进一步包括(c)获取来源于转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体并且在与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出提高的胁迫耐受性，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。
选择(或识别)植物中提高的胁迫耐受性的方法，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫，该方法包括(a)获取转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V或Clustal VV比对方法在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，8％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性；(b)获取来源于所述转基因植物的子代植物，其中子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及(c)选择(或识别)在与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有提高的胁迫耐受性的子代植物，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫，氮胁迫和渗透胁迫。
在另一个实施方案中，选择(或识别)植物中提高的胁迫耐受性的方法，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫，该方法包括：(a)获取转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性，这是基于Clustal V或Clustal W比对方法，在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时的结果；(b)使部分(a)的转基因植物在其中表达该多核苷酸的条件下生长；以及(c)选择(或识别)部分(b)的转基因植物，其在与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有提高的胁迫耐受性，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。
选择(或识别)植物中提高的胁迫耐受性的方法，其中胁迫选自：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫，该方法包括：(a)获取转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，其中核苷酸序列是：(i)在严格条件下与包含SEQID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122的全长互补序列的DNA分子是可杂交的；或者(ii)通过至少一个选自下列的方法改变一个或多个核苷酸而来源于SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122，所述方法选自：缺失、取代、添加和插入；(b)获取来源于所述转基因植物的子代植物，其中子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及(c)选择(或识别)在与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有提高的胁迫耐受性的子代植物。
制备在与对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型的植物的方法：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量，该方法包括以下步骤：将重组DNA构建体引入到植物中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性。
制备表现出至少一个选自下列的表型的植物的方法：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量，其中该方法包括由包含重组DNA构建体的种子生长植物，其中重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性，其中该植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量。
制备表现出至少一个选自下列的表型的植物的方法：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个调控序列的多核苷酸，其中多核苷酸编码的多肽当利用SEQ ID NO：18，29，33，45，47，53，55，61，64，65，77，78，101，103，105，107，111，115，131，132，135，137，139，141，144，433，559和604制备的概形隐马尔可夫模型(Profile Hidden Markov Model)进行查询时提供1E-15或更小的E-值评分，该查询使用hmmsearch算法进行，其中Z参数设为10亿；(b)由(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及(c)获取来源于(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体，并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量。
提高作物植物中至少一个选自下列的表型的方法：三重胁迫耐受性、干旱胁迫耐受性、氮胁迫耐受性、渗透胁迫耐受性、ABA响应、分蘖数、产量和生物量，该方法包括提高作物植物中羧酸酯酶的表达。在一个实施方案中，作物植物是玉米。在一个实施方案中，羧酸酯酶在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性。在一个实施方案中，羧酸酯酶是本公开的表1和表2中所公开的DTP4多肽。在一个实施方案中，当利用SEQ ID NO：18，29，33，45，47，53，55，61，64，65，77，78，101，103，105，107，111，115，131，132，135，137，139，141，144，433，559和604制备的概形隐马尔可夫模型(Profile Hidden Markov Model)进行查询时，羧酸酯酶提供1E-15或更小的E-值评分，该查询使用himmsearch算法进行，其中Z参数设为10亿。
在一个实施方案中，羧酸酯酶是多肽，其中该多肽当使用表18中提供的概形隐马尔可夫模型(Profile Hidden Markov Model)进行查询时提供1E-15或更小的E-值评分。
一个实施方案涵盖提高植物中的胁迫耐受性的方法，其中胁迫选自：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫，该方法包括：
(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个调控序列的多核苷酸，其中多核苷酸编码的多肽当利用SEQ ID NO：18，29，33，45，47，53，55，61，64，65，77，78，101，103，105，107，111，115，131，132，135，137，139，141，144，433，559和604制备的概形隐马尔可夫模型(Profile Hidden Markov Model)进行查询时提供1E-15或更小的E-值评分，该查询使用hmrnsearch算法进行，其中Z参数设为10亿；(b)由(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及(c)获取来源于(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出对至少一个选自下列的胁迫提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。
选择(或识别)植物中农学特性改变的方法，该方法包括(a)获取转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V或Clustal W比对方法在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性；(b)获取来源于所述转基因植物的子代植物，其中子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及(c)选择(或识别)子代植物，其在与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时(任选地在至少一种胁迫条件下)表现出至少一种农学特性的改变。至少一种胁迫条件可选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。多核苷酸优选地编码DTP4多肽。DTP4多肽优选地具有胁迫耐受性活性，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、渗透胁迫和氮胁迫。
在另一个实施方案中，选择(或识别)植物中至少一种农学特性的改变的方法包括；(a)获取转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V或Clustal W比对方法在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性，其中该转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；(b)使部分(a)的转基因植物在其中该多核苷酸得以表达的条件下生长；以及(c)选择(或识别)部分(b)的转基因植物，其在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。任选地，所述选择(或识别)步骤(c)包括确定转基因植物在至少一种条件下与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。至少一种农学性状可为产量、生物量或两者，并且改变可为增加。至少一种胁迫条件可选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。
至少一种农学特性可为非生物胁迫耐受性、绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、叶片数、分蘖数、生长速率、首次花粉脱落时间、首次吐丝时间、雌雄穗开花间隔(ASI)、茎直径、根构造、滞绿、相对水含量、水利用、水利用效率、主植株、分蘖、主穗、主植株和分蘖或芯的干重；籽粒行数、总植株重量、籽粒重量、籽粒数、耐盐性、叶绿素含量、黄酮醇含量、黄叶数、低温胁迫下的早期幼苗活力和出苗。这些农学特性可能在植物发育的任何阶段进行测量。可在胁迫或非胁迫条件下测量这些农学特性中的一种或多种，并且可显示本文公开的重组构建体的过表达的改变。
选择(或识别)植物中农学特性的改变的方法，该方法包括(a)获取转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，其中核苷酸序列是：(i)在严格条件下与包含SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122的全长互补序列的DNA分子是可杂交的；或者(ii)通过至少一个选自下列的方法改变一个或多个核苷酸而来源于SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122，所述方法选自：缺失、取代、添加和插入；(b)获取来源于所述转基因植物的子代植物，其中子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及(c)选择(或识别)子代植物，其任选地在胁迫条件下与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。多核苷酸优选地编码DTP4多肽。DTP4多肽优选地具有胁迫耐受性活性，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、渗透胁迫和氮胁迫。
重组DNA构建体用于制备植物的用途，该植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量，其中重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V或Clustal W比对方法，利用相应的默认参数，在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性。多肽可在植物的至少一个组织中、或在至少一种环境胁迫条件期间、或两者中过表达。植物可选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
制备种子(例如可作为提供耐旱性的产品销售的种子)的方法，该方法包括任一上述的方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。
从种子生产油或种子副产物、或两者的方法，该方法包括从种子提取油或种子副产物、或两者，该种子包含重组DNA构建体，其中该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V或Clustal W比对方法，利用相应的默认参数，在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性。种子可获取自包含重组DNA构建体的植物，其中植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量。多肽可在可在植物的至少一个组织中、或在至少一种非生物胁迫条件期间、或两者中过表达。植物可选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。油或种子副产物、或两者，可包含重组DNA构建体。
分离种子油的方法是本领域熟知的：(Young等人，Processing of Fats andOils，In The Lipid Handbook，Gunstone等人编辑，第5章，第253 257页；Chapman&Hall：London(1994))。种子副产物包括但不限于以下副产物：粗粉、卵磷脂、树胶、游离脂肪酸、颜料、皂、硬脂精、生育酚、甾醇和挥发物。
可在受控环境(例如温室)中或田间测试中评估改变的根构造。评估可在模拟的或天然存在的低氮或高氮条件下进行。改变的根构造可为根质量的增加。根质量的增加在与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时可为至少5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，30％，35％，40％，45％或50％。
在任一前述方法或本公开方法的任一其它实施方案中，在转基因植物中选择农学特性改变的步骤(如果适用的话)可包括选择在各种环境条件下与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变的转基因植物。
在任一前述方法或本公开方法的任一其它实施方案中，在子代植物中选择农学特性改变的步骤(如果适用的话)可包括选择在各种环境条件下与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变的子代植物。
在任一前述方法或本公开方法的任一其它实施方案中，在所述引入步骤中，所述可再生的植物细胞可包含愈伤组织细胞、胚胎愈伤组织细胞、配子细胞、分生细胞或未成熟胚芽细胞。可再生的植物细胞可来源于近交玉米植物。
在任一前述方法或本公开方法的任一其它实施方案中，所述再生步骤可包括以下步骤：(i)在包含促胚发生激素的培养基中培养所述转化的植物细胞，直至观察到愈伤组织；(ii)将步骤(i)的所述转化植物细胞转移到第一培养基中，其包括促组织形成激素；以及(iii)在第二培养基上传代培养步骤(ii)后的所述转化的植物细胞，以允许嫩芽伸长、根发育或这两者同时发生。
在任一前述方法或本公开方法的任一其它实施方案中，至少一种农学特性可选自：非生物胁迫耐受性、绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、叶片数、分蘖数、生长速率、首次花粉脱落时间、首次吐丝时间、雌雄穗开花间隔(ASI)、茎直径、根构造、滞绿、相对水含量、水利用、水利用效率、主植株、分蘖、主穗、主植株和分蘖或芯的干重；籽粒行数、总植株重量、籽粒重量、籽粒数、耐盐性、叶绿素含量、黄酮醇含量、黄叶数、低温胁迫下的早期幼苗活力和出苗。至少一种农学特性的改变可为产量、绿度或生物量的提高。
在任一前述方法或本公开方法的任一其它实施方案中，植物可在胁迫条件下与不包含所述重组DNA构建体(或所述抑制DNA构建体)的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。
在任一前述方法或本公开方法的任一其它实施方案中，存在供选择的替代方案用于将包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸的重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中。例如可将调控序列(例如一种或多种增强子、任选地作为转座元件的部件)引入到可再生的植物细胞中，然后筛选其中将调控序列可操作地连接至编码本发明多肽的内源基因的事件。
向植物引入本公开的重组DNA构建体可通过任何合适的技术来进行，包括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、轰击或农杆菌(Agrobacterium)介导的转化。植物转化和再生技术已经在国际专利公布WO 2009/006276中进行了描述，其内容以引用方式并入本文。
含有编码所关注蛋白质的外来的外源性分离核酸片段的植物的发育或再生是本领域所熟知的。可使再生的植株自花授粉以提供纯合的转基因植株。另外，将从再生的植物获得的花粉与农艺上重要的品系的种子培育植株进行杂交。反过来，用来自这些重要品系的植物的花粉对再生的植物进行授粉。用本领域技术人员公知的方法来培植本公开的含有所需多肽的转基因植株。
实施方案：
1.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造和提高的分蘖数。
2.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出产量、生物量或两者的提高。
3.根据实施方案2所述的植物，其中所述植物在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的所述对照植物进行比较时表现出产量、生物量或两者的所述提高。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的植物，其中所述植物选自：拟南芥属(Arabidopsis)、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
5.实施方案1至4中任一项所述的植物种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体，该构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性，并且其中由所述种子产生的植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型的提高：干旱胁迫耐受性、三重胁迫耐受性、渗透胁迫耐受性、氮胁迫耐受性、分蘖数、产量和生物量。
6.一种提高植物中的胁迫耐受性的方法，其中胁迫选自：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫，该方法包括：
(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个调控序列的多核苷酸，其中多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性；
(b)由(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及
(c)获取来源于(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出对至少一个选自下列的胁迫提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。
7.一种选择具有提高的胁迫耐受性的植物的方法，其中胁迫选自：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫，所述方法包括：
(a)获取转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性；
(b)使部分(a)的转基因植物在其中该多核苷酸得以表达的条件下生长；以及
(c)选择部分(b)的转基因植物，其在与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有提高的胁迫耐受性，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。
8.一种选择产量、生物量或两者发生改变的植物的方法，该方法包括：
(a)获取转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性；
(b)使部分(a)的转基因植物在其中该多核苷酸得以表达的条件下生长；以及
(c)选择部分(b)的转基因植物，其在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出产量、生物量或两者的改变。
9.根据实施方案8所述的方法，其中所述选择步骤(c)包括确定(b)的转基因植物在水限制条件下与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出产量、生物量或两者的改变。
10.根据实施方案8或实施方案9所述的方法，其中所述改变是提高。
11.根据实施方案6至10中任一项所述的方法，其中所述植物选自：拟南芥属(Arabidopsis)、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
12.一种分离的多核苷酸，其包含：
(a)编码具有胁迫耐受性活性的多肽的核苷酸序列，其中胁迫选自干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫，并且其中多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131132，135，627或628进行比较时具有至少95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性；或
(b)(a)的核苷酸序列的全长互补序列。
13.根据实施方案12所述的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列具有与SEQ IDNO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111 113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628相比较小于100％的序列同一性。
14.根据实施方案12所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122。
15.一种包含重组DNA构建体的植物或种子，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控序列的实施方案12至14中任一项所述的多核苷酸。
16.一种在其基因组中包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的内源多核苷酸的植物，其中所述内源多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含异源调控元件的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。
17.一种提高作物植物中至少一个选自下列的表型的方法：三重胁迫耐受性、干旱胁迫耐受性、氮胁迫耐受性、渗透胁迫耐受性、ABA响应、分蘖数、产量和生物量，该方法包括提高作物植物中羧酸酯酶的表达。
18.根据实施方案17所述的方法，其中所述作物植物是玉米。
19.根据实施方案17或实施方案18所述的方法，其中羧酸酯酶在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性。羧酸酯酶可包含存在于共有序列SEQ ID NO：630中的至少一个元件，其选自：保守的“亲核弯头”(GxSxG)、保守的催化三联体和带有保守残基G-G-G的“氧负离子洞”。
20.根据实施方案17或实施方案18所述的方法，其中当利用SEQ ID NO：18，29，33，45，47，53，55，61，64，65，77，78，101，103，105，107，111，115，131，132，135，137，139，141，144，433，559和604制备的概形隐马尔可夫模型(Profile Hidden Markov Model)进行查询时，羧酸酯酶提供1E-15或更小的E-值评分，该查询使用hmmsearch算法进行，其中Z参数设为10亿。
21.一种包含下述多核苷酸的重组DNA构建体，其中所述多核苷酸可操作地连接至异源启动子，并且编码具有至少一种选自下列的活性的多肽：羧酸酯酶、提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数，其中该多肽当利用SEQ ID NO：18，29，33，45，47，53，55，61，64，65，77，78，101，103，105，107，111，115，131，132，135，137，139，141，144，433，559和604制备的概形隐马尔可夫模型(Profile Hidden Markov Model)进行查询时提供1E-15或更小的E-值评分，该查询使用hmmsearch算法进行，其中Z参数设为10亿。
22.一种包含实施方案21所述的重组构建体的植物，其中该植物在与不包含重组构建体的植物进行比较时表现出提高的产量、生物量或两者。
23.一种制备表现出至少一个选自下列的表型的植物的方法：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数，该方法包括：
(a)将实施方案21所述的重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中：
(b)由(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及
(c)获取来源于(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含实施方案21所述的重组DNA构建体，并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。
24.一种提高植物中的胁迫耐受性的方法，其中胁迫选自：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫，该方法包括：
(a)将实施方案21所述的重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中；
(b)由(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；以及
(c)获取来源于(b)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含实施方案21所述的重组DNA构建体并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出对至少一个选自下列的胁迫提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。
25.一种制备在与对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型的植物的方法：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量，该方法包括以下步骤：将重组DNA构建体引入到植物中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性。
26.一种制备表现出至少一个选自下列的性状的植物的方法：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量，其中该方法包括由包含重组DNA构建体的种子生长植物，其中重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性，其中该植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量。
27.一种制备种子的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使第一植物与第二植物杂交，其中第一植物和第二植物中的至少一个包含重组DNA构建体，其中该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性；以及
(b)选择杂交步骤(a)的种子，其中该种子包含重组DNA构建体。
28.根据实施方案27所述的方法，其中由部分(b)的种子生长的植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量。
29.一种从种子生产油或种子副产物、或两者的方法，该方法包括从种子提取油或种子副产物、或两者，该种子包含重组DNA构建体，其中该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性。
30.根据实施方案29所述的方法，其中种子获取自植物，该植物包含重组DNA构建体，并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的性状：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量。
31.根据实施方案29或实施方案30所述的方法，其中油或种子副产物、或两者，包含重组DNA构建体。
32.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18进行比较时具有至少95％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量。多肽的氨基酸序列可具有对SEQ ID NO：18小于100％的序列同一性。
33.一种制备在与对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型的植物的方法：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量，该方法包括以下步骤：将重组DNA构建体引入到植物中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，该多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18进行比较时具有至少95％的序列同一性。多肽的氨基酸序列可具有对SEQ ID NO：18小于100％的序列同一性。
在上文实施方案1-33中的任一项中，多肽可包含存在于共有序列SEQ ID NO：630中的至少一个元件，其选自：保守的“亲核弯头”(GxSxG)、保守的催化三联体和带有保守残基G-G-G的“氧负离子洞”。
实施例
以下实施例进一步说明本公开，除非另行指出，否则其中份和百分数是以重量计，度是指摄氏度。应理解，这些实施例虽然说明本公开的各实施方案，但仅以举例说明的方式给出。由以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可确定本公开的必要特征，并且在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可作出本公开的各种变化和修改以使本公开适合于各种应用和条件。因此，除了本文显示和描述的那些之外，本领域技术人员由前文的描述将显而易见地知道本公开的各种修改形式。此类修改形式也旨在落入所附权利要求的范围内。
实施例1
制备具有激活标记基因的拟南芥种群
使用已知方法制备拟南芥激活标记的种群。将所得的T1种子播在土壤上，通过喷洒草胺磷(AgrEvo；Bayer Environmental Science)选择转基因幼苗。选择了总共100,000株耐草胺磷的T1籽苗。将得自各品系的T2种子保持分离。
实施例2
筛选以鉴定耐旱性增加的品系
使激活标记的品系经受定量干旱胁迫筛选(PCT公开WO/2012/058528)。将在与整个浅箱的平均值进行比较时具有黄色积聚显著延迟和/或莲座叶面积显著保持的品系命名为Phase 1 hits。在相同分析条件下进行Phase 1 hits的重复试样再筛选。当Phase 2平行测定的其中一个或两个显示与整个浅箱的平均值有显著差异时(评分大于0.9)，则认为该品系是经验证的耐旱性品系。
实施例3
筛选以鉴定具有提高的ABA超敏感性的品系
使如实施例1所述的激活标记的品系经受独立的ABA敏感性筛选。筛选如国际专利申请PCT/US12/62374所述进行。
转基因植物品系的筛选在补充有低浓度ABA的培养基上完成。
野生型和大多数转基因种子在0.6μM ABA下显示一致的发芽特征。因此将0.6μMABA用于phase 1突变体筛选。
发芽在3天后出幼根时进行记录。种子使用放大镜手动计数。分析数据，发芽百分比为发芽种子对接种的种子总数的百分比。绘制发芽曲线。类似于野生型，大多数转基因品系在第3天具有＞90％的发芽率。因此对于定性为异常值的品系，它必须在第3天显示显著更低的发芽率(＜75％)。通常临界值(75％发芽率)偏离96个品系的平均值至少四个SD。记录在48小时、72小时的所有品系的发芽计数数据及它们的附图。
实施例4
鉴定来自耐旱性激活标记品系的激活标记的AT-DTP4多肽基因
进一步分析显示耐旱性的激活标记品系(No.121463)。提取来自该品系的DNA，并且在突变品系中侧接插入序列的基因通过SAIFF PCR进行鉴定(Siebert等人，NucleicAcids Res.23：1087-1088(1995))。鉴定一个PCR扩增的片段，它包含T-DNA边界序列和拟南芥属(Arabidopsis)基因序列。获取侧接插入序列的基因序列，并通过与完全拟南芥属(Arabidopsis)基因组的序列比对鉴定候选基因。就给定的整合事件而言，最靠近35S增强子元件/插入序列的注释基因是品系中的活化候选基因。就品系121463而言，在整合位点处最靠近35S增强子的基因是At5g62180(SEQ ID NO：16；NCBI GI No.30697645)，其编码DTP4多肽(SEQ ID NO：18；NCBI GI No.75180635)。
实施例5
鉴定来自显示ABA超敏感性的激活标记品系的激活标记的AT-DTP4多肽基因
一个激活标记的品系(No.990013；35S0059G11)显示ABA超敏感性，对其进行进一步分析。提取来自该品系的DNA，并且在突变品系中侧接T-DNA插入序列的基因通过使用SAIFF PCR进行鉴定(Siebert等人，Nucleic Acids Res.23：1087-1088(1995))。一个PCR扩增的片段得以鉴定，它包含T-DNA边界序列和拟南芥属(Arabidopsis)基因序列。获取侧接插入序列的基因序列，通过与完全拟南芥属(Arabidopsis)基因组的序列比对鉴定候选基因。就给定的整合事件而言，最靠近35S增强子元件/连接区的注释基因是品系中的活化候选基因。就品系990013而言，在整合位点处最靠近35S增强子的基因是At5g62180(SEQ IDNO：16；NCBI GI No.30697645)，其编码DTP4多肽(SEQ ID NO：18；NCBI GI No.75180635)。
实施例6
验证用于耐旱性的拟南芥属(Arabidopsis)候选基因At5g62180(AT-DTP4多肽)
可将候选基因转化到拟南芥属(Arabidopsis)中并在35S启动子下过表达(PCT公开WO/2012/058528)。如果在转基因品系中观察到与在亲本激活标记品系中相同或相似的表型，则认为该候选基因是拟南芥属中经验证的“前导基因”。
测试候选拟南芥属(Arabidopsis)DTP4多肽基因(At5g62180；SEQ ID NO：16；NCBIGI No.30697645)赋予耐旱性的能力。
将候选基因克隆在pBC-yellow中的35S启动子后以制备35S启动子：：At5g62180表达构建体pBC-Yellow-At5g62180。
转基因T1种子通过黄色荧光进行选择，并且将T1种子紧邻着野生型种子种植并在水限制条件下生长。生长条件和成像分析如实施例2所述。发现来自激活标记的初始耐旱性表型可在用其中At5g62180通过35S启动子直接表达的构建体转化过的野生型拟南芥属(Arabidopsis)植物中重现。通过PCT公开WO/2012/058528的方法测定的耐旱性评分是1.35。
实施例7
经由转化到拟南芥属(Arabidopsis)中验证拟南芥属(Arabidopsis)候选基因 At5g62180(AT-DTP4多肽)的ABA超敏感性
用以下方式测试候选拟南芥属(Arabidopsis)DTP4多肽基因(At5g62180；SEQ IDNO：16；NCBI GI No.30697645)赋予ABA超敏感性的能力。
合成At5g62180 cDNA蛋白编码区并将其克隆进转化载体中。
选择转基因T1种子并用于如下所述的发芽分析。发现初始ABA超敏感性表型可在用其中At5g62180通过35S启动子直接表达的构建体转化过的野生型拟南芥属(Arabidopsis)植物中重现。
分析条件：
种子进行表面消毒并层积96小时。将约100个种子接种到一个平板中并层积96小时，随后在生长室中培养，该生长室的程序为在22℃和50％相对湿度下光照16小时。发芽记录为出幼根。
观察和结果：
发芽在1/2MS培养基和1μM ABA中4天后出幼根时进行记录。种子使用放大镜手动计数。分析数据，发芽百分比为发芽种子对接种的种子总数的百分比。临界值低于对照至少2个标准方差。绘制发芽曲线。野生型col-0植物在第3天具有＞90％的发芽率。具有pBC-yellow-At5g62180的品系在第3天显示＜75％的发芽率，如图4所示。
实施例8
编码DTP4多肽的cDNA克隆的表征
cDNA文库提供来自玉米(Zea mays)、草香碗蕨(Dennstaedtia punctilobula)、刺田菁(Sesbania bispinosa)、三齿蒿(Artemisia tridentata)、宝盖草(Lamiumamplexicaule)、莫愁菊(Delosperma nubigenum)、皱叶椒草(Peperomia caperata)和其它植物物种的各种组织的mRNA，制备该文库并且鉴定编码DTP4多肽的cDNA克隆。
表3给出关于本文所公开的一些其它DTP4多肽的附加信息。
表3
一些DTP4多肽的说明
利用来自表1列出的克隆的At-DTP4多肽和玉米序列的BLAST搜索显示出由cDNA编码的多肽与来自各种生物体的DTP4多肽的相似性。如表1、表2和图1所示，某些cDNA编码的多肽类似于DTP4多肽，它们来自拟南芥属(Arabidopsis)(GI No.75180635；SEQ ID NO：18)。
表4和表5(专利文献)示出的是本文所公开的一些DTP4多肽的BLAST结果，它们是以下序列中的一者或多者：单个表达序列标签(“EST”)、包含指示cDNA克隆的完整cDNA插入序列的序列(“全长插入序列”或“FIS”)、由两个或更多个EST、FIS或PCR序列组装成的重叠群序列(“重叠群”)、或编码来源于FIS或重叠群的完整或功能蛋白的序列(“完全基因序列”或“CGS”)。表4和5也示出利用Clustal V比对方法、使用默认参数的每对氨基酸序列的百分比序列同一性值。
表4
DTP4多肽的BLASTP结果
表5：
DTP4多肽的BLASTP结果
图1A-图1G示出在ABA敏感性测定中测试的DTP4多肽(SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，99，101，103，107，111，113，117，119，121.123，127，129，130，131，132，135，627和628)的比对。在框中框出在给定位置与共有序列(SEQ ID NO：630)的残基相同的残基。如果一个残基在所有序列中相同，显示该残基，示出共有序列(SEQID NO：630)，否则用句点(period)表示。
图2示出图1A-1G中显示的DTP4多肽的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异度值。
使用生物信息学计算软件包(Inc.，Madison，WI)的程序进行序列比对和百分比同一性计算。序列的多重比对使用Clustal V比对方法进行(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5：151-153)，采用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)执行。使用Clustal方法进行双序列比对的默认参数是KTUPLE＝1、空位罚分＝3、窗口＝5以及对角线保存＝5。
序列比对和BLAST记分及概率指示包含本公开cDNA克隆的核酸片段编码DTP4多肽。
实施例9
制备含有拟南芥属(Arabidopsis)前导基因的同源物的植物表达载体
与拟南芥属(Arabidopsis)AT-DTP4多肽同源的序列可以使用序列比较算法如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1993)；也参见美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)国立医学图书馆(National Library of Medicine)的国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)的万维网网址上对BLAST算法的解释)进行鉴定。编码同源DTP4多肽的序列可通过任何以下方法进行PCR扩增。
方法1(基于RNA的方法)：如果编码DTP4多肽同源物基因的蛋白编码区的5’和3’序列信息或5’和3’UTR是可用的，能够如实施例5所述设计基因特异性引物。可将RT-PCR用于植物RNA来获得含有蛋白编码区的核酸片段，该蛋白编码区侧接attB1(SEQ ID NO：10)和attB2(SEQ ID NO：11)序列。引物可含有起始密码子上游的共有Kozak序列(CAACA)。
方法2(基于DNA的方法)：另选地，如果编码DTP4多肽同源物的基因的cDNA克隆是可用的，可以PCR扩增完整cDNA插入序列(含有5′和3′非编码区)。可设计正向引物和反向引物，使它们分别含有attB1序列和在该cDNA插入序列前面的载体特异性序列、或者attB2序列和在该cDNA插入序列后面的载体特异性序列。对于克隆进载体pBulescript SK+中的cDNA插入序列，可使用正向引物VC062(SEQ ID NO：14)和反向引物VC063(SEQ ID NO：15)。
方法3(基因组DNA)：可利用长片段基因组PCR捕获(long range genomic PCRcapture)获得基因组序列。可基于基因组座位的序列设计引物，并可将所得的PCR产物进行测序。能够使用FGENESH(Salamov，A.和Solovyev，V.(2000)Genome Res.，10：516-522)程序进行序列分析，并且任选地能够与来自其它物种的同源序列进行比对以辅助鉴定推定的内含子。
上述方法可根据本领域技术人员已知的步骤进行修改。例如，方法1的引物可含有限制性酶切位点而不是attB1和attB2位点，用于后来将PCR产物克隆进含有attB1和attB2位点的载体内。另外，方法2可涉及从cDNA克隆、λ克隆、BAC克隆或基因组DNA扩增。
可利用BP重组反应将通过任一种上述方法获得的PCR产物与供体载体(例如pDONRTM/Zeo(INVITROGENTM)或pDONRTM221(INVITROGENTM)组合。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从pDONRTM221移除并定向克隆具有侧接attB1和attB2位点的PCR产物而得到入门克隆(入门克隆)。使用INVITROGENTM CLONASETM技术，然后能够将来自入门克隆的编码同源DTP4多肽的序列转移到合适的目的载体中，如pBC-Yellow、PHP27840或PHP23236(PCT公开WO/2012/058528；其以引用方式并入本文)，以获得植物表达载体，其分别用于拟南芥属(Arabidopsis)、大豆和玉米。
供体载体pDONRTM/Zeo或pDONRTM221的attP1和attP2位点分别在SEQ ID NO：2和3中给出。目的载体pBC-Yellow、PHP27840和PHP23236的attR1和attR2位点分别在SEQ IDNO：8和9中给出。BP反应是在表达克隆(或侧接attB的PCR产物)和供体(例如pDONRTM)载体之间的重组反应以形成入门克隆。LR反应是在入门克隆和目的载体之间的重组以形成表达克隆。供体载体包含attP1和attP2位点。入门克隆包含attL1和attL2位点(分别是SEQ ID NO：4和5)。目的载体包含attR1和attR2位点。表达克隆包含attB1和attB2位点。attB1位点由attL1和attR1位点部分构成。attB2位点由attL2和attR2位点部分构成。
另选地，可进行多个入门克隆和合适的目的载体之间的MultiSiteLR重组反应以产生表达载体。
实施例10
用验证过的拟南芥属(Arabidopsis)前导基因制备大豆表达载体并转化大豆
可转化大豆植物以过表达经验证的拟南芥属前导基因或得自各种物种的相应同源物以便检查所得的表型。
可将实施例5中所述的相同入门克隆用于将每个基因定向克隆进PHP27840载体(PCT公开WO/2012/058528)中，使得该基因的表达处于SCP1启动子(国际公布03/033651)的控制下。
然后可用包含编码本公开多肽的序列的表达载体转化大豆胚芽。大豆转化和再生技术已经在国际专利公布WO 2009/006276中进行了描述，其内容以引用方式并入本文。
T1植物可经受土壤基的干旱胁迫。使用图像分析，可在干旱胁迫之前和期间进行多次植物面积、体积、生长速率和颜色分析。导致萎蔫或叶片面积减少的显著推迟、黄色积聚和/或在干旱胁迫期间生长速率提高的过表达构建体将被认为是拟南芥属(Arabidopsis)基因在大豆中发挥功能以提高耐旱性的证据。
然后可在较严格的田间基研究下检测分析用验证基因转化的大豆植物以研究在灌溉良好和水限制条件下的产量增加和/或稳定性。
实施例11
使用粒子轰击用经验证的拟南芥属(Arabidopsis)前导基因转化玉米
可转化玉米植物以过表达经验证的拟南芥属前导基因或得自各种物种的相应同源物以便检查所得的表型。
可使用实施例5中所述的相同入门克隆将每个基因定向克隆到玉米转化载体中。在玉米转化载体中该基因的表达可处于组成型启动子的控制下，例如玉米遍在蛋白启动子(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)。
然后可通过粒子轰击将上述重组DNA构建体引入玉米细胞中。通过粒子轰击的玉米转化技术已经在国际专利公布WO 2009/006276中进行了描述，其内容以引用方式并入本文。
T1植物可经受土壤基的干旱胁迫。使用图像分析，可在干旱胁迫之前和期间进行多次植物面积、体积、生长速率和颜色分析。导致萎蔫或叶片面积减少的显著推迟、黄色积聚和/或在干旱胁迫期间生长速率提高的过表达构建体将被认为是拟南芥属(Arabidopsis)基因在玉米中发挥功能以提高耐旱性的证据。
实施例12
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404的电穿孔
将电穿孔感受态细胞(40μL)如包含PHP10523(PCT公开WO/2012/058528)的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404在冰上解冻(20至30分钟)。PHP10523含有供进行T-DNA转移的VIR基因、农杆菌低拷贝数质粒复制起点、四环素抗性基因和用于体内DNA生物分子重组的Cos位点。同时，将电穿孔小槽在冰上冷冻。将电穿孔仪设置调整为2.1kV。将DNA等分试样(0.5μL亲本DNA，在低盐缓冲液或双蒸H2O中的浓度为0.2μg-1.0μg)与解冻的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404细胞混合，同时仍在冰上。将混合物转移至电穿孔管的底部并静止保持在冰上1-2分钟。按下“pulse(脉冲)”键两次(理想的是获得4.0毫秒的脉冲)对细胞进行电穿孔(Eppendorf电穿孔仪2510)。随后，将0.5mL室温下的2xYT培养基(或SOC培养基)加入到电穿孔管并转移至15mL按压盖管(例如FALCONTM管)中。将细胞在28-30℃、200-250rpm下温育3小时。
将250μL的等分试样散布在包含YM培养基和50μg/mL奇放线菌素的平板上并在28-30℃下培养三天。为了增加转化体的数目，可进行如下两个任选步骤中的其中一个：
选项1：用30μL 15mg/mL利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体抗性基因。这个额外的选择消除了当使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时所观察到的某些污染性菌落。
选项2：该电穿孔重复进行两次，以补偿较差的电感受态细胞。
转化体的鉴定：
选取四个独立的克隆并划痕接种在包含AB基本培养基和50μg/mL奇放线菌素的平板上用于分离单个克隆。将平板在28℃下孵育二至三天。对于每个推定的共整合体选取单个克隆并将其接种在4mL的10g/L细菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，和50mg/L奇放线菌素中。将混合物在振荡下于28℃温育24小时。采用Miniprep和任选的PB缓冲液洗涤，从4mL培养物分离出质粒DNA。DNA在30μL中洗脱。将2μL等分试样用于如上所述对20μL的DH10b+20μL双蒸H2O进行电穿孔。任选地，可将15μL等分试样用于转化75-100μLINVITROGENTM Library Efficiency DH5α。将细胞散布在包含LB培养基和50μg/mL奇放线菌素的平板上并将其在37℃下培养过夜。
对于每个推定的共整合体选取三至四个独立克隆并将其接种在4mL的2xYT培养基(10g/L细菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠)和50μg/mL奇放线菌素中。将细胞在振荡下于37℃下温育过夜。接下来，使用Miniprep，用任选PB缓冲液洗涤(洗脱成50μL)，以从4mL培养物中分离质粒DNA。使用8μL质粒DNA用SalI(使用亲本DNA和PHP10523作对照物)进行消化。对代表2种具有正确Sall消化模式(使用亲本DNA和PHP10523作为对照)的推定共整合子的4个质粒，使用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII再进行三次消化。推荐使用电子凝胶来进行比较。
实施例13
使用农杆菌属(Agrobacterium)细菌转化玉米
可转化玉米植物以过表达经验证的拟南芥属前导基因或得自各种物种的相应同源物以便检查所得的表型。
农杆菌介导的玉米的转化基本上如Zhao等人在Meth.Mol.Biol.318：315-323(2006)中所述进行(也参见Zhao等人，Mol.Breed.8：323-333(2001)和公布于1999年11月9日的美国专利5,981,840，其以引用方式并入本文)。转化过程涉及细菌接种、共培养、静息、选择和植物再生。
1.未成熟胚芽制备：
将未成熟玉米胚芽从颖果上切下来，并且放置在含有2mL PHI-A培养基的2mL微量管中。
2.未成熟胚芽的农杆菌属(Agrobacterium)细菌感染和共培养：
2.1感染步骤：
用1mL微量移液器移除(1)的PHI-A培养基并添加1mL农杆菌悬浮液。将管轻轻地倒转进行混合。将混合物在室温下温育5分钟。
2.2共培养步骤：
用1mL微量移液器从感染步骤移除农杆菌悬浮液。使用无菌刮刀，将胚从管刮脱并转移至100×15mm培养皿中的PHI-B培养基平板。将胚以胚轴向下定向在培养基的表面上。将带有胚的平板在黑暗中20℃下培养三天。L-半胱氨酸可用于共培养阶段。对于标准双元载体，提供有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培养培养基对回收稳定的转基因事件是关键的。
3.推定的转基因事件的选择
向100×15mm培养皿中的每个PHI-D培养基板转移10个胚，保持取向，用石蜡膜(Parafilm)将皿密封。将平板在黑暗中于28℃下培养。预计在六至八周将看见作为黄色胚芽组织的主动生长推定事件。不产生事件的胚可能是褐色的并且坏死，极少看到脆性组织生长。取决于生长速率，以二至三周的间隔将推定的转基因胚性组织分培至新鲜的PHI-D平板。记录事件。
4.T0植株的再生
将在100×25mm培养皿中的PHI-D培养基上繁殖的胚性组织分培至PHI-E培养基(体细胞胚成熟培养基)并在黑暗中于28℃下温育，直至体细胞胚成熟，持续约十至十八天。将具有明确盾片和胚芽鞘的单独的成熟体细胞胚转移至PHI-F胚发芽培养基并在光照(约80μE，来自冷白色荧光灯或等同的荧光灯)下于28℃下温育。在七至十天后，将再生的植株(约10cm高)盆栽于园艺混合物(horticultural mix)中并用标准的园艺方法使之茁壮。
用于植物转化的培养基：
1.PHI-A：4g/L CHU基础盐，1.0mL/L 1000X Eriksson′s维生素混合物，0.5mg/L盐酸硫胺，1.5mg/L 2，4-D，0.69g/L L-脯氨酸，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，pH5.2。添加100μM乙酰丁香酮(过滤灭菌)。
2.PHI-B：无葡萄糖的PHI-A，2，4-D增加至2mg/L，蔗糖减少至30g/L并补充有0.85mg/L硝酸银(过滤灭菌)、3.0g/L100μM乙酰丁香酮(过滤灭菌)，pH5.8。
3.PHI-C：无和乙酰丁香酮的PHI-B，减少2，4-D至1.5mg/L，补加8.0g/L琼脂、0.5g/L 2-[N-吗啉]乙磺酸(MES)缓冲剂、100mg/L羧苄西林(过滤灭菌)。
4.PHI-D：补加3mg/L双丙氨膦的PHI-C(过滤灭菌)。
5.PHI-E：4.3g/L Murashige和Skoog(MS)盐(Gibco，BRL 11117-074)，0.5mg/L烟酸，0.1mg/L盐酸硫胺素，0.5mg/L盐酸吡哆辛，2.0mg/L甘氨酸，0.1g/L肌醇，0.5mg/L玉米素(西格玛公司(Sigma)，目录号Z-0164)，1mg/L吲哚乙酸(IAA)，26.4μg/L脱落酸(ABA)，60g/L蔗糖，3mg/L双丙氨膦(过滤灭菌)，100mg/L羧苄青霉素(过滤灭菌)，8g/L琼脂，pH5.6。
6.PHI-F：无玉米素、IAA、ABA的PHI-E；蔗糖减少至40g/L；用1.5g/L代替琼脂；pH 5.6。
可通过首先将组织簇转移至补充有0.2mg/L 2，4-D的N6培养基来从转基因愈伤组织再生植株。两个星期后，可将组织转移至再生培养基(Fromm等人，Bio/Technology 8：833-839(1990))。
可再生出转基因T0植物并确定它们的表型。可收集T1种子。
此外，含有经验证的拟南芥属(Arabidopsis)基因的重组DNA构建体可通过直接转化或者通过从单独转化的品系渗入来引入到玉米优良近交系中。
近交或杂交的转基因植物可通过更严苛的田间实验来研究在水限制条件下和不限制水条件下的产量增加和/或稳定性。
随后可进行产量分析以测定包含验证过的拟南芥属(Arabidopsis)前导基因的植物在与不包含验证过的拟南芥属(Arabidopsis)前导基因的对照植物(或参比植物)进行比较时是否具有产量改善(在水限制条件下和不限制水条件下)。具体地，可在包含验证过的拟南芥属(Arabidopsis)前导基因的植物和对照植物的开花期和/或结实期施加水限制条件。包含验证过的拟南芥属(Arabidopsis)前导基因的植物相对于对照植物将具有更少的产量损失，例如在水限制条件下的产量损失减少至少25％，至少20％，至少15％，至少10％或至少5％，或者在不限制水条件下相对于对照植物将具有提高的产量，例如产量提高至少5％，至少10％，至少15％，至少20％或至少25％。
实施例14A
制备用于转化玉米的拟南芥属(Arabidopsis)前导基因(At5g62180)表达载体
使用INVITROGENTM 技术，进行LR重组反应以制备前体质粒pEV-DTP4。载体pEV-DTP4包含以下表达盒：
遍在蛋白启动子：：At5g62180(SEQ ID NO：17)：：PinII终止子；过表达感兴趣的基因(拟南芥属(Arabidopsis)DTP4多肽)的表达盒。
还克隆具有替代密码子的At5g62180序列SEQ ID NO：19以形成前体质粒pEV-DTP4ac，其包含以下表达盒：遍在蛋白启动子：：At5g62180(SEQ ID NO：19)：：SB-GKAF终止子；过表达感兴趣的基因(拟南芥属(Arabidopsis)DTP4多肽)的表达盒。
SB-GKAF终止子描述于美国专利申请61/514055中，其以引用方式并入本文。
实施例14B
利用农杆菌属(Agrobacterium)用拟南芥属(Arabidopsis)前导基因(At5g62180) 转化玉米
利用如实施例12和13所述的利用农杆菌介导的转化，可将存在于载体pEV-DTP4中的DTP4多肽表达盒和存在于载体pEV-DTP4ac中的DTP4多肽表达盒引入玉米近交系或来源于优良玉米近交系的可转化玉米品系中。
可将载体pEV-DTP4电穿孔引入包含载体PHP10523(PCT公开WO/2012/058528)的LBA4404农杆菌属(Agrobacterium)菌株中以形成共整合载体pCV-DTP4。共整合载体是通过2个质粒pEV-DTP4与PHP10523的重组(通过每个载体上含有的COS重组位点)而形成的。共整合载体pCV-DTP4除包含农杆菌属(Agrobacterium)菌株和农杆菌介导的转化所需的其它基因(TET，TET，TRFA，ORI终止子，CTL，ORI V，VIR C1，VIR C2，VIR G，VIR B)之外，还包含同上(实施例14A)的表达盒。
相似地，将载体pEV-DTP4ac和PHP10523重组以提供共整合载体pCV-DTP4ac。共整合载体pCV-DTP4ac除包含农杆菌属(Agrobacterium)菌株和农杆菌介导的转化所需的其它基因(TET，TET，TRFA，ORI终止子，CTL，ORI V，VIR C1，VIR C2，VIR G，VIR B)之外，还包含与pEV-DTP4ac(实施例14A)相同的表达盒。
实施例15
制备用于转化Gaspe Flint来源的玉米品系的目的载体PHP23236
目的载体PHP23236是通过用质粒PHP23235转化包含质粒PHP10523的农杆菌属(Agrobacterium)菌株LBA4404并分离所得的共整合产物而获得的。质粒PHP23236、PHP10523和PHP23235在PCT公开WO/2012/058528中有所描述，其以引用方式并入本文。目的载体PHP23236可被用于如实施例16所述的与入门克隆的重组反应，以产生用于转化GaspeFlint衍生的玉米品系的玉米表达载体。
实施例16
制备用于转化Gaspe Flint来源的玉米品系的质粒
使用INVITROGENTM LR重组技术，可将At5g62180候选基因的蛋白编码区定向克隆到目的载体PHP23236(PCT公开WO/2012/058528)中以形成表达载体pGF-DTP4。这种表达载体包含在UBI启动子控制下编码DTP4多肽的感兴趣的蛋白编码区，并且是T-DNA二元载体，用于通过如本文所述实施例所述(但不限于)的农杆菌属介导的转化引入玉米中。
实施例17
用验证过的拟南芥属(Arabidopsis)前导基因转化Gaspe Flint来源的玉米品系
可转化玉米植物以过表达拟南芥属(Arabidopsis)前导基因或得自其它物种的相应同源物以便检查所得的表型。可转化Gaspe Flint来源的玉米品系并如前文的PCT公开WO/2012/058528所述进行分析，该公开的内容以引用方式并入本文。
实施例18A
评估Gaspe Flint来源的玉米品系的耐旱性
可用以下方法筛选具有干旱胁迫耐受性的含候选基因的转基因Gaspe Flint来源的玉米品系。
转基因玉米植物经受供水良好条件(对照)和干旱胁迫条件。在T1阶段或更晚的阶段筛选转基因玉米植物。
对于植物生长，土壤混合物由1/31/3SB300和1/3沙土构成。所有罐装满相同量的土壤±10克。手动浇水使得罐达到最多100％的罐体容量(“FC”)。使用20-10-20(氮-磷-钾)125ppm氮营养溶液将所有植物保持在60％FC。在整个实验期间每张表监测pH每周至少三次。在种植后第13天开始(DAP)，实验可分成两个处理组，良好灌溉组和缺水组。将包括缺水处理组在内的所有植物保持在40％FC，而将良好灌溉处理组的植物保持在80％FC。缺水植物在慢性干旱胁迫条件下(40％FC)生长10天。在慢性胁迫期间所有植物每日拍照。在慢性干旱末期(22DAP)采集植物样品用于代谢特征分析。在慢性胁迫结束时给所有植物拍照并测量叶绿素荧光。缺水植物经过重度干旱胁迫期及随后的恢复期，分别为23-31DAP和32-34DAP。在重度干旱胁迫期间，限制水和营养物质直至植物达到8％FC。在重度胁迫期和回复期结束时给所有植物再次拍照并测量叶绿素荧光。计算更大的Student′s t检验的概率，以用于比较每个转基因平均值与合适的无效转基因平均值(分离无效转基因或构建体无效转基因)。使用最小值(P＜t)0.1作为具有统计意义上显著性的结果的临界值。
实施例18B
评估玉米品系的耐旱性
具有提高的耐旱性的品系也能够使用以下方法进行筛选(也参见图3的处理时间表)：
转基因玉米幼苗通过测量叶绿素荧光性能、生物量积聚和干旱存活率进行耐旱性筛选。转基因植物与无效转基因植物(即，不包含该转基因)进行比较。实验设计为随机完全区集(Randomized Complete Block)，并且重复实验由来自每个事件的13个阳性植株和一个构建体无效植株组成(每个事件2个阴性植株)。
植物在水分充足(WW)条件下生长＝60％田间持水量(％FC)至三叶阶段。在三叶阶段，在WW条件下进行第一次荧光测量，测量位置在最充分展开的叶片的转折点上、叶缘上并避开中间的叶脉。
这之后通过保持20％FC 9至10天进行一次中度干旱胁迫(图3，第13天，MOD DRT)。在该胁迫处理期间叶片可能出现灰色并且可能发生卷曲。在MOD DRT末期，通过提高至25％FC使植物恢复(MOD rec)。在这段时间内，叶片将开始展开。这是一个时间敏感性的步骤，其发生可能需要至多1小时并且可能取决于构建体和测试的时间。当植物看起来已经完全恢复时(叶片展开)，进行第二次荧光测量。
这之后通过不提供任何水直至植物衰萎来进行重度干旱胁迫(SEV DRT)。重度干旱胁迫的持续时间为8-10天和/或至植物衰萎为止。随后，通过灌溉所有植物至100％FC进行恢复(REC)。保持100％FC 72小时。在恢复24、48、72小时后记录存活率评分(是/否)。
采集完整的苗(鲜苗)样品并记录重量(苗鲜重)。然后将鲜苗材料在70度干燥120小时，此时记录苗干重。
测量的变量定义如下：
变量“Fv’/Fm’无胁迫”是在最优灌溉条件下，在最充分展开的叶片(最常见的第三片叶)的转折点上、叶缘上并避开中间的叶脉的最佳量子产率(Fv’/Fm’)的量度。Fv’/Fm’提供对给定PPFD上PSII光化学的最大效率的估计，它是如果所有PSII中心开启(QA氧化)时PSII的运行效率。
变量“Fv’/Fm’胁迫”是在水胁迫条件下(25％田间持水率)的最佳量子产率(Fv’/Fm’)的量度。该测量在其中田间持水率从60％下降至20％的中度干旱期之前。在那时田间持水率达到25％并且收集测量数据。
变量“phiPSII_无胁迫”是在最优灌溉条件下，在最充分展开的叶片(最常见的第三片叶)的转折点上、叶缘上并避开中间的叶脉的Photosystem II(PSII)效率的量度。phiPSII值提供对PSII运行效率的估计，其估计PSII吸收光用于QA还原的效率。
变量“phiPSII_胁迫”是在水胁迫条件下(25％田间持水率)的Photosystem II(PSII)效率的量度。该测量在其中田间持水率从60％下降至20％的中度干旱期之前。在那时田间持水率达到25％并且收集测量数据。
实施例19A
具有拟南芥属(Arabidopsis)前导基因的玉米品系的产量分析
含有经验证的拟南芥属(Arabidopsis)基因的重组DNA构建体可通过直接转化或者通过从单独转化的品系渗入来引入到玉米优良近交系中。
近交或杂交的转基因植物可通过更严苛的田间试验来研究在水限制条件下和供水良好条件下的产量增加和/或稳定性。
随后可进行产量分析以测定包含验证过的拟南芥属(Arabidopsis)前导基因的植物在与不包含验证过的拟南芥属(Arabidopsis)前导基因的对照植物进行比较时是否具有产量改善(在水限制条件下)。具体地，可在包含验证过的拟南芥属(Arabidopsis)前导基因的植物和对照植物的开花期和/或结实期施加干旱条件。可以测得这两种植物的产量都有所减少。包含验证过的拟南芥属(Arabidopsis)前导基因的植物具有相对于对照植物更少的产量损失，例如产量损失减少至少25％，至少20％，至少15％，至少10％或至少5％。
可使用以上方法选择在水限制条件下和/或供水良好条件下，与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有增加产量的转基因植物。包含验证过的拟南芥属(Arabidopsis)前导基因的植物在水限制条件下和/或供水良好条件下可具有相对于对照植物提高的产量，例如产量提高至少5％，至少10％，至少15％，至少20％或至少25％。
实施例19B
用编码拟南芥属(Arabidopsis)前导基因At5g62180的pCV-DTP4转化的玉米品系 的产量分析
在3个位置(位置“A”、“E”和“B”)对九个转基因事件进行了田间测试。在“B”位置，在开花期间施加干旱条件(“B1”；开花胁迫)并且在籽粒灌浆期间施加干旱条件(“B2”；籽粒灌浆胁迫)。在籽粒灌浆期间在“A”位置提供足量水，并且在“E”位置经历轻度干旱。9个转基因事件的产量数据(蒲式耳/英亩；bu/ac)在图5中与wt和批无效对照(BN)一起显示。双尾检验的统计学显著性报道为P＜0.1。
当值大于无效比较时，显著性值(2-尾检验具有小于或等于0.1的P值)用粗体示出，并且当值小于无效时，用粗体和斜体示出。
在最严重的“B2”位置，它是中性的。在中度的“B1”位置，三个事件是阳性的，但是实验是不可靠的，因为在无效转基因和野生型性能之间的趋异度非预期。
实施例19C
用编码拟南芥属(Arabidopsis)前导基因At5g62180的pCV-DTP4ac转化的玉米品 系的产量分析
第一年测试：
如实施例14A和14B所述将由存在于载体pCV-DTP4ac中的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)编码的AT-DTP4多肽(SEQ ID NO：18)引入可转化的玉米品系，其来源于优良玉米近交系。
八个转基因事件在5个位置A、E、C、D和B进行田间测试。在位置B处，在开花期间施加轻度干旱条件(这个处理分成2个区域B1-a和B1-b)，并且在籽粒灌浆期间施加重度干旱条件(“籽粒灌浆胁迫；B2)。在籽粒灌浆期间在“A”位置提供足量水，并且在“E”位置经历轻度干旱。“C”和“D”位置经历重度胁迫(图10)。
在所有位置收集产量数据，每个位置进行3-6个平行测定。
8个转基因事件的产量数据(蒲式耳/英亩；bu/ac)与批无效对照(BN)一起显示在图10A和10B中。产量分析通过ASREML(VSN International Ltd)进行，并且值是BLUP(BestLinear Unbiased Prediction)(Cullis，B.R等人，(1998)Biometrics 54：1-18，Gilmour，A.R.等人，(2009)ASReml User Guide 3.0，Gilmour，A.R.等人，(1995)Biometrics51：1440-50)。
如图10A所示，转基因对产量的一致效应在所有位置显现，这导致在3-8事件中的显著正效应，阳性事件量值范围为4至16bu/ac。
图10B示出将位置分成“高胁迫”、“低胁迫”和“无胁迫(TPE)”类别的产量分析。从图15B中可看出，在高胁迫和低胁迫位置的所有8个转基因事件、以及在“无胁迫类别”的2个事件均可见转基因对产量的正效应。
也评估转基因对其它农学特性的效应；例如植株高度和穗高(EARHT，PLTHT；在位置“A”(无胁迫)和位置“D”(高胁迫)位置)、热致脱落时间(TTSHED：位置“D”和B2-b(位置B，籽粒灌浆胁迫)；两个高胁迫位置)、根倒伏或茎倒伏百分比(LRTLPC，STLPCT；在位置“E”(低胁迫位置)。如图11A和图11B所示，未观察到转基因对这些特性的效应。
第二年测试：
第一年进行田间测试的八个转基因事件在第二年，在具有不同干旱胁迫水平的多个位置进行田间测试：无胁迫(8个位置；图14A中的1-8)；中度胁迫(5个位置；图14A中的9-13)；和重度胁迫(5个位置；图14A中的14-18)。
八个转基因事件也在三个低氮位置(图14A中的位置19-21)进行测试。
在所有位置收集产量数据，每个位置进行3-6个平行测定。
干旱胁迫的8个转基因事件的产量数据(蒲式耳/英亩；bu/ac)在图14A-14C中示出，并且响应低氮胁迫的产量数据在图15中示出；所有数据与批无效对照(BN)一起示出。产量分析通过ASREML(VSNInternational Ltd)进行，并且值是BLUP(Best Linear UnbiasedPrediction)(Cullis，B.R等人，(1998)Biometrics 54：1-18，Gilmour，A.R.等人，(2009)ASReml User Guide 3.0，Gilmour，A.R.等人，(1995)Biometrics51：1440-50)。图14D示出“无胁迫”、“中度胁迫”和“重度胁迫”位置的多位置分析，以及所有干旱胁迫位置的多位置分析。
如图14A-图14D所示，转基因对产量的效应在至少一个无胁迫位置、至少2个中度和重度胁迫位置可见；在图14D中的多位置分析示出转基因对产量的一致的正效应，在中度胁迫下阳性事件量值范围为15至20bu/ac。
图14D示出将位置分成“高胁迫”、“低胁迫”和“无胁迫”类别的产量分析。从图14B中可看出，在中度胁迫和重度胁迫位置的所有8个转基因事件、以及在“无胁迫类别”的2个事件均可见转基因对产量的正效应。
如图15所示，在低氮条件下未观察到转基因对产量的正效应。
实施例19D
用编码拟南芥属(Arabidopsis)DTP4同源物AT-CXE8的pCV-AT-CXE8ac转化的玉米 品系的产量分析
如实施例14A和实施例14B所述克隆由具有替代密码子的核苷酸序列(SEQ ID NO：63)编码的AT-CXE8多肽(SEQ ID NO：64)；使用Invitrogen Gateway技术。
也克隆具有替代密码子的At2g45600序列SEQ ID NO：63以形成前体质粒pEV-CXE8ac，其包含以下表达盒：Zm遍在蛋白启动子：：At2g45600(SEQ ID NO：19)：：Sb-Ubi终止子；过表达感兴趣的基因(AT-DTP4同源物，拟南芥属(Arabidopsis)CXE8多肽)的表达盒。
如实施例14A和14B所述将由存在于载体pCV-AT-CXE8ac中的核苷酸序列(SEQ IDNO：63)编码的AT-CXE8多肽(SEQ ID NO：64)引入可转化的玉米品系，其来源于优良玉米近交系。
在7个位置对七个转基因事件进行了田间测试。
七个转基因事件在多个位置进行田间测试，它们的干旱胁迫水平不同：无胁迫(1个位置；图16A中的位置28)；中度胁迫(1个位置；图16A中的位置22)；和重度胁迫(4个位置；图16A中的位置24-27)。
在所有位置收集产量数据，每个位置进行3-6个平行测定。
七个转基因事件的产量数据(蒲式耳/英亩；bu/ac)与批无效对照(BN)一起显示在图16A和16B中。产量分析通过ASREML(VSN International Ltd)进行，并且值是BLUP(BestLinear Unbiased Prediction)(Cullis，B.R等人，(1998)Biometrics 54：1-18，Gilmour，A.R.等人，(2009)ASReml User Guide 3.0，Gilmour，A.R.等人，(1995)Biometrics51：1440-50)。
如图16A所示，转基因对产量的一致效应在无胁迫和重度胁迫位置可见，这导致在3-8事件中的显著正效应，阳性事件量值范围为5至10bu/ac。
图16B示出通过干旱胁迫水平分组的所有位置的产量分析。从图16B中可看出，在将所有胁迫水平位置一起分析后，在所有位置分析中6个转基因事件显示转基因对产量的正效应。
实施例20A
制备用于玉米转化的玉米DTP4多肽前导基因表达载体
可将在专利申请中公开的玉米DTP4同源物的蛋白编码区引入INVITROGENTM载体以形成入门克隆。
利用INVITROGENTM 技术，可进行入门克隆和目的载体的LR重组反应以形成前体质粒。这些载体包含以下表达盒：
遍在蛋白启动子：：Zm-DTP4-多肽：：PinII终止子；过表达感兴趣基因的表达盒。
实施例20B
利用农杆菌属(Agrobacterium)用玉米DTP4多肽前导基因转化玉米
利用如实施例12和13所述的利用农杆菌介导的转化，可将来自上述实施例的存在于载体中的玉米DTP4多肽表达盒引入玉米近交系或来源于优良玉米近交系的可转化玉米品系。
可将任何或这些载体电穿孔引入包含载体PHP10523(PCT公开WO/2012/058528)的LBA4404农杆菌属(Agrobacterium)菌株中以形成共整合载体。共整合载体是通过2个质粒(前体质粒与PHP10523)的重组(通过每个载体上含有的COS重组位点)而形成。共整合载体除包含农杆菌属(Agrobacterium)菌株和农杆菌介导的转化所需的其它基因(TET，TET，TRFA，ORI终止子，CTL，ORI V，VIR C1，VIR C2，VIR G，VIRB)之外，还包含3个同上(实施例20A)的表达盒。
实施例21
制备用于转化Gaspe Flint来源的玉米品系的玉米表达质粒
利用如实施例9所述的INVITROGENTM 重组技术，编码本文公开的玉米DTP4多肽同源物的克隆可定向克隆进入目的载体PHP23236(POT公开WO/2012/058528)以形成表达载体。每个表达载体包含在UBI启动子控制下感兴趣的cDNA，并且是T-DNA二元载体，用于通过如本文所述实施例所述(但不限于)的农杆菌属介导的转化引入玉米中。
实施例22
转化和评价具有验证过的前导基因的大豆同源物的大豆
基于同源性搜索，可鉴定验证过的拟南芥属(Arabidopsis)前导基因的一个或若干个候选大豆同源物，并且还可评估它们增加大豆耐旱性的能力。载体构建、植物转化和表型分析将类似于前述实施例所述的规程。
实施例23
用具有验证过的前导基因的玉米和大豆同源物转化拟南芥属(Arabidopsis)
验证过的拟南芥属(Arabidopsis)前导基因的大豆和玉米同源物能够在35S启动子的控制下被转化到拟南芥属(Arabidopsis)中并评价它们提高拟南芥属(Arabidopsis)耐旱性的能力。载体构建、植物转化和表型分析将类似于前述实施例所述的规程。
实施例24
用来自其它物种的DTP4多肽转化拟南芥属(Arabidopsis)
本文公开的任何DTP4多肽，包括在表1或表2中给出的多肽，可在35S启动子的控制下被转化到拟南芥属(Arabidopsis)中并评价它们提高拟南芥属(Arabidopsis)耐旱性的能力，或者在本文所述的任何其它测试中进行评价。载体构建、植物转化和表型分析将类似于前述实施例所述的规程。
实施例25A
渗透胁迫分析
为了分析转基因品系的渗透胁迫耐受性，在培养基中的渗透物组合如水溶性的无机盐、糖醇和高分子量非透过渗透物可用于选择渗透耐受性植物品系。
在这一四组分胁迫分析中所用的渗透胁迫剂是：
1)NaCl(氯化钠)
2)山梨醇
3)甘露糖醇
4)聚乙二醇(PEG)
通过在培养基中提供这些胁迫剂，我们目标在于模拟体外环境中的多种胁迫条件，从而为植物提供响应四种胁迫剂的机会。
方法和材料：
因为有四种胁迫剂一起使用，在溶液中每种胁迫剂为四分之一，它们一起将提供100％的胁迫或1.23MPa的渗透压。因此在100％四组分培养基中使用每种组分的以下浓度。
分析条件：种子进行表面消毒并层积48小时。将约100个种子接种到一个平板中并在生长室中培养，该生长室的程序为在22℃和50％相对湿度下光照16小时。发芽记录为出幼根。
分析计划：完成6-天分析和延长的10-天分析以测试转基因拟南芥属(Arabidopsis)品系种子的渗透胁迫耐受性。
第0天-对不同干旱前处理和层积的种子进行表面消毒
第2天-接种到四组分培养基上
第4天-发芽(48小时)计数
第5天-发芽(72小时)计数/从48小时至96小时的扫描平板拍照。
第6天-发芽(96小时)计数
对于延长的10-天分析，记录48小时至96小时的发芽。在第7、8、9和10天，检查出苗的绿度和四叶阶段。
制备培养基：
发芽培养基(GM或0％四组分培养基)1升：
通过单独称重特定的量(克)添加这种四组分剂(四种渗透物)，获得它们相应的浓度。在表6中给出所有浓度的渗透物的四组分培养基制备表。
表6：
四组分培养基制备表
10％ 20％ 30％ 40％ 50％ 60％ 70％ 80％ 90％ 100％
NaCl 0.36 0.731 1.09 1.46 1.82 2.19 2.55 2.9 3.29 3.656
甘露糖醇 2.27 4.55 6.83 9.1 11.38 13.66 15.93 18.2 20.49 22.77
山梨醇 2.27 4.55 6.83 9.1 11.38 13.66 15.93 18.2 20.49 22.77
PEG 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
种子消毒：
将大约100μl拟南芥属(Arabidopsis)Columbia野生型种子(col wt)和待测试的转基因品系种子置于1.75ml微离心管中并在乙醇中灭菌1分钟30秒，随后用无菌水洗涤一次。随后它们经受漂白处理(4％漂白剂，含有Tween 20)2分钟30秒。这随后用无菌水洗涤4至5次。种子在接种前，在4℃下层积48小时。
种子接种：
将层积的种子接种到单个平板上，平板具有如表6给出的各自四组分胁迫浓度。平板在室中培养，室设为在22℃和50％相对湿度下光照16小时。发芽在经48至96小时后出幼根时记录。种子使用放大镜进行手动计数。平板使用Epson扫描仪10,000XL在800dpi下扫描并拍照。在延时分析的情况下，还经10天的时间段记录叶片绿度(手动)和出真叶，即，4叶片阶段(手动记录)，以计算生长速率和出苗的健康。
分析数据，发芽百分比为发芽种子对接种的种子总数的百分比。通过将四组分浓度对发芽百分比作图，以柱状图和S形曲线的形式表示分析数据。
实施例25B
具有AT-DTP4蛋白的转基因拟南芥属(Arabidopsis)种子在渗透胁迫下的出苗
如上所述生成的来自具有At-DTP4蛋白的转基因拟南芥属(Arabidopsis)品系的T1种子包含35S启动子：：At5g62180表达构建体pBC-Yellow-At5g62180，如实施例25A所述测试其在渗透胁迫下的出苗。
拟南芥属(Arabidopsis)Columbia种子用作野生型对照并且在60％存在发芽减少，随后在100％出现下降和零发芽，如表7所示。
表7示出在渗透胁迫下，在48小时的出苗百分比数据。
表7：拟南芥属(Arabidopsis)中的发芽百分比数据
培养基中的四组分％ WT的％发芽 At5g62180的％发芽
0 96 90
10 80 87
20 76 90
30 69 92
40 52 90
50 29 82
60 20 66
70 10 54
80 2 9
90 6 65
100 0 2
在渗透胁迫下的出苗-10天分析：
表7中的结果显示转基因拟南芥属(Arabidopsis)品系(品系ID 64)包含35S启动子：：At5g62180表达构建体，pBC-Yellow-At5g62180，其以前选择用作具有耐旱性和ABA超敏感性的表型，也展示在渗透胁迫下提高的出苗。
重复对品系ID 64的渗透胁迫分析，并且也在延长的10天分析中记录绿度百分比和出叶百分比。在0％(GM或生长培养基)，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％和100％的四组分浓度下记录品系在48小时的发芽，并且在延长的10天分析中记录绿度百分比和出叶百分比。结果在图6A和图6B中示出。
分析绿度百分比和出叶百分比。绿度百分比记录为具有绿叶(子叶或真叶)的幼苗与黄色、褐色或紫色的叶片相比较的百分比。手动记录绿度，并且如果在4个叶片的任一片上存在任何黄色或褐色条痕，认为它不是绿色。绿度记录为仅具有完全绿色叶片的幼苗。
出叶记录为在两片子叶已经完全伸展后，出现完全伸展叶片1和2。因此，出叶百分比是具有2片真叶或总计4个叶片(2个子叶和2个真叶)的幼苗数。
在48小时的发芽百分比实验用批量种子一式三份地重复一次，并且结果在图7中示出。将种子接种到包含MS培养基+甲硫氨酸亚砜的MSO平板上，并且选择植株转植到土壤中，收获种子并进行分析。
实施例26A
ABA/根生长分析
固着植物已经进化出更高的适应性以克服不利的环境挑战。植物激素脱落酸(ABA)是植物响应于此类胁迫的关键内源信使，并且因此理解ABA信号对于改善植物性能，尤其是在干旱胁迫下的植物性能是必需的。干旱是非常复杂的现象，涉及多个关键调节子，并且为了获得广泛的此类作用因素，必须使用多个分析方法。贯彻这一宗旨，已经开发出根生长分析。
在ABA/根分析中，在MS培养基上发芽后，在包含ABA的培养基上的根生长敏感性被用作分析原则。MS培养基包含MS基础盐、MS维生素、蔗糖和作为胶凝剂的植物凝胶。ABA/根分析将使我们能够有可能捕获超敏感性和低敏感性的异常值/超常值，使其成为用于筛选新基因并作为杂交验证分析的强有力工具。
ABA/根分析是一个两阶段分析。阶段I包括在230μMol光照强度下，在基础发芽/MS培养基上垂直种植种子。在发芽5天后，采集幼苗并转移至包含ABA的培养基。在转移时标记根尖位置。允许幼苗在包含ABA的培养基上垂直生长7天，每日旋转平板以使每个平板收到均匀的光照。在第七天，给平板拍照并分析根表型。分析的总体示意图在图8中示出。
实施例26B
具有AT-DTP4多肽的转基因拟南芥属(Arabidopsis)种子的ABA/根生长分析
在这一分析中，将期望ABA超敏感异常植株在转移时幼苗终止生长，而ABA低敏感的异常植株的根将继续生长，这是因为它们不能感应到培养基中的ABA。对于不敏感品系，将期望它与WT类似，其将作为阴性对照。
分析条件：
在实施例5A中描述的WT种子和包含pBC-yellow-At5g62180构建体的转基因种子用于这一分析。种子首先用100％乙醇，随后用漂白剂+Tween 20溶液，然后用无菌水洗涤4次进行表面消毒并层积48小时。将两行约30个层积种子逐个种植在发芽培养基上，并且将平板竖直保持在生长室中5天。生长室设置为在22℃和50％相对湿度下用230μMol的光照16小时。在5天后，逐个采集幼苗并转移至包含不同浓度ABA的培养基，其浓度为0，2.5，5，10，15，17.5，20，25和30μM ABA。幼苗垂直生长7天。在7天后，分析并记录根表型。在15-25μM浓度范围内的代表性结果在图9中示出。
实施例27
ABA敏感性测定：在拟南芥属(Arabidopsis)中具有DTP4多肽的发芽百分比分析
通过如实施例7所述的发芽百分比分析测试与AtDTP4(SEQ ID NO：18)同源的DTP4多肽赋予ABA超敏感性的能力。
分析这些同源物中的每一个的cDNA蛋白编码区并将它们克隆进转化载体。在2个ABA浓度下(1μM和2μM)测试同源物的ABA超敏感性。
选择转基因T2种子并用于如实施例7所述的发芽分析。两种田菁属(Sesbania)同源物sesgr1n.pk107.c11和sesgr1n.pk079.h12以及(分别是SEQ ID NO：44和46)当它们通过35S启动子直接表达时显示ABA超敏感性。
在1μM ABA下，野生型col-0植物在第5天具有＞90％的发芽率。具有AtDTP4构建体的转基因品系在第5天显示＜90％的发芽率，如图12A所示。在第3天，具有表达DTP4同源物sesgr1n.pk079.h12(SEQ ID NO：47)的构建体的品系显示约70％的发芽，并且具有表达DTP4同源物sesgr1n.pk107.c11(SEQ ID NO：45)的构建体的品系显示约80％的发芽。
在2μM ABA下，野生型col-0植物在第5天具有＞90％的发芽率。具有AtDTP4构建体的转基因品系在第5天显示＜70％的发芽率，如图12B所示。在第5天，具有表达DTP4同源物sesgr1n.pk079.h12(SEQ ID NO：47)的构建体的品系显示＜50％的发芽，并且具有表达DTP4同源物sesgr1n.pk107.c11(SEQ ID NO：45)的构建体的品系显示＜70％的发芽。
图12C示出表达分别在表9和表10中给出的一些其它待测试的DTP4同源物的转基因拟南芥属(Arabidopsis)植物的发芽百分比分析。
实施例28
ABA敏感性测定：在拟南芥属(Arabidopsis)中具有AT-DTP4多肽的子叶变绿 (Cotyledon Greening)分析
通过如下所述的百分比绿子叶分析测试在表8和表9给出的DTP4多肽赋予ABA超敏感性的能力。
合成这些同源物中的每一个的cDNA蛋白编码区并将它们克隆进转化载体。在包含2μM ABA的培养基上测试同源物的ABA超敏感性。
分析条件：
将种子进行表面消毒并层积96小时。将约100个种子接种到一个平板中并层积96小时，随后在生长室中培养，该生长室的程序为在22℃和50％相对湿度下光照16小时。记录具有绿子叶的幼苗。
观察和结果：
在第5-7天，记录在1/2MS培养基和2μM ABA中具有绿色并伸展的子叶的幼苗。种子使用放大镜手动计数。分析数据，发芽百分比为具有绿色子叶的幼苗对接种的种子总数的百分比。野生型col-0植物通常具有～60-70％的绿子叶幼苗。具有pBC-yellow-At5g62180(所描述的AtDTP4表达构建体)和一些同源物的品系在这一分析中具有＜45％的记录。
图13和图12C分别示出表达分别在表8和表9中给出的一些其它待测试的DTP4多肽的转基因拟南芥属(Arabidopsis)植物的绿子叶分析和发芽百分比分析结果(实施例27)。
表8：DTP4多肽的ABA敏感性测定
表9
DTP4多肽的ABA敏感性测定
实施例29A
ABA敏感性测定：拟南芥属(Arabidopsis)中的根构造分析
为了测试转基因植物响应ABA的根构造改变，如这一实施例所述完成根构造分析。
种子用50％家用漂白剂.01％triton X-100溶液进行灭菌，然后接种在含有以下培养基的平板上：0.5x无氮Hoagland’s，8mM KNO3，1％蔗糖，1mM MES和1％PHYTAGELTM，补充有0.1μM ABA，密度为4颗种子/板。通常将10个平板置于架子中。将平板在4℃下保持三天以对种子进行层积处理(stratify)，然后在22℃光照和20℃黑暗下垂直保持12天。光周期为16h；8小时黑暗，平均光强度为～180μMol/m2/s。架子(通常每个装有10个平板)在每个搁板中每隔一天旋转。在第12天，评价平板的幼苗状态，拍摄整个平板的数字图像并分析根面积。
用软件(Regent Instruments Inc)分析这些在垂直板上生长的籽苗的根生长情况，该软件是一种专门设计用来进行根的测量的图像分析系统。使用像素对比度来将浅色根与较深色的背景相区分。为在不拾取背景的情况下鉴定到最大数量的根，像素分级保持在150-170，使用过滤特征来除去长宽比小于10.0的目标。各板上被分析的区域是从植物叶的边缘至离板底部约1cm处。使用完全相同的设置和分析区域来分析一个批次内的所有板。将给某板赋予的总根长度分数除以已萌发并已向下生长至板的一半处的植株的数目。每个品系生长八个板，将它们的分数取平均值。然后将这个平均值与已经同时生长的含有野生型种子的八个板的平均值进行比较。
将来自转基因的三十株幼苗与相同数目的对照相比较并得到概率值。认为具有等于和/或大于E-03的概率值(P值)的转基因是在RA分析中验证过的。
实施例29B
转基因AT-DTP4拟南芥属(Arabidopsis)植物的根构造分析
用以下方式测试拟南芥属(Arabidopsis)DTP4多肽基因(At5g62180；SEQ ID NO：16；NCBI GI No.30697645)赋予改变的ABA敏感性的能力。
T3种子来自七个单独的插入事件(命名为E3，E4，E5，E6，E7，E8和E9)，它们来自如实施例6所述生成，包含35S启动子：：At表达构建体pBC-yellow-At5g62180的、具有AT-DTP4蛋白的转基因拟南芥属(Arabidopsis)品系，如实施例27A所述测试种子由于在培养基中存在ABA而发生的根构造改变。
在相同条件下种植非转化的Columbia种子，并且同时使用单独的插入事件作为对照。单个品系事件和对照种子按照如实施例29A所述的方法进行根构造分析以测试ABA敏感性。
扫描具有32株幼苗的八个平板，并且获取每个事件的32个根的像素值，将它们每个与对照获得的像素值进行比较。
进行t检验分析以显示在0.1μM ABA下，AT-DTP4转基因植物具有比wt植物更好的根生长，这指示改变的ABA敏感性。
在不同的2天中的2个不同实验中完成的不同事件的P值在表10给出。具有等于和/或大于E-03的概率值(P值)的事件用粗体示出。
表10：
具有AT-DTP4的转基因植物的RA分析的P值
实施例30
通过质谱检测转基因玉米叶片中的DTP4蛋白
将来自如实施例19所述在田间产量试验中使用的两个构建体的转基因玉米事件在生长室中再生长至阶段V5以提供叶片样品，用于通过质谱检测其中的DTP4蛋白。切碎叶片并在液氮中碾碎，并且随后冻干冷冻的粉末。提取来自每个样品的10mg冻干叶片粉末的蛋白并通过质谱进行分析。在pCV-DTP4ac构建体的所有8个事件中检测AT-DTP4蛋白。
构建体pCV-DTP4ac的田间生长的转基因事件也用于通过相同质谱方法进行的DTP4蛋白检测(图17)。在所有转基因事件的V9叶片中检测DTP4蛋白，但是不在无效转基因植物的叶片中检测。在事件DTP4-L17中检测在田间生长植物中的最大量的DTP4蛋白，这在生长室生长的植物的数据中观察到。
实施例31
过表达AT-DTP4ac的转基因玉米植物的分蘖数分析在田间条件下的分蘖生产
将AT-DTP4(pCV-DTP4ac)引入来源于优良玉米近交系的可转化玉米品系。
在2014年，在2个位置A(开花胁迫，)和B(供水良好)处进行六个转基因事件的田间测试。该试验是田间生理学的框架。在位置A，在开花期间施加轻度干旱条件。“B”位置为供水良好。在所有位置收集分蘖数数据，每个位置进行4个平行测定。在曲线中间的20株植物每株计数其分蘖数。
6个转基因事件的分蘖数(每株植物分蘖数)在图18中示出。每株转基因植物的分蘖数比构建体无效(CN)植物的分蘖数大得多。
实施例32
ABA敏感性测定：玉米中用AT-DTP4ac多肽进行的根和苗生长分析
如实施例5、7和25所述，在拟南芥属(Arabidopsis)中过表达DTP4导致对ABA提高的敏感性。为了测定是否过表达AT-DTP4(SEQ ID NO：18)的转基因玉米植物也是ABA超敏感的，用转基因事件和相应的构建体pCV-DTP4ac无效事件进行玉米ABA分析。将玉米种子在水中的纸巾卷中发芽4天，随后再用无ABA或10μM ABA处理7天。在ABA处理之前和之后测量根和苗生长，并且记录差异。包括来自已知具有ABA超敏感性的另一个构建体的阳性对照事件。用每个发芽卷的5个种子完成六个平行测定。
材料和方法
在第11天完成本方法的实验，该实验起始于水中的种子发芽(0DAP)。在发芽四天后，初始的五个种子记录初始的根和苗测量结果，随后转移至单个发芽卷，它们已经用10μM或0μM ABA处理过(0DAT)。随后在生长室中再培养7天，记录每卷的最终根和苗测量结果(7DAT)。
对发芽卷中的五个植物的性状进行平均。根生长和苗生长性状计算为最终和初始测量的差异。也分析初始测量以确定是否差异在处理之前就存在。在处理和对照之间进行比较，在事件和构建体水平上使用空间上的调整。实验设计是具有平行测定的多时间裂区，有时经几天来完成。
结果：
来自2个不同实验的构建体水平结果在不同的两天内完成，结果在图19中示出。
在10μM ABA处理中的阳性对照显示显著降低的苗和根生长，这符合对ABA超敏感对照的预期。相比之下，四个AT-DTP4ac转基因事件具有显著提高的根生长，并且无事件具有显著降低的苗生长，说明对ABA的敏感性降低。因此，在拟南芥属(Arabidopsis)和玉米中过表达AT-DTP4改变ABA敏感性。
实施例33
过表达AT-DTP4ac的转基因玉米植物的三重胁迫分析
在干旱、光照和热胁迫组合后使用三重胁迫分析测试AT-DTP4ac和其它AT-DTP4同源物赋予胁迫抗性的能力。
材料和方法
将玉米植物在生长室中生长至V4阶段，生长室条件为27℃日间/15℃夜间温度，15小时光周期，60％相对湿度和800μmol m-1sec-1的光照强度(表11)。在这个时期灌溉植物以保持供水良好的条件。在这个21天的周期后，记录“三重胁迫”前的初始植物测量结果(处理后0天，或DAT)，包括定容土壤水含量、高光谱成像和叶绿素荧光。通过提高温度至38℃日间/27℃夜间、提高光照强度至1300μmol m-1sec-1、并减少水开始三重胁迫。再次收集处理后第3和6天的测量结果。在6DAT测量中，破坏性地收获植物生物质以获得鲜重和干重。在事件和构建体水平上测定12个平行测定的性状的显著差异。
表11：
三重胁迫分析的实验过程
日期 事件
种植前1周或更短的时间 装满罐
0DAP 种植，开始“正常”条件
7DAP 减少至1株植物/罐
0DAT或20DAP 初始测量，当植物在“正常”条件下时发生
21DAP 生长室程序切换至“三重胁迫”程序
3DAT或24DAP 第二组测量。
6DAT或27DAP 包括破坏性收获的最终组测量。
结果：在三重胁迫期间，具有pCV-DTP4ac的植物具有比无效转基因更大的叶片面积，这通过用高光谱相机获得的像素面积来测量(图20)。在生物量测量、土壤水含量或叶绿素荧光参数中未观察到显著差异。
图20示出在三重胁迫期间，具有pCV-DTP4ac(UBI：AT-DTP4)的植物的叶片面积的构建体水平的响应。显著性差异为P＜0.1，黑色柱指示显著的阳性构建体水平响应，黑灰色柱指示无显著性差异的比较。数字指示相对于构建体无效的百分比差值。
实施例34
过表达AT-DTP4ac的转基因玉米植物的渗透胁迫分析
使用渗透胁迫分析测试在过表达DTP4多肽的转基因玉米植物中的DTP4多肽赋予渗透胁迫抗性的能力。
这些实验是如实施例25所述的渗透胁迫分析的变型。
材料和方法
所有实验在一个Percival生长室中进行，该生长室保持在完全黑暗条件下，温度为25℃并且相对湿度为95％。对于每个实验，具有所有可用事件(转基因和无效事件)的一个构建体在Nunc Bioassay Plates(245×245×25mm，大约225ml的体积)中测试。
完成两种处理：对照和四组分渗透胁迫(70％浓度；ψw＝-1.0MPa)
每种处理的每个事件(转基因，无效事件)包含六个平行测定。
培养基制备：
○四组分胁迫(70％)培养基：
·MS盐--1.1g/L
·MES水合物--0.3905g/L
·PEG 8000--70g/L
·甘露糖醇--15.94g/L
·山梨醇--15.94g/L
·NaCl--2.557g/L
·用1M KOH调节培养基至5.70
·植物凝胶-8g/L
○对照培养基：
·MS盐-1.1g/L
·MES水合物-0.3905g/L
·用1M KOH调节培养基至5.70
·植物凝胶-8g/L
结果：在平板接种后24，32，48，56，72，和96小时时收集种子发芽数据。在每个实验末期经由蒸汽压渗压计测量对照和四组分胁迫(70％浓度)培养基的水势(waterpotentials)。
发现在48-96小时，响应于四组分胁迫的种子发芽相对于对照出现显著抑制。对PHP51731的所有可利用事件(总共八个)测试两次，它们具有可再现的结果。AT-DTP4ac转基因事件一致地展示相对于无效转基因对四组分胁迫显著降低的敏感性。
在两个实验期间，八个转基因事件中的七个相对于无效转基因表现出对四组分胁迫显著降低的发芽敏感性。
结果在表12和图21中示出。
表12：
具有AT-DTP4过表达玉米植物的渗透胁迫分析
实施例35
用过表达AT-DTP4ac的转基因玉米植物进行透明高管根生长分析以评估根和苗的 发育
开发这一分析并用于评估过表达DTP4多肽的转基因玉米植物响应于供水良好和土壤干燥条件的根生长发育可塑性。
材料和方法：
在温室中进行该实验。将玉米种子在预先浸泡在水中48小时的发芽纸上吸涨。将均匀的玉米幼苗(具有10-22mm的根长)转植到透明丙烯酸管中(长1.5米，大约38L体积)，其包含3∶1的Dynamix：沙土培养基。土壤培养基补充有Scott’s Osmocote Plus(15-9-12)以提供在每个实验整个期间的缓慢营养物质释放。对于每个实验，测试具有两个选择事件(转基因和无效事件)的一个构建体。完成两种处理：供水良好和干旱。在V3-V4生长阶段之间诱导干旱循环三周。每种处理的每个事件(转基因，无效事件)包含6个平行测定。
完成深度和时间测量以监测侧向的生长发育，按照设计说明书，由定制供应商永久性安装总计40个根窗口。为了描绘差异化的深度，每个根窗口已经被系统分配了一个数字命名。在减少水供应后，通过用带有附接偏振滤光器的数字相机在不同深度拍摄每个根窗口的一系列图像来每周监测侧向根的生长。为了确保获得标准化的图像，相机安装在定制设计并制造的丙烯酸夹具上。所有图像被送去进行自动化的定量分析。
土壤水含量测量：在干旱期间的所有植物中，最靠上的100cm土壤的视介电常数使用土壤水分探针进行双周定量，从而更好地解释以及比较基因型内和基因型间的根发育时间和模式。植物生长定量：在干旱周期内每两周收集植株高度和叶片数数据。完成苗鲜重、苗干重、总叶片面积、初生根长度的收获测量；收集所有植物的数据。
表13：
过表达AT-DTP4的玉米植物的透明高管根分析
实施例36
大肠杆菌中AT-DTP4融合蛋白的表达、蛋白纯化和酯酶活性分析
使用pET28a表达载体表达AT-DTP4融合蛋白，其包含20个附加的N-末端氨基酸，包括6个组氨酸标记。融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：629所示。大肠杆菌培养物在37℃下，在2X YT培养基中生长至OD600nm为0.6。随后用0.5mM IPTG诱导转基因表达，并且使培养物在20℃下再生长20小时。融合蛋白从大肠杆菌提取物中利用钴亲和色谱纯化，并且获得高纯度蛋白。将纯化蛋白的等分试样冻存在-80℃的10％甘油中。随后解冻等分试样并对pH8的50mM Tris-HCI透析，随后进行酯酶活性分析，该分析利用对-硝基苯基乙酸酯作为底物。
对这种底物的酯酶活性通过观察在405nm波长的吸光度增加来监测，因为对-硝基苯酚产物在405nm处吸光。活性分析使用在pH8的50mMTris-HCI中的1μg蛋白完成，分析体积为200μl，使用96孔平底微滴定板。完成无酶的对照反应，并且速率被从加酶的反应速率减去以修正底物的自动水解。纯化的AT-DTP4蛋白具有明显的酯酶活性，其利用对-硝基苯基乙酸酯作为底物(图23)。透析蛋白通过在280nm的吸光度进行定量，利用1OD(280nm)＝0.92mg/ml的值。
实施例37
在田间小区的过表达AT-DTP4多肽的转基因玉米植物中观察到的性状
观察到田间小区供水条件良好，生长有用pCV-DTP4ac转化过的转基因玉米植物。使用随机完全区集设计，其具有2行小区和4个田间平行测定。标记在每行中的五个连续均匀分布的植物进行观察，每个小区总计观察10株植物。在一些小区中，少于10株植物被用于观察。对于一个性状，在V12的分蘖数，使用除在每行的每侧上的末端植物之外的所有小区的植物。对于另一个性状，茎直径，仅测量3个事件。在表14中给出对测量的性状的描述和结果的总结，并在表15中给出详细结果。在构建体水平上，若干性状观察到与无效转基因的小的但是统计学显著的差异，包括在V12的植株高度、在V9的叶片数和从V9至V12的生长速率的降低。在V12观察到提高的分蘖数。花粉脱落大约晚半天，并且因为在这些供水良好的条件下吐丝在花粉脱落之前，ASI由于脱落延迟为阴性的且更大。
表14：
田间小区中的性状描述和结果总结
表15
在田间小区观察到的性状。
实施例38
在田间罐中观察到的性状
除在实施例37中描述的田间小区之外，还在供水良好位置进行田间罐研究。在罐中生长玉米植物允许通过减少灌溉在供水良好的位置施加干旱胁迫，因为罐中的植物从灌溉中收到比降雨更多的水，这是由于罐的颈部尺寸小，并且事实上水从罐中迅速排走。罐为10升体积，7.75″×18″的方形树罐。使用裂区设计，对整个小区、事件裂区和转基因事件与无效事件裂区进行处理。如此在整个实验中，每个事件相邻于其对应的无效事件。每个平行试验有六个罐，其包括三个转基因事件和三个对应的无效事件。完成在供水良好处理中的30个平行试验和在干旱胁迫处理中的30个平行试验。在每个处理中，在R1收获30个平行试验中的15个，并且在R6收获另外15个平行试验。在表16中给出对测量的性状的描述和对罐研究的结果总结，并在表17中给出结果。在供水良好处理中的构建体水平上观察到以下性状与无效转基因有显著差异：在V4和V6提高的分蘖数、在V10、V13、V16和R1降低的植株高度、在V10减少的叶片数、从V6至V10降低的生长速率、减少的黄酮醇、降低的水利用效率、在R1降低的主苗干重、在R1提高的分蘖干重、延迟的脱落和吐丝时间、以及在R6提高的营养部分干重。在干旱胁迫处理中的构建体水平上观察到以下性状与无效转基因有显著差异：在V4和V6提高的分蘖、在V6、V10和V13降低的植株高度、在V10、V13和成熟期降低的叶片数、减少的黄酮醇、在R1降低的主苗干重、在R1提高的分蘖和穗干重、较早的吐丝时间、降低的ASI、在3个日期减少的黄叶(提高的保绿)、在R6降低的营养部分干重、以及提高的籽粒干重(产量)、穗、籽粒数和在R6的收获指数。在表16中给出综述，并且在表17中给出不同事件的数目。
决定植物健康、产量和生物量的多个这些性状的显著性是本领域熟知的。例如利用Dualex仪器的叶绿素和黄酮醇测量、其它性状如收获指数、水利用效率、植株高度、干重、籽粒重量等的测量是本领域熟知的(Cerovic等人，Physiologia Plantarum 146：251-260.2012；Sinclair，T.R.；Crop Sci.38：638-643(1998)，Edmeades等人，(1999)CropSci.39：1306-1315，Andrade等人，Crop Sci.42：1173-1179(2002)，Berke等人，(1995)CropSci.39：1542-1549，Garwood等人，Crop Science，Vol.10，1970年1月-2月)。
表16：
田间罐研究的性状描述
ND：“未测定”
表17：
在田间罐中观察到的性状
(WW＝供水良好的；DRT＝干旱胁迫的；**p值＜0.05；*p值＜0.1))
实施例39
对DTP4特异性的概形HMM
概形HMM是多重序列比对、或者甚至单序列比对的统计模型。他们收集关于每列比对的保守程度、以及哪个残基可能是保守的位点特异性信息。
描述：
使用(利用概形隐马尔可夫模型(Profile Hidden Markov Models)的生物序列分析)搜索序列数据库以获得蛋白序列的同源物，并且进行蛋白序列比对。可用于用单个查询序列搜索序列数据库，但是当查询是序列家族的多重序列比对时，它变得尤其起作用。制备一个查询概形(profile)，其为取代、插入和缺失分配位点特异性的评分体系。概形是概率性模型，称为“概形隐马尔可夫模型(Profile Hidden Markov Models)”(概形HMM)(Krogh等人，1994，J.Mol.Biol.，235：1501-1531；Eddy，1998，Curr.Opin.Struct.Biol.，6：361-365.；Durbin等人，ProbabilisticModels of Proteins and Nucleic Acids.Cambridge University Press，CambridgeUK.1998，Eddy，Sean R.，2010年3月，HMMER User′s Guide Version 3.0，Howard HughesMedical Institute，Janelia Farm Research Campus，Ashburn VA，USA；美国专利公布US20100293118)。与基于较老的评分方法的BLAST、FASTA和其它序列比对及数据库搜索工具相比，是显著更精确的，并且更有能力检测远同源物，这是因为它基于的概率模型的能力。
形成对DTP4基因家族特异性的概形HMM的方法
步骤1：鉴定AT-DTP4同源物：
通过用BLAST和Jackhammer在一个蛋白序列室内数据库中查询的蛋白序列鉴定AT-CXE20的同源物，该数据库通过编译来自各种植物基因组的UniProt和翻译ORF的蛋白序列生成，植物基因组从NCBI和国际测序cDNA测序数据中检索得到。因此鉴定的同源物使用软件MUSCLE比对(Edgar，Robert C.(2004)，Nucleic Acids Research 19；32(5)1792-7)，其利用MEGA6程序(系统发育和分子进化分析使用MEGA，第6版进行(Tamura K.等人，(2013)Mol.Biol.Elio/.30(12)：2725-2729)。系统发育分析用MEGA6程序和最大似然法(Jones D.T.等人，(1992).Comp Appi Biosci 8：275-282；Tamura K.等人，(2013)viol.Biol.Evoi.30(12)：2725-2729)完成。
所得树的分枝根据Marshall等人，J Mol Evol(2003)57：487-500进行注释。利用Marshall命名法，分离并再比对来自CXE树的基因子集、II型、IV型、V型和VI型。利用这些蛋白建立新的最大似然树。
步骤2：鉴定并再比对II型羧酸酯酶
再比对II型前导枝特异性的蛋白并用与步骤1相同的方法建立新树。随后根据分枝图采集来自新II型特异性树的蛋白，从而每个小分枝得到一个蛋白。再比对这些蛋白，SEQ ID NO：18，29，33，45，47，53，55，61，64，65，77，78，101，103，105，107，111，115，131，132，135，137，139，141 144，433，559和604，并用于在步骤3中建立HMM。
步骤3：形成DTP6的概形HMM
基于AT-CXE20同源物的多重序列比对(MSA)，使用3.0的HMM建立模块形成DTP4的概形HMM。
步骤4：利用概形搜索蛋白数据库
在如步骤1所述的蛋白序列数据库中查询形成的概形HMM。如步骤5所述进一步检查检索到的Hits。
步骤5：测定概形特异性以鉴定DTP4相关的蛋白序列。
匹配CXE20的概形HMM的所有蛋白序列在至少80％的HMM概形长度上具有小于0.001的E-值，认为它们具有统计意义上的显著性并对应于基因家族。因为获得的所有统计学上显著的蛋白是CXE20基因家族的成员，说明本文所述的CXE20的概形HMM是对II型羧酸酯酶优先级排序特异性的，并且鉴定羧酸酯酶家族的其它成员。CXE20家族的HMM概形在附表18中示出。
实施例40
内源DTP4基因的靶向调节或诱变
技术人员还将理解，可通过核酸序列的突变引入变化，从而引起编码的mRNA或编码的多肽如DTP4的氨基酸序列的表达变化，分别导致mRNA或蛋白或两者的生物学活性改变。参见例如提交于2014年8月20日的美国专利申请14/463687所述的方法，该专利申请以引用的方式全文并入本文。因此，变体核酸分子可通过将一个或多个核苷酸取代、添加和/或缺失引入本文公开的对应核酸序列或周围序列而形成。此类变体核酸序列也被本发明涵盖。
变体核酸序列可通过引入序列改变来制备，该序列改变沿着全部或部分基因区域随机发生，包括但不限于化学或辐射诱变和寡核苷酸介导的诱变(OMM)(Beetham等人，1999；Okuzaki和Toriyama，2004)。另选地或除此之外，可在特定选择位点引入序列改变，利用双链断裂技术如ZNFs、定制设计的归巢内切核酸酶、TALENs、CRISPR/CAS(也称作导向RNA/Cas内切核酸酶体系(提交于2014年8月20日的美国专利申请14/463687)、或其它基于蛋白和/或核酸的诱变技术。可筛选所得变体以获得改变的活性。应当理解，技术常常不是互相排斥的。事实上，所述各种方法可单独或组合使用、并行或连续使用，以形成或获得多样的序列变体。

Claims (28)

1.一种提高作物植物中至少一个选自下列的表型的方法：三重胁迫耐受性、干旱胁迫耐受性、氮胁迫耐受性、渗透胁迫耐受性、ABA响应、分蘖数、产量和生物量，所述方法包括提高所述作物植物中羧酸酯酶的表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述作物植物是玉米，并且所述羧酸酯酶是植物羧酸酯酶。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述羧酸酯酶在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性。
4.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造和提高的分蘖数。
5.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出产量、生物量或两者的提高。
6.根据权利要求5所述的植物，其中所述植物在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的所述对照植物进行比较时表现出产量、生物量或两者的所述提高。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的植物，其中所述植物选自：拟南芥属(Arabidopsis)、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
8.权利要求4至7中任一项所述的植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性，并且其中由所述种子产生的植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型的提高：干旱胁迫耐受性、三重胁迫耐受性、渗透胁迫耐受性、氮胁迫耐受性、分蘖数、产量和生物量。
9.一种提高植物中的胁迫耐受性的方法，其中所述胁迫选自：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫，所述方法包括：
(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性；
(b)由(a)的所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及
(c)获取来源于(b)的所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出对至少一个选自下列的胁迫的提高的耐受性：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。
10.一种选择具有提高的胁迫耐受性的植物的方法，其中所述胁迫选自：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫，所述方法包括：
(a)获取转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性；
(b)使部分(a)的所述转基因植物在其中所述多核苷酸得以表达的条件下生长；以及
(c)选择部分(b)的所述转基因植物，其在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有提高的胁迫耐受性，其中所述胁迫选自：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫。
11.一种选择产量、生物量或两者发生改变的植物的方法，所述方法包括：
(a)获取转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性；
(b)使部分(a)的所述转基因植物在其中所述多核苷酸得以表达的条件下生长；以及
(c)选择部分(b)的所述转基因植物，其在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出产量、生物量或两者的改变。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述选择步骤(c)包括确定(b)的所述转基因植物在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出产量、生物量或两者的改变。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述改变是提高。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其中所述植物选自：拟南芥属、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
15.一种分离的多核苷酸，其包含：
(a)编码具有胁迫耐受性活性的多肽的核苷酸序列，其中所述胁迫选自：干旱胁迫、三重胁迫、氮胁迫和渗透胁迫，并且其中所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少95％的序列同一性；或
(b)(a)的所述核苷酸序列的全长互补序列。
16.根据权利要求15所述的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628。
17.根据权利要求15所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：16，17，19，38，42，44，46，48，50，54，58，60，62，63，94，96，100，102，106，110，112，116，118，120或122。
18.一种包含重组DNA构建体的植物或种子，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控序列的权利要求15至17中任一项所述的多核苷酸。
19.一种在其基因组中包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的内源多核苷酸的植物，其中所述内源多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述异源调控元件的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数。
20.一种制备在与对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型的植物的方法：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量，所述方法包括以下步骤：将重组DNA构建体引入到植物中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性。
21.一种制备表现出至少一个选自下列的表型的植物的方法：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量，其中所述方法包括由包含重组DNA构建体的种子生长植物，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ IDNO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性，其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量。
22.一种制备种子的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使第一植物与第二植物杂交，其中所述第一植物和所述第二植物中的至少一个包含重组DNA构建体，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性；以及
(b)选择所述杂交步骤(a)的种子，其中所述种子包含所述重组DNA构建体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中由部分(b)的所述种子生长的植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量。
24.一种从种子生产油或种子副产物、或两者的方法，所述方法包括从种子提取油或种子副产物、或两者，所述种子包含重组DNA构建体，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18，39，43，45，47，49，51，55，59，61，64，65，66，95，97，101，103，107，111，113，117，119，121，123，127，129，130，131，132，135，627或628进行比较时具有至少80％的序列同一性。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述种子获取自植物，所述植物包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述油或所述种子副产物、或两者，包含所述重组DNA构建体。
27.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18进行比较时具有至少95％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量。
28.一种制备在与对照植物进行比较时表现出至少一个选自下列的表型的植物的方法：提高的三重胁迫耐受性、提高的干旱胁迫耐受性、提高的氮胁迫耐受性、提高的渗透胁迫耐受性、改变的ABA响应、改变的根构造、提高的分蘖数、提高的产量和提高的生物量，所述方法包括以下步骤：将重组DNA构建体引入到植物中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：18进行比较时具有至少95％的序列同一性。
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