CN107974459A - 提高植物非生物胁迫耐性的构建体和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了分离的多核苷酸和多肽，重组DNA构建体、抑制DNA构建体和CRISPR/Cas9构建体，和使用抑制DNA构建体或CRISPR/Cas9构建体转化可再生植物细胞获得的组合物如植物或种子，所述植物或者种子中分离的多核苷酸的表达或活性发生变化。通过减少分离的多核苷酸的表达或活性获得耐旱性增加的植物。

Description

提高植物非生物胁迫耐性的构建体和方法
技术领域
本发明涉及植物育种和遗传学领域，特别是，涉及用于提高植物耐诸如干旱等非生物胁迫的构建体和方法。
背景技术
生物和非生物原因可以对植物产生胁迫，例如造成生物胁迫的原因包括病原菌感染、昆虫取食、一种植物对另一种植物的寄生，例如槲寄生；非生物胁迫包括诸如有效水分的过量或者不足、极限温度和诸如除草剂的合成化学药品。
非生物胁迫是造成世界范围内农作物减产的主要原因，造成主要农作物平均减产50％以上(Boyer,J.S.(1982)Science 218：443-448；Bray,E.A.等(2000)In Biochemistryand Molecular Biology of Plants,edited by Buchannan,B.B.等,Amer.Soc.PlantBiol.,pp.1158-1249)。植物固着于地面，必须调整以适应周围的环境条件，这就导致了植物发育中基因调控、形态形成和新陈代谢的巨大可塑性。植物的适应和防御策略包括激活编码重要蛋白的基因，这些蛋白可以使植物适应或防御不同胁迫条件。
干旱(有效水分不足)是一种主要的非生物胁迫，限制了世界范围内农作物的生产。在植物生长发育阶段，将植物暴露于水分限制环境下，将会激活植物各种不同生理和发育变化。近年来，尽管对非生物胁迫响应的分子机制和植物耐旱性的遗传调控网络进行了广泛的研究(Valliyodan，B.和Nguyen，H.T.(2006)Curr.Opin.Plant Biol.9：189-195；Wang，W.等(2003)Planta 218：1-14；Vinocur，B.和Altman，A.(2005)Curr.Opin.Biotechnol.16：123-132；Chaves，M.M.和Oliveira，M.M.(2004)J.Exp.Bot.55：2365-2384；Shinozaki，K.等(2003)Curr.Opin.Plant Biol.6:410-417；Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(2005)Trends Plant Sci.10:88-94)，但是植物如何感受、传导干旱胁迫信号和其耐旱性的生物化学和分子机制仍然是生物学研究中面临的一个主要挑战。分子标记辅助育种能够提高农作物的耐旱性。转基因途径提高农作物的耐旱性已经取得了很大进展(Vinocur B.and Altman A.(2005)Curr.Opin.Biotechnol.16:123-132；Lawlor DW.(2013)J.Exp.Bot.64：83-108).
激活标签可以用于鉴定影响植物性状的基因，这一方法已经用于模式植物拟南芥的研究中(Weigel，D.等(2000)Plant Physiol.122：1003-1013)。转录增强子序列的插入主要激活和/或提高邻近内源基因的表达，因此该方法可以用于分离具有重要农艺性状表型的基因，包括提高非生物胁迫如耐旱性和耐冷性的基因。
发明概述
本发明包括以下具体实施例：
在一个实施例中，本发明包括一个分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11、14或17的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的序列一致性至少为90％；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列，其中减少所述多核苷酸的表达增加植物的耐旱性。所述分离的多核苷酸包括SEQ ID NO：2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17或18所示的核苷酸序列；所述分离的多核苷酸编码的多肽包括SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19所示的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本发明包括一个重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包括一个分离的多核苷酸和与其可操作的连接至少一个异源调控元件，其中所述多核苷酸包括(a)一个多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17或18的序列一致性至少为85％；(b)一个多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的序列一致性至少为90％；或者(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。
在另一个实施例中，本发明包括一个抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包括至少一个异源调控元件和与其可操作连接的抑制元件，所述抑制元件包括(a)一个多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的一致性至少为85％；(b)一个多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的一致性至少为90％；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列，所述抑制元件抑制包括SEQ ID NO：3(PRP1)、SEQ IDNO：6(PP2C64)、SEQ ID NO：9(OPPL1)、SEQ ID NO:12(MFS9)、SEQ ID NO：15(LAO1)或SEQ IDNO：18(DN-DSP1)所示的多核苷酸区域的内源靶序列的表达。所述抑制元件包括(a)核苷酸序列为SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的多核苷酸序列；(b)编码的多肽的氨基酸序列为SEQID NO：4、7、10、13、16或19的多核苷酸序列；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。进一步的，抑制元件可包括SEQ ID NO：45、46、47、48、49或50的多核苷酸。
在另一个实施例中，本发明包括一个CRIPSR/Cas9构建体，所述CRIPSR/Cas9构建体包括一个编码Cas9酶的多核苷酸、一个编码核定位信号的多核苷酸、至少一个异源的调控元件和与其可操作连接的gRNA，其中，所述gRNA靶向包含内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因和其调控元件的靶基因组中区域，以降低内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或者活性。进一步的，所述gRNA靶向核苷酸序列为SEQ IDNO：3、6、9、12、15、18或86的多核苷酸的基因组区域。
在另一个实施例中，本发明包括一种植物，与对照植物中野生PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活力相比，所述植物中内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活力降低；其中，与对照植物相比，所述植物表现出至少一种表型，所述表型选自：增强的耐旱性、增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐性和增加的生物量；所述植物通过下述步骤获得：(a)向植物转入一个抑制DNA构建体以减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多核苷酸的表达，所述抑制DNA构建体包括至少一个异源调控元件和与其可操作连接的抑制元件，所述内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多核苷酸选自SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19序列，或与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19一致性至少为95％的序列；或(b)向包括内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因和其启动子的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸的改变，以减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达和活力。
进一步的，所述植物包含一个抑制DNA构建体，其中所述抑制DNA构建体包括至少一个调控元件和与其可操作连接的抑制元件，所述抑制元件包括源于下述序列的100bp连续碱基对：(a)一个多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为85％；(b)一个多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的序列一致性至少为90％；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。所述抑制元件进一步包括(a)核苷酸序列为SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的多核苷酸；(b)编码多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:4、7、10、13、16或19的多核苷酸；或(c)核酸序列(a)或(b)的全长互补序列。所述抑制元件进一步包括核苷酸序列SEQ ID NO：45、46、47、48、49或50。
所述植物包含突变的PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因，其中，与对照植物相比，所述植物中PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的表达量降低，或PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的活力降低或者消失；所述植物通过向包含SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18序列，或与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18序列一致性至少为90％的序列的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸的改变，以降低内源OsPRP1、OsPP2C64、OsOPPL1、OsMFS9、OsLAO1或OsDN-DSP1多肽的表达或活性。所述突变的OsPRP1、OsPP2C64、OsOPPL1、OsMFS9、OsLAO1或OsDN-DSP1基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为95％。
所述植物包含突变的PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1启动子，其中，与对照植物相比，所述植物中PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的表达减少，所述植物通过向内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因上游基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸的改变，以减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达。进一步的，所述植物通过向包含序列SEQ ID NO：86、87、88、89、90或91的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸的改变，以减少内源OsPRP1、OsPP2C64、OsOPPL1、OsMFS9、OsLAO1或OsDN-DSP1多肽的表达。所述植物通过序列为SEQ ID NO:77的gRNA靶向序列为SEQ ID NO:86的基因区域产生一个核苷酸的插入，以降低内源多肽OsMFS9的表达。
所述植物显示出增加的非生物胁迫耐性，所述非生物胁迫是干旱胁迫。
在另一个实施例中，本发明包括公开的任一植物，其中所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
在另一实施例中，公开了方法，所述方法中，当与对照植物中野生型PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活力相比，降低植物中内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性；与所述对照植物相比，所述植物显示出至少一种表型，所述表型选自增加的耐旱性、增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐性和增加的生物量；所述方法包括的遗传修饰步骤为：(a)向植物中转入一个抑制DNA构建体以减少PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达，所述抑制DNA构建体包括至少一个异源调控元件和与其可操作连接的抑制元件；(b)向包含内源基因PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因和其调控元件的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或或替换一个DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸的改变，其中所述变化能够有效降低内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性。
进一步的，所述方法包括向植物中转入一个抑制DNA构建体以减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达，所述抑制DNA构建体包括至少一个异源调控元件和与其可操作连接的抑制元件，其中，所述抑制元件包含源自下述序列的至少100bp连续的碱基对：(a)一个多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18序列一致性至少为85％；(b)一个多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的序列一致性至少为90％；(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。所述抑制元件包括下述序列的至少100bp连续的碱基对：(a)核苷酸序列为SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的多核苷酸，(b)编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的多核苷酸；(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。所述抑制元件包括SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：50的序列。
所述方法包括向包含内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因或其调控元件的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸的改变，所述变化能够有效降低内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性。
所述变化通过锌指核酸酶、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)、成簇的规则间隔的短回文重复序列技术(CRISPR/Cas)、归位核酸酶切酶或NgAgo介导实现。进一步的，所述变化由CRISPR/Cas系统导入。
在另一个实施例中，公开了提高植物耐旱性的方法，其包括(a)使用载体转化可再生植物细胞降低内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性；(b)由步骤(a)的可再生细胞再生修饰的植物；和(c)获得源于步骤(b)修饰植物的子代植物，其中，与对照植物相比，所述子代植物显示出提高的耐旱性。
所述构建体包括至少一个调控元件和与其可操作连接的抑制元件，所述抑制元件包括源自(a)一个多核苷酸，核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为85％；(b)一个多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的序列一致性至少为90％；(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列的至少100bp连续的碱基对。所述抑制元件进一步包括源自(a)核苷酸序列为SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的多核苷酸；(b)编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的多核苷酸；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列的至少100bp连续碱基对。所述抑制元件进一步包括核苷酸序列为SEQ ID NO：45、46、47、48、49或50的多核苷酸。
所述载体包括一个编码Cas9酶的多核苷酸、一个编码核定位信号的多核苷酸、至少一个异源调控元件和与其可操作连接的gRNA，所述gRNA靶向包含内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因或其调控元件的靶基因组区域，以减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性。所述gRNA靶向序列SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、86、87、88、89、90或91以减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性。进一步的，所述gRNA包括核苷酸序列SEQ ID NO：77和79，靶向位点位于水稻基因组染色体3的842668-842698之间，其中启动子编辑产生的结果为在水稻基因组染色体3的842668-842698之间产生1个碱基的插入，并减少OsMFS9基因的表达。
在另一个实施例中，公开了提高水稻植株籽粒产量的方法，所述方法中，与对照植物相比，所述植物在胁迫条件下显示出提高的籽粒产量，所述方法包括的步骤为减少水稻植株中内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因或异源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的表达。
在另一个实施例中，公开了鉴定水稻植株群体中一个或多个等位基因的方法，所述等位基因与籽粒产量的增加相关，所述方法包括的步骤为(a)检测水稻植株群体中一个或多个多态性，所述多态性位于(i)多肽编码的基因组区域或(ii)调控所述多肽表达的调控区域，所述多肽包含的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19,或与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19序列一致性为90％以上的氨基酸序列；所述多肽编码基因组区域或所述调控多肽表达的调控区域的一个或多个多态性与籽粒产量相关；和(b)鉴定一个或多个等位基因，所述等位基因位于增加产量相关的一个或多个多态性中，所述增加产量相关的一个或多个等位基因可用于分子标记辅助选择增加籽粒产量的水稻植株。所述一个或多个多态性位于多核苷酸的编码区，所述调控区域是启动子。
附图说明和序列表
根据以下发明详述和附图及序列表，可以更全面的理解本发明，以下发明详述和附图及序列表形成本发明的一部分。
图1为OsPRP1过量表达转基因水稻第一次田间干旱试验中海南田间在水稻不同发育时期的土壤含水量。OsPRP1过量表达转基因水稻在断水后36天开始抽穗，断水后79天成熟。
图2为OsPRP1过量表达转基因水稻第二次田间干旱试验中宁夏田间在水稻不同发育时期的土壤含水量。OsPRP1过量表达转基因水稻在断水后57天开始抽穗，断水后88天成熟。
图3为OsPP2C64过量表达转基因水稻田间干旱试验中海南田间在水稻不同发育时期的土壤含水量。OsPP2C64过量表达转基因水稻在断水后39天开始抽穗，断水后88天成熟。
图4为OsPP2C64过量表达转基因水稻第二次田间干旱试验中海南田间在水稻不同发育时期的土壤含水量。OsPP2C64过量表达转基因水稻在断水后57天开始抽穗，断水后88天成熟。
图5为OsOPPL1过量表达转基因水稻第一次田间干旱试验中海南田间在水稻不同发育时期的土壤含水量。OsOPPL1过量表达转基因水稻在断水后40天开始抽穗，断水后83天成熟。
图6为OsOPPL1过量表达转基因水稻田间干旱试验中宁夏田间在水稻不同发育时期的土壤含水量。OsOPPL1过量表达转基因水稻在断水后57天开始抽穗，断水后88天成熟。
图7为OsMFS9过量表达转基因水稻田间干旱试验中海南田间在水稻不同发育时期的土壤含水量。OsMFS9过量表达转基因水稻在断水后40天开始抽穗，断水后73天成熟。
图8为OsLAO1过量表达转基因水稻第二次田间干旱试验中海南田间在水稻不同发育时期的土壤含水量。OsLAO1过量表达转基因水稻在断水后40天开始抽穗，断水后73天成熟。
图9为OsOPPL1和OsDN-DSP1过量表达转基因水稻田间干旱试验中宁夏田间在水稻不同发育时期的土壤含水量。OsOPPL1和OsDN-DSP1过量表达转基因水稻在断水后46天开始抽穗，断水后86天成熟。
图10为OsDN-DSP1过量表达转基因水稻田间干旱试验中海南田间在水稻不同发育时期的土壤含水量。OsDN-DSP1过量表达转基因水稻在断水后36天开始抽穗，断水后86天成熟。
图11为CRISPR/Cas系统载体的结构示意图
图12为RNAi构建体转基因水稻田间试验中海南田间突然含水量变化图，测试的抑制转基因水稻在断水后29天开始抽穗，断水后80天成熟。
图13为OsMFS9抑制转基因水稻第一次田间验证中田间土壤含水量变化图。OsMFS9抑制转基因水稻在断水后31天开始抽穗，断水后64天成熟。为避免没有收获到籽粒，在断水后27天进行一次浇水。
图14为OsMFS9抑制转基因水稻第二次田间干旱试验中土壤含水量变化图，OsMFS9抑制转基因水稻在断水后25天开始抽穗，断水后83天成熟。
图15为DP2420水稻田间试验中海南田间土壤含水量变化图，DP2421水稻在断水后22天开始抽穗，断水后76天成熟。
表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列的编号
序列描述以及关联的序列表遵循如37 C.F.R.§1.821-1.825中所列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic AcidsRes.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本发明。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822中列出的规则。
详细描述
本发明中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文均以引用的方式并入本发明。
如本发明所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。
如本发明所述：
“OsPRP1”是富含脯氨酸蛋白1(proline-rich protein 1)，涉及水稻基因位点LOC_Os01g57004.1编码的多肽，当过量表达时，赋予植物敏旱表型。“PRP1多肽”此处涉及OsPRP1多肽和其他植物中同源物。
OsPRP1多肽(SEQ ID NO：4)是水稻基因位点LOC_Os01g57004.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：3)或核酸序列(SEQ ID NO：2)编码的多肽。该多肽在TIGR(网址plant biologymsu.edu/index.shtml)中注释为“粘合/富含脯氨酸蛋白，推测，表达”，但是没有在先功能介绍。
“OsPP2C64”是蛋白磷酸酶2C64(protein phosphatase 2C 64)，涉及水稻基因位点LOC_Os07g37890.1编码的多肽，当过量表达时，赋予植物敏旱表型。“PP2C64多肽”此处指OsPP2C64多肽和源于其他植物的同源物。
OsPP2C64多肽(SEQ ID NO：7)是水稻基因位点LOC_Os07g37890.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：6)或核苷酸序列(SEQ ID NO：5)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中注释为“蛋白磷酸酶2C，推测，表达”，在NCBI中注释为“可能的蛋白磷酸酶2C64”，但是没有在先的功能说明。
“OsOPPL1”是氧化保护蛋白-类似1(oxidation protection protein-like 1)是水稻基因位点LOC_Os02g51770.1编码的多肽，当过量表达时，赋予植物敏旱表型。“OPPL1多肽”此处指OsOPPL1多肽和源于其他植物的同源物。
OsOPPL1多肽(SEQ ID NO：10)是水稻基因位点LOC_Os02g51770.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：9)或核苷酸序列(SEQ ID NO：8)编码的多肽。该多肽在TIGR中注释为“TLD家族蛋白，推测，表达”，在NCBI中注释为“氧化保护蛋白-类似”。
“OsMFS9”是主要协助转运蛋白超家族9(major facilitator superfamily 9)，涉及水稻基因位点LOC_Os03g02380.1编码的多肽，当过量表达时，赋予植物敏旱表型。“MFS9多肽”此处指OsMFS9多肽和源于其他植物的同源物。
OsMFS9多肽(SEQ ID NO：13)是水稻基因位点LOC_Os03g02380.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：12)或核苷酸序列(SEQ ID NO：11)编码的多肽。该多肽在TIGR中注释为“含有主要协助转运蛋白超家族结构域的蛋白5，推测，表达”，在NCBI中注释为“钼酸盐阴离子转运体”，但是没有在先的功能介绍。
“OsLAO1”是L-抗坏血酸氧化酶1(L-ascorbate oxidase 1)，涉及水稻基因位点LOC_Os07g02810.1编码的多肽，当过量表达时，赋予植物敏旱表型。“LAO1多肽”此处指OsLAO1多肽和源于其他植物的同源物。
OsLAO1多肽(SEQ ID NO：16)是水稻基因位点LOC_Os07g02810.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：15)或核苷酸序列(SEQ ID NO：14)编码的多肽。该多肽在TIGR中注释为“抗坏血酸氧化酶同源物前体，推测，表达”，在NCBI中注释为“L-抗坏血酸氧化酶同源物”。
“OsDN-DSP1”是指敏旱蛋白1(drought sensitive protein 1)，涉及水稻基因位点LOC_Os02g57210.1编码的多肽，当过量表达时，赋予敏旱表型。“DN-DSP1多肽”此处指OsDN-DSP1多肽和源于其他植物的同源物。
OsDN-DSP1多肽(SEQ ID NO：19)是水稻基因位点LOC_Os02g57210.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：18)或者核苷酸序列(SEQ ID NO：17)编码的多肽。该多肽在TIGR中注释为“表达蛋白”，在NCBI中注释为“未知蛋白”。
本发明中的单子叶植物包括禾本科的植物；双子叶植物包括十字花科、豆科和茄科的植物。
“全长互补序列”是指给定核苷酸序列的互补序列，互补序列和核苷酸序列含有相同的核苷酸数，并且100％的互补。
“性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理的、形态的、生化的或物理的特征。在一些实施例中，这些特征可以是肉眼可见的，比如种子、植株的大小等；可用生物化学技术测定的指标，如种子或叶片中蛋白、淀粉或油份的含量等；可观察的代谢或生理过程，如测定对水分胁迫、特定盐、糖或氮浓度的耐性；可检测的基因表达水平；或可观察渗透胁迫的耐性或产量等农艺性状。
“农艺性状”是可测量的指标参数，包括但不限于：叶片绿色、籽粒产量、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物营养组织氮含量、植物总游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、植物营养组织游离氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、圆锥花序的大小、早期苗的活力和低温胁迫下的出苗状况。
可以测量增加的生物量，例如与对照植物相比，增加的植物高度、植物总叶面积、植物鲜重、植物干重或植物种子产量等。
增加植株生物量或大小的能力具有多种重要商业应用，作物栽培品种可用于产生较高植物营养组织部分，用于食品、饲料、纤维和/或生物燃料。
人们对叶片大小的增加特别有兴趣。增加的叶片生物量可用于增加植物源药或工业产品的生产，增加的分蘖数可以增加产量，增加植物叶片面积可提高植物总的光合作用，增加的光合合成能力可以增加特定植物组织的产量，并使植物在低光强或高光强下生长，所述特定植物组织包括叶片、根、果实或种子。
其它组织如根的生物量的改变有利于提高植物在严酷条件下生长的能力，所述严酷条件包括干旱、营养贫瘠，因为大量的根系可以更好地吸收水分和营养。
对于观赏植物，人们所期望获得较大的品种，许多植物包括果树，用于木材生产的树，作为视图或风帘的乔木或灌木，可以通过增加其大小以获得较大的产量或增加屏障。
“转基因的”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本发明所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。
“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因，测试的植物或植物细胞可以是转基因植物或转基因植物细胞的子代。
“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。
“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
“子代”包括植物的任何后续世代。
“修饰的植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸或修饰的基因或启动子的植物。例如异源多核苷酸能够稳定地整合进基因组中，并遗传连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。T0植物直接源于转化和再生过程，T0植物的子代为T1代(第一个子代)，T2代(第二个子代)等。修饰的基因或启动子为在植物基因组中单个或多个或脱氧核苷酸片段的插入或删除。
针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。
“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可在细胞中翻译成蛋白质的RNA。
“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可为单链的或者可用DNA聚合成酶I的Klenow片段合成双链形式。
“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽，即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。
“前体”蛋白质指mRNA翻译的初级产物；即带有前肽和原肽的蛋白质。前肽和原肽可为并且不限于细胞内定位信号。
“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上游离的，或者从天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分中分离的。分离的多核苷酸可从它们天然存在的宿主细胞中纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
“重组体”指(例如)通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。
“重组DNA载体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA载体可包含不同来源的调控序列和编码序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
术语“入门克隆”和“入门载体”本发明可互换使用。
“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
“植物中有功能启动子”是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。
“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。
“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
“抑制元件”指长度约为21-1500bp或更长的，可以与内源性基因表达的mRNA序列选择性结合，并下调其表达的片段。
“gRNA”是引导RNA，指约20bp长度的可以与mRNA互补RNA片段，其介导核苷酸的插入或删除。
术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。
有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“导入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。
“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)导入其中的任何细胞。
本发明所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。
“稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。
“瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。
“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。
“叶绿体转运肽”是与蛋白协同翻译并将蛋白导向叶绿体或翻译蛋白的细胞中存在的其它质体类型的氨基酸序列。“叶绿体转运序列”指编码叶绿体转运肽的核苷酸序列。“信号肽”是一种与蛋白协同翻译并将蛋白导向分泌器官的氨基酸序列(Chrispeels，M.(1991)Ann.Rev.PlantPhys.Plant Mol.Biol.42：21-53)。如果将所述蛋白导向液泡，可另外加上液泡靶向信号，或者如果将所述蛋白导向内质网，可加上内质网驻留信号。如果将蛋白导向细胞核，将移除任何存在的信号肽并用以核定位信号替代(Raikhel(1992)PlantPhys.100：1627-1632)。“线粒体信号肽”是引导前体蛋白进入线粒体的氨基酸序列(Zhang和Glaser(2002)Trends Plant Sci 7：14-21)。
目前已知有多种可以用来研究各种多聚核苷酸和多肽序列之间关系的方法。本发明中，“参考序列”是一个界定序列，用作序列比对的基础。参考序列是一个特定序列的子集或全部，例如全长cDNA/基因序列的片段，抑或完整的cDNA/基因序列。此处用到的“比对窗口”，涉及到一个多聚核苷酸或多肽序列的共有或特定片段，其中两个序列的最佳比对时，与参考序列(没有添加或者删除)相比，比较窗口中序列可能会包含添加或删除(换言之既间隙)。通常比对窗口中至少包含20个连续的碱基或氨基酸，还可以选择30、40、50、100甚至更长。本领域的技术人员为了避免因引入序列间隙而导致的与参考序列的高相似性，引入空位罚分，并减去相应的匹配数目。
使用缺省参数就可以通过上述程序开展序列联配工作。Higgins等(Gene 73：237-244，1988)，Higgins等(CABIOS 5：151-153，1989)，Corpet等(Nucleic Acids Res.16：10881-10890，1988)，Huang等(CABIOS 8：155-165，1992)和Pearson等(Meth.Mol.Biol.24：307-331，1994)对CLUSTAL进行了详细的描述；ALIGN程序则以Myers和Miller提出的supra算法(1988)为基础。进行氨基酸序列比对时，当使用PAM120残基重量表，且空位罚分为12和空位罚分为4时，可以与ALIGN程序相结合对氨基酸序列进行比较。BLAST程序(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403，1990)以Karlin和Altschul的supra算法(1990)为基础，可以使用BLASTN对核苷酸序列进行检索，score＝100，wordlength＝12，以获得本发明所涉及蛋白质对应编码核苷酸序列的同源序列；可以使用BLASTX，score＝50，wordlength＝3，以获得本发明所涉及蛋白质或多肽的同源氨基酸序列。Gapped BLAST(BLAST 2.0)(Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389)可以用于Gap比对。作为一种选择，PSI-BLAST(BLAST2.0)可以开展交互式搜索，从而检测到亲缘关系较远的两个分子(Altschul等(1997)supra)。当使用BLAST时，Gapped BLAST、PSI-BLAST和相应程序的缺省参数(例如用于核甘酸序列的BLASTN，用于蛋白质的BLASTX)也可以一并使用(美国政府国立卫生研究院国立医学图书馆国家生物技术信息中心)。序列联配也可以用于人工检索。
通过使用GAP(Ver 10)和以下参数可以得到配对序列一致性/相似性值：使用GAPWeight 50、Length Weight 3以及nwsgapdna.cmp得分矩阵来计算核酸序列的一致性(％)和相似性(％)；使用GAP Weight 8、Length Weight 2以及BLOSUM62得分矩阵可以计算氨基酸序列的一致性(％)和相似性(％)；或者任何等同程序。任何序列比较程序都可以被看作“等同程序”，因为任意两条序列进行比较，都会产生一个联配结果，包含一致的核苷酸或氨基酸碱基配对。当与GAP Ver 10所产生序列联配结果进行比较时，还会产生序列一致性百分比。
GAP利用Needleman和Wunsch算法((1970)J.Mol.Biol.48：443-453)，以发现两个全长序列联配的最大匹配数和最小间隙数。GAP考虑所有可能的联配和gap位点，并创造联配位点数目最大且gap数目结果，它允许匹配碱基单元中存在间隙创造罚分和间隙延展罚分，GAP必须利用每个插入间隙的间隙创造罚分匹配数，另外，如果选择间隙延展罚分大于0，GAP必须利用每个插入间隙的长度间隙次数，间隙延展罚分。GCG Wisconsin遗传学软件包Ver 10中，缺省间隙创造罚分值和间隙延展罚分值分别为8和2，核苷酸序列中，缺省间隙创造罚分是50，缺省间隙延展罚分为3，间隙创造和间隙延展罚分可以是0-200中的整数，因此间隙创造和间隙延展罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。
除非特别说明，本发明中的多序列比对采用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp.(1989)CABIOS.5：151-153)和缺省参数(间隙罚分＝10，间隙长度罚分＝10)，两个比对的缺省参数和计算氨基酸序列一致性百分数使用Clustal V方法：KTUPLE＝1，间隙罚分＝3，窗口＝5和对角线拯救＝5；用于核酸序列的参数KTUPLE＝2，间隙罚分＝5，窗口＝4和对角线拯救＝4。序列比对后应用Clustal V程序，通过观察“序列距离”表，可以得到“一致性百分比”和“散度”值，除非特别说明，一致性百分比和散度值以相同的方式获得。
本发明中，当在特定比对窗口中最大一致性比对时，两个多聚核苷酸或多肽序列的“序列一致性”或“一致性”指参考两序列中残基相同，当序列一致性百分数用于提及的蛋白质，被认为不同残基位置与保守氨基酸替代不同，氨基酸残基被具有相似化学性质的其它氨基酸残基(如电荷或疏水性)替代，而不改变分子的功能特性，当序列在保守区替代不同，序列一致性百分数可以上调以更正替代的保守性，保守替代不同的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。本领域的技术人员熟悉进行调整的方法，包括计算作为部分的而不是全长错配的保守替代，因而增加序列一致性百分数，因此，相同氨基酸给与1分，不保守的替代给与0分，保守替代给与0-1分，计算保守替代的得分，如在PC/GENE执行(Intelligenetics，Mountain View，加州)。
本发明中“序列一致性百分数”的计算包括确定两个序列中相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位置数目，获得匹配位置数，然后将匹配的位置数除以比对窗口中位置总数再乘以100。
本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory Press：Cold SpringHarbor，1989(下文称为“Sambrook”)。
实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、赋予耐旱性的抑制DNA构建体、CRISPR/Cas9构建体，包含抑制DNA构建体或CRISPR/Cas9构建体的诸如植物或种子的组合物、以及利用这些构建体的方法。
分离的多核苷酸和多肽：
本发明包括如下分离的多核苷酸和多肽：
一种分离的多核苷酸，包括(i)一种核酸序列，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQID NO：4、7、10、13、16或19相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列，其中核酸序列(i)与全长互补序列具有相同数目的核苷酸，并且100％的互补。前述任一分离的多核苷酸可用于构建本发明的任一重组DNA构建体，过量表达所述编码的多肽降低植物的耐旱性，抑制所述多肽的表达提高植物的抗旱性能。
一种分离的多核苷酸，其包括(i)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；(ii)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11、14或17相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(iii)核酸序列(i)或(ii)的全长互补序列。前述任一分离的多核苷酸可用于构建本发明的任一重组DNA构建体，分离的多核苷酸优选为编码PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽。过量表达所述编码的多肽降低植物的耐旱性，抑制所述多肽的表达提高植物的抗旱性能。
一个分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。所属多肽优选为PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽，过量表达所述多肽降低植物的耐旱性，抑制所述多肽的表达提高植物的抗旱性能。
重组DNA构建体、抑制DNA构建体和CRISPR/Cas9构建体：
一方面，本发明包括重组DNA构建体。
在一个实施方案中，一个重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列(如植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸包括(i)一种核酸序列，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。
在另一个实施方案中，一个重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列(如植物中有功能的启动子)，其中，所述多核苷酸包括(i)一个核酸序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；(ii)一个核酸序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11、14或17相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(iii)核苷酸序列(i)或(ii)的全长互补序列。
在一个实施方案中，一个重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列(如植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽，所述多肽优选为具有敏旱性，并可来自，例如水稻(Oryzasativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。
在另一方面，本发明包括抑制DNA构建体。
一个抑制DNA构建体包括至少一个调控序列(如植物中有功能的启动子)和与其可操作连接的(a)全部或部分：(i)一个多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(a)(i)的全长互补序列；或(b)源于靶基因的正义链或反义链的全部或部分的区域，所述区域的核酸序列与该靶基因的正义链或反义链的全部或部分相比具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％得序列一致性，其中所述靶基因编码敏旱多肽；或者(c)全部或部分：(i)与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的核苷酸序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的核苷酸序列，或者(ii)核酸序列(c)(i)的全长互补序列。抑制DNA载体包括反义载体、病毒抑制载体、发夹抑制载体、茎-环抑制载体、双链RNA产生载体、RNAi载体或小RNA载体(例如siRNA载体或miRNA载体)。
“抑制DNA载体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA载体。对该植物来说，该靶基因可为内源性的基因或是转入的基因。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不特指机理并且包括但不限于反义、病毒-抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。
抑制DNA载体可包含源自所关注的靶基因的区域并且可包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，所述区域可与所关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100％相同或者具有少于100％序列的一致性(如，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性)。
抑制DNA载体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于反义载体、病毒-抑制载体、发夹抑制载体、茎-环抑制载体、产生双链RNA的载体，以及更通常的是，RNAi(RNA干扰)载体和小RNA载体，例如siRNA(短干扰RNA)载体和miRNA(微RNA)载体
“反义抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的反义RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物(美国专利号5,107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。
RNA干扰(RNAi)是指由短干扰性RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，(1998)Nature 391：806)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。据信PTGS转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守性细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共有(Fire等人，(1999)Trends Genet.15：358)。
小RNA在控制基因表达中起重要作用，例如。小RNA控制包括开花在内的很多发育过程。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因载体来以基因工程手段改变植物基因的表达。
小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结合时，小RNA或者引发靶序列的RNA裂解或者引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据信小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。
微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物中鉴定出的非编码RNA(Lagos-Quintana等人，(2001)Science 294：853-858；Lagos-Quintana等人，(2002)Curr.Biol.12：735-739；Lau等人，(2001)Science 294：858-862；Lee和Ambros，Science294：(2001)862-864；Llave等人，(2002)Plant Cell 14：1605-1619；Mourelatos等人，(2002)Genes.Dev.16：720-728；Park等人，(2002)Curr.Biol.12：1484-1495；Reinhart等人，(2002)Genes.Dev.16：1616-1626)。它们是由大小为大约70至200nt较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。
微RNA(miRNA)看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调节靶基因。看起来有可能miRNA可进入至少两条靶基因调控途径：(1)翻译抑制；和(2)RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA类似于在动物中的RNA干涉作用(RNAi)和植物中的转录后基因沉默(PTGS)期间生成的21-25nt的短干涉RNA(siRNA)，并且可能掺入了RNA诱导沉默复合物(RISC)，该复合物与RNAi相似或相同。
在另一方面，本发明包括基因组编辑构建体如CRISPR/Cas构建体。
一个CRIPSR/Cas9构建体,包括一个编码Cas9酶的多核苷酸、一个编码核定位信号的多核苷酸、至少一个异源的调控元件和与其可操作连接的gRNA，其中，所述gRNA靶向包含内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因和其调控元件的靶基因组区域，以降低内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或者活性。所述gRNA靶向核苷酸序列为SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、86、87、88、89、90或91的多核苷酸的基因组区域。
一个调控元件驱动内源基因表达或编码序列本身，例如，可能会通过CRISPR/Cas9体系的基因组编辑技术被编辑或插入植物中。
诸如设计锌指、转录激活样效应子(TALEs)或归位和酸内切酶的基因组编辑技术可用于产生靶基因组变化。
通常，“CRISPR系统”指包括编码Cas基因的序列、tracr(tracr-激活CRISPR)序列、一个tracr-mate序列、一个引导序列或其他序列和源于CRISPR位点的转录物。
CRISPR位点(成簇的规律间隔短回文重复，也被称作SPIDRs，间隔穿插的顺向重复)构成近来描述的DNA位点家族，CRISPR位点由短且高度保守的DNA重复(典型的24～40bp，重复1～140次，也称为CRISPR重复)组成，CRISPR位点为部分回文。重复序列(通常具有品种特异性)被固定长度(代表性的20～58bp，根据CRISPR位点而不同)的可变序列间隔开(公布与2007年3月1日的WO2007/025097)。
Cas基因指通常耦合的，关联或邻近CRISPR位点或在CRISPR位点侧翼的附近的基因。术语“CAS基因”和“CRISPR关联(CAS)基因”此处可以互换使用。(Haft等(2005)PLoSComput Biol474-483)。如本发明所描述，除了四个已知基因家族外，41个CRISPR关联(CAS)基因家族进行了描述。这表明CRISPR系统属于不同的类别，具有不同的重复模式，基因组别和物种范围。一个给定的CRISPR位点不同物种间的CAS基因数目不同。
Cas核酸内切酶指Cas基因编码的Cas蛋白，其中，所述Cas蛋白可以向靶DNA序列导入双链断裂。Cas核酸切酶由引导多聚核苷酸引导识别和选择性的向细胞基因组特定靶位点导入双链断裂(U.S.2015/0082478)。引导多聚核苷酸/Cas核酸内切酶体系包括Cas核酸内切酶和引导多聚核苷酸组成的复合体，所述引导多聚核苷酸能够向DNA靶序列导入双链断裂。如果一个正确的前间区序列邻近基序(PAM)位于的靶序列的3’端，Cas核酸内切酶有引导RNA引导解开基因组靶位点邻近DNA双链，切割靶序列DNA双链的识别位点。Cas核酸内切酶可以通过本领域已知的方法直接导入细胞，例如，转染和/或局部适用，但不限于瞬时导入方法。
如本发明中使用，术语“引导RNA”指crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA两个RNA分子合成的融合，所述crRNA包括一个可变的靶结构域。在一个实施例中，引导RNA包括一个12～30bp核苷酸序列的可变的靶结构域和可以与Cas核酸内切酶相互作用的RNA片段。
如本发明所述，术语“引导多聚核苷酸”指可以与Cas核酸内切酶构成复合体的多聚核苷酸序列，并且可以使Cas核酸内切酶识别并随意切割DNA靶位点(U.S.2015/0082478)。引导多聚核苷酸可以是单链分子也可以是双链分子，引导多核苷酸序列可以是RNA序列，DNA序列或它们的组合(RNA-DNA组合序列)。可选的，引导多聚核苷酸包括至少一个核苷酸，磷酸二酯键或修饰键，例如，但不限于锁定核苷酸(LNA)、5-甲基脱氧胞苷、2，6-二氨基嘌呤、2-氟腺苷，2-氟脲苷、2-甲基RNA、硫代磷酸酯键，一种胆固醇分子链、聚乙二醇分子链、以间隔18(六乙二醇链)分子链、或5至3共价键产生的环。引导多聚核苷酸仅包括也被称作“引导RNA”的脱氧核糖核酸。
术语“Cas核酸内切酶识别结构域”或引导多聚核苷酸的“CER结构域”此处可互换使用，包括与Cas核酸内切酶多肽相互作用的核苷酸序列(诸如引导多聚核苷酸的第二核苷酸序列)。CER结构域由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列(例如此处描述的修饰)或它们的任意组合构成。
核苷酸序列连接单引导多聚核苷酸的crnucleotide和tracrnucleotide可以组成RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一个实施例中，核苷酸序列连接单引导多聚核苷酸的crNucleotide和tracrNucleotide组成长度至少为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100bp。在另一个实施例中，核苷酸序列连接单多聚核苷酸的crNucleotide和tracrNucleotide组成四核苷酸环序列，诸如，但不限于GAAA四核苷酸环序列。
DNA核酸酶和其他的突变酶结构域可以与DNA结合结构域融合在靶DNA上产生双链断裂(DSB)，DNA结合结构域包括，例如一个特异DNA结合结构域，或一个位点特异DNA结合结构域。位点特异DNA结合结构域包括但不限于TAL(转录激活样效应因子)或锌指结合结构域。
DNA结合结构域与DNA核酸酶融合的例子包括但不限于TALEN和多TALEN。转录激活样效应因子核酸酶(TALENs)是TAL效应因子DNA结合结构域融合到DNA酶的结构域产生的人工限制性酶。TAL蛋白是细菌产生的，包括高度保守的33～34氨基酸DNA结合结构域序列(PCT公开号WO2014127287，美国专利公开号US20140087426)。
起初的TALEN嵌合体是由野生型的FokI核酸内切酶结构域制备的，而TALEN也包括源于FokI核酸内切酶结构域变异提高了切割特异性和切割活性突变嵌合体。在一些例子中，多个TALEN可以靶向多个基因区域表达。
锌指是另一种类型的DNA结合结构域，可以将突变引入靶DNA。
各种蛋白工程技术可以用于改变锌指DNA结合特异性，这样设计的锌指的串联重复序列可用于靶向期望的基因组DNA序列。融合第二个蛋白结构域例如转录抑制子到锌指，可以与附近的YEP基因启动子结合，从而降低ICDH1、MtN3L、DN-DTP6、ANKL1、MBD2、TP1、ACOAT1或DN-DTP7基因表达水平。
应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。例如，丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。
调控元件：
本发明的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)包含至少一个调控元件。
调控元件可以是启动子或增强子。
多个启动子可用于本发明的重组DNA构建体，启动子根据期望的结果选择，可包括宿主生物体中表达的组成型、组织特异型、诱导型、或其他启动子。
一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子称为“组成型启动子”。
当组成型启动子驱动候选基因表达时能够评估候选基因的效应，但候选基因在35S或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫特异启动子可消除不需要的效应但保留提高植物耐旱性的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效应(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)。
适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和在WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell2：163-171)；泛素启动子(Christensen)等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。
在选择启动子用于本发明方法时，期望使用组织特异性启动子或发育调节启动子。
组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列，其调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。
本领域的技术人员知道多种叶片优选的启动子(Yamamoto等(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon等(1994)Plant Physiol.105：357-367；Yamamoto等(1994)Plant CellPhysiol.35(5)：773-778；Gotor等(1993)Plant J.3：509-518；Orozco等(1993)PlantMol.Biol.23(6)：1129-1138；和Matsuoka等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590)。
可用于本发明的种子或胚特异性启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(Kti3，Jofuku和Goldberg，(1989)Plant Cell 1：1079-1093)，convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子叶)(Rerie，W.G.等，(1991)Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等，(1990)Planta 180：461-470；Higgins，T.J.V.等，(1988)Plant.Mol.Biol.11：683-695)，玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等，(1988)EMBO J.7：1249-1255)，菜豆蛋白(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324)，植物血球凝集素(菜豆子叶)(Voelker，T.等，(1987)EMBO J.6：3571-3577)，B-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子叶)(Chen，Z-L等，(1988)EMBOJ.7：297-302)，谷蛋白(稻胚乳)，大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(Marris，C.等，(1988)Plant Mol.Biol.10：359-366)，麦谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳)(Colot，V.等，(1987)EMBO J.6：3559-3564)。可操作地连接至嵌合基因载体异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。这样的实施例包括在拟南芥和甘蓝型油菜(Brassica napus)种子中表达脑啡肽的拟南芥属2S种子储藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等，(1989)Bio/Technology 7：L929-932)，表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子(Riggs等，(1989)PlantSci.63：47-57)，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(Colot等，(1987)EMBOJ6：3559-3564)。
诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操纵连接的DNA序列。诱导启动子或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。
用于本发明的启动子包括以下启动子：1)胁迫诱导型RD29A启动子(Kasuga等，(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)；2)胁迫诱导启动子Rab17(Vilardell等，(1991)Plant Mol.Bio.17:985-993；Kamp Busk等(1997)Plant J 11(6)：1285-1295)；3)大麦启动子B22E；B22E是发育中玉米籽粒中的柄所特异表达的启动子(“Primary Structure of aNovel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers”Klemsdal,S.S.等，(1991)Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16)；和4)玉米启动子Zag2(“Identification and molecular characterization of ZAG1，the maize homolog ofthe Arabidopsis floralhomeotic gene AGAMOUS”，Schmidt，R.J.等，(1993)Plant Cell5(7)：729-737；“Structural characterization，chromosomal localization andphylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-box genes frommaize”，Theissen等，(1995)Gene 156(2)：155-166；NCBI GenBank登录号X80206))。Zag2转录物可在授粉前5天至授粉后(DAP)7至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序的心皮中表达，Ciml是发育玉米籽粒的籽仁特异的启动子。Ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被检测到。其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。
对于在发育种子组织中表达的多聚核苷酸，特定的启动子包括种子优选的启动子，尤其是早期籽粒/胚胎启动子和晚期籽粒/胚乳启动子，授粉后籽粒的发育大致可以分为三个基本阶段，籽粒生长的停滞期起始于授粉后0天到10-12天，在此期间，籽粒没有明显的生长，但是决定籽粒活力的重要事件将在此期间发生(如细胞建成数目)。线性籽粒灌浆期起始于授粉后的10-12天并延续到授粉后的40天左右，在此籽粒发育期间，籽粒达到最终的质量，并产生多种储藏物质如淀粉、蛋白质和油等；成熟期起始于授粉后大约40天到收获，在这一过程中，籽粒开始休眠，变干并为萌芽前的种子休眠做准备。本发明中的“早期籽粒/胚乳启动子”指主要在种子发育的停滞期(也就是授粉第0天到授粉后第12天期间)驱动基因表达的启动子；“后期籽粒/胚乳启动子”主要驱动基因在授粉后12天到成熟过程中的种子中基因表达；表达窗口可能会有一些重叠，将根据使用的ABA偶联的序列和期望的表型选择启动子。
早期籽粒/胚胎启动子包括，Cim1，其在授粉后第5天活跃在特定组织中(WO 00/11177)；其它的早期籽粒/胚胎启动子包括种子偏爱启动子end1，其在授粉后7-10天表达，和end2，其在授粉后9-14天在整个籽粒中表达，在授粉后10天在胚乳和果皮中表达(WO00/12733)，此处以全文引用方式并入本文。本发明中的特定方法使用的其它早期籽粒/胚乳启动子包括种子偏爱启动子ltp2(美国专利号5,525,716)；玉米Zm40启动子(美国专利号6,403,862)；玉米nuc1c(美国专利号6,407,315)；玉米ckx1-2启动子(美国专利号6,921,815和美国专利申请公开号2006/0037103)；玉米lec1启动子(美国专利号7,122,658)；玉米ESR启动子(美国专利号7,276,596)；玉米ZAP启动子(美国专利申请公开号20040025206和20070136891)；玉米启动子eep1(美国专利申请公开号20070169226)；和玉米启动子ADF4(美国专利申请号60/963,878，2007年8月7日申请)。
本发明中调控核酸序列在植物中表达的其它启动子是茎特异启动子，包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号EF030816；Abrahams等(1995)Plant Mol.Biol.27：513-528)和S2B启动子(GenBank登录号EF030817)和类似的启动子。
启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的DNA片段。
用于本发明特定实施例的启动子包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、泛素、CaMV19S、nos、Adh、蔗糖合成酶、R-等位基因、维管组织偏爱启动子S2A(Genbank登录号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2。其他启动子还包括根偏爱启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US 2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CRlBIO启动子(WO06055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790；GINo.1063664)。
本发明的重组DNA构建体也可包括其他调控元件，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在特定实施方案中，重组DNA载体还包括增强子或沉默子。
内含子序列可加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信使RNA的量。已经显示，在植物和动物两者的表达载体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参见Buchman和Berg，(1988)Mol.Cell Biol.8：4395-4405；Callis等，(1987)Genes Dev.1：1183-1200。
任何植物都可以选择用来鉴定将用于本发明重组DNA载体的调控序列和基因。适用于分离基因和调控序列的靶植物的实例应该包括但不限于苜蓿、苹果、杏、拟南芥、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心菜、加拿大油菜、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻子、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔、克莱门氏小柑橘、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、车前草、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。
组合物：
本发明的组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体或抑制DNA构建体(例如上面所讨论的任何一种构建体)的植物，或包含修饰的PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1、DN-DSP1基因的植物，或PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1、DN-DSP1基因启动子被修饰的植物。组合物还包括所述植物的任何子代，以及获取自所述植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体、或修饰的PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1、DN-DSP1基因或启动子。所述子代包括植物通过自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交种和自交系
在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的修饰植物可自花授粉而产生纯合的自交系植物。该自交系植物产生的种子含有新导入的重组DNA构建体或抑制DNA构建体，或修饰的PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1、DN-DSP1基因或启动子。这些种子可生长成植物，所述植物表现出改变的农学特性(如水分限制条件下增加农业特性)，或者可用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长成植物，所述植物将会表现出如改变的农学特性。所述种子可为玉米种子或水稻种子。
植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如水稻、玉米或大豆植物，如玉米杂种植物或玉米自交系植物。植物还可为向日葵、高梁、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗或柳枝稷。
重组DNA构建体可稳定地整合进植物的基因组中，基因或启动子的修饰可以在植物中稳定遗传。
实施方案包括但不限于以下实施方案：
1.在其基因组中包含抑制DNA构建体的植物，如水稻、玉米或大豆，所述抑制DNA构建体包含至少一个调控元件，和与其可操作连接的抑制元件，所述抑制元件所关注的靶基因正义链或反义链的全部或部分的区域，所述抑制元件与其源于的正义链或反义链的全部或部分的序列一致性50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，所述所关注的靶基因编码敏旱多肽；与对照植物相比，所述植物表现出增加的耐旱性，且所述植物进一步表现出至少一个改变的农艺性状。
2.在其基因组中包含抑制DNA构建体的植物，如水稻、玉米或大豆，所述抑制DNA构建体包含至少一个调控元件，和与其可操作连接的抑制元件，所述抑制元件为下述序列的至少100bp连续碱基对：(a)一个核酸序列，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(b)核酸序列(a)的全长互补序列，其中，与对照植物相比，所述植物表现出增强的耐旱性，所述植物进一步表现出至少一个农艺性状的改变。
3.在其基因组中包含抑制DNA构建体的植物，如水稻、玉米或大豆，所述抑制DNA构建体包含至少一个调控序列，和与其可操作连接抑制元件，所述抑制元件为下述序列的至少100bp连续碱基对：(a)一个多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(b)核酸序列(a)的全长互补序列，其中，与对照植物相比，所述植物表现出增强的耐旱性，所述植物进一步表现出至少一个农艺性状的改变。
4.在其基因组中包含抑制DNA构建体的植物，如水稻、玉米或大豆，所述抑制DNA构建体包含至少一个调控序列，和与其可操作连接的(a)核酸序列为SEQ ID NO：45、46、47、48、49或50的多核苷酸，或(b)核酸序列(a)的全长互补序列，与对照植物相比，所述植物表现出增强的耐旱性，所述植物进一步表现出至少一个农艺性状的改变。
5.一种改良植物，如水稻、玉米或大豆，含有(a)一种修饰的多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11、14或17的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为85％；(c)核酸序列(a)或(b)的全长互补序列，其中所述植物表现出增强的耐旱性。
6.一种改良植物，如水稻、玉米或大豆，含有(a)一种修饰的多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11、14或17的序列一致性至少为95％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为95％；(c)核酸序列(a)或(b)的全长互补序列，其中所述植物表现出增强的耐旱性。
7.一种改良的植物，其中，与对照植物相比，所述植物中PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的表达降低；所述植物表现出至少一个表型，选自：增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐性和增加的生物量。所述植物表现出增加的非生物胁迫耐性，所述非生物胁迫是干旱胁迫。
8.一种植物含有修饰的PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1启动子，其中，与对照植物相比，所述植物中PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的表达降低，所述植物表现出至少一个表型，选自：增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐性和增加的生物量。所述植物表现出增加的非生物胁迫耐性，所述非生物胁迫是干旱胁迫。
9.实施方案1-8的所述植物的任何子代，实施方案1-8的所述植物的任何种子，实施方案1-8的所述植物的任何子代植物的种子，和源于实施方案1-8的所述植物和其子代植物的细胞。
前述实施方案1-9或其它实施方案中，所述敏旱性多肽可来自水稻(Oryzasativa)、野生稻(Oryza australiensis)、短舌野生稻(Oryza barthii)、非洲型稻(Oryzaglaberrima)、阔叶稻(Oryza latifolia)、长雄野生稻(Oryza longistaminata)、南方野生稻(Oryza meridionalis)、药用野生稻(Oryza officinalis)、斑点野生稻(Oryzapunctata)、普通野生稻(Oryza rufipogon)(红稻)、印度野生稻(Oryza nivara)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycinetabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。
前述实施方案1-9或其它实施方案中，重组DNA构建体、抑制DNA构建体或CRISPR/Cas9构建体包含至少一个植物中有功能的启动子作为调控序列。
前述实施方案1-9或其它实施方案中，至少一种农艺性状的变化可以是增加也可以是减少。
前述1-9实施方案或其它实施方案中，与对照植物相比，所述植物在水分限制条件下表现出至少一个农艺性状的变化。
“干旱”指植物可用水分的减少，特别是较长时间的缺水或者在植物重要的生长阶段发生，会造成植物损伤，或阻止植物的生长(限制植物的生长，降低籽粒的产量)。
“耐旱性”指植物在干旱胁迫下能够存活并且没有实质性的生理或物理损伤的能力，和/或一段时间干旱后复水能够恢复的能力。
植物“增强的耐旱性”是与参照或对照植物相比测定的，反映了植物在干旱胁迫下存活的能力，并且与生长在相似干旱条件下参照或对照相比，具有较小的生理或物理损伤，或者干旱胁迫后复水时，比对照植物恢复更多和/或更快的能力。
“环境条件”指植物生长的环境，诸如可用的水分、可用的营养物质或存在的昆虫或病害。
“百草枯”(1,1-二甲基-4,4-联吡啶二氯化物)是一类叶片喷施的非选择性的吡啶除草剂，能够引起光氧化胁迫，并进一步造成植物的损害或者阻止植物的正常生长。
“百草枯耐性”是一种植物性状，反映了百草枯溶液处理后，与参照或对照植物相比，植物的存活或生长良好的能力。
植物“增强的百草枯耐性”是相对于参照或对照植物测定的，反映了植物在百草枯溶液处理后，与参照或对照植物相比，能够存活并具有较小的生理或物理伤害的能力。通常，针对较低浓度的百草枯溶液的耐性用作诸如干旱胁迫的非生物胁迫耐性的一种指标。
“氧化胁迫”反映了活性氧分子的生成和生物系统清除活性氧中间体或修复损伤的能力之间的不平衡。扰乱细胞正常的氧化还原状态会导致产生过氧化氢和自由基的毒性效应，过氧化氢和自由基能够损害包括蛋白、脂质和DNA在内的细胞组成部件。
下面的例子描述一些代表性的方法或技术用于模拟干旱条件和/或评估耐旱性；模拟氧化条件。
本领域的技术人员也可以测试模拟或者自然发生的干旱条件下的植物保持足够产量(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的产量)的能力评估耐旱性，例如，干旱条件下产生与非干旱条件下相比实质相当的产量；与对照或参照植物相比，干旱条件下产量减少较少。
本发明中涉及的参数包括与对照细胞或对照植物相比的恢复度、存活率、百草枯耐性率、基因表达水平、水分利用效率、编码蛋白的水平或活性和其他参数。“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到所关注基因，测试的植物或植物细胞可以是转基因植物或转基因植物细胞的子代，并含有上述的基因的改变。本领域技术人员很容易找到适当的对照或参照植物，当采用本发明描述的组合物或方法评估或测定转基因植物一个农艺性状或表型时。例如，但不限于下述举例：
1.改良植物的子代，所述改良植物对于重组DNA构建体、抑制DNA构建体或修饰的多核苷酸来说是半合子的，所述子代分离成包含或不包含该DNA构建体、抑制DNA构建体或修饰多核苷酸的植株：包含该重组DNA构建体、抑制DNA构建体或修饰多核苷酸的子代将通常相对于不包含该重组DNA构建体、抑制DNA构建体或修饰多核苷酸的子代来进行测量(即，不包含该重组DNA构建体、抑制DNA构建体或修饰多核苷酸的子代是对照或参照植物)。
2.重组DNA构建体、抑制DNA构建体或修饰多核苷酸的基因渗入至近交系中，例如在水稻和玉米中，或基因渗入进变种中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或品种品系进行测量(即，亲本近交系或品种品系是对照或参照植物)。
3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组DNA构建体、抑制DNA构建体或修饰的多核苷酸：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照植物或参照植物)。
4.包含重组DNA构建体、抑制DNA载建体或修饰多核苷酸的植物：该植物可以相对于这样的对照植物进行评价或测量，该对照植物不包含重组DNA构建体、抑制DNA构建体或修饰的多核苷酸，但具有与该植物相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体、抑制DNA构建体或修饰的多核苷酸的植株相比较，该核遗传物质具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性)。存在许多可用于分析、比较和表征植物遗传背景的实验室的技术；其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLPs)、随机扩增多态性DNA(RAPDs)、任何引物聚合成酶链式反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异扩增区域(SCARs)、扩增片段长度多态性和也称为微卫星的简单序列重复(SSRs)。
对照植物或对照植物细胞包括，例如：(a)相同基因型，用于遗传改变产生受测植物或细胞的，作为起始材料的野生型植物或细胞；(b)相同基因型，作为起始材料但是转入空构建体(如带有标记基因的并对目标的性状没有影响的构建体)的植物或植物细胞；(c)测试植物或植物细胞子代分离的非转化的植物或植物细胞；(d)没有暴露于可以诱导所关注基因表达的条件或刺激下的，与受测试植物或植物细胞基因组相同的植物或植物细胞；(e)特定的所关注的基因不表达情况下的，受测试的植物或者植物细胞本身。对照可以包括多种代表上述一种或多种类型的多个个体，例如，类型(c)中性状分离后非转化的材料的混合通常认为是bulk null。
本发明中，ZH11-TC和DP0158指对照植物。ZH11-TC表示通过组织培养中花11获得的水稻植株，DP0158表示转化空构建体DP0158获得水稻植株。
方法：
方法包括但不限于：修饰或改变宿主内源基因组基因或启动子的方法，改变内源多肽表达或活性的方法，提高植物耐旱性的方法，评估植物耐旱性的方法，提高植物百草枯耐受性的方法，改变植物农艺性状的方法，确定植物农艺性状变化的方法，调控植物开花时间的方法，观察和/或评估植物农艺性状的方法，和生产种子的方法。植物可以是单子叶植物或双子叶植物，例如水稻、玉米或大豆，植物也可以是向日葵、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗或高粱，种子是玉米或大豆种子，例如玉米杂交种子或玉米自交种子。
修饰或改变宿主内源基因组DNA的方法，包括改变宿主天然DNA序列或包括调控元件、编码或非编码序列的在先转基因序列。这些方法也可以用于将核酸序列靶向到基因组中改造目标识别序列。例如，本文中转基因修饰的细胞或植物是使用传统的基因工程核酸内切酶如归位核酸内切酶修饰植物基因组产生的(例如WO 2009/114321；Gao等(2010)Plant Journal 1：176-187)。其他的位点定向基因工程是通过使用锌指结构域识别偶联的限制性内切酶的限制性特点修饰内源基因(例如Urnov等(2010)Nat Rev Genet.11(9)：636-46；Shukla等(2009)Nature 459(7245)：437-41)。转录激活样(TAL)效应因子-DNA修饰酶(transcription activator-like effector-DNA modifying enzyme，TALE或TALEN)可用于基因工程修饰植物基因组，参见例如US20110145940,Cermak等(2011)Nucleic AcidsRes.39(12)和Boch等(2009)，Science 326(5959)：1509-12。植物基因组特定定点修饰也可以使用细菌II型CRISPR(成簇的规律的间隔的短回文的重复序列，clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR关联蛋白，CRISPR-associated)系统，参考例如Belhaj等(2013)，Plant Methods 9:39.CRISPR/Cas系统可以允许可定制的小的非编码RNA引导的基因组DNA靶向切割。
方法包括但不限于以下方法：
转化细胞方法包括将本发明公开的任意一个或多个分离的多核苷酸、RNAi构建体或CRISPR/Cas构建体转化细胞，其中，在特定的实施方案中，所述细胞是真核细胞，如酵母、昆虫或植物细胞；或原核细胞如细菌细胞。
产生修饰植物的方法包括转化将本发明公开的任意分离的核苷酸、重组DNA构建体、抑制DNA构建体或CRISPR/Cas构建体转化植物细胞和由转化的植物细胞再生改良的植物，其中本方法获得的改良植物和改良植物的种子可用于本发明的其他方法。
改变本发明多肽在植物细胞中表达水平的方法包括：(a)将本发明重组DNA构建体转化可再生植物细胞；和(b)由步骤(a)后可再生植物细胞再生转基因植物；和(c)使转化植物在适于重组DNA构建体表达的条件下生长，其中重组DNA构建体的表达导致转化植物中本发明多肽含量的变化。
改变本发明多肽在植物细胞中表达水平的方法包括：(a)将本发明抑制DNA构建体转化可再生植物细胞；和(b)由步骤(a)后可再生植物细胞再生转基因植物；和(c)使转化植物生长，其中抑制DNA构建体的表达导致转化植物中本发明多肽含量的变化。
改变本发明多肽在植物细胞中表达水平的方法包括：(a)将本发明CRISPR/Cas构建体转化可再生植物细胞；和(b)由步骤(a)后可再生植物细胞再生转基因植物；其中植物基因被修饰；和(c)使转化植物生长，其中转化的CRISPR/Cas构建体导致转化植物中本发明多肽含量的变化。
一种方法，所述方法中，与对照植物中野生型PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性相比，降低植物中内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性；与所述对照植物相比，所述植物显示出至少一种表型，所述表型选自增加的耐旱性、增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐性和增加的生物量；所述方法包括的遗传修饰步骤为：向包含内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸的改变，所述变化能够有效降低内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性。
一种方法，所述方法中，与对照植物中野生型MFS9多肽的表达或活性相比，降低植物中内源MFS9多肽的表达或活性；与所述对照植物相比，所述植物显示出至少一种表型，所述表型选自增加的耐旱性、增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐性和增加的生物量；所述方法包括步骤为：向包含内源MFS9基因和其启动子的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸的改变，所述变化能够有效降低内源MFS9多肽的表达或活性。
一种提高植物耐旱性和/或百草枯耐性的方法，其包括：(a)使用一个抑制DNA构建体转化可再生植物细胞，其中所述抑制DNA构建体至少一个调控元件(例如，植物中有功能的启动子)和与其可操作连接的至少100bp连续碱基对，所述至少100bp连续碱基对源自(i)一个多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、7％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，(ii)核酸序列(a)(i)的全长互补序列；(b)获得所述转基因植物的子代植物，所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体，且，与对照植物相比，所述子代植物显示出提高的耐旱性和/或百草枯耐性。
一种提高植物耐旱性和/或百草枯耐性的方法，其包括：(a)使用一个抑制DNA构建体转化可再生植物细胞，其中所述抑制DNA构建体至少一个调控元件(例如，植物中有功能的启动子)和与其可操作连接的至少100bp连续碱基对，所述至少100bp连续碱基对源自(i)一个多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、7％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，(ii)核酸序列(a)(i)的全长互补序列；(b)获得所述转基因植物的子代植物，所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体，且，与对照植物相比，所述子代植物显示出提高的耐旱性和/或百草枯耐性。
一种提高植物耐旱性和/或百草枯耐性的方法，其包括：(a)使用一个抑制DNA构建体转化可再生植物细胞，其中所述抑制DNA构建体至少一个调控元件(例如，植物中有功能的启动子)和与其可操作连接的(i)核苷酸序列为SEQ ID NO：45、46、47、48、49或50的多核苷酸，或(ii)核酸序列(a)(i)的全长互补序列；(b)获得所述转基因植物的子代植物，所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体，且，与对照植物相比，所述子代植物显示出提高的耐旱性和/或百草枯耐性。
一种提高植物耐旱性和/或百草枯耐性的方法，其包括(a)使用一个CRISPR/Cas载体转化植物可再生细胞，所述CRISPR/Cas载体一个编码Cas9酶的多核苷酸、一个编码核定位信号的多核苷酸、至少一个异源调控元件和与其可操作连接的gRNA，所述gRNA靶向包含内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因或其调控元件的靶基因组区域；(b)获得所述修饰植物的子代植物，所述子代植物在其基因组中包含修饰的PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因或启动子，且，与对照植物相比，所述子代植物显示出提高的耐旱性。
一种提高植物耐旱性和/或百草枯耐性的方法，其包括(a)使用一个CRISPR/Cas载体转化植物可再生细胞，所述CRISPR/Cas载体一个编码Cas9酶的多核苷酸、一个编码核定位信号的多核苷酸、至少一个异源调控元件和与其可操作连接的gRNA，其中所述gRNA靶向SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、86、87、88、89、90或91；(b)获得所述修饰植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含修饰的PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因或启动子，且，与对照植物相比，所述子代植物显示出提高的耐旱性。
一种评价植物耐旱性的方法，其包括(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含一个抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包括至少一个调控元件(例如，植物中有功能的启动子)和与其可操作连接的至少100bp连续碱基对，所述至少100bp连续碱基对源自(i)一个多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、7％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，(ii)核酸序列(a)(i)的全长互补序列；(b)获得所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体；和(c)与对照植物相比，评价所述子代植物的耐旱性。
一种评价植物耐旱性的方法，其包括(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含一个抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包括至少一个调控元件(例如，植物中有功能的启动子)和与其可操作连接的序列为SEQ ID NO：45、46、47、48、49或50的多核苷酸，(ii)核酸序列(a)(i)的全长互补序列；(b)获得所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体；和(c)与对照植物相比，评价所述子代植物的耐旱性。
一种确定植物农艺性状变化的方法，其包括(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含一个抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包括至少一个调控元件(例如，植物中有功能的启动子)和与其可操作连接的多核苷酸，所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、7％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；(b)获得所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体；和(c)与对照植物相比，尤其是水分限制条件下，确定子代植物是否显示出至少一个农艺性状的变化。
生产种子的方法包括前述的任一方法，进一步还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含抑制DNA构建体或修饰的PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因或启动子。
在前述任一的方法或本文其他实施方案披露的任意方法中，所述引入步骤中所述再生植物细胞可包括愈伤细胞、胚胎愈伤细胞、配子细胞、分生细胞、或不成熟的胚胎细胞。可再生植物细胞可源于自交玉米植株或水稻。
在前述任一方法或本文披露的其他实施方案中的任一方法中，所述再生步骤可包括：(i)在含有胚促激素培养基上培养所述转化的植物细胞直至长出愈伤组织；(ii)将步骤(i)所述的转化植物细胞转移至含有组织促激素的第一培养基上；和(iii)将步骤(ii)所述转化植物细胞接种到第二培养基上，使其茎伸长、根发育或两者均发育。
在前述任一方法或本发明的其他实施方案的方法中，确定修饰植物农艺性状的变化的步骤，如果可行，可包括在可变的环境条件下，确定与不含有重组DNA构建体的对照植物或野生型植物相比，修饰植物是否表现出至少一个农艺性状的变化。
在前述任一方法或者本发明其他实施方案的任一方法中，如果可能，确定子代植物农艺性状变化的步骤包括可变的环境条件下，与不含有重组DNA构建体的对照植物或野生型植物相比，确定所述子代植物是否表现出至少一个农艺性状的变化。
在前述任一方法或者本发明其他实施方案的任一方法中，与对照植物相比，植物在水分限制条件下表现出至少一个农艺性状的变化。
在前述任一方法或者本发明其他实施方案的任一方法中，存在将重组DNA构建体导入可再生植物的供选方案，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列，例如可以将一个调控序列(如一个或多个增强子、任选的转座子元件的一部分)导入可再生植物细胞，接着筛选带有调控序列和与其可操作连接的编码本发明多肽的内源基因的转基因事件。
可以通过任何适当的技术将本发明的重组DNA构建体、抑制DNA构建体或CRSIPR/Cas构建体导入植物中，所述技术包括但不限于直接DNA吸收、化学药品处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、基因枪轰击或农杆菌的转化。植物转化和再生的技术在国际专利公开号WO 2009/006276中描述，其全部内容并入作为参考。
本领域的技术人员熟悉将编码期望多肽的外源基因转化植物和培育再生植物的方法。再生植物可以自花授粉产生纯合子转基因植物，或者将再生植物的花粉与种子长出的农艺重要的植物杂交，或者农艺重要的植物的花粉与再生的转基因植物杂交。本领域的技术人员熟知培育本文披露的含有期望多肽的转基因植物的方法。
实施例
本文的具体实施进一步在下列实例中示明。在这些实例中，除非特别说明，采用摄氏/公制。在这些实例中，仅用举例说明具体的实施过程。通过上述讨论和具体事例，本领域的专业人员可以查明本发明的基本特征，经过各种改变和修改将本发明应用于各种用途和条件，并不偏离本发明主体和范围。因此，除了本专利表述和讨论的各种修改外，本领域内的专业人员所做的不偏离本发明主题的修改也将落入本专利的权力要求范围内。
实施例1.敏旱基因的克隆和构建体构建
基于水稻激活标签突变体库初步筛选的结果和表2展示的基因ID序列信息，设计引物，克隆水稻敏旱基因OsPRP1、OsPP2C64、OsOPPL1、OsMFS9、OsLAO1和OsDN-DSP1。引物序列和扩增基因片段的长度如表3所示。
以中花11号水稻叶、茎和根混合的cDNA库为模板克隆OsPP2C64；以ZH11水稻基因组DNA库为模板克隆OsPRP1、OsOPPL1、OsMFS9、OsLAO1和OsDN-DSP1的gDNA。PCR反应混合液和PCR程序如表4和5所示。
表2.水稻基因名称、基因ID(TIGR)和构建体ID
基因名称 LOC ID 构建体ID
OsPRP1 LOC_Os01g57004.1 DP0086
OsPP2C64 LOC_Os07g37890.1 DP0297
OsOPPL1 LOC_Os02g51770 DP0328
OsMFS9 LOC_Os03g02380 DP0343
OsLAO1 LOC_Os07g02810.1 DP0451
OsDN-DSP1 LOC_Os02g57210.1 DP0505
表3.克隆水稻敏旱基因的引物
表4.克隆敏旱基因的PCR反应混合液
表5.PCR循环状况
PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳分离后采用柱式试剂盒回收，并与TA克隆载体连接。通过测序确定PCR产物的核酸序列和在构建体中的方向，然后将基因克隆到植物双元载体DP0158(pCAMBIA1300-DsRed，SEQ ID NO:1)中。
DP0086构建体中克隆的核苷酸序列和OsPRP1的编码序列如SEQ ID NO：2和3所示，OsPRP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；DP0297构建体中克隆的核苷酸序列和OsPP2C64的编码序列如SEQ ID NO：5和6所示，OsPP2C64的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；DP0328构建体中克隆的核苷酸序列和OsOPPL1的编码序列如SEQ ID NO：8和9所示，OsOPPL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；DP0343构建体中克隆的核苷酸序列和OsMFS9的编码序列如SEQID NO：11和12所示，OsMFS9的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；DP0451构建体中克隆的核苷酸序列和OsLAO1的编码序列如SEQ ID NO：14和15所示，OsLAO1的氨基酸序列如SEQ IDNO：16所示；和DP0505构建体中克隆的核苷酸序列和OsDN-DSP1的编码序列如SEQ ID NO：17和18所示，OsDN-DSP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
实施例2.转化获得转基因水稻
过表达构建体和空载体(DP0158)采用林拥军和张启发((2005)Plant CellRep.23：540-547)描述的农杆菌介导的方法转化入中花11号水稻。中花11号水稻为中国农业科学院作物研究所培育的品种，第一批种子由北京未名凯拓农业生物公司提供。转化实验室获得的T0代转基因幼苗移栽至田间水田中获得T1种子，T1和T2代种子储藏在4℃冷库中。过表达构建体含有DsRED和HYG基因，T1和T2代种子在绿色荧光灯下发红色荧光的为转基因种子，并用于下列性状验证试验。
实施例3.基因表达分析
采用标准的实时RT-PCR程序诸如源于的反转录试剂盒和实时RT-PCR(SYBRRPremix Ex TaqTM,宝生物)分析转基因水稻植株中基因的表达水平。EF1α基因用作内参显示转基因水稻和对照植物的扩增和上样量类似。以EF1αmRNA水平为参照确定基因表达量。
实时PCR分析测定了不同转基因水稻株系叶片中OsPRP1基因的相对表达水平,ZH11-TC叶片中基因的表达水平设置为1.00，其它转基因株系中OsPRP1基因表达水平与对照ZH11-TC相比,浮动范围在8-2954倍之间。ZH11-TC为组织培养获得的ZH11，DP0158代表转空构建体DP0158的ZH11。OsPRP1基因实时RT-PCR分析的引物如：SEQ ID NO：32和33所示。
DP0086-F1：5'-TGATCGTAGGTACGGCTACTC-3'(SEQ ID NO：32)
DP0086-R1：5'-AGCAAGGCATCCTTCGAG-3'(SEQ ID NO：33)
实时PCR分析测定了不同转基因水稻株系叶片中OsPP2C64基因的相对表达水平,ZH11-TC叶片中基因的表达水平设置为1.00，其它转基因株系中OsPP2C64基因表达水平与对照ZH11-TC相比,浮动范围在2-113倍之间。OsPP2C64基因在多数转基因株系中过量表达，实时RT-PCR分析的引物如下所示：
DP0297-F1：5'-TCACAGTTAGGACAGTTGCAG-3'(SEQ ID NO：34)
DP0297-R1：5'-CCTAGGAAGCTGAACAAGTGAG-3'(SEQ ID NO：35)
实时PCR分析测定了不同转基因水稻株系叶片中OsOPPL1基因的相对表达水平,ZH11-TC叶片中基因的表达水平设置为1.00，其它转基因株系中OsOPPL1基因表达水平与对照ZH11-TC相比,浮动范围在3-78倍之间。OsOPPL1基因在多数转基因株系中过量表达，实时RT-PCR分析的引物如下所示：
DP0328-F1：5'-CTAGATGCCGACCTGTTGAG-3'(SEQ ID NO：36)
DP0328-R1：5'-CTTGGAAGGATAGACGAAACCC-3'(SEQ ID NO：37)
实时PCR分析测定了不同转基因水稻株系叶片中OsMFS9基因的相对表达水平,ZH11-TC叶片中基因的表达水平设置为1.00，其它转基因株系中OsMFS9基因表达水平与对照ZH11-TC相比,浮动范围在16-618倍之间。OsMFS9基因在所有测定的转基因株系中过量表达。
DP0343-F1：5'-GGAGGTAGCATCTCATTTGGAG-3'(SEQ ID NO：38)
DP0343-R1：5'-GCCAGAATATGCCAACGC-3'(SEQ ID NO：39)
实时PCR分析测定了不同转基因水稻株系叶片中OsLAO1基因的相对表达水平,ZH11-TC叶片中基因的表达水平设置为1.00，其它转基因株系中OsLAO1基因表达水平与对照ZH11-TC相比,浮动范围在3246-12946倍之间。实时RT-PCR分析的引物如下所示：
DP0451-F1：5'-GGCAATCTTGGTGTCATTGG-3'(SEQ ID NO：40)
DP0451-R1：5'-GTCGGGATACTGTACTCATTGG-3'(SEQ ID NO：41)
实时PCR分析测定了不同转基因水稻株系叶片中OsDN-DSP1基因的相对表达水平,ZH11-TC叶片中基因的表达水平设置为1.00，其它转基因株系中OsDN-DSP1基因表达水平与对照ZH11-TC相比,浮动范围在225-474倍之间。实时RT-PCR分析的引物如下所示：
DP0505-F1：5'-GGCACCATCTCGTCTTCG-3'(SEQ ID NO：42)
DP0505-R1：5'-CCTCCACCTTCTCCACCTC-3'(SEQ ID NO：43)
实施例4.转基因水稻植株的田间干旱试验
开花期干旱胁迫是农业生产中严重的问题。转基因水稻植株在田间干旱条件下进行验证。
方法：
田间干旱试验中，每个基因构建体选择9-12个转基因株系进行验证。T2代转基因种子和对照种子采用800ppm多菌灵在32℃消毒8h，蒸馏水清洗3～5次后，32℃浸种16h，然后在35-37℃培养箱萌发18h。萌发的种子种植在田间苗床上，三叶期时，将水稻幼苗移栽到田间试验地，设置四个重复，每个重复每转基因株系10棵苗，并将四个重复种植在同一地块。同一地块中，邻近种植转基因株系种植的ZH11-TC和DP0158用作统计分析中的对照。
水稻苗期正常管理，并使用相应的杀虫剂和化肥，幼穗期停止浇水，因此开花期时产生干旱胁迫，干旱时间长短取决于温度和湿度等天气条件。干旱期间，使用TDR30(Spectrum Technologies，Inc.)在每块地的10个位点每四天测定土壤相对含水量。
试验过程中，观察并记录植株表型，植株的表型主要包括抽穗期、卷叶程度、敏旱性和抗旱性，尤其关注中午时植株的卷叶程度。收获时，每个株系在每行中间挑选约6株具有代表性的植株，并称量每株水稻籽粒的重量，利用混合线性模型(mixed linear model)对籽粒重量进行统计分析。P＜0.1时，认为转基因株系为阳性株系，基因具有提高耐旱性功能。
田间干旱试验结果：
1)OsPRP1过量表达转基因水稻(DP0086)的田间DRT(干旱耐性)验证试验结果
第一次试验中，12个OsPRP1转基因水稻株系在海南省进行验证，ZH11-TC和DP0158(空载体对照)水稻植株临近种植用作对照。在主茎穗幼穗分化4期，分蘖穗幼穗分化1期停止灌水，断水后19天，主茎穗处于幼穗分化8期，分蘖穗幼穗分化7期，水稻植株开始出现叶片卷曲的表型。在此过程中，土壤体积含水量从35％降到20％(图1)。断水后35天，水稻植株抽穗，土壤体积含水量降到10％。除转基因株系DP0086.07、DP0086.27和DP0086.36外，OsPRP1过量表达转基因水稻表现出叶片卷曲和叶绿色变浅的敏旱表型。表6为测定的单株籽粒产量，载体水平上，OsPRP1过量表达的转基因水稻的单株籽粒产量低于ZH11-TC和DP0158对照植株；转基因株系水平上，9个株系的单株籽粒产量低于ZH11-TC和DP0158对照，且其中3个株系的单株籽粒产量显著低于ZH11-TC水稻植株。这些结果表明OsPRP1转基因水稻在干旱胁迫后出现营养生长期的敏旱表型，并且，与对照相比，获得较少的单株籽粒产量。
表6.OsPRP1转基因水稻植株在田间干旱条件下籽粒产量分析(第一次试验)
第二次试验在宁夏省进行，对12个OsPRP1过表达转基因株系进行验证20％主茎穗幼穗分化2期停止灌水，开始干旱胁迫。18天后，主茎穗处于幼穗分化5期，分蘖穗处于幼穗分化4期，水稻植株开始出现叶片卷曲的胁迫表型。在此期间，土壤体积含水量从40％降到12％(图2)。断水后46天，水稻植株抽穗。干旱胁迫过程中，与ZH11-TC和DP0158水稻植株相比，9个转基因株系在营养生长期表现出敏旱表型，如叶片卷曲和叶片干枯；两个转基因株系DP0086.07和DP0086.27生长正常。转基因株系DP0086.36在成熟期表现出较好的结实率。与ZH11-TC和DP0158对照植株相比，OsPRP1过表达转基因水稻在载体水平表现出较低的单株籽粒产量。如表7所示，10个OsPRP1过表达转基因株系的单株籽粒产量低于ZH11-TC对照，11个转基因株系的单株籽粒产量低于DP0158对照。这些结果进一步表明OsPRP1过表达水稻对干旱敏感，过量表达OsPRP1基因降低了开花期和抽穗期干旱胁迫后转基因水稻的单株籽粒产量。
表7.OsPRP1转基因水稻在田间干旱条件下籽粒产量分析(第二次试验)
2)OsPP2C64过表达转基因水稻(DP0297)的田间DRT验证结果
12个OsPP2C64过表达转基因水稻在海南田间进行验证，ZH11-TC和DP0158水稻植株临近种植用作对照。在主茎穗幼穗分化1期停止灌水，开始干旱胁迫；断水后17天，水稻植株开始出现叶片卷曲的表型，此时主茎穗处于幼穗分化6期。断水后29天，水稻植株开始抽穗。在主茎穗抽穗过程中，土壤体积含水量从25％降到7％(图3)。
如表8的单株籽粒产量所示，在载体水平，OsPP2C64过表达转基因水稻的单株籽粒产量低于ZH11-TC和DP0158水稻；转基因水稻株系水平上，9个转基因株系的单株籽粒产量低于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果表明OsPP2C64t过表达转基因水稻对干旱条件敏感，过量表达OsPP2C64基因降低了开花期干旱胁迫后转基因水稻的单株籽粒产量。
表8.OsPP2C64转基因水稻植株在田间干旱条件下籽粒产量分析(第一次试验)
10个OsPP2C64过表达转基因水稻株系再次在海南省进行验证。在主茎穗幼穗分化3期，分蘖穗幼穗分化1期停止灌水，断水19天后，主茎穗处于幼穗分化8期，分蘖穗处于幼穗分化6期，水稻植株开始出现叶片卷曲的胁迫后表型；断水后35天，水稻植株开始抽穗。主茎穗抽穗过程中，田间土壤含水量从35％降低到7％(图4)。干旱胁迫过程中，5个OsPP2C64转基因株系：DP0297.04、DP0297.05、DP0297.10、DP0297.14和DP0297.21，与对照相比，表现出较重的卷叶程度。
如表9所示，载体水平上，OsPP2C64过表达转基因水稻的单株籽粒产量显著低于ZH11-TC对照，并低于DP0158对照；转基因株系水平上，所有的转基因株系的单株籽粒产量低于ZH11-TC水稻植株，且8个转基因株系的单株籽粒产量低于DP0158对照。这些结果进一步表明OsPP2C64过表达转基因水稻在营养生长阶段对干旱条件敏感，过量表达OsPP2C64基因降低了开花期干旱胁迫后转基因水稻的单株籽粒产量。
表9.OsPP2C64转基因水稻植株在田间干旱条件下籽粒产量分析(第二次试验)
第三次试验显示出同样的趋势，载体水平上，OsPP2C64过表达转基因水稻的单株籽粒产量低于ZH11-TC对照，且显著低于DP0158对照；转基因株系水平上，5个转基因株系的单株籽粒产量低于ZH11-TC和DP0158对照植株(表10)。这些结果表明过量表达OsPP2C64基因导致了转基因植物的敏旱性，并降低了干旱胁迫后籽粒的产量。
表10.OsPP2C64转基因水稻植株在干旱条件下籽粒产量分析(第三次试验)
3)OsOPPL1过表达转基因水稻(DP0328)的田间DRT验证结果
第一次试验中，12个OsOPPL1转基因水稻株系在海南省进行验证。在主茎穗幼穗分化2期，分蘖穗幼穗分化尚未开始的时候停止灌水，开始干旱胁迫；23天后，主茎穗抽出，分蘖穗处于幼穗分化6期，土壤体积含水量从30％降到10％(图5)，转基因水稻植株开始出现敏旱表型如叶片卷曲。在干旱胁迫的前期，与ZH11-TC和DP0158水稻植株相比，2个OsOPPL1转基因株系DP0328.15和DP0328.48的叶片卷曲程度高。
籽粒产量的结果表明，干旱胁迫后，载体水平上，OsOPPL1转基因水稻的籽粒产量高于ZH11-TC和DP0158对照，进一步的转基因株系水平的分析表明9个转基因株系的单株籽粒产量高于ZH11-TC和DP0158对照(表11)。这些结果表明OsOPPL1转基因水稻在营养生长期是敏旱的。
表11.OsOPPL1转基因水稻植株在田间干旱条件下籽粒产量分析(第一次试验)
第二次试验在宁夏省进行，对同样的12个OsOPPL1过表达转基因株系进行验证。20％主茎穗幼穗分化2期停止灌水，开始干旱胁迫；18天后，主茎穗处于幼穗分化5期，分蘖穗处于幼穗分化4期，水稻植株开始出现叶片卷曲等胁迫后表型。抽穗过程，土壤体积含水量从47％降低至10％(图6)。8个OsOPPL1转基因株系：DP0328.13、DP0328.15、DP0328.16、DP0328.30、DP0328.32、DP0328.40、DP0328.48和DP0328.49表现出较重的叶片卷曲和较淡的叶色。载体水平上，OsOPPL1过表达转基因水稻的单株籽粒产量低于ZH11-TC对照，但高于DP0158对照；转基因株系水平上，10个OsOPPL1转基因株系的单株籽粒产量低于ZH11-TC对照(表12)。这些结果进一步表明OsOPPL1转基因水稻植株在营养阶段是敏旱的。
表12.OsOPPL1转基因水稻植株在田间干旱条件下籽粒产量分析(第二次试验)
4)OsMFS9过表达转基因水稻(DP0343)的田间DRT验证结果
第一次试验中，对12个OsMFS9过表达转基因水稻株系在海南省进行验证，ZH11-TC和DP0158水稻植株临近种植并用做对照。在主茎穗幼穗分化3期时停止灌水，开始干旱胁迫，23天后，主茎穗抽出，分蘖穗处于幼穗分化7期，水稻植株开始出现叶片卷曲的胁迫表型。在此过程中，土壤体积含水量从30％降到13％(表7)。断水后38天，水稻植株抽穗，土壤体积含水量降至6％。
表13为测定的单株籽粒产量，载体水平上，OsMFS9过表达转基因水稻的单株籽粒产量低于ZH11-TC水稻植株，但高于DP0158水稻植株；转基因株系水平上，9个转基因株系的单株籽粒产量低于ZH11-TC对照，其中5个转基因株系的单株籽粒产量显著低于ZH11-TC水稻植株。这些结果表明OsMFS9转基因水稻在干旱胁迫后是敏旱的，并降低了收获的单株籽粒产量。
表13.OsMFS9转基因水稻植株在田间干旱条件下籽粒产量分析(第一次试验)
第二次试验在宁夏省进行，对同样的12个OsMFS9过表达转基因株系进行验证。20％主茎穗幼穗分化2期停止灌水，开始干旱胁迫，18天后，主茎穗处于幼穗分化5期，分蘖穗处于幼穗分化4期，水稻植株开始出现叶片卷曲的胁破表型。在此过程中，土壤体积含水量从47％降至12％(表6)。断水后46天，水稻植株抽穗。胁迫过程中，与ZH11-TC和DP0158水稻植株相比，2个转基因株系DP0343.01和DP0343.16表现出敏旱表型，如叶片卷曲和叶片干枯。载体水平上，OsMFS9过表达转基因水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC和DP0158对照。如表14所示，8个OsMFS9转基因水稻株系的单株籽粒产量低于ZH11-TC对照。这些结果表明OsMFS9转基因水稻在营养生长阶段是敏旱的。
表14.OsMFS9转基因水稻植株在田间干旱条件下籽粒产量分析(第二次试验)
5)OsLAO1过量表达转基因水稻(DP0451)的田间DRT验证结果
第一次试验在海南省对12个OsLAO1过表达转基因株系进行验证。在主茎穗幼穗分化3期时停止灌水，开始干旱胁迫。断水后23天，主茎穗抽出，分蘖穗处于幼穗分化7期，水稻植株开始出现叶片卷曲的表型。在此过程中，土壤体积含水量从26％降至10％(图8)，断水后40天，水稻植株抽穗，土壤体积含水量降至5％。3个转基因株系DP0451.07、DP0451.08和DP0451.12表现出叶片卷曲和叶色变浅的敏旱表型。表15的单株籽粒产量表明，载体水平上，OsLAO1过表达转基因水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果表明OsLAO1过表达转基因水稻在干旱后的营养阶段表现出敏旱。
表15.OsLAO1转基因水稻植株在田间干旱条件下籽粒产量分析(第一次试验)
第二次试验在宁夏省进行，对同样的12个OsLAO1过表达转基因株系进行验证。20％主茎穗幼穗分化2期停止灌水，开始干旱胁迫；18天后，主茎穗处于幼穗分化5期，分蘖穗处于幼穗分化4期，水稻植株开始出现叶片卷曲的胁破表型。在此过程中，土壤体积含水量从45％降至12％(表9)。断水后46天，水稻植株抽穗。如表16所示，载体水平上，OsLAO1过表达转基因水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC和DP0158对照；3个OsLAO1转基因水稻株系的单株籽粒产量低于ZH11-TC对照，9个转基因株系的单株籽粒产量低于DP0158。这些结果表明OsLAO1转基因水稻可能是敏旱的。
表16.OsLAO1转基因水稻植株在田间干旱条件下籽粒产量分析(第二次试验)
6)OsDN-DSP1过表达转基因水稻(DP0505)的田间DRT验证结果
12个OsDN-DSP1转基因株系在海南省进行验证，ZH11-TC和DP0158水稻植株用作对照。在主茎穗幼穗分化4期，分蘖穗幼穗分化1期停止灌水，开始干旱胁迫。断水后19天，主茎穗幼穗分化8期，水稻植株开始出现叶片卷曲的表型。断水后37天，水稻植株开始抽穗；主茎穗抽穗过程中，土壤体积含水量从35％降至10％(图3)。与ZH11-TC和DP0158对照相比，除DP0505.05、P0505.08和DP0505.09外，OsDN-DSP1过表达转基因水稻株系卷叶程度较高且叶色较浅。
如表17单株籽粒产量所示，载体水平上，OsDN-DSP1过表达转基因水稻的单株籽粒产量显著低于ZH11-TC对照，并低于DP0158对照；转基因株系水平上，所有OsDN-DSP1过表达转基因株的单株籽粒产量低于ZH11-TC对照，8个转基因株系的单株籽粒产量低于DP0158对照。这些结果表明OsDN-DSP1过表达转基因水稻对干旱条件敏旱，过量表达OsDN-DSP1基因增加了植株在营养生长气的敏旱性，并导致降低开花期干旱胁迫后的转基因水稻的单株籽粒产量。
表17.OsDN-DSP1转基因水稻植株在田间干旱条件下的籽粒产量分析(第一次试验)
第二次验证试验在宁夏省进行，对同样的12个OsOPPL1过表达转基因株系进行验证。20％主茎穗幼穗分化2期停止灌水，开始干旱胁迫，18天后，主茎穗处于幼穗分化5期，分蘖穗处于幼穗分化4期。抽穗过程中，土壤体积含水量从45％降至10％(图9)，水稻植株出现胁迫后表型，与第一次试验相同，胁迫过程中，同样的9个OsDN-DSP1过表达转基因株系表现出较重的卷叶程度和较浅的叶色。籽粒产量分析表明，载体水平上，OsDN-DSP1过表达转基因水稻的单株籽粒产量显著低于ZH11-TC对照，单略高于DP0158对照；转基因株系水平上，所有12个转基因株系的单株籽粒产量显著低于ZH11-TC对照，6个转基因株系的单株籽粒产量低于DP0158对照(表18)这些结果进一步表明OsDN-DSP1过表达转基因水稻植株在营养阶段是敏旱的，过量表达OsDN-DSP1基因降低干旱胁迫后单株籽粒产量。
表18.OsDN-DSP1转基因水稻植株在田间干旱条件下籽粒产量分析(第二次试验)
实施例5.转基因水稻的温室干旱验证
转基因水稻幼苗的耐旱性筛选试验在温室中进行。温室中设置比例为1:1的钠灯和金属卤化物灯作为光源，光照/黑暗时间为16h/8h，光源设置在苗床上部大约1.5m处，晴天时，高于苗床30cm处的光强度为10,000-20,000lx，阴天时为6,000-10,000lx；温室相对湿度为30％-90％，温度为20-35℃。
干旱验证方法：
T2转基因种子和对照种子首先采用800ppm的多菌灵在32℃消毒8h，然后使用蒸馏水冲洗3～5次，然后32℃浸种16h，在35-37℃培养箱中萌发18h。萌发的种子种植在装有有机质、蛭石和沙子(V:V:V＝3:3:2)的托盘中。幼苗在正常的温室条件下生长，并浇灌改良的IRRI溶液，当幼苗生长到3-叶期时，停止浇水，并将水稻幼苗放置在干燥的位置，直至水稻叶片变干和卷曲(大约9～15天，根据季节不同)，然后再将托盘放在水槽中使水稻苗复水5-7天，并计算恢复程度。应用以下的打分系统：大于半个绿茎＝1，大于2/3的绿叶＝1，大于1/3绿叶并低于2/3绿叶＝0.5，低于1/3绿叶＝0.2，零绿叶或绿茎＝0。恢复度是绿色组织得分的总和，数据利用混合模型(Mixed Model)进行统计分析，表现显著优于对照的水稻株系被认为是阳性株系(P＜0.05)。存活率指存活株数除以总株数的百分数，是干旱验证的一个指标。
随机区组设计用于从载体水平对转基因水稻进行耐旱性或敏旱性的验证，组织培养获得的Zhonghua 11，即ZH11-TC，和空载体转基因水稻对照(DP0158)用作对照。每个构建体选择9～12个转基因株系，种植在同一试验单元中，采用混合模型(Mixed Model)考虑载体、株系和环境效应来评估基因的功能。如果转基因水稻的存活率或恢复度显著高于或低于对照(P＜0.05)，则认为测试的基因具有耐旱性的功能或者是敏旱的。
温室干旱试验结果：
1)OsPRP1过表达转基因水稻(DP0086)的温室DRT验证结果
第一次试验中，选择9个OsPRP1过表达转基因株系进行验证，并设置两个重复。当水稻长到三叶期时，将水稻植株放置在干燥的位置，17天后，水稻叶片卷曲并开始干枯，然后将这些水稻植株放置在水中恢复5天，测定植物的存活率和恢复度。表19表明，在载体水平，OsPRP1过表达转基因水稻的存活率低于ZH11-TC和DP0158对照，恢复度显著低于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平，7个OsPRP1过表达转基因株系的存活率低于ZH11-TC和DP0158对照，且其中6个转基因株系的恢复度显著低于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果表明OsPRP1过表达转基因水稻是敏旱的。
表19.OsPRP1转基因水稻植株在温室条件下耐旱性试验(第一次试验)
第二次试验对同样的9个转基因株系进行验证。当水稻幼苗长至三叶期时，首先将水稻植株放置在干燥的位置干旱胁迫20天，在水中恢复5天；然后再将水稻植株干旱胁迫17天，水中恢复5天后，计算恢复度。如表20所示，108株OsPRP1过表达转基因水稻中，52株存活。载体水平上，OsPRP1过表达转基因水稻的存活率和恢复度低于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平的分析表明，8个转基因株系的存活率低于ZH11-TC和DP0158对照，且其中7个转基因株系的恢复度低于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果进一步表明OsPRP1过表达转基因水稻是敏旱的，过量表达OsPRP1基因导致了植物的敏旱性。
表20.OsPRP1转基因水稻植株在温室条件下耐旱性试验(第二次试验)
2)OsPP2C64过表达转基因水稻(DP0297)的温室DRT验证结果
对9个OsPP2C64过表达转基因株系进行了验证，当水稻长到三叶期时，将水稻植株放置在干燥的位置，16天后，将这些水稻植株放置在水中恢复6天。表21表明，在载体水平，OsPP2C64过表达转基因水稻的存活率和恢复度低于ZH11-TC对照，但高于DP0158对照，恢复度显著低于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平，5个OsPP2C64过表达转基因株系的存活率低于ZH11-TC对照，恢复度显著低于ZH11-TC对照和DP0158对照。这些结果表明OsPP2C64过表达转基因水稻对干旱条件敏感。
表21.OsPP2C64转基因水稻植株在田间干旱条件下耐旱性试验
3)OsOPPL1过表达转基因水稻(DP0328)的温室DRT验证结果
对9个OsOPPL1过表达转基因株系进行验证，设置两个重复。当植株生长到3-叶期时，断水20天，然后水稻植株在水中恢复7天。如表22所示，载体水平上，OsOPPL1过表达转基因水稻的存活率和恢复度均低于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平上，6个OsOPPL1过表达转基因株系的存活率和恢复度低于两个对照。这些结果表明OsOPPL1过表达转基因水稻在苗期对干旱条件敏旱。
表22.OsOPPL1转基因水稻植株在温室条件下耐旱性试验(第一次试验)
第二次试验中，水稻植株干旱胁迫约42天，然后在水中恢复5天。如表23所示，载体水平上，OsOPPL1过表达转基因水稻的存活率和恢复度低于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平的分析表明OsOPPL1过表达转基因株系、ZH11-TC和DP0158的差别没有达到显著水平。这些结果进一步表明OsOPPL1过表达转基因水稻在苗期不耐旱。
表23.OsOPPL1转基因水稻植株在温室条件下的耐旱性试验(第二次试验)
4)OsMFS9过表达转基因水稻(DP0343)的温室DRT验证结果
对9个OsMFS9过表达转基因水稻株系进行验证。当水稻植株生长到3-叶期时，将水稻植株放置在干燥的地方，16天不浇水，然后将水稻植株放置在水中恢复7天。表24表明，载体水平上，OsMFS9过表达转基因水稻的存活率和恢复度低于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平上，6个转基因株系的存活率低于ZH11-TC和DP0158对照，8个转基因株系的恢复度低于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果表明OsMFS9过表达转基因水稻在苗期对干旱条件敏感。
表24.OsMFS9转基因水稻植株在温室条件下的耐旱性试验
5)OsLAO1过表达转基因水稻(DP0451)的温室DRT验证结果
对9个OsLAO1过表达转基因株系进行验证。当水稻植株生长到3-叶期时，将植株转移到干燥的位置，16天后，再将水稻植株转移到水中恢复5天，计算恢复度。表25表明，载体水平上，OsLAO1过表达转基因水稻的存活率和恢复度较低；8个转基因株系、ZH11-TC和DP0158对照的差别没有达到显著水平。这些结果表明OsLAO1过表达转基因水稻不是耐旱性的。
表25.OsLAO1转基因水稻植株在温室条件下的耐旱性试验(第一次试验)
第二次试验中，转基因水稻、ZH11-TC和DP0158水稻植株在干旱条件下胁迫20天，然后在水中恢复5天。如表26所示，95株OsLAO1过表达转基因水稻植株中，51株存活，而24株ZH11-TC幼苗中20株存活，所有的DP0158幼苗存活。载体水平上OsLAO1过表达转基因水稻的存活率低于ZH11-TC和DP0158对照，恢复度显著低于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平的分析表明所有9个转基因株系的存活率和恢复度低于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果表明OsLAO1过表达转基因水稻植株是干旱敏感的，过量表达OsLAO1基因增加了转基因植物的敏旱性。
表26.OsLAO1转基因水稻植株在温室条件下的耐旱性试验(第二次试验)
6)OsDN-DSP1过表达转基因水稻(DP0505)的温室DRT验证结果
本次试验中，种植9个OsDN-DSP1过表达转基因水稻株系、ZH11-TC和DP0158，当植株生长到3-叶期时，将水稻植株干旱胁迫16天，然后在水中恢复5天。216株OsDN-DSP1过表达转基因水稻植株中，90株存活，而48株ZH11-TC幼苗中，43株存活，24株DP0158幼苗中17株存活。OsDN-DSP1过表达转基因水稻的存活率低于ZH11-TC和DP0158对照，恢复度显著低于ZH11-TC和DP0158对照(表27)。转基因株系水平的分析表明6个转基因株系的存活率和平均恢复度低于两个对照。这些结果表明OsDN-DSP1过表达转基因水稻对干旱条件敏感。
表27.OsDN-DSP1转基因水稻在温室条件下的耐旱性试验
实施例6.转基因水稻植株的实验室百草枯试验
百草枯(1,1-二甲基-4,4-联吡啶二氯化物)是一类叶片喷施的非选择性的吡啶除草剂，是世界范围内广泛应用一种除草剂，能够控制大量作物如玉米、水稻、大豆等中生长的杂草。在植物细胞中，百草枯主要靶向叶绿体，百草枯通过接受光系统I的电子，然后与氧气发生化学反应生成过氧化物和过氧化氢，而过氧化物和过氧化氢可以导致产生光氧化胁迫。干旱胁迫通常导致植物中产生活性氧(ROS)，有时，植物的耐旱性与增强的抗活性氧能力相关。百草枯是强有力的氧化胁迫诱导剂，能够大大的增加活性氧(ROS)的产生，同时抑制抗氧化系统活性所需的的还原物和化合物的再生。非生物胁迫增加了ROS的产生，而植物响应耐性到死亡的范围取决于胁迫力度和与其相关的ROS水平。相对较低水平的百草枯能够模拟胁迫相关的ROS产生，并用作植物胁迫生物学中胁迫耐性的标记(Hasaneen M.N.A.(2012)Herbicide-Properties,Synthesis and Control of Weeds book)。因此，进一步采用百草枯验证耐旱性的转基因水稻。
百草枯试验方法：
每个构建体的水稻选择10个转基因株系用于百草枯试验，组培中花11(ZH11-TC)和转空载体对照DP0158用作对照。T2代种子参照实施例4描述的方法消毒和萌发。百草枯试验在温度28-30℃，湿度30％的生长室中进行。萌发的种子放置在底部有孔的离心管中，采用水稻水培方法，培养5天，至一叶一心期；然后选择高度大约3.5～4cm的一致的幼苗用于百草枯试验。本实验采用随机区组设计，在同一个筛选水槽内设置5个区组；区组内包含所有测试的10个转基因株系、ZH11-TC和DP0158；区组的行列为16*12，每一行为一份测试材料，故每个转基因株系在区组内各12株，对照ZH11-TC和DP0158在区组内各3行；区组内的所有转基因株系和对照均随机排布。幼苗用终浓度为0.8μM的百草枯溶液进行处理7天，光周期为10h黑暗/14h光照，每两天更换一次溶液，在处理和更换溶液后，保证幼苗首先进入光周期的黑暗时期。处理7天后，计算绿色的幼苗。绿色没有损伤的幼苗为百草枯耐性幼苗；叶片、茎部变白褪色的幼苗为非百草枯耐性的幼苗。
耐性率是百草枯试验的一个指标，指保持绿色并显示百草枯耐性表型的幼苗数除以总幼苗数的百分数。
试验数据在载体水平(所有的转基因幼苗与对照幼苗相比)和转基因株系水平(不同的转基因株系与对照相比)进行分析，采用的统计模型为“Y～seg+line(seg)+rep+error”，随机效应为“rep”，统计方法是“ PROC GLIMMIX”。
百草枯试验结果：
1)OsPRP1过表达转基因水稻(DP0086)的百草枯验证结果
百草枯溶液处理7天后，600株OsPRP1过表达转基因幼苗中，194株保持绿色并显示出百草枯耐性表型；而180株ZH11-TC幼苗中，90株具有百草枯耐性表型；180株DP0158幼苗中，66株显示百草枯耐性表型。载体水平上，所测试的OsPRP1转基因幼苗的耐性率显著低于ZH11-TC和DP0158对照。
进一步在转基因株系水平的分析表明9个OsPRP1过表达转基因株系的百草枯耐性率低于ZH11-TC对照，6个转基因株系的百草枯耐性率低于DP0158对照(表28)。这些结果表明，OsPRP1转基因水稻在苗期不耐受百草枯溶液，OsPRP1转基因水稻是对氧化胁迫条件敏感。
表28.OsPRP1转基因水稻植株在实验室条件下的百草枯耐性试验
2)OsPP2C64过表达转基因水稻(DP0297)的百草枯验证结果
针对OsPP2C64过表达水稻，第一次试验中，在0.8μM百草枯溶液处理7天后，11％的转基因幼苗保持绿色并显示出耐旱性表型，而18％的ZH11-TC幼苗和10％的DP0158幼苗表现出百草枯耐性表型。OsPP2C64过表达转基因幼苗的百草枯耐性率显著低于ZH11-TC对照。
表29为转基因株系水平的分析，表明8个转基因株系的百草枯耐性率低于ZH11-TC对照。这些结果表明OsPP2C64过表达转基因水稻不具有百草耐性。
表29.OsPP2C64转基因水稻植株在实验室条件下的百草枯耐性试验(第一次试验)
第二次试验中，百草枯溶液处理7天后，504株OsPP2C64过表达水稻中，131株保持绿色并显示出百草枯耐性表型，而228株ZH11-TC幼苗中，99株表现出百草枯耐性，228株DP0158幼苗中，81株表现出百草枯耐性。OsPP2C64过表达转基因水稻幼苗的百草枯耐性率显著低于ZH11-TC和DP0158对照。转基因株系水平的分析表明，8个转基因株系的百草枯耐性率低于ZH11-TC和DP0158对照，其中7个转基因株系的百草枯耐性率显著低于ZH11-TC对照(表30)。这些结果进一步表明OsPP2C64过表达转基因水稻不具有百草枯耐性，过量表达OsPP2C64基因导致转基因水稻的百草枯敏感或者氧化胁迫敏感。
表30.OsPP2C64转基因水稻植株在实验室条件下的百草枯耐性试验(第二次试验)
3)OsOPPL1过量表达转基因水稻(DP0328)的百草枯验证结果
第一次试验中，百草枯溶液处理后，576株OsOPPL1过表达转基因水稻中，285株保持绿色并显示出百草枯耐性表型；而204株ZH11-TC幼苗中，75株表现出百草枯耐性表型，180株DP0158幼苗中，65株表现出百草枯耐性表型。OsOPPL1过表达转基因水稻的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。百草枯溶液处理后，与ZH11-TC或DP0158相比，OsOPPL1过表达转基因水稻长势较好。表31的转基因株系水平的分析表明，7个转基因株系的百草枯耐性率高于ZH11-TC和DP0158幼苗，这些结果表明OsOPPL1过表达转基因水稻在幼苗期载体水平或者转基因株系水平的百草枯耐性率增加。过量表达OsOPPL1基因提高了转基因植物百草枯耐性率。
表31.OsOPPL1转基因水稻在实验室条件下的百草枯耐性试验(第一次试验)
第二次试验中，百草枯溶液处理后，600株OsOPPL1过表达转基因水稻幼苗中，393株保持绿色并显示出百草枯耐性表型；而180株ZH11-TC幼苗中68显示出百草枯耐性；180株DP0158幼苗中，78株表现出百草枯耐性表性。OsOPPL1过表达转基因水稻的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。
转基因株系水平的分析表明，9个转基因株系的百草枯耐性率高于ZH11-TC和DP0158幼苗，8个转基因株系的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC对照，7个转基因株系的白草枯耐性率显著高于DP0158对照(表32)。这些结果进一步表明OsOPPL1过表达转基因水稻在苗期，无论是载体水平还是转基因株系水平，百草枯的耐性率增加了，过量表达OsOPPL1基因提高了转基因植物的百草枯耐性。
表32.OsOPPL1转基因水稻植株在实验室条件下的百草枯耐性试验(第二次试验)
4)OsLAO1过量表达转基因水稻(DP0451)的百草枯验证结果
百草枯溶液处理后，600株OsLAO1过表达转基因幼苗中，351株保持绿色，并表现出百草枯耐性表型；而180株ZH11-TC幼苗中，62株表现出百草枯耐性表型；180株DP0158幼苗中，33株表现出百草枯耐性。OsOPPL1过表达转基因幼苗的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。表33为转基因株系水平的分析，表明9个转基因株系的百草枯耐性率高于ZH11-TC和DP0158对照；7个转基因株系的百草枯耐性率显著的高。这些结果表明OsLAO1过表达转基因具有苗期百草枯耐性。
表33.OsLAO1转基因水稻植株在实验室条件下的百草枯耐性试验
5)OsDN-DSP1过量表达转基因水稻(DP0505)的百草枯验证结果
百草枯溶液处理后，600株OsDN-DSP1过表达转基因幼苗中，197株保持绿色，并表现出百草枯耐性；而180株ZH11-TC幼苗中，65株表现出百草枯的耐性表型；180株DP0158幼苗中，72株表现出百草枯耐性表型。载体水平上，OsDN-DSP1过表达转基因幼苗的百草枯耐性率低于ZH11-TC和DP0158对照，转基因株系水平的分析表明，5个转基因株系的百草枯耐性率低于ZH11-TC对照，8个转基因株系的百草枯耐性率低于DP0158对照(表34)。这些结果表明OsDN-DSP1过表达转基因水稻不仅具有百草枯耐性。
表34.OsDN-DSP1转基因水稻植株在实验室条件下的百草枯耐性试验
表7.RNAi和CRISPR/Cas9构建体的构建
为了探讨降低基因的表达量是否能够改变基因的功能，我们构建的RNAi构建体和CRISPR/Cas9构建体。
RNAi构建体的构建：
我们采用表35和36中的模板和引物扩增克隆正向cDNA片段和反向cDNA片段。随后将正向cDNA片段、内含子(SEQ ID NO：44)和反向cDNA片段连接在一起，并于TA载体连接。测序确定片段的核酸序列和其在载体中的连接方向后，将RNAi结构片段(正向cDNA-内含子-反向cDNA)克隆到植物双元载体DP0158中，获得RNAi构建体。
表35.用于构建RNAi构建体的水稻片段
表36.克隆构建RNAi构建体的片段的引物
CRISPR/Cas9构建体的构建
OsMFS9基因和其启动子的基因组编辑
根据OsMFS9基因(SEQ ID NO:11and SEQ ID NO:12)的核苷酸序列，设计靶向特定位点的gRNA序列，用于基因组编辑。表37为基因组编辑和启动子编辑OsMFS9基因的引物序列、靶位点和特定链，DP2318、DP2389和DP2410为基因组编辑的构建体，DP2409、DP2412、DP2421、DP2423和DP2508为启动子编辑构建体。DP2318和DP2389为OsMFS9基因单位点编辑的构建体，靶引物首先退火形成短双链片段，然后该片段插入载体pHSG396GW-URS-UC-mpCas9&U6-DsRed中，待确定gRNA片段的核酸序列后，将gRNA片段连接至表达载体Pcambia13000DsRed-GW-Adv.ccdB上。针对其他的两个位点编辑的构建体，不同的引物对首先退火形成双链片段，然后将两个gRNA片段叠加在一起，并插入克隆载体中，然后插入表达载体中构建DP2410、DP2409、DP2412、DP2421、DP2423和DP2508。
表37.用于构建OsMFS9基因和启动子编辑的CRISPR/Cas9构建体引物
实施例8.转化获得转基因水稻植株和基因表达分析
采用实施例2描述的方法将RNAi和CRISPR/Cas9构建体转化入水稻植株。采用实施例3的描述的方法进行基因表达分析。
实时PCR分析测定了不同OsMFS9抑制转基因水稻株系叶片中OsMFS9基因相对表达量，ZH11-TC水稻叶片中OsMFS9基因的基础表达量设为1.00，其它OsMFS9抑制转基因株系中表达量浮动在0.07-0.53之间。OsMSF9抑制转基因水稻植株中基因的表达水平低于ZH11-TC，实时PCR采用的引物如SEQ ID NO：38和39所示。
DP0343-F1：5'-GGAGGTAGCATCTCATTTGGAG-3'(SEQ ID NO：38)
DP0343-R1：5'-GCCAGAATATGCCAACGC-3'(SEQ ID NO：39)
采用引物对SEQ ID NO：38和39测定了OsMFS9启动子编辑水稻株系(DP2421)叶片中OsMFS9基因的相对表达量，ZH11-TC叶片中OsMFS9基因的相对表达量设置为1.00，启动子编辑株系中OsMFS9基因的相对表达量在0.50-0.81之间浮动，OsMFS9基因的表达量在OsMFS9启动子编辑的DP2421水稻中是降低的。
实施例9.转基因水稻植株的田间干旱试验
田间筛选T1或T2代种子验证降低基因表达是否能够提高转基因水稻的耐旱性。
田间干旱筛选的方法在实施例4中进行了描述。
筛选结果：
1)OsMFS9抑制转基因水稻(DP0687)的田间DRT验证结果
T2代OsMFS9抑制转基因株系在北京田间进行验证，ZH11-TC和DP0158水稻用作对照。在主茎穗幼穗分化2期时停止灌水，开始干旱胁迫，17天后，主茎穗处于分蘖穗幼穗分化6期，水稻植株开始出现干旱胁迫的表型；断水后31天，为避免不能收获种子，对植株再次浇水，土壤田间含水量的变化如图13所示。转基因株系DP0687.02表现出耐旱表型，DP0687.11表现出较好的结实率。载体水平上，OsMFS9转基因水稻植株获得了比DP0158显著高的单株籽粒产量(表38)；8个OsMFS9抑制转基因水稻株系的单株籽粒产量显著高于DP0158对照。
表38.OsMFS9抑制转基因水稻(DP687)植株在田间干旱条件下的籽粒产量分析(第一次试验)
OsMFS9抑制转基因水稻植株再次在海南省进行干旱验证试验。在主茎穗幼穗分化3期时停止灌水，开始干旱胁迫，23天后，主茎穗抽出，分蘖穗处于幼穗分化6期，水稻植株开始出现叶片卷曲的表型。图14为土壤体积含水量变化的图。表39表明，载体水平，OsMFS9抑制转基因水稻植株获得高于ZH11-TC和DP0158对照的单株籽粒产量；7个抑制转基因株系的单株籽粒产量高于ZH11-TC，且显著高于DP0158对照。
表39.OsMFS9抑制转基因水稻(DP687)植株在田间干旱条件下的籽粒产量分析(第二次试验)
2)OsMFS9启动子编辑水稻(DP2421)的田间DRT验证结果
OsMFS9启动子编辑的株系在海南进行验证，ZH11-TC水稻植株临近种植并用作对照。主茎穗幼穗分化3期停止灌水，开始干旱胁迫，土壤体积含水量从16％缓慢的降至6％(图12)。断水后22天，水稻植株处于抽穗期。OsMFS9启动子编辑水稻在腊熟期之前没有出现没有出现干旱胁迫的表型，四个DP2421株系：DP2421H.02A、DP2421H.10A、DP2421H.11A和DP2421.14A在成熟期表现出较好的结实率。表40表明，载体水平上，DP2421水稻的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC；转基因株系水平，6个水稻株系的单株籽粒产量高于ZH11-TC对照。
表40.T1代OsMFS9启动子编辑(DP2421)水稻植株在田间干旱条件下的籽粒产量分析
3)OsLAO1抑制转基因水稻(DP2113)的田间DRT验证结果
11个T2代OsLAO1抑制转基因水稻株系在海南省进行验证，ZH11-TC和DP0158水稻临近种植并用作对照。主茎穗幼穗分化3期停止灌水，开始干旱胁迫，土壤体积含水量从16％缓慢的降至6％(图12)。断水后50天，水稻植株主茎穗处于乳熟期，水稻植株开始出现叶片卷曲的表型。如表41所示，载体水平上，OsLAO1抑制转基因株系、ZH11-TC和DP0158对照之间的差别较小；载体水平上，6个抑制转基因株系的单株籽粒产量高于ZH11-TC和DP0158对照。
表41.T1代OsLAO1抑制转基因水稻(DP2113)植株在田间干旱条件下的籽粒产量分析
4)OsDN-DSP1抑制转基因水稻(DP2116)的田间DRT验证结果
12个T2代OsDN-DSP1抑制转基因水稻株系在海南省进行验证，ZH11-TC和DP0158水稻植株临近种植并用作对照。主茎穗幼穗分化3期停止灌水，开始干旱胁迫，土壤体积含水量从16％缓慢的降至6％(图12)。断水后50天，水稻植株主茎穗处于乳熟期，水稻植株开始出现叶片卷曲的表型。干旱胁迫后，7个抑制转基因株系DP2116.01、DP2116.03、DP2116.04、DP2116.05、DP2116.09、DP2116.10和DP2116.12表现出耐旱性表型和较好的结实率。如表42所示，载体水平上，OsDN-DSP1抑制转基因水稻获得高于ZH11-TC和DP0158的单株籽粒产量；转基因株系水平上，6个转基因株系的单株籽粒产量高于ZH11-TC和DP0158对照。
表42.T1代OsDN-DSP1抑制转基因水稻(DP2116)植株在田间干旱条件下籽粒产量分析
实施例10.评估水稻基因在玉米植株中的功能
将水稻耐敏性基因或者玉米、拟南芥或其它物种中的相应的同源基因转化或修饰玉米植株，以组成型的启动子如玉米泛素启动子(Christensen等(1989)PlantMol.Biol.12：619-632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)或诸如胁迫响应启动子或组织偏爱启动子的其它启动子驱动玉米转化构建体中基因的表达，采用微粒轰击法(国际专利公布WO 2009/006276)将构建的重组DNA构建体转化玉米，也可以以采用农杆菌介导法(Zhao等，Meth.Mol.Biol.318：315-323(2006)和Zhao等，Mol.Breed.8：323-333(2001)和美国专利号5,981,840，1999年11月9日公布)转化玉米。农杆菌介导转化的过程包括细菌的接种、共培养、静止、筛选和植株的再生。
再生植株的子代如T1代植株可以种在土壤中进行干旱胁迫，采用图像分析，测量胁迫前和干旱胁迫过程中多个时期点植株面积、体积、生长速率和叶片颜色。与对照相比，明显延迟胁迫期间植株的萎蔫，叶面积的减小，黄色素积累的减少，和/或促进生长速率的增加被认为基因提高玉米的耐旱性能。

Claims (41)

1.一种分离的多核苷酸，包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11、14或17相比，具有至少85％的一致性；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18相比，具有至少85％的一致性；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19相比，具有至少90％的序列一致性；或者(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列，其中，减少所述多核苷酸的表达增加了植物的耐旱性。
2.根据权利要求1分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括如下序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18。
3.根据权利要求1分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19。
4.一个重组DNA构建体，其包括1-3任一权利要求中分离的多核苷酸和与其可操作连接的至少一个异源调控元件。
5.一种抑制DNA构建体体，其包含至少一个异源调控元件和与其可操作连接的抑制元件，所述抑制元件包括1-3任一权利要求的多核苷酸的一个片段，所述抑制元件抑制内源靶基因的表达，所述内源靶基因序列包括SEQ ID NO：3(PRP1)、SEQ ID NO：6(PP2C64)、SEQ IDNO：9(OPPL1)、SEQ ID NO：12(MFS9)、SEQ ID NO：15(LAO1)或者SEQ ID NO：18(DN-DSP1)表示的多核苷酸区域。
6.根据权利要求5的抑制DNA构建体，所述抑制元件包括(a)核苷酸序列为SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的多核苷酸；(b)编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的多肽的核苷酸序列；或者(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。
7.根据权利要求6的抑制DNA构建体，所述抑制元件包括SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：50。
8.一种CRISPR/Cas构建体，其包含一个编码Cas9酶的多核苷酸、一个编码核定位信号的多核苷酸、至少一个异源调控元件和与其可操作连接的gRNA，所述gRNA靶向包括内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因和其调控元件的靶基因组区域，并减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性。
9.根据权利要求8的CRISPR/Cas构建体，所述gRNA靶向包含核苷酸序列为SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、86、87、88、89、90或91的多核苷酸的基因组区域。
10.一种植物，当与对照植物中野生型PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或者活性相比，所述植物中内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性降低，其中所述植物与对照植物相比，表现出至少一种下述表型：增加的耐旱性、增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐性、增加的生物量；所述植物通过下述步骤获得：(a)将抑制DNA构建体转入植物，所述抑制DNA构建体包含至少一个异源调控元件，和与其可操作连接的抑制元件，并减少序列为SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19，或与序列SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19一致性至少为95％的内源PRP1,PP2C64,OPPL1,MFS9,LAO1or DN-DSP1多肽的表达；或者(b)在包含内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因和其启动子的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或者替换一个DNA片段，或者(ii)引入一个或多个核苷酸的改变，以减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或者活性。
11.根据权利要求10的植物，所述植物含有一个抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包括至少一个调控元件和与其可操作连接的抑制元件，所述抑制元件包括至少100bp下述序列：(a)一个多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为85％；(b)一个多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的序列一致性至少为90％；或者(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列，所述植物与对照植物相比，显示出增加的耐旱性。
12.根据权利要求11的植物，所述抑制元件包括至少100bp下述序列：(a)核苷酸序列为SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的多核苷酸；(b)编码氨基酸序列为SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的多肽的多核苷酸；或者(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列，所述植物与对照植物相比，显示出增加的耐旱性。
13.根据权利要求12的植物，所述抑制元件包括核苷酸序列SEQ ID NO：45、46、47、48、49或50，所述植物与对照植物相比，显示出增加的耐旱性。
14.根据权利要求10的植物，所述植物含有突变的PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因，其中与对照植物相比，所述植物中PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的表达降低，或者PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的活性降低或者缺失，所述植物通过以下步骤获得：向包含内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段、或替换一个DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸的改变，以减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或者活性。
15.根据权利要求14的植物，所述植物通过向包含序列SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18或者与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18一致性至少为90％的序列的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，或(i)引入一个或多个核苷酸的改变获得，所述改变减少内源OsPRP1、OsPP2C64、OsOPPL1、OsMFS9、OsLAO1或OsDN-DSP1多肽的表达或者活性。
16.根据权利要求15的植物，所述突变的PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18序列一致性至少为95％。
17.根据权利要求10的植物，所述植物含有突变的PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1启动子,其中与对照植物相比，所述植物中PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的表达降低，所述植物通过向内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因上游基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸的改变获得，所述改变减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达。
18.根据权利要求17的植物，所述植物通过向包含序列SEQ ID NO：86、87、88、89、90、或91的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，(ii)引入一个或多个核苷酸的改变而产生，所述减少内源OsPRP1、OsPP2C64、OsOPPL1、OsMFS9、OsLAO1或OsDN-DSP1多肽的表达。
19.根据权利要求18的植物，所述植物中通过序列为SEQ ID NO：77的gRNA介导包含序列SEQ ID NO：86的基因组区域靶产生一个核苷酸的变化而产生，所述的改变减少了内源OsMFS9多肽的表达。
20.根据10-19任一权利要求的植物，所述植物显示出增加的非生物胁迫耐性，所述非生物胁迫是干旱胁迫。
21.根据10-19任一权利要求，所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
22.一种方法，所述方法中，与对照植物中野生型PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性相比，降低植物中内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性；与所述对照植物相比，所述植物显示出至少一种表型，所述表型选自增加的耐旱性、增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐性和增加的生物量；所述方法包括的遗传修饰步骤为：(a)向植物中转入一个抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包括至少一个异源调控元件和与其可操作连接的抑制元件，减少PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达；(b)向包含内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因和其调控元件的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸的改变，所述变化能够有效降低内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性。
23.根据权利要求22的方法，所述方法包括向植物中转入一个抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包括至少一个异源调控元件和与其可操作连接的抑制元件，减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达，其中所述抑制元件包含至少100bp连续的碱基对，所述至少100bp连续碱基对源于(a)一个多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18序列一致性至少为85％；(b)一个多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的序列一致性至少为90％；(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。
24.根据权利要求23的方法，所述抑制元件包括至少100bp连续的碱基对，所述碱基对源于(a)核苷酸序列为SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的多核苷酸，(b)编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的多核苷酸；(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。
25.根据权利要求24的方法，所述抑制元件包括SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：50的序列。
26.根据权利要求22的方法，所述方法包括向包含内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，(ii)引入一个或多个核苷酸的改变，所述变化能够有效降低内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性。
27.根据权利要求22的方法，所述方法包括向内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因上游基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸的改变，所述变化能够有效降低内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性。
28.根据权利要求26或27的方法，所述变化通过锌指核酸酶、转录激活样效应核酸酶(TALEN)、Transcription Activator-Like Effector Nuclease(TALEN),CRISPR/Cas,归巢核酸内切酶或NgAgo引入。
29.根据权利要求28的方法，其中所述变化由CRISPR/Cas系统引入。
30.一种提高植物耐旱性的方法，包括：
(a)使用载体转化可再生植物细胞降低内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性；
(b)由步骤(a)的可再生细胞再生修饰的植物；和
(c)获得源于步骤(b)修饰植物的子代植物，其中与对照植物相比，所述子代植物显示出提高的耐旱性。
31.根据权利要求30的方法，所述构建体包括至少一本调控元件和与其可操作连接的抑制元件，所述抑制元件包括源自(a)一个多核苷酸，核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为85％；(b)一个多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO：4、7、10、13、16或19的序列一致性至少为90％；(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列的至少100bp连续的碱基对，。
32.根据权利要求31的方法，所述抑制元件包括源自(a)核苷酸序列为SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的多核苷酸；(b)编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19的多核苷酸；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列的至少100bp连续碱基对。
33.根据权利要求32的方法，所述抑制元件包括核苷酸序列为SEQ ID NO：45、46、47、48、49或50的多核苷酸。
34.根据权利要求30的方法，所述载体包括一个编码Cas9酶的多核苷酸、一个编码和定位信号的多核苷酸、至少一个异源调控元件和与其可操作连接的gRNA，所述gRNA靶向包含内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因或其调控元件的靶基因组区域，以减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性。
35.根据权利要求34的方法，所述gRNA靶向序列SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、86、87、88、89、90或91以减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性。
36.根据权利要求37的方法，所述gRNA包括核苷酸序列SEQ ID NO：77和79，靶向位点位于水稻基因组染色体3的842668-842698之间，其中启动子编辑产生的结果为在水稻基因组染色体3的842668-842698之间产生1个碱基的插入，并减少OsMFS9基因的表达。
37.一种提高水稻植株籽粒产量的方法，所述方法中，与对照植物相比，所述植物在胁迫条件下显示出提高的籽粒产量，所述方法包括的步骤为减少水稻植株中内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因或异源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的表达。
38.一种鉴定水稻植株群体中与提高籽粒产量相关一个或多个等位基因的方法，所述方法包括的步骤为：
(a)检测水稻植株群体中一个或多个多态性，所述多态性位于(i)编码一个多肽的基因组区域，或(ii)调控(i)中多肽表达的调控区域，所述多肽包括的氨基酸序列选自SEQ IDNO：4、7、10、13、16或19，或与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19一致性至少为90％的氨基酸序列，所述位于多肽编码基因组区域或多肽表达调控区域的一个或多个多态性与籽粒产量相关；和
(b)鉴定位于一个或多个多态性中的的一个或多个等位基因，所述等位基因与提高籽粒产量相关。
39.根据权利要求38的方法，所述一个或多个提高籽粒产量相关的等位基因用于分子标记辅助筛选提高籽粒产量的水稻植株。
40.根据权利要求38的方法所述一个或多个多态性位于多肽的编码区。
41.根据权利要求38的方法，所述调控区域是启动子。
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