CN112980869A

CN112980869A - Pp2cg1基因在调控拟南芥耐低温胁迫中的应用

Info

Publication number: CN112980869A
Application number: CN201911277169.0A
Authority: CN
Inventors: 杨淑华; 吕健; 张晓燕
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2021-06-18

Abstract

本发明涉及PP2CG1基因在调控拟南芥耐低温胁迫中的应用。本发明首次揭示了PP2CG1基因具有调控拟南芥耐低温胁迫的能力，将PP2CG1基因在拟南芥中敲除，得到的突变体植物相较野生型拟南芥表现出显著的耐低温表型。因此，PP2CG1基因与拟南芥抗低温相关。本发明为培育耐低温植物新品种提供了宝贵基因资源。本发明还提供了植物蛋白磷酸酶基因PP2CG1的CRISPR/Cas9突变体材料，敲除PP2CG1基因后，植物表现为耐低温的表型。本发明的突变体材料为培育耐低温胁迫植物提供了新的种质资源，同时为研究植物应答低温胁迫的机制和抵御不利环境的分子机理奠定理论基础。

Description

PP2CG1基因在调控拟南芥耐低温胁迫中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程和植物遗传育种领域，具体地说，涉及PP2CG1基因在调控拟南芥耐低温胁迫中的应用。

背景技术

低温寒害是一种全球性的自然灾害，不仅限制植物的地理分布，还会抑制植物的生长发育，导致植物减产甚至死亡。因此，研究植物对低温耐受性的分子机制，对培育抗寒稳产的粮食植物新品种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供PP2CG1基因在调控拟南芥耐低温胁迫中的应用。

本发明构思如下：利用模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)，通过CRISPR/Cas9技术将蛋白磷酸酶基因PP2CG1通过农杆菌介导的转基因技术获得敲除该基因的株系，随后又将转基因株系中的外源Cas9基因分离出植物体内得到非转基因的pp2cg1-crispr拟南芥纯合突变体株系。经过一系列低温处理实验验证了该突变体植株耐受低温的表型。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供PP2CG1基因在调控拟南芥耐低温胁迫中的应用。其中，所述调控为负调控。

本发明中，PP2CG1基因来源于哥伦比亚生态型的拟南芥，在拟南芥基因组数据库中的编号为At2g33700。PP2CG1基因具有如SEQ ID NO:所示的核苷酸序列，由1585个碱基组成，PP2CG1基因的读码框为自5’端第1-184位、第272-464位、第615-819位和第1025-1582碱基组成的外显子拼接组成。其编码拟南芥PP2C蛋白磷酸酶。

PP2CG1基因为编码如下蛋白磷酸酶(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

第二方面，本发明提供一种提高拟南芥耐冷性的方法，所述方法包括：利用基因工程手段，对拟南芥PP2CG1基因进行定点突变，使得该基因功能缺失，从而提高拟南芥的耐冷性；或者，

通过敲除或降低拟南芥PP2CG1基因的表达，从而提高拟南芥的耐冷性。

进一步地，针对拟南芥中的目标基因PP2CG1设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化拟南芥，实现对拟南芥基因PP2CG1的定点突变，进而获得该基因功能缺失的转基因拟南芥植株。

优选地，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-CACTGCTTGTGAGGTGCCT-3’和5’-CACAAGCAGTGCTACTAGG-3’(SEQ ID NO:9-10)。

将本发明的PP2CG1基因敲除后，植物表现为耐低温的表型。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可以对所使用的载体进行改造，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。

第三方面，本发明提供根据上述方法获得的拟南芥在植物育种中的应用。

前述的应用，育种目的是选育耐低温型植物。育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

第四方面，本发明提供PP2CG1基因打靶载体，所述打靶载体是以拟南芥PP2CG1基因为靶点设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中构建得到的。

第五方面，本发明提供靶向编辑PP2CG1基因的CRISPR/Cas9系统在提高拟南芥耐冷性中的应用。

第六方面，本发明提供用于扩增PP2CG1基因的引物对。序列如下(SEQ ID NO:3-4)：

上游引物：5’-atgagtatggatttttcac-3’

下游引物：5’-tcacggatagccatcgagcacgc-3’

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次揭示了PP2CG1基因具有调控拟南芥耐低温胁迫的能力，将PP2CG1基因在拟南芥中敲除，所获得的突变体植物相较野生型拟南芥表现出显著的耐低温表型。因此，PP2CG1基因与拟南芥抗低温相关。本发明为培育耐低温植物新品种提供了宝贵基因资源，本发明还提供了植物蛋白磷酸酶基因PP2CG1的CRISPR/Cas9突变体材料，敲除PP2CG1基因后，植物表现为耐低温的表型。本发明的突变体材料为培育耐低温胁迫植物提供了新的种质资源，同时为研究植物应答低温胁迫的机制和抵御不利环境的分子机理奠定理论基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中CRISPR/Cas9株系中PP2CG1基因的测序检测结果。

图2为本发明实施例2中pp2cg1-crispr非冷驯化和冷驯化后低温处理植株恢复情况。

图3为本发明实施例2中pp2cg1-crispr非冷驯化和冷驯化后低温处理植株成活率和离子渗漏率统计情况。

图4为本发明实施例3中sgRNA1和sgRNA2的打靶效率比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的pcbc-DT1T2载体和pHEE401E载体由中国农业大学陈其军教授惠赠(参见Egg cell-specific promoter-controlled CRISPR/Cas9 efficientlygenerates homozygous mutants for multiple target genes in Arabidopsis in asingle generation；Zhi-Ping

Hui-Li

Li Dong,Hai-Yan Zhang,Chun-Yan Han,Xue-Chen Wang and Qi-Jun Chen；DOI 10.1186/s13059-015-0715-0)。拟南芥品种为哥伦比亚生态型。

以下实施例中使用的主要试剂如下：各种限制性内切酶、Taq酶、T4连接酶、KOD等购自TAKARA(大连)、NEB、Toyobo等生物公司；dNTPs购自Genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程公司；MS培养基，琼脂粉，琼脂糖，氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、硫酸庆大霉素(Gen)、利福平(Rif)等抗生素及LB Medium等购自Sigma公司；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。

实施例中所使用的引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，并由上海美吉生物医药科技有限公司进行相关测序。

实施例1 PP2CG1基因CRISPR敲除植株的构建与筛选

为全面了解PP2C蛋白对植物抗逆能力的影响，从拟南芥属拟南芥(Arabidopsisthaliana(L.)HEYNH.)中敲除编码植物蛋白磷酸酶的基因PP2CG1。首先通过网站CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)筛选靶点序列5’-CACTGCTTGTGAGGTGCCT-3’和5’-CACAAGCAGTGCTACTAGG-3’，然后参照文献(Egg cell-specific promoter-controlledCRISPR/Cas9 efficiently generates homozygous mutants for multiple targetgenes in Arabidopsis in a single generation；Zhi-Ping

Hui-Li

LiDong,Hai-Yan Zhang,Chun-Yan Han,Xue-Chen Wang and Qi-Jun Chen；DOI 10.1186/s13059-015-0715-0)中的方法，在靶点序列前后添加上接头序列，作为引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

所用引物如下(SEQ ID NO:5-8)：

上游引物：

5’-atatatggtctcgattgCACTGCTTGTGAGGTGCCTgtt-3’

5’-tgCACTGCTTGTGAGGTGCCTgttttagagctagaaatagc-3’

下游引物：

5’-aacCACAAGCAGTGCTACTAGGcaatctcttagtcgactctac-3’

5’-attattggtctcgaaacCACAAGCAGTGCTACTAGGc-3’

以pCBC-DT1T2为模板，用合成的引物进行PCR扩增，得到阳性条带后将其回收于25μL的TE缓冲液中。将2μL的回收产物、2μL的pHEE401E载体、1.5μL的T4连接酶缓冲液(NEB公司)、1μL的T4连接酶(NEB公司)、1.5μL的BSA(TAKARA公司)、1μL的Bsa I内切酶(NEB公司)、6μL的超纯水充分混匀，然后放入PCR仪按照37℃5h，50℃5min，80℃10min的程序进行反应。将反应后的产物通过热激法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，加入600μL的无抗性LB液体培养基，在37℃摇床中培养40min，将菌液均匀的涂到含有50mg/mL卡那霉素的LB固体培养基上并放入37℃烘箱培养16h。

通过菌落PCR鉴定阳性克隆，提取质粒，并将质粒送至上海美吉生物医药科技有限公司测序，待测序正确后进行下一步试验。

将正确构建的载体利用电击转化法转化到农杆菌GV3101菌株中，再将含有上述载体的阳性单克隆菌转化到拟南芥野生型植株中，得到拟南芥转基因幼苗。具体方法如下：将含有上述载体的农杆菌接种于200mL LB三抗液体培养液(Kan 50mg/mL，Rif 50mg/mL，Gen50mg/mL)中，28℃振荡培养过夜OD₆₀₀至0.8-1.0；5000rpm，室温离心10min，收集菌体；用200mL转化液(1/2MS，5％蔗糖，60μL Silwet L-77)悬浮菌体，调整菌体浓度OD₆₀₀至0.8-1.0；将拟南芥花序浸泡在农杆菌的转化液中30s左右后取出，套上保鲜袋保湿并将植物置于黑暗处避光过夜，12h后将植物取出放置于光照培养架上正常生长至收种。

pHEE401E载体所携带筛选抗性基因为潮霉素，用潮霉素抗性对拟南芥转基因幼苗进行筛选结合测序获得纯合CRISPR/Cas9突变体植物。具体方法如下：将上述获得的T₁代具有潮霉素抗性的阳性苗进行测序，对CRISPR/Cas9纯合突变的阳性苗单株收种得到T₂代；对T₂代种子进行潮霉素抗性的测试，选择全部没有抗性的株系即为纯合CRISPR/Cas9突变体株系；将有抗性的株系再进行单株收种得到T₃代；对T₃代种子进行潮霉素抗性筛选，选择全部没有抗性的纯合CRISPR/Cas9突变体株系。该纯合体可以用于繁种、低温逆境处理实验。

本实验转化、筛选得到CRISPR/Cas9纯合突变体株系pp2cg1-crispr。采用测序方法检测所得CRISPR/Cas9株系中PP2CG1的敲除情况。具体方法如下：提取野生型(WT)、pp2cg1-crispr植株基因组DNA，送入上海美吉生物医药科技有限公司进行测序分析。检测结果见图1，可以看出突变体株系中由于在第一个外显子出现片段缺失造成移码突变导致翻译提前终止。

在其它植物中敲除PP2CG1基因的方法可以参考本实施例进行。

实施例2敲除PP2CG1植物与PP2CG1同源基因的T-DNA插入突变体pp2cg2的抗低温能力比较

首先使拟南芥野生型幼苗、实施例1中获得的pp2cg1-crispr株系以及从ABRC(美国俄亥俄州立大学ABRC拟南芥保藏中心)购买的PP2CG1同源基因的T-DNA插入突变体pp2cg2(Salk_100314C)在MS固体培养基上生长，共20份材料。幼苗生长14d后，将幼苗分为两组，每组10份材料。第一组，对非冷驯化(NA)的幼苗进行低温处理，程序设定为0℃至-5℃梯度降温(每小时降低1℃)，处理至-5℃运行1h后取出。第二组，将幼苗放置4℃培养箱中冷驯化48h(CA)，之后进行低温处理，与上述非冷驯化低温处理方法类似，处理温度-10℃，处理时间1h。将低温处理后的幼苗转移至4℃黑暗条件放置12h使其培养基缓慢解冻，之后在正常光照条件下培养3-4d，在此期间，低温中受伤的组织会在培养过程中黄化枯死，而能够抵抗低温伤害的组织逐渐变绿并恢复生长，拍摄照片并统计成活率(Survival Rate)，并取材进行离子渗漏率统计。离子渗漏率的统计方法可参见EGR2 phosphatase regulatesOST1 kinase activity and freezing tolerance in Arabidopsis；Yanglin Ding,JianLv,Yiting Shi,Junping Gao,Jian Hua,Chunpeng Song,Zhizhong Gong&Shuhua Yang；DOI 10.15252/embj.201899819。

CRISPR/Cas9株系pp2cg1-crispr、pp2cg2株系及对照野生型株系，在冷驯化和非冷驯化后低温处理后的表型见图2；CRISPR/Cas9株系pp2cg1-crispr冷驯化和非冷驯化后低温处理植株成活率和离子渗漏率统计结果见图3。实验结果表明，在非冷驯化条件下，pp2cg1-crispr植株相较于野生型表现为明显的抗低温表型，而pp2cg2植株与野生型相比没有明显的表型差异；在冷驯化后，尽管pp2cg1-crispr和pp2cg2植株均比野生型抗冷，但pp2cg1-crispr比pp2cg2略微耐冷(P<0.05)。

实施例3 sgRNA的设计以及打靶载体的打靶效率比较

为了验证本发明设计的sgRNA(将其称为sgRNA1)具有较高的打靶效率，以CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)中提供的与sgRNA1得分相近的sgRNA2(5’-CCTCACAAGCAGTGCTAC-3’和5’-CAGTACTGCTCGGCAATCA-3’)按照实施例1中的方法同时转化拟南芥，并进行打靶效率的比较。sgRNA1和sgRNA2的打靶效率比较见图4。实验结果表明，在T1代阳性苗中，使用sgRNA1比sgRNA2的实验组可以得到更多的纯合突变体(sgRNA1:6.25％；sgRNA2:1.04％)以及更多的杂合突变体(sgRNA1:23.96％；sgRNA2:18.23％)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> PP2CG1基因在调控拟南芥耐低温胁迫中的应用

<130> KHP191116559.8

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 380

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

Met Ser Met Asp Phe Ser Pro Leu Leu Thr Val Leu Glu Gly Asp Phe

1 5 10 15

Asn Lys Asp Asn Thr Ser Ser Ala Thr Glu Ile Asp Thr Leu Glu Asn

20 25 30

Leu Asp Asp Thr Arg Gln Ile Ser Lys Gly Lys Pro Pro Arg His Leu

35 40 45

Thr Ser Ser Ala Thr Arg Leu Gln Leu Ala Ala Asn Ala Asp Val Asp

50 55 60

Val Cys Asn Leu Val Met Lys Ser Leu Asp Asp Lys Ser Glu Phe Leu

65 70 75 80

Pro Val Tyr Arg Ser Gly Ser Cys Ala Glu Gln Gly Ala Lys Gln Phe

85 90 95

Met Glu Asp Glu His Ile Cys Ile Asp Asp Leu Val Asn His Leu Gly

100 105 110

Ala Ala Ile Gln Cys Ser Ser Leu Gly Ala Phe Tyr Gly Val Phe Asp

115 120 125

Gly His Gly Gly Thr Asp Ala Ala His Phe Val Arg Lys Asn Ile Leu

130 135 140

Arg Phe Ile Val Glu Asp Ser Ser Phe Pro Leu Cys Val Lys Lys Ala

145 150 155 160

Ile Lys Ser Ala Phe Leu Lys Ala Asp Tyr Glu Phe Ala Asp Asp Ser

165 170 175

Ser Leu Asp Ile Ser Ser Gly Thr Thr Ala Leu Thr Ala Phe Ile Phe

180 185 190

Gly Arg Arg Leu Ile Ile Ala Asn Ala Gly Asp Cys Arg Ala Val Leu

195 200 205

Gly Arg Arg Gly Arg Ala Ile Glu Leu Ser Lys Asp His Lys Pro Asn

210 215 220

Cys Thr Ala Glu Lys Val Arg Ile Glu Lys Leu Gly Gly Val Val Tyr

225 230 235 240

Asp Gly Tyr Leu Asn Gly Gln Leu Ser Val Ala Arg Ala Ile Gly Asp

245 250 255

Trp His Met Lys Gly Pro Lys Gly Ser Ala Cys Pro Leu Ser Pro Glu

260 265 270

Pro Glu Leu Gln Glu Thr Asp Leu Ser Glu Asp Asp Glu Phe Leu Ile

275 280 285

Met Gly Cys Asp Gly Leu Trp Asp Val Met Ser Ser Gln Cys Ala Val

290 295 300

Thr Ile Ala Arg Lys Glu Leu Met Ile His Asn Asp Pro Glu Arg Cys

305 310 315 320

Ser Arg Glu Leu Val Arg Glu Ala Leu Lys Arg Asn Thr Cys Asp Asn

325 330 335

Leu Thr Val Ile Val Val Cys Phe Ser Pro Asp Pro Pro Gln Arg Ile

340 345 350

Glu Ile Arg Met Gln Ser Arg Val Arg Arg Ser Ile Ser Ala Glu Gly

355 360 365

Leu Asn Leu Leu Lys Gly Val Leu Asp Gly Tyr Pro

370 375 380

<210> 2

<211> 1585

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

atgagtatgg atttttcacc tttgttaacg gttcttgagg gagatttcaa caaggataat 60

acttcttctg caacagaaat tgatacttta gagaacttag atgacactag gcagataagt 120

aaaggaaaac ctccgaggca cctcacaagc agtgctacta ggctgcagct tgcagccaat 180

gcggtaatat acttgaccct gctttttctt tttccttttc tttgttacaa tgggattcga 240

atgatgtaac tggtttctgt ttgtgcgcag gatgtggatg tttgtaactt ggttatgaag 300

tcacttgatg acaaatcaga gtttctacct gtataccgat caggaagttg tgctgagcaa 360

ggggcaaaac agttcatgga agatgaacac atttgcatcg atgatcttgt taatcatctt 420

ggtgcagcta ttcaatgctc ttctcttgga gccttctatg gggtgagttt atcttccaat 480

cttacccaaa gaagcataaa agcaattcac tagcctgatt cttctttctt ctcctctttt 540

gtactagtac gatataagag gtattacttc aaaaactctt ctaacatttg ttgattgtgt 600

gtcctttggc aggtatttga tggccacggt ggcacagatg cagcacactt tgttagaaag 660

aacattctga gattcattgt agaggactcc tccttcccac tatgcgtaaa gaaagcaatt 720

aagagtgctt tcttaaaagc tgattatgaa tttgcagatg attcttctct tgacatctct 780

tctgggacca ctgcgcttac agcttttatt tttggacggt aagagcattt aaattcgtat 840

ttatgaactt gggaagctat atatgttatc acctgtataa tcatcaatac ttatcaggtt 900

gcctgtgtgt ataagataga gaataaggct tagtgtaaag acttatgtaa cgggctgttt 960

taccatgttt ctttgtagtt ttgatgtgat tttgaataga attgctactt tctttcttta 1020

caggaggttg ataattgcaa atgctggtga ttgccgagca gtactgggga gaagaggtag 1080

ggcaattgag ttgtccaaag atcacaaacc aaactgcaca gccgagaaag taagaataga 1140

aaagttaggt ggagttgtgt atgacggtta cctcaacggg caactatcag ttgcacgtgc 1200

cattggagac tggcacatga aaggtcccaa aggctctgct tgtccgctaa gcccagagcc 1260

agagttgcaa gagacagacc tgagtgaaga cgacgagttc ttgataatgg gatgtgatgg 1320

tctgtgggat gtgatgagca gccagtgcgc tgtgacaata gctaggaagg aactgatgat 1380

tcataatgat ccagagagat gctctagaga gcttgtgagg gaggccctta aacggaatac 1440

atgtgacaat ttgacagtga ttgttgtgtg cttctctccg gatcctccac agaggataga 1500

gatccgaatg cagtcacggg tgaggcggag catatctgcg gaagggttaa acctactcaa 1560

aggcgtgctc gatggctatc cgtga 1585

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagtatgg atttttcac 19

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcacggatag ccatcgagca cgc 23

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atatatggtc tcgattgcac tgcttgtgag gtgcctgtt 39

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcactgctt gtgaggtgcc tgttttagag ctagaaatag c 41

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaccacaagc agtgctacta ggcaatctct tagtcgactc tac 43

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attattggtc tcgaaaccac aagcagtgct actaggc 37

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cactgcttgt gaggtgcct 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cacaagcagt gctactagg 19

Claims

1.PP2CG1基因在调控拟南芥耐低温胁迫中的应用，其特征在于，其中，PP2CG1基因为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控为负调控。

3.一种提高拟南芥耐冷性的方法，其特征在于，所述方法包括：利用基因工程手段，对拟南芥PP2CG1基因进行定点突变，使得该基因功能缺失，从而提高拟南芥的耐冷性；或者，

通过敲除或降低拟南芥PP2CG1基因的表达，从而提高拟南芥的耐冷性；

其中，所述PP2CG1基因的定义同权利要求1中所述。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，针对拟南芥中的目标基因PP2CG1设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化拟南芥，实现对拟南芥基因PP2CG1的定点突变，进而获得该基因功能缺失的转基因拟南芥植株。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-CACTGCTTGTGAGGTGCCT-3’和5’-CACAAGCAGTGCTACTAGG-3’。

6.根据权利要求3-5任一项所述方法获得的拟南芥在植物育种中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，育种目的是选育耐低温型植物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，育种方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

9.PP2CG1基因打靶载体，其特征在于，所述打靶载体是以拟南芥PP2CG1基因为靶点设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中构建得到的；

其中，所述PP2CG1基因的定义同权利要求1中所述；

sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-CACTGCTTGTGAGGTGCCT-3’和5’-CACAAGCAGTGCTACTAGG-3’。

10.靶向编辑PP2CG1基因的CRISPR/Cas9系统在提高拟南芥耐冷性中的应用，其中，所述PP2CG1基因的定义同权利要求1中所述。