MX2007008486A

MX2007008486A - Gen y promotor cyclo1 de maiz.

Info

Publication number: MX2007008486A
Application number: MX2007008486A
Authority: MX
Inventors: Albert L Lu; Scott Diehn; Lynne E Sims; Kim R Ward
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 2005-01-13
Filing date: 2006-01-06
Publication date: 2008-02-15
Also published as: US20060156439A1; AR051903A1; BRPI0606657A2; WO2006076189A2; DE602006013788D1; CA2594728C; ATE465174T1; CA2594728A1; EP1846442A2; US7268226B2; WO2006076189A3; EP1846442B1

Abstract

Composiciones y metodos para regular la expresion de secuencias de nucleotidos heterologas en una planta. Las composiciones incluyen una nueva secuencia de nucleotidos de un promotor con preferencia por la raiz para el gen que codifica Cyclo1. Se proporciona un metodo para expresar una secuencia de nucleotidos heterologa en una planta usando las secuencias promotoras descriptas en la presente documentacion. El metodo comprende incorporar en forma estable una secuencia de nucleotidos, unida operativamente al promotor con preferencia por las raices de la presente invencion, en el genoma de una celula vegetal, y regenerar una planta transformada en forma estable que expresa la secuencia de nucleotidos. La presente invencion tambien se relaciona con acidos nucleicos aislados que codifican ciclotidas vegetales. La invencion se relaciona con la construccion de un gen quimerico que codifica la totalidad o una porcion de la ciclotida vegetal, en la orientacion del marco de lectura o antisentido, donde la expresion del gen quimerico resulta en la produccion de niveles alterados de ciclotidas vegetales en una celula huesped transformada.

Description

GEN Y PROMOTOR CYCLO1 DE MAÍZ CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de la biología molecular de plantas, más particularmente con la regulación de la expresión genética en plantas.

REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la Solicitud Provisional de los EEUU N° 60/643.720, presentada el 13 de enero de 2005, que se incorpora por completo en la presente documentación a modo de referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los avances recientes en la ingeniería genética de plantas han permitido diseñar plantas con características o caracteres mejorados, tales como resistencia a enfermedades, resistencia a insectos, resistencia a herbicidas, estabilidad o duración de almacenamiento mejorada del producto de consumo final obtenido de las plantas, y mejoramiento de la calidad nutricional de las porciones comestibles de la planta. Por consiguiente, en el genoma de la planta pueden incorporarse uno o más genes deseados de una fuente diferente de la planta, pero modificados para impartir características o cualidades diferentes o mejoradas. De este modo, pueden expresarse uno o más genes nuevos en la célula vegetal para que presente el fenotipo deseado, tal como un carácter o una característica nueva. Debe haber señales reguladoras apropiadas presentes, y deben estar en la localización apropiada respecto del gen, con el fin de obtener la expresión del gen recién insertado en la célula vegetal. Estas señales reguladoras pueden incluir una región promotora, una secuencia directriz 5' no traducida y una secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación 3'. Un promotor es una secuencia de ADN que dirige la maquinaria celular de una planta para producir ARN a partir de la secuencia codificante contigua río abajo (3') del promotor. La región promotora influye en la velocidad, la etapa del desarrollo y el tipo celular en el que se expresa el transcripto de ARN a partir del gen. El transcripto de ARN se procesa para producir ARN mensajero (ARNm), que sirve como molde para la traducción de la secuencia de ARN en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. La secuencia directriz 5' no traducida es una región del ARNm río arriba de la región codificante de la proteína, que puede participar en el inicio y la traducción del ARNm. La señal de terminación de la transcripción/poliadenilación 3' es una región no traducida río abajo de la región codificante de la proteína, que opera en las células vegetales para provocar la terminación de la transcripción del ARN y la adición de nucleótidos de poliadenilato en el extremo 3' del ARN. La expresión de las secuencias de ADN heterólogas en un huésped vegetal depende de la presencia de un promotor unido operativamente que opera en la planta huésped. El tipo de secuencia promotora seleccionada se basa en cuándo y dónde se desea la expresión del ADN heterólogo en el organismo. Cuando se desea la expresión en tejidos u órganos específicos, pueden usarse promotores con preferencias tisulares. Cuando se desea la expresión genética en respuesta a un estímulo, los promotores inducibles son el elemento regulador a elegir. En contraste, cuando se desea una expresión continua en todas las células de una planta, se utilizan promotores constitutivos. Un promotor inducible es un promotor que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripción de una o más secuencias de ADN o genes en repuesta a un inductor. En ausencia de un inductor, las secuencias de ADN o los genes no se transcribirán o se transcribirán a un nivel menor que en un estado inducido. El inductor puede ser un agente químico, tal como un metabolito, un regulador del crecimiento, un compuesto herbicida o fenólico, o un estrés fisiológico impuesto directamente sobre la planta, tal como frío, calor, sal, sequía o toxinas. En el caso del combate de plagas vegetales, también es deseable tener un promotor que sea inducido por patógenos vegetales, incluyendo insectos plaga, nematodes o agentes causantes de enfermedades en plantas, tales como una bacteria, un virus o un hongo. El contacto con el patógeno inducirá la activación de la transcripción, de modo que se producirá una proteína que combatirá el patógeno en un momento en que sea efectiva para defender la planta. También puede usarse un promotor inducido por patógenos para detectar el contacto con un patógeno, por ejemplo, mediante la expresión de un marcador detectable, de modo que pueda evaluarse la necesidad de aplicación de pesticidas. Una célula vegetal que contiene un promotor inducible puede exponerse a un inductor aplicando el inductor a la célula o la planta por vía externa, tal como por medio de rocío, riego, calentamiento o exposición al patógeno operativo. Un promotor constitutivo es un promotor que dirige la expresión de un gen en varias partes de una planta y en forma continua durante el desarrollo de la planta. Los ejemplos de algunos promotores constitutivos que se usan ampliamente para inducir la expresión de genes heterólogos en plantas transgénicas incluyen el promotor del gen de nopalina sintetasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, (Patente de los EEUU N° 5034322), los promotores 35S y 19S del virus en mosaico de la coliflor (CaMv) (Patente de los EEUU N° 5352605), aquellos derivados de cualquiera de los distintos genes de actina, de los que se sabe que se expresan en la mayor parte de los tipos celulares (Patente de los EEUU N° 6002068), y el promotor de ubiquitina, (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 72:619-632; y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689), que es un producto genético conocido por acumularse en muchos tipos celulares. Pueden incluirse otras secuencias reguladoras río arriba y/o río abajo de la secuencia promotora nuclear en las construcciones de expresión de los vectores de transformación, con el propósito de alterar los niveles de expresión de las secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta transgénica. Por consiguiente, la modificación genética de plantas mediante el uso de técnicas de ingeniería genética para producir plantas con caracteres útiles requiere de la disponibilidad de una variedad de promotores. Con el fin de maximizar la aplicación comercial de la tecnología de plantas transgénicas, es importante dirigir la expresión del ADN introducido de una forma con especificidad por sitios. Por ejemplo, es deseable producir compuestos defensivos tóxicos en los tejidos que se ven sometidos al ataque de patógenos, pero no en los tejidos que han de ser cosechados e ingeridos por los consumidores. Al dirigir la síntesis o el almacenamiento de proteínas o compuestos deseables de una forma con especificidad por sitios, pueden manipularse las plantas como fabricas o sistemas de producción, de modo de obtener una vapedad importante de compuestos con utilidad comercial. Los promotores con especificidad celular proporcionan la capacidad de dirigir la síntesis de los compuestos, en forma espacial y temporal, a tejidos u órganos muy especializados, tales como raíces, hojas, tejidos vasculares, embriones, semillas o flores. Como alternativa, puede ser deseable inhibir la expresión de una secuencia de ADN nativa en los tejidos de una planta para obtener un fenotipo deseado.

Puede lograrse esta inhibición transformando la planta para que comprenda un promotor con preferencia tisular, unido operativamente a una secuencia de nucleótidos antisentido, de modo que la expresión de la secuencia antisentido produzca un transcripto de ARN que interfiera con la traducción del ARNm de la secuencia de ADN nativa. Hasta la fecha, no se ha estudiado apropiadamente la regulación de la expresión genética en las raíces de las plantas, a pesar de la importancia de la raíz en el desarrollo de la planta. En algún grado, esto puede atribuirse a la carencia de funciones bioquímicas específicas para la raíz y fácilmente accesibles, cuyos genes puedan clonarse, estudiarse y manipularse. Se han identificado varios genes que se expresan con preferencia en los tejidos de las raíces de las plantas. Véanse, por ejemplo, Takahashi er al. (1991 ) Plant J. 7:327-332; Takahashi et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:8013-8016; Hertig eí al. (1991 ) Plant Mol. Biol. 76:171-174; Xu eí al. (1995) Plant Mol. Biol. 27:237-248; Capone ef al. (1994) Plant Mol. Biol. 25:681-691 ; Masuda eí al. (1999) Plant Cell Physiol. 40(11 ): 177-81 ; Luschnig eí al. (1998) Genes Dev. 12(14):2 75-87; Goddemeier eí al. (1998) Plant Mol. Biol. 36(5): 799-802; y Yamamoto eí al. (1991 ) Plant Cell 3(4J:371 -82. Aunque se han caracterizado promotores específicos para la raíz en varios tipos de plantas, no se han descripto promotores específicos para la raíz de maíz en la literatura. La expresión constitutiva de algunas proteínas heterólogas, tales como insecticidas, conduce a efectos fenotípicos y agronómicos. La limitación de la expresión de proteínas insecticidas, por ejemplo, a los tejidos en los que se alimenta el insecto (en este caso, las raíces), permite que la planta dedique más energía al crecimiento normal, en vez de a la expresión de la proteína en toda la planta. Usando promotores con preferencia por la raíz, también puede limitarse la expresión de la proteína en porciones no deseables de la planta. Sin embargo, muchos de los promotores con preferencia por la raíz que han sido aislados no dirigen la expresión de cantidades suficientes de transgenes de una forma eficaz en plantas. Por consiguiente, es necesario el aislamiento y la caracterización de promotores con preferencia tisular, particularmente con preferencia por la raíz, que puedan dirigir la transcripción de un nivel suficientemente elevados de una secuencia de nucleótidos heteróloga deseada. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para regular la expresión genética en una planta. Las composiciones comprenden nuevas secuencias de nucleótidos para un promotor que inicia la transcripción con preferencia por la raíz.

Más particularmente, se proporciona una región de inicio de la transcripción aislada de maíz. Otras realizaciones de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 1 , un fragmento de la secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 1 , y las secuencias de promotores vegetales depositadas en huéspedes bacterianos con el N° de Depósito de Patente NRRL B- 30794. Además, las composiciones de las realizaciones comprenden secuencias de nucleótidos que tienen al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , y que dirigen la expresión con preferencia por la raíz de una secuencia de nucleótidos unida operativamente. También se incluyen fragmentos funcionales de la secuencia detallada como SEQ ID N° 1 , que dirige la expresión con preferencia por la raíz de una secuencia de nucleótidos unida operativamente. Las composiciones de las realizaciones también incluyen construcciones de ADN que comprenden un promotor de las realizaciones unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, donde el promotor es capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés en una célula vegetal y también donde el promotor comprende las secuencias de nucleótidos de las realizaciones. Además, en las realizaciones se proporcionan vectores de expresión, y plantas o células vegetales que tienen una construcción de ADN mencionada previamente incorporada en forma estable en sus genomas. Adicionalmente, las composiciones incluyen semillas transgénicas de dichas plantas. Los métodos de las realizaciones comprenden un medio para expresar selectivamente una secuencia de nucleótidos en una raíz de una planta, que comprende transformar una célula vegetal con una construcción de ADN, y regenerar una planta transformada a partir de la célula vegetal transformada, donde la construcción de ADN comprende un promotor y una secuencia de nucleótidos heteróloga unida operativamente al promotor, donde además el promotor inicia la transcripción con preferencia por la raíz de la secuencia de nucleótidos en una célula vegetal. De este modo, las secuencias promotoras son útiles para controlar la expresión de secuencias codificantes unidas operativamente de una forma con preferencia por la raíz. Río abajo y bajo la regulación del inicio de la transcripción del promotor habrá una secuencia de interés que proporcionará la modificación del fenotipo de la planta. Esta modificación incluye modular la producción de un producto endógeno, en lo referente a la cantidad, la distribución relativa o semejantes, o la producción de un producto de expresión de exógeno para obtener una función o un producto nuevo en la planta. Por ejemplo, se incluye una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, a la sal, el frío, la sequía, patógenos o insectos.

En otro aspecto, los métodos de las realizaciones se relacionan con un método para modular la expresión de un gen en la raíz de una planta transformada en forma estable, que comprende los pasos de (a) transformar una célula vegetal con una construcción de ADN que comprende el promotor de las realizaciones, unido operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos; (b) cultivar una célula vegetal bajo condiciones apropiadas para el desarrollo de la planta, y (c) regenerar una planta transformada en forma estable a partir de la célula vegetal, donde la expresión de la secuencia de nucleótidos altera el fenotipo de la planta. Las realizaciones incluyen una secuencia de ciclotida que puede usarse para mejorar el sistema de defensa contra patógenos de la planta. Otras realizaciones se relacionan con una molécula que puede ciclarse, y con su precursor lineal; con péptidos, polipéptidos o proteínas cíclicas; y adicionalmente incluyen las formas lineales de homólogos estructurales no cíclicos de los péptidos, los polipéptidos o las proteínas cíclicas. También se incluyen las formas derivadas de la molécula ciclada y los precursores lineales codificados por las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención. Los péptidos, los polipéptidos y las proteínas cíclicas y lineales pueden ser de ocurrencia natural, o pueden estar modificados por medio de la inserción o la sustitución de secuencias de aminoácidos heterólogas. Las realizaciones también incluyen un método que comprende transformar en forma estable una planta con una secuencia de nucleótidos de ciclotida capaz de modular el sistema de defensa contra patógenos de la planta, unida operativamente con un promotor capaz de dirigir la expresión de un gen en una célula vegetal. Además, se proporcionan plantas, células vegetales y semillas transformadas, así como métodos para preparar estas plantas, células vegetales y semillas.

Las realizaciones de la invención se relacionan con un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 11 ; una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácidos detalladas en SEQ ID N° 12 y 13, una secuencia de nucleótidos caracterizada por al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 11 ; una secuencia de nucleótidos caracterizada por al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 11 ; una secuencia de nucleótidos caracterizada por al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 11 ; y una secuencia de nucleótidos que comprende el complemento de cualquiera de las anteriores. Otra realización comprende el complemento de las secuencias de nucleótidos descriptas en la presente documentación. Una realización de la invención también provee un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste en: un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos detallada en SEQ ID N° 12 y 13; un polipéptido caracterizado por al menos 90% de identidad con SEQ ID N° 12 y 13; un polipéptido caracterizado por al menos 95% de identidad con SEQ ID N° 12 y 13; un polipéptido caracterizado por al menos 97% de identidad con SEQ ID N° 12 y 13; un polipéptido caracterizado por al menos 98% de identidad con SEQ ID N° 12 y 13; y un polipéptido caracterizado por al menos 99% de identidad con SEQ ID N° 12 y 13.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En la Figura 1 se muestra el perfil de Lynx MPSS del gen Cyclol , que presenta una expresión no preferencial.

En la Figura 2 se muestra la secuencia del promotor Cyclol de maíz. Se indican las posiciones de la caja TATA, el sitio de inicio de la transcripción (TSS) mapeado por 5' RACE y otros motivos de interés en la secuencia promotora.

La Figura 3 es un alineamiento del polipéptido de ciclotida codificado por el gen Cyclol , comparado con otras ciclotidas conocidas. Los residuos idénticos se indican con letra negrita. Los residuos que son similares y se consideran sustituciones conservativas se indican con letra cursiva.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION Las composiciones de las realizaciones comprenden nuevas secuencias de nucleótidos para promotores vegetales, particularmente un promotor con preferencia por la raíz de un gen Cyclol de maíz, más particularmente, el promotor del gen Cyclol . En particular, las realizaciones proporcionan moléculas de ácidos nucleicos aisladas que comprenden la secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 1 , y la secuencia promotora vegetal depositada en huéspedes bacterianos con el N° de Depósito de Patente NRRL B-30794, y fragmentos, variantes y complementos de ésta. Los plásmidos que contienen las secuencias de nucleótidos promotoras vegetales de las realizaciones fueron depositados el 1o de Diciembre de 2004 en el Depósito de Patentes de la Colección de Cultivos del Servicio de Investigación Agrícola del Centro Nacional de Investigación de Utilización Agrícola, en 1815 N. University Street, Peoría, IL, 61604, y se les asignó el N° de Depósito de Patente NRRL B-30794. Este depósito será mantenido de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional de Depósitos de Microorganismos para Propósitos de Procedimientos de Patentes. Este depósito se realizó meramente con fines de conveniencia para aquellos entrenados en la técnica, y no se admite que sea necesario un depósito bajo 35 U.S.C. §112. El depósito estará disponible para el público, de forma irrevocable y sin estriccíones o condiciones, una vez otorgada la patente. Sin embargo, deberá comprenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la presente invención como derogación de los derechos de patente garantizados por la acción del gobierno. Las secuencias promotoras de las realizaciones son útiles para expresar secuencias de nucleótidos unidas operativamente de una forma con preferencia tisular, particularmente con preferencia por la raíz. Entonces, las secuencias promotoras Cyclol pueden usarse en la expresión con preferencia por la raíz de una secuencia de nucleótidos de interés unida operativamente. Las secuencias de las realizaciones también pueden usarse en la construcción de vectores de expresión para la transformación subsiguiente en plantas de interés, como sondas para aislar otros promotores de genes Cyclol , como marcadores moleculares, y semejantes. El promotor Cyclol de las realizaciones fue aislado a partir de ADN genómico de maíz. El método específico usado para obtener el promotor Cyclol de las realizaciones se describe en el Ejemplo 3, en la sección experimental de esta solicitud. Las realizaciones comprenden composiciones de ácidos nucleicos aislados o sustancialmente purificados. Una molécula de ácidos nucleicos "aislada" o "purificada", o una porción de ésta con actividad biológica, está sustancialmente libre de otro matepal celular o medio de cultivo, cuando se la produce de acuerdo con técnicas recombinantes, o está sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas, cuando se la sintetiza por medios químicos. En general, un ácido nucleico "aislado" está libre de las secuencias (por ejemplo, secuencias que codifican proteínas) que lo rodean en su ambiente natural (es decir, las secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que rodean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que deriva el ácido nucleico. El gen Cyclol (SEQ ID N° 1 1 ) puede ser un gen relacionado con la defensa. La secuencia de aminoácidos predicha del producto proteico de Cyclol (SEQ ID N° 12 y 13) presenta homología con una clase de proteínas relacionadas con la defensa que tienen un conjunto diverso de actividades, ¡ncluyendo funciones antimicrobianas e insecticidas. Esta clase se conoce ampliamente como ciclotidas, que han sido identificadas en plantas de diversas especies (véanse las Solicitudes Provisionales de Patente de los EEUU 60/575571 y 60/616190). La proteína Cyclol contiene un marco conservado de cisteína similar, con residuos de aminoácidos adicionales reconocidos como una característica de este grupo de péptidos cíclicos. El gen Cyclol de maíz se expresa con preferencia en tejido de raíz de maíz, como lo demuestran las comparaciones del perfil genético tisular derivada de la secuenciación masiva de firmas paralelas Lynx (MPSS), que se descpbe con mayor detalle en el Ejemplo 1. Las pequeñas proteínas ricas en lisina, que han sido implicadas en la defensa del huésped y han sido aisladas de fuentes de fuentes vegetales, incluyen defensinas, tioninas y pequeñas proteínas antimicrobianas (AMP). Recientemente se han reconocido las ciclotidas, que también son moléculas ricas en lisina, y se las ha caracterizado como participantes de la repuesta del huésped (Craik eí al. (1999), J. Mol. Biol. 294: 1327-1336; Craik et al. (2000), Toxicon 39: 43-60). Los polipéptidos de ciclotidas, codificados por secuencias genéticas y producidos como precursores lineales, son ricos en lisina y son capaces de formar un ciclo a través de un enlace peptídico. Las ciclotidas presentan un amplio rango de actividad biológica, tal como actividad antibacteriana, actividad antifúngica, actividad anti-HIV y actividad uterotónica (Craik (2001 ), Toxicon 39: 1809-1813). Adicionalmente, se ha demostrado que las ciclotidas poseen actividad insecticida (Jennings et al. (2001 ) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 98:10614-10619). Las ciclotidas cicladas difieren de las proteínas clásicas porque no tienen extremos N o C libres, debido a su esqueleto circular de amida. Los polipéptidos de ciclotidas derivan de proteínas precursoras más largas, por lo que la producción del esqueleto cíclico comprende pasos de corte y ciclado. El esqueleto cíclico de la molécula de ciclotida típicamente tiene un tamaño que varía entre 29 y 37 residuos de aminoácidos, y tiene tres enlaces disulfuro que forman un motivo de nudo de cistina, donde dos enlaces disulfuro y las cadenas de los esqueletos conectados forman un anillo enhebrado por el tercer enlace disulfuro. Los mecanismos inherentes al ciclado del esqueleto son desconocidos en la actualidad. Una posibilidad es el proceso químico o enzimático de corte del esqueleto del dominio maduro, y el ciclado subsiguiente. Las características combinadas del nudo de cistina cíclico producen un plegamiento único de la proteína, que tiene una topología compleja y una estabilidad química y biológica excepcional. La mayoría de las ciclotidas vegetales han sido aisladas de plantas de las familias Rubiaceae y Violaceae (Gustafson et al. (1994), J. Nat. Prod. 116: 9337- 9338; Gustafson et al. (2000), J. Nat. Prod. 63: 176-178; Witherup ef al. (1994), J.

Nat. Prod. 57: 1619-1625; Saéter ef al. (1995), Biochemistry 34, 4147-4158; Bokesch ef al. (2001 ), J. Nat. Prod. 64: 249-250; Schopke ef al. (1993), Sci. Pharm. 61 : 145-153; Claeson et al. (1998), J. Nat. Prod. 61 : 77-81 ; Góransson ef a/. (1999), J. Nat. Prod. 62: 283-286; Hallock eí al. (2000), J. Org. Chem. 65: 124-128; Broussalis ef a/. (2001 ), Phytochemistry 58: 47-51 ). Recientemente se descubrieron dos miembros de una nueva subclase de la familia de las ciclotidas en la familia Cucurbitaceae (Hernández ef al. (2000), Biochemistry 39: 5722-5730.; Felizmenio-Quimio ef al. (2001 ), J. Biol. Chem. 276: 22875-22882; Heitz ef al. (2001 ), Biochemistry 40: 7973-7983; Trabi y Craik, (2002), Trencfs in Biochem. Sci. 27: 132-138). Las ciclotidas pueden usarse en plantas transgénicas para producir plantas con mayor resistencia a patógenos, tales como hongos, virus, bacterias, nematodes e insectos. Por consiguiente, las realizaciones de la presente invención satisfacen la necesidad de mejorar la respuesta defensiva de la planta a través de un mecanismo de base molecular que puede incorporarse rápidamente en cultivos comerciales. Las composiciones de las realizaciones incluyen moléculas de ácidos nucleicos que comprenden la secuencia de nucleótidos promotora detallada en SEQ ID N° 1. El término "promotor" designa una región de ADN reguladora, que comprende comúnmente una caja TATA capaz de dirigir la ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en el sitio de inicio de la transcripción apropiado para una secuencia codificante particular. Además, un promotor puede comprender otras secuencias de reconocimiento localizadas generalmente río arriba o 5' de la caja TATA, conocidas como elementos promotores río arriba, que influyen en la velocidad de inicio de la transcripción. Se reconoce que, al haber identificado las secuencias de nucleótidos para las regiones promotoras descriptas en la presente documentación, el aislamiento y la identificación de otros elementos reguladores en la región 5' no traducida de las regiones promotoras particulares identificadas en la presente documentación está dentro del alcance de aquellos entrenados en la técnica. Por consiguiente; por ejemplo, las regiones promotoras descriptas en la presente documentación pueden comprender elementos reguladores río arriba adicionales, tales como aquellos responsables de la expresión tisular y temporal de la secuencia codificante, los potenciadores y semejantes. Véanse en particular la Patente Australiana N° AU-A-77751/94 y las Patentes de los EEUU N° 5466785 y 5635618. Del mismo modo, los elementos promotores que permiten la expresión en el tejido deseado, tal como la raíz, pueden identificarse, aislarse y usarse con otros promotores nucleares para conferir una expresión con preferencia por la raíz. En este aspecto de las realizaciones, un "promotor nuclear" designa un promotor sin elementos promotores. En el contexto de esta descripción, el término "elemento regulador" también hace referencia a una secuencia de ADN, comúnmente, pero no siempre, río arriba (5') de la secuencia codificante de un gen estructural, que incluye secuencias que controlan la expresión de la región codificante al proporcionar el reconocimiento por la ARN polimerasa y/u otros factores requeridos para que la transcripción comience en un sitio particular. Un ejemplo de un elemento regulador que permite el reconocimiento por la ARN polimerasa u otros factores de transcripción para asegurar el inicio en un sitio particular es un elemento promotor.

Un elemento promotor comprende un elemento promotor nuclear, responsable del inicio de la transcripción, así como otros elementos reguladores (como se describe en otra parte de esta solicitud) que modifican la expresión genética. Debe comprenderse que las secuencias de nucleótidos localizadas en los intrones, o 3' de la secuencia de la región codificante, también pueden contribuir a la regulación de la expresión de una región codificante de interés. Los ejemplos de ¡ntrones apropiados incluyen, sin limitaciones, el intrón IVS6 de maíz o el intrón de actina de maíz. Un elemento regulador también puede incluir aquellos elementos localizados río abajo (3') del sitio de inicio de la transcripción, o dentro de regiones transcriptas, o ambos. En el contexto de las realizaciones, un elemento regulador post-transcripcional puede incluir los elementos que están activos después del inicio de la transcripción, por ejemplo, potenciadores de la traducción y la transcripción, represores de la traducción y la transcripción, y determinantes de la estabilidad del ARNm. Los elementos reguladores de las realizaciones, o los fragmentos de éstos, pueden estar asociados operativamente con elementos reguladores o promotores heterólogos, con el fin de modular la actividad del elemento regulador heterólogo. Esta modulación incluye: (a) la potenciación o la represión de la actividad de transcripción del elemento regulador heterólogo; (b) la modulación de eventos post-transcripcionales, o la combinación de (a) y (b). Por ejemplo, uno o más elementos reguladores de las realizaciones, o fragmentos de éstos, puede asociarse operativamente con promotores constitutivos, inducibles o específicos para tejidos, o con fragmentos de éstos, para modular la actividad de estos promotores en las células vegetales de tejidos deseados. La secuencia promotora con preferencia por la raíz Cyclol de las realizaciones, cuando se coloca en una construcción de ADN, de modo tal que el promotor está unido operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés, permite la expresión de la secuencia de nucleótidos en las células de una planta transformada en forma estable con esta construcción de ADN. El término "unida operativamente" denota que la transcripción o la traducción de la secuencia de nucleótidos heteróloga está bajo la influencia de la secuencia promotora. La "unión operativa" también designa la unión de dos secuencias de nucleótidos, de modo tal que la secuencia codificante de cada fragmento de ADN permanece en el marco de lectura apropiado. De este modo, las secuencias de nucleótidos para los promotores de las realizaciones se proporcionan en construcciones de ADN, en combinación con la secuencia de nucleótidos de interés, típicamente una secuencia de nucleótidos heteróloga, para obtener la expresión en la planta de interés. El término "secuencia de nucleótidos heteróloga" designa una secuencia que no está unida operativamente en forma natural con la secuencia promotora. Si bien esta secuencia de nucleótidos es heteróloga respecto de la secuencia promotora, puede ser homologa (nativa); o heteróloga (extraña), respecto de la planta huésped. Las secuencias reguladoras de las realizaciones, cuando están unidas operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, y están incorporadas en forma estable en el genoma de la planta, dirigen la expresión "con preferencia por la raíz" de la secuencia de nucleótidos heteróloga. El término "con preferencia por la raíz" denota que la expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga es más abundante en la raíz. El término "raíz" hace referencia a cualquier parte de la estructura de la raíz, incluyendo, sin limitaciones, el extremo de la raíz, el meristema apical, la protodermis, el merístema basal, el procambium, la endodermis, la corteza, la corteza vascular, la epidermis y semejantes. Si bien puede haber un cierto nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga en otros tipos de tejido vegetal, la expresión ocurre de forma más abundante en la raíz; lo que puede incluir, sin limitaciones, las raíces primarias, laterales y adventicias. Se reconoce que los promotores de las realizaciones pueden usarse con sus secuencias codificantes nativas para incrementar o disminuir la expresión, lo que resulta en un cambio en el fenotipo de la planta transformada.

Las modificaciones de las secuencias promotoras aisladas de las realizaciones pueden proporcionar un rango de expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga. Por consiguiente, puede modificárselas para que sean promotores débiles o promotores fuertes. En general, un "promotor débil" designa un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante en un nivel bajo. Un nivel de expresión "bajo" hace referencia a niveles de expresión de entre aproximadamente 1/10000 transcriptos, aproximadamente 1/100000 transcriptos y aproximadamente 1/500000 transcriptos. Por otro lado, un promotor fuerte dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel elevado, o entre aproximadamente 1/10 transcriptos, aproximadamente 1/100 transcriptos y aproximadamente 1/1000 transcriptos. Los fragmentos y las variantes de las secuencias promotoras descriptas también están comprendidos por las realizaciones. Un "fragmento" designa una porción de la secuencia promotora. Los fragmentos de una secuencia promotora pueden retener la actividad biológica, y por consiguiente, abarcan fragmentos capaces de dirigir la expresión con preferencia por la raíz de una secuencia de nucleótidos unida operativamente. Por consiguiente, por ejemplo, puede utilizarse menos que la secuencia promotora completa descripta en la presente documentación para dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés unida operativamente, tal como una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína heteróloga. Aquellos entrenados en la técnica saben cómo determinar si estos fragmentos disminuyen los niveles de expresión o alteran la naturaleza de la expresión, es decir, expresión constitutiva o inducible. Como alternativa, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos promotora que son útiles como sondas de hibridización, como se describe más adelante, generalmente no retienen esta actividad de regulación. Por consiguiente, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar entre al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta la extensión completa de la secuencia de nucleótidos de las realizaciones. Por consiguiente, un fragmento de una secuencia de nucleótidos promotora Cyclol puede codificar una porción del promotor Cyclol con actividad biológica, o puede ser un fragmento que puede usarse como una sonda de hibridización o un cebador de PCR, de acuerdo con los métodos que se describen más adelante. Puede prepararse una porción con actividad biológica de un promotor Cyclol aislando una porción de la secuencia de nucleótidos del promotor Cyclol de las realizaciones y evaluando la actividad de dicha porción del promotor Cyclol . Las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos promotora comprenden al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 o hasta la cantidad de nucleótidos presentes en la secuencia de nucleótidos promotora completa descripta en la presente documentación, por ejemplo 1140 nucleótidos para SEQ ID N° 1. Los nucleótidos de dichos fragmentos comúnmente comprenderán la caja de reconocimiento TATA de la secuencia promotora particular. Estos fragmentos pueden obtenerse usando enzimas de restricción paras cortar la secuencia de nucleótidos promotora de ocurrencia natural descripta en la presente documentación; sintetizando una secuencia de nucleótidos de la secuencia de ocurrencia natural de la secuencia de ADN promotora; o pueden obtenerse usando tecnología de PCR. Véase en particular, Mullís eí al. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350, y Erlich, editor (1989) PCR Technology (Stockton Press, Nueva York). Las variantes de estos fragmentos promotores, tales como aquellas resultantes de mutagénesis dirigida a sitios específicos y un procedimiento tal como el "barajado de ADN" también están abarcadas por las composiciones de las realizaciones. Un "análogo" de los elementos reguladores de las realizaciones incluye cualquier sustitución, deleción o adición a la secuencia de un elemento regulador, siempre que dicho análogo mantenga al menos una propiedad de regulación asociada con la actividad del elemento regulador de las realizaciones. Estas propiedades incluyen el direccionamiento de la especificidad por órganos, la especificidad por tejidos, la actividad temporal, la actividad de desarrollo o cualquier combinación de éstas. El término "variantes" designa secuencias que tienen una similitud sustancial con una secuencia promotora descripta en la presente documentación.

Para las secuencias de nucleótidos, pueden identificarse variantes de ocurrencia natural como éstas mediante el uso de procedimientos conocidos de biología molecular, tales como por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridización detalladas más adelante. Las variantes de las secuencias de nucleótidos también incluyen las secuencias de nucleótidos derivadas en forma sintética, tales como aquellas generadas, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida a sitios específicos. En general, las variantes de una secuencia de nucleótidos particular de las realizaciones tendrán al menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, generalmente al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, hasta 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con dicha secuencia de nucleótidos particular, determinada empleando los programas de alineamiento de secuencias descriptos en otra parte la presente documentación, usando los parámetros por omisión. Las variantes con actividad biológica también están abarcadas por las realizaciones. Las variantes con actividad biológica incluyen, por ejemplo, la secuencia promotora nativa de las realizaciones que tienen una o más sustituciones, deleciones o inserciones de nucleótidos. La actividad promotora puede medirse usando procedimientos tales como análisis de Northern, mediciones de actividad informante tomadas de fusiones de transcripción, y semejantes. Véase, por ejemplo, Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York), conocido de aquí en adelante como "Sambrook", e incorporado en la presente documentación a modo de referencia. Como alternativa, pueden medirse los niveles de un gen informante, tal como la proteína fluorescente verde (GFP) o semejantes, producidos bajo el control de un fragmento promotor o una variante. Véase, por ejemplo, la Patente de los EEUU N° 6072050, incorporada en la presente documentación a modo de referencia. Los métodos para efectuar mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel ef al. (1987) Methods in Enzymol. 754:367-382; Patente de los EEUU N° 4873192; Walker y Gaastra, editores (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias citadas en dichas publicaciones. Las variantes de las secuencias de nucleótidos promotoras también comprenden secuencias derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico, tal como el barajado de ADN. Con un procedimiento como este, pueden manipularse una o más secuencias promotoras diferentes para crear un nuevo promotor que posee las propiedades deseadas. De este modo, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de secuencias de polinucleótidos relacionadas que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial, las cuales pueden recombinarse en forma homologa en vitro o in vivo. En la técnica se conocen estrategias para barajar ADN. Véanse, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :10747-10751 ; Stemmer (1994) Nature 370:389-391 ; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore ef al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri ef al. (1998) Nature 391 :288-291 ; y las Patentes de los EEUU N° 5605793 y 5837458. Las secuencias de nucleótidos de las realizaciones pueden usarse para aislar secuencias correspondientes, particularmente otras plantas, por ejemplo, otras monocotiledóneas. De este modo, pueden usarse métodos, tales como PCR, hibridización y semejantes, para identificar estas secuencias sobre la base de su homología de secuencia con la secuencia detallada en la presente documentación. Las secuencias aisladas sobre la base de su identidad de secuencia con la secuencia promotora Cyclol completa detallada en la presente documentación, o con fragmentos de éstas, están abarcadas por las realizaciones. Las regiones promotoras de las realizaciones pueden aislarse de cualquier planta, incluyendo, sin limitaciones, maíz (Zea mays), Brassica (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Sécale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus annuus), trigo (Triticum aestivum), soja (Glicine max), tabaco (Nicotiana tabacum), papa (Solanum tuberosum), maní (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), casava (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nucífera), ananá (Ananas comosus), árboles de cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), avocado (Persea americana), higo (Ficus casica), guava (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), avena, cártamo cebada, verduras, ornamentales y coniferas. En un abordaje basado en PCR, pueden diseñarse oligonucleótidos cebadores para usar en reacciones de PCR para amplificar las secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y efectuar clonaciones por PCR son generalmente conocidos en la técnica, y se describen en Sambrook supra. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Ver también Innis et al., editores (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, editores (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); y Innis y Gelfand, editores (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos de PCR conocidos incluyen, sin limitaciones, métodos para usar cebadores apareados, cebadores anidados, cebadores individuales específicos, cebadores degenerados, cebadores específicos para genes, cebadores específicos para vectores, cebadores con faltas de coincidencia parciales y semejantes En los procedimientos de hibridización, se utiliza la totalidad o parte de una secuencia de nucleótidos conocida como una sonda, la cual hibridiza selectivamente con otras secuencias de nucleótidos correspondientes presentes una población de fragmentos de ADN genómico o fragmentos de ADNc clonados (es decir, bibliotecas genómicas o bibliotecas de ADNc) de un organismo seleccionado. Las sondas de hibridización pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos, y pueden estar marcadas con un grupo detectable, tal como 32P, o con cualquier otro marcador de detección. De este modo, por ejemplo, pueden prepararse sondas de hibridización marcando oligonucleótidos sintéticos basados en la secuencia promotora Cyclol de las realizaciones. Los métodos para preparar sondas para hibridizar y construir bibliotecas de ADNc y genómicas son generalmente conocidos en la técnica, y se describen en Sambrook, supra. Por ejemplo, puede usarse la secuencia promotora Cyclol completa descripta en la presente documentación, o una o más porciones de ésta, como una sonda capaz de hibridizar específicamente con las secuencias promotoras Cyclol correspondientes. Para obtener una hibridización específica bajo una variedad de condiciones, estas sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias promotoras Cyclol y tienen al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, y generalmente al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Estas sondas pueden usarse para amplificar las secuencias promotoras Cyclol correspondientes a partir de una planta seleccionada por PCR. Puede usarse este procedimiento para aislar secuencias codificantes adicionales a partir de un organismo deseado, o como un ensayo diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en una planta. Los procedimientos de hibridización incluyen el análisis de hibridización de bibliotecas de ADN plaqueadas (placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook, supra). La hibridizacíón de dichas secuencias puede llevarse a cabo bajo condiciones severas. Las "condiciones severas" o "condiciones de hibridización severas" comprenden condiciones bajo las cuales una sonda hibridiza con su secuencia blanco, con un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces respecto del fondo). Las condiciones severas dependen de la secuencia y difieren bajo distintas circunstancias. Mediante el control de la severidad de la hibridización y/o las condiciones de lavado, pueden identificarse secuencias blanco que son 100% complementarias con la sonda (análisis de homólogos). Como alternativa, pueden ajustarse las condiciones de severidad para permitir un cierto grado de falta de coincidencia entre las secuencias, con el fin de detectar grados de similitud menores (análisis de heterólogos). En general, una sonda tiene menos que aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, comúnmente menos que 500 nucleótidos de longitud. Típicamente, las condiciones severas son aquellas donde la concentración de sal es menor que aproximadamente 1 ,5 M de iones Na, típicamente una concentración de entre aproximadamente 0,01 y 1 ,0 M de iones Na (o de otras sales) a un pH de entre 7,0 y 8,3, donde la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, de entre 10 y 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, de más de 50 nucleótidos). También pueden obtenerse condiciones severas agregando agentes desestabilizadores, tales como formamida. Los ejemplos de condiciones de severidad baja incluyen una hibridización con una solución amortiguadora con entre 30 y 35% de formamida, NaCI 1 M, 1 % de SDS (dodecil sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en SSC entre 1X y 2X (SSC 20X = NaCI 3,0 M/citrato de trisodio 0,3 M) a 50-55°C. Los ejemplos de condiciones de severidad moderada incluyen una hibridización en una solución que contiene entre 40 y 45% de formamida, NaCI 1 ,0 M, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado en SSC entre 0,5X y 1X a 55-60°C. Los ejemplos de condiciones de severidad alta incluyen una hibridización en 50% de formamida, NaCI 1 M, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado final en SSC 0,1 X a 60-65°C por al menos 30 minutos. La duración de la hibridización es generalmente menor que aproximadamente 24 horas, comúnmente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 12 horas. La especificidad es típicamente una función de los lavados post- hibridización, donde los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de ADN-ADN, puede estimarse el punto de fusión térmico (Tm) empleando la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 738:267-284: Tm = 81 ,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (% de GC) - 0,61 (% de form.) - 500/I; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de form. es el porcentaje de formamida en la solución de hibridización, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. El Tm es la temperatura (a una fuerza iónica y un pH específico) a la que 50% de una secuencia blanco complementaria hibridiza con una sonda que coincide perfectamente. El Tm se reduce en aproximadamente 1°C por cada 1 % de falta de coincidencia; por consiguiente, pueden ajustarse el Tm, las condiciones de hibridización y/o lavado para efectuar una hibridización con secuencias con una identidad deseada. Por ejemplo, si se busca una secuencias con >90% de identidad, puede reducirse el Tm en 10°C. Generalmente se seleccionan condiciones severas con temperaturas aproximadamente 5°C menores que el Tm para la secuencia específica y su complemento, a una fuerza iónica y un pH específico. Sin embargo, pueden obtenerse condiciones muy severas utilizando una hibridización y/o un lavado a una temperatura 1 , 2, 3 ó 4°C menor que el Tm; las condiciones de severidad moderada utilizan una hibridización y/o un lavado a una temperatura 6, 7, 8, 9 ó 10°C menor que el punto de fusión térmico (Tm); las condiciones de sevepdad baja utilizan una hibridización y/o un lavado a una temperatura 11 , 12, 13, 14, 15 ó 20°C menor que el punto de fusión térmico (Tm). Usando la ecuación, las condiciones de hibridización y lavado deseadas, y el Tm deseado, aquellos entrenados en la técnica comprenderán que se describen en forma implícita variaciones en la severidad de las soluciones de hibridización y/o lavado. Si el grado de falta de coincidencia resulta en un Tm menor que 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), es preferible incrementar la concentración SSC para usar una temperatura mayor. Puede hallarse una guía extensa para la hibridización de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel ef al., editores (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York), conocido como "Ausubel" de aquí en adelante. Véase también Sambrook, supra. Por consiguiente; las secuencias aisladas que tienen una actividad promotora con preferencia por la raíz e hibrídizan bajo condiciones severas con las secuencias promotoras Cyclol descriptas en la presente documentación, o con fragmentos de éstas, están abarcadas por las realizaciones. En general, las secuencias que tienen actividad promotora e hibridizan con las secuencias promotoras descriptas en la presente documentación serán al menos entre 40% y 50% homologas, entre aproximadamente 60% y 70% homologas, y aún aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% o 98% homologas, o más, con las secuencias descriptas. Es decir, la similitud de secuencia entre las secuencias puede variar, y las secuencias pueden compartir al menos entre aproximadamente 40% y 50%, entre aproximadamente 60% y 70%, y aún 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de similitud de secuencia. Se usan los siguientes términos para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia" y (e) "identidad sustancial". (a) Como se lo usa en la presente documentación, una "secuencia de referencia" es una secuencia definida, usada como la base para realizar una comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo, un segmento o la totalidad de la secuencia de un ADNc o un gen, o la secuencia completa del ADNc o el gen. (b) Como se lo usa en la presente documentación, una "ventana de comparación" incluye referencias a un segmento contiguo y específico de una secuencia de polinucleótidos, donde la secuencia de polinucleótidos puede compararse con una secuencia de referencia, y donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, faltas de coincidencia) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para alinear ambas secuencias en forma óptima. En general, la ventana de comparación tiene al menos 20 nucleótidos contiguos de largo, y opcionalmente puede tener 30, 40, 50, 100 o más. Aquellos entrenados en la técnica comprenden que, para evitar una similitud elevada con una secuencia de referencia debido a la inclusión de faltas de coincidencia en la secuencia de polinucleótidos, típicamente se introduce una penalidad de falta de coincidencia y se la sustrae de la cantidad de coincidencias.

Los métodos para alinear secuencias de nucleótidos y aminoácidos con fines de comparación son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, puede realizarse la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias cualquiera usando un algoritmo matemático. Los ejemplos preferidos no limitantes de estos algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11 -17; el algoritmo de homología local de Smith eí al. (1981 ) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda por similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 872264, modificado como se indica en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Pueden usarse implementaciones informáticas de estos algoritmos matemáticos para comparar secuencias con el fin de determinar la identidad de secuencia. Dichas implementaciones incluyen, sin limitaciones: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible en Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0); el programa ALIGN PLUS (Versión 3.0, copiright 1997): y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Conjunto de Software Wisconsin Genetics del Grupo de Genética Informática, Versión 10 (disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, EEUU). La matriz de calificación usada en la Versión 10 del Conjunto de Software Wisconsin Genetics es BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915). Pueden prepararse alineamientos usando estos programas con los parámetros por omisión. El programa CLUSTAL ha sido bien descripto en Higgins eí al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins ef al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet ef al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang ef al. (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson ef al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. Los programas ALIGN y ALIGN PLUS se basan en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Puede usarse una tabla de ponderación de residuos PAM 120, una longitud de penalidad de falta de coincidencia de 12, y una falta de coincidencia de 4 con el programa ALIGN cuando se compara una secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra. La búsqueda de nucleótidos BLAST puede realizarse con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o un polipéptido de la invención. Para obtener alineamientos con faltas de coincidencia para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se descpbe en Altschul eí al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como alternativa, puede utilizarse PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda repetida que detecte interrelaciones distantes entre moléculas. Ver Altschul ef al. (1997) supra. Cuando se emplea BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, pueden usarse los parámetros por omisión de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase el sitio de Internet del Centro Nacional de Información de Biotecnología. También puede realizarse el alineamiento por inspección manual. También pueden efectuarse los alineamientos por inspección manual. A menos que se establezca lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente documentación hacen referencia a los valores obtenidos usando el programa GAP con los parámetros por omisión, o cualquier programa equivalente. Un "programa equivalente" abarca cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualquiera en cuestión, genera un alineamiento idéntico de coincidencias de nucleótidos o residuos de aminoácidos, y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico, cuando se lo compara con el alineamiento correspondiente generado con GAP. El programa GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) supra, para hallar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de faltas de coincidencia. GAP considera todos los alineamientos posibles y todas las posiciones de falta de coincidencia, y crea el alineamiento con la mayor cantidad de coincidencias de bases y la menor cantidad de faltas de coincidencia. Permite proveer una penalidad de creación de faltas de coincidencia y una penalidad de extensión de faltas de coincidencia en unidades de bases coincidentes. GAP debe crear una ganancia a partir de la cantidad de coincidencias, respecto de la penalidad de creación de faltas de coincidencia, para cada falta de coincidencia que inserta. Si se selecciona una penalidad de extensión de falta de coincidencia mayor que cero, GAP debe además crear una ganancia para cada falta de coincidencia insertada, que abarca la longitud de la falta de coincidencia multiplicada por la penalidad de extensión de falta de coincidencia. Los valores por omisión de creación de faltas de coincidencia y extensión de faltas de coincidencia en la Versión 10 del Conjunto de Software Wisconsin Genetics para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Para secuencias de nucleótidos, la penalidad por omisión de creación de falta de coincidencia es de 50, mientras que la penalidad por omisión de extensión de falta de coincidencia es de 3. Las penalidades de creación de falta de coincidencia y extensión de falta de coincidencia puede expresarse como un número entero seleccionado del grupo de enteros que consiste entre 0 y 200. Por consiguiente, por ejemplo, las penalidades de creación de falta de coincidencia y extensión de faltas de coincidencia pueden ser de 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o más. (c) Como se la usa en la presente documentación, la "identidad de secuencia" o la "identidad", en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son idénticos cuando se efectúa un alineamiento de correspondencia máxima para una ventana de comparación específica. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de residuos que no son idénticas comúnmente difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas, donde se sustituyen los residuos de aminoácidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad), y, por ende, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, puede incrementarse el porcentaje de identidad de secuencia para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren en dichas sustituciones conservativas presentan "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Típicamente, esto comprende evaluar una sustitución conservativa como una falta de coincidencia parcial, en vez de total, lo que incrementa el porcentaje de identidad de secuencia. Por consiguiente, por ejemplo, cuando a un aminoácido idéntico se le asigna un valor de 1 y a una sustitución no conservativa se le asigna un valor de cero, a una sustitución conservativa se le asigna un valor entre cero y 1. El valor de las sustituciones conservativas se calcula, por ejemplo, como se detalla en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California). (d) Como se lo usa en la presente documentación, el "porcentaje de identidad de secuencia" designa el valor determinado por medio de la comparación de dos secuencias alineadas en forma óptima a lo largo de una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, faltas de coincidencia), en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones), para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Se calcula el porcentaje determinando la cantidad de posiciones en las cuales existe una base de ácido nucleico idéntica en ambas secuencias, de modo de obtener la cantidad de posiciones de coincidencia, dividiendo la cantidad de posiciones de coincidencia por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando la cantidad total de posiciones por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. (e)(¡) El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 70% de identidad de secuencia, al menos 80%, al menos 90% y al menos 95%, en comparación con una secuencia de referencia, usando uno de los programas de alineamiento descriptos, con los parámetros convencionales. Aquellos entrenados en la técnica reconocerán que pueden ajustarse apropiadamente estos valores para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos, teniendo en cuenta la degeneración de los codones, la similitud de los aminoácidos, la localización en el marco de lectura y semejantes. La identidad sustancial de secuencias de aminoácidos para estos propósitos normalmente comprende una identidad de secuencia de al menos 60%, 70%, 80%, 90% o 95%. Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es cuando las dos moléculas hibridizan una con otra bajo condiciones severas. Generalmente se seleccionan condiciones severas con temperaturas aproximadamente 5°C menores que el Tm para la secuencia específica, a una fuerza iónica y un pH específico. Sin embargo, las condiciones severas abarcan temperaturas en el rango de entre aproximadamente 1°C y aproximadamente 20°C menores que el Tm, dependiendo del grado de severidad, como se indica de otro modo en la presente documentación. Los ácidos nucleicos que hibridizan unos con otros bajo condiciones severas aún son sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando se crea una copia del ácido nucleico usando la degeneración de codones máxima permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es cuando el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico presenta reactividad inmunológica cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico. La secuencia promotora Cyclol descripta en la presente documentación, así como las variantes y los fragmentos de ésta, es útil para la modificación genética de plantas, por ejemplo, para la producción de una planta transformada o transgénica, para expresar un fenotipo de interés. Como se los usa en la presente documentación, los términos "planta transformada" y "planta transgénica" hacen referencia a una planta que comprende un polinucleótido heterólogo en su genoma. En general, el polinucleótido heterólogo se integra en forma estable en el genoma de una planta transgénica o transformada, de modo que el polinucleótido pasa a las generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede estar integrado en el genoma solo o como parte de una construcción de ADN. Debe comprenderse que, como se lo usa en la presente documentación, el término "transgénico" incluye cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de planta o planta cuyo genotipo ha sido alterado por la presencia del ácido nucleico heterólogo, incluyendo aquellos transgénicos alterados inicialmente de este modo, así como aquellos creados mediante el cruzamiento sexual o la propagación asexual a partir del transgénico inicial. El término "transgénico", como se lo usa en la presente documentación, no comprende la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) por métodos convencionales de cruzamiento de plantas o sucesos de ocurrencia natural, tales como fertilización cruzada al azar, infección por virus no recombinantes, transformación con bactepas no recombinantes, transposición no recombinante o mutación espontánea.

Un "evento" transgénico se produce transformando las células vegetales con una construcción de ADN heteróloga, que incluye un cassette de expresión de ácido nucleico que comprende un transgen de interés, regenerando una población de plantas resultantes de la inserción del transgen en el genoma de la planta, y seleccionando una planta particular caracterizada por la inserción en una localización particular del genoma. En términos fenotípicos, un evento se caracteriza por la expresión del transgen. A nivel genético, un evento es parte de la composición genética de una planta. El término "evento" también hace referencia a la progenie producida por un cruzamiento sexual entre la transformante y otra variedad que ¡ncluye el ADN heterólogo. Como se lo usa en la presente documentación, el término "planta" incluye referencias a plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etcétera), semillas y células vegetales, y progenie de éstas. Dentro del alcance de las realizaciones, las partes de las plantas transgénicas comprenden, por ejemplo, células vegetales, protoplastos, tejidos, callos, embpones, así como flores, tallos, frutos, óvulos, hojas o raíces originadas en las plantas transgénicas o su progenie transformada previamente con una molécula de ADN de las realizaciones, por lo que consisten al menos en parte en células transgénicas, también están contenidas en las realizaciones. Como se lo usa en la presente documentación, el término "célula vegetal" incluye, sin limitaciones, semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callos, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas. La clase de las plantas que pueden usarse en los métodos de la invención es generalmente tan amplia como la clase de las plantas superiores que pueden transformarse empleando procedimientos convencionales, incluyendo especies de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas.

Las secuencias promotoras y los métodos descriptos en la presente documentación son útiles para regular la expresión de cualquier secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta huésped. Por consiguiente, la secuencia de nucleótidos heteróloga unida operativamente a los promotores descriptos en la presente documentación puede ser un gen estructural que codifica una proteína de interés. Los genes de interés reflejan los mercados y los intereses comerciales de aquellos que participan en el desarrollo del cultivo. Los cultivos y los mercados de interés cambian, y a medida que las naciones en desarrollo se abren a los mercados mundiales, también emergen nuevos cultivos y tecnologías. Además, a medida que crece la comprensión de los caracteres y las características agronómicas, tales como el rendimiento y la heterosis, la elección de los genes para la transformación cambia de forma acorde. Las categorías de genes de interés para las realizaciones incluyen, por ejemplo, aquellos genes que participan en la información, tales como los dedos de cinc, aquellos que participan en la comunicación, tales como las quinasas, y aquellos que participan en el mantenimiento, tales como las proteínas de ataque calórico. Las categorías de transgenes más específicos, por ejemplo, incluyen genes que codifican proteínas que confieren resistencia estrés abiótico, como por ejemplo, sequías, temperatura, salinidad y toxinas, tales como plaguicidas y herbicidas, o estrés biótico, como por ejemplo, ataques de hongos, virus, bactepas, insectos y nematodes, y el desarrollo de enfermedades asociadas con estos organismos. Resultan de interés varios cambios en el fenotipo, incluyendo la modificación de la expresión de un gen en una raíz de una planta, la alteración del mecanismo de defensa contra patógenos o insectos en una planta, el incremento de la tolerancia a herbicidas de la planta, la alteración del desarrollo de las raíces como respuesta a estrés ambiental, y semejantes. Pueden obtenerse estos resultados promoviendo la expresión de productos heterólogos o incrementando la expresión de productos endógenos en plantas. Como alternativa, también pueden obtenerse estos resultados mediante la reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, particularmente enzimas, transportadores o cofactores, o afectando la asimilación de nutrientes en la planta. Estos cambios resultan en una alteración del fenotipo de la planta transformada. Se reconoce que cualquier gen de interés puede ser unido operativamente a las secuencias promotoras de las realizaciones, y expresarse en la raíz de una planta. Puede usarse una construcción de ADN que comprende uno de estos genes de interés en técnicas de transformación, tales como aquellas que se describen más adelante, para crear resistencia a enfermedades o insectos en plantas con fenotipos susceptibles o para mejorar la resistencia a enfermedades o insectos en plantas con fenotipos resistentes. Por consiguiente, las realizaciones abarcan métodos que están dirigidos a la protección de las plantas contra patógenos fúngicos, bacterias, virus, nematodes, insectos y semejantes. La "resistencia a enfermedades" o la "resistencia insectos" denotan que las plantas no presentan los síntomas dañinos resultantes de las interacciones planta-patógeno.

Los genes de resistencia a enfermedades y resistencia a insectos, tales como las lisozimas, las cecropinas, las maganinas o las tioninas para la protección contra bacterias, o las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR), tales como las glucanasas, y las quitinasas para la protección contra hongos, o las endotoxinas de Bacillus thuringiensis, los inhibidores de proteasas, las colagenasas, las lectinas y glicosidasas para el control de nematodes o insectos, son todos ejemplos de productos génicos útiles. Los patógenos de las realizaciones incluyen, sin limitaciones, virus o viroides, bacterias, insectos, nematodes, hongos, y semejantes. Los virus incluyen el virus en mosaico del tabaco o el pepino, el virus de las manchas en anillo, el virus de necrosis, el virus en mosaico del maíz enano, etcétera. Los nematodes incluyen nematodes parásitos, tales como los nematodes de los nudos de las raíces, los quistes y las lesiones, etcétera. Los genes de resistencia a insectos pueden codificar resistencia a plagas que producen grandes mermas en el rendimiento, tales como la oruga de la raíz, la oruga cortadora, el taladro del maíz europeo y semejantes. Estos genes incluyen, por ejemplo, los genes de proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (Patentes de los EEUU N° 5366892, 5747450, 5736514, 5723756, 5593881 y Geiser ef al. (1986) Gene 48:109); lectinas (Van Damme ef al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); y semejantes. Los genes que codifican caracteres de resistencia a enfermedades incluyen genes de destoxificación, tales como aquellos contra fumonisina (Patente de los EEUU N° 5792931 ); avirulencia (avr) y los genes de resistencia a enfermedades (R) (Jones ef al. (1994) Science 266:789; Martin ef al. (1993) Science 262:1432; y Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); y semejantes. Pueden introducirse caracteres de resistencia a herbicidas en plantas con genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la acetolactato sintetasa (ALS), en particular los herbicidas tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de acetolactato sintetasa (ALS), que contiene mutaciones que permiten obtener dicha resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra), genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la glutamina sintetasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), u otros genes como los mencionados conocidos en la técnica. La resistencia a glifosato es impartida por los genes de 5-enol piruvilshikimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS) mutante y aroA. Véase, por ejemplo, la Patente de los EEUU N° 4940835, de Shah ef al., donde se descpbe la secuencia de nucleótidos de una forma de EPSPS que puede confepr resistencia a glifosato. En la Patente de los EEUU N° 5627061 también se describen genes que codifican enzimas EPSPS. Véanse también las Patentes de los EEUU N° 6248876; 6040497; 5804425; 5633435; 5145783; 4971908; 5312910; 5188642; 4940835; 5866775; 6225114; 6130366; 5310667; 4535060; 4769061 ; 5633448; 5510471 ; RE 36449; RE 37287 y 5491288; y las publicaciones internacionales WO 97/04103; WO 97/04114; WO 00/66746; WO 01/66704; WO 00/66747 y WO 00/66748, que se incorporan en la presente documentación a modo de referencia con este propósito. También puede obtenerse resistencia a glifosato en aquellas plantas que expresan un gen que codifica una enzima glifosato óxido-reductasa, como se describe con mayor detalle en las Patentes de los EEUU N° 5776760 y 5463175, que se incorporan en la presente documentación a modo de referencia con este propósito. Además, puede impartirse resistencia a glifosato en plantas mediante la sobreexpresión de genes que codifican glifosato N-acetiltransferasa. Véanse, por ejemplo, las Solicitudes de Patentes de los EEUU con N° de Orden 10/004357 y 10/427692. También puede haber genes de esterilidad codificados en una construcción de ADN, los cuales proporcionan una alternativa a la remoción física de espigas. Los ejemplos de genes usados de estas formas incluyen genes con preferencia por los tejidos masculinos y genes con fenotipos de esterilidad masculina, tales como QM, descripto en la Patente de los EEUU N° 5583210. Otros genes incluyen quinasas y aquellos que codifican compuestos tóxicos para el desarrollo de los gametofitos masculinos o femeninos. Los caracteres comerciales también pueden estar codificados por uno o más genes que, por ejemplo, pueden incrementar el contenido de almidón para producir etanol, o proporcionan la expresión de proteínas. Otro uso importante de las plantas transformadas es en la producción de polímeros y bioplásticos, tal como se describe en la Patente de los EEUU N° 5602321. Los genes, tales como la ß-cetotiolasa, la PHBasa (polihidroxibutirato sintetasa) y la acetoacetil-CoA reductasa (véase Schubert eí al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA). Pueden alterarse caracteres de importancia agrícola que afectan la calidad del grano, tales como los niveles y los tipos de aceite, saturados e insaturados, la calidad y la cantidad de aminoácidos esenciales, los niveles de celulosa, almidón y el contenido de proteínas, usando los métodos de las realizaciones. Las modificaciones incluyen el incremento del contenido de ácido oleico, aceites saturados e insaturados, niveles incrementados de lisina y azufre, proporción de aminoácidos esenciales, y también la modificación del almidón. Se describen modificaciones de proteínas de hordotionina en las Patentes de los EEUU N° 5990389, 5885801 , 5885802 y 5703049, incorporadas en la presente documentación a modo de referencia. Otro ejemplo es la proteína rica en lisina y azufre codificada por la albúmina 2S de soja descripta en la Patente de los EEUU N° 5850016, y el inhibidor de quimiotripsína de cebada, descripto en Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, cuyas descripciones se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales, así como aquellos de otras fuentes, incluyendo procariotas y otros eucariotas. Estos productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas y semejantes. Los ejemplos de otros genes que pueden aplicarse, y su fenotipo asociado, incluyen el gen y/o el ARN que codifica la proteína de recubrimiento viral, u otros genes virales o vegetales que confieren resistencia a virus; genes que confieren resistencia a hongos; genes que confieren resistencia a insectos; genes que promueven mejoras en el rendimiento; y genes que proporcionan resistencia al estrés, tal como la deshidratación como resultado del calor y la salinidad, los elementos metálicos o traza tóxicos, o semejantes. En otras realizaciones, las secuencias promotoras Cyclol se unen operativamente a genes de interés que mejoran el crecimiento de la planta o incrementan los rendimientos de los cultivos bajo condiciones de densidad elevada de plantas. Por ejemplo, el promotor Cyclol puede unirse operativamente una secuencia de nucleótidos que expresa genes de importancia agrícola que resultan en sistemas de raíces primarias o laterales mejoradas. Estos genes incluyen, sin limitaciones, transportadores de nutrientes/agua e inductores del crecimiento. Los ejemplos de estos genes incluyen, sin limitaciones, la H+-ATPasa de membrana plasmática de maíz (MHA2) (Frias ef al. (1996) Plant Cell 8:1533-44); AKT1 , un componente del aparato de asimilación de potasio en Arabidopsis (Spalding eí al. (1999) J. Gen. Physiol. 773:909-18); los genes RML, que activan el ciclo de división celular en las células apicales de la raíz (Cheng ef al. (1995) Plant Physiol. 708:881 ); los genes de glutamina sintetasa de maíz (Sukanya et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26:1935-46) y hemoglobina (Duff et al. (1997) J. Biol. Chem. 27:16749-16752; Arredondo-Peter ef al. (1997) Plant Physiol. 775:1259-1266; Arredondo-Peter et al. (1997) Plant Physiol. 774:493-500, y las referencias citadas en dichas publicaciones). El promotor Cyclol también puede ser útil para expresar secuencias de nucleótidos antisentido de genes que afectan negativamente el desarrollo de la raíz bajo condiciones de densidad de siembra elevada. La "ARNi" hace referencia a una serie de técnicas relacionadas para reducir la expresión de genes (véase, por ejemplo, la Patente de los EEUU N° 6506559). Se cree que las técnicas más antiguas, conocidas con otros nombres, se basan en el mismo mecanismo, pero se les da otros nombres en la literatura. Éstos incluyen "inhibición antisentido", la producción de transcriptos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína blanco, y "co-supresión" o "supresión en el sentido del marco de lectura", que hacen referencia a la producción de transcriptos de ARN en el sentido del marco de lectura capaces de suprimir la expresión de genes extraños o endógenos idénticos o sustancialmente similares (Patente de los EEUU N° 5231020, incorporada en la presente documentación a modo de referencia). Estas técnicas se basan en el uso de construcciones que resultan en la acumulación de ARN de cadena doble, con una cadena complementaria con el gen blanco que se desea silenciar. La secuencia promotora Cyclol de las realizaciones, y sus fragmentos o variantes con actividad biológica relacionadas descriptas en la presente documentación, puede usarse para dirigir la expresión de construcciones que resultarán en interferencia de ARN, incluyendo microARN y siARN. La secuencia de nucleótidos heteróloga unida operativamente al promotor Cyclol , y sus fragmentos o variantes con actividad biológica relacionadas descriptas en la presente documentación, puede ser una secuencia antisentido de un gen blanco. La terminología "secuencia de nucleótidos de ADN antisentido" designa una secuencia que está en orientación inversa, en la orientación normal 5' a 3', respecto de dicha secuencia de nucleótidos. Cuando se la administra a una célula vegetal, la expresión de la secuencia de ADN antisentido evita la expresión normal de la secuencia de nucleótidos de ADN del gen blanco. La secuencia de nucleótidos antisentido codifica un transcripto de ARN que es complementario y capaz de hibridizar con el ARN mensajero endógeno (ARNm) producido por la transcripción de la secuencia de nucleótidos de ADN del gen blanco. En este caso, se inhibe la producción de la proteína nativa codificada por el gen blanco para obtener una respuesta fenotípica deseada. Pueden realizarse modificaciones de las secuencias antisentido siempre que las secuencias hibridicen e interfieran con la expresión del ARNm correspondiente. De este modo, pueden usarse construcciones antisentido que tienen, por ejemplo, 70%, 80% u 85% de identidad de secuencia con las secuencias antisentido correspondientes. Además, pueden usarse porciones de los nucleótidos antisentido para alterar la expresión del gen blanco. En general, pueden usarse secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos o más. Por consiguiente, las secuencias promotoras descriptas en la presente documentación pueden unirse operativamente a secuencias de ADN antisentido para reducir o inhibir la expresión de una proteína nativa en la planta. En una realización, las construcciones de ADN comprenderán una región de inicio de la transcripción que comprenderá una de las secuencias de nucleótidos promotoras descriptas en la presente documentación, o variantes o fragmentos de ésta, unida operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga cuya expresión se desee controlar con el promotor de las realizaciones. Esta construcción de ADN contiene una pluralidad de sitios de restricción para insertar la secuencia de nucleótidos bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. Además, la construcción de ADN puede contener genes marcadores de selección. La construcción de ADN incluirá, en la dirección de transcripción 5' a 3': Las regiones reguladoras (es decir, los promotores, las regiones de regulación de la transcripción y las regiones de terminación de la traducción) y/o el polinucleótido de las realizaciones pueden ser nativos/análogos respecto de la célula huésped o unos de otros. Como alternativa, las regiones reguladoras y/o el polinucleótido de la invención pueden ser heterólogos respecto de la célula huésped o unos de otros. Como se lo usa en la presente documentación, "heteróloga", en referencia a una secuencia, es una secuencia que se origina a partir de una especie extraña, o, si es de la misma especie, está sustancialmente modificada en comparación con su forma nativa, en lo referente a su composición y/o su locus genómico, merced a la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la que deriva el polinucleótido, o, si es de una especie igual/análoga, uno o ambos están sustancialmente modificados respecto de su forma y/o su locus genómico original, o el promotor no es el promotor nativo del polinucleótido unido operativamente. La región de terminación incluida opcionalmente puede ser nativa respecto de la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa respecto del polinucleótido de interés unido operativamente, puede ser nativa respecto de la planta huésped, o puede derivar de otra fuente (es decir, puede ser extraña o heteróloga) respecto del promotor, el polinucleótido de interés, el huésped o cualquier combinación de éstos. Existen regiones de terminación convenientes disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de finalización de la octopina sintetasa y la nopalina sintetasa. Véanse también Guerineau et al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991 ) Cell 64:671 -674; Sanfacon eí al. (1991 ) Genes Dev. 5:141 -149; Mogen ef al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91 :151 -158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi ef al. (1987) Nucleic Acids Res. :9627-9639. En realizaciones particulares, se usa el terminador del gen del inhibidor de proteasa de papa II (Pinll). Véanse, por ejemplo, Keil ef al. (1986) Nucí. Acids Res. 14:5641-5650; y An ef al. (1989) Plant Cell 1 :115-122, incorporados por completo en la presente documentación a modo de referencia.

La construcción de ADN que comprende una secuencia promotora de las realizaciones, unida operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga, también contiene al menos una secuencia de nucleótidos adicional de un gen que se desea cotransformar en el organismo. Como alternativa, pueden proporcionarse secuencias adicionales en otra construcción de ADN. Cuando sea apropiado, podrá optimizarse la secuencia de nucleótidos heteróloga, cuya expresión estará bajo el control de la secuencia promotora de las realizaciones y cualquier secuencia de nucleótidos adicional, para obtener una expresión incrementada en la planta transformada. Es decir, podrán sintetizarse estas secuencias de nucleótidos usando codones preferidos por la planta para obtener una expresión mejorada. En la técnica existen métodos disponibles para sintetizar secuencias de nucleótidos con preferencia por las plantas. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EEUU N° 5380831 y 5436391 , y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporados en la presente documentación a modo de referencia. Se conocen otras modificaciones de secuencia para potenciar la expresión genética en una célula huésped. Éstas incluyen la eliminación de las secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitios de separación de exones-intrones, repeticiones tipo transposón y otras secuencias bien caracterizadas de este topo, que puedan ser perjudiciales para la expresión genética. Puede ajustarse el contenido de G-C de la secuencia de nucleótidos heteróloga de acuerdo con los niveles promedio para un huésped celular dado, calculados en referencia a genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando sea posible, se modificará la secuencia para evitar estructuras secundarias de ARNm en hebilla.

Además, las construcciones de ADN pueden contener secuencias directrices 5'. Dichas secuencias directrices pueden servir para potenciar la traducción. Las directrices de la traducción son conocidas en la técnica e incluyen las siguientes: directrices de picornavirus, por ejemplo, la directriz EMCV (región no codificante 5' de la encefalomiocarditis) (Elroy-Stein ef al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); directrices de potivirus, por ejemplo, la directriz TEV (Virus de la Roya del Tabaco) (Allison et al. (1986) Virology 754:9-20); la directriz MDMV (Virus en Mosaico del Maíz Enano) y la proteína que se une a las cadenas pesadas de la inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991 ) Nature 353:90-94); la directriz no traducida del ARNm de la proteína de recubrimiento del virus en mosaico de la alfalfa (AMV ARN 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); la directriz del virus en mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology of RNA, paginas 237-256); y la directriz del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel ef al. (1991 ) Virology 81 :382- 385). Véase también, Della-Cioppa ef al. (1987) Plant Physiol. también pueden utilizarse otros métodos conocidos para mejorar la traducción y/o la estabilidad del ARNm, por ejemplo, intrones, tales como el intrón de la ubiquitina de maíz (Christensen y Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218; Christensen et al. (1992) Plant Molecular Biology 18:675-689) o el intrón Adhl de maíz (Kyozuka et al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 228:40-48; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357) y semejantes. Las construcciones de ADN de las realizaciones también incluyen otros potenciadores, ya sean potenciadores de la traducción o la transcripción, según se los necesite. Estas regiones potenciadoras son bien conocidas por aquellos entrenados en la técnica, y pueden incluir el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. El codón de inicio debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante para asegurar la traducción de la secuencia completa. Las señales de control de la traducción y los codones de inicio pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. Pueden introducirse regiones de inicio de la traducción de la fuente de la región de inicio de la transcripción, o del gen estructural. La secuencia también puede derivar del elemento regulador seleccionado para expresar el gen, y puede modificarse específicamente para incrementar la traducción del ARNm. Se reconoce que puede utilizarse el incremento de los niveles de transcripción en combinación con las regiones promotoras de las realizaciones. En la técnica se conocen potenciadores, y éstos incluyen la región potenciadora SV40, el elemento potenciador 35S y semejantes. En la preparación de la construcción de ADN, pueden manipularse los distintos fragmentos de ADN para obtener las secuencias de ADN en la orientación apropiada, y, cuando resulte apropiado, en el marco de lectura apropiado. Con este fin, pueden emplearse adaptadores o conectores para unir los fragmentos de ADN, o puede recurrirse a otras manipulaciones para proporcionar los sitios de restricción convenientes. Pueden agregarse o eliminarse sitios de restricción, puede eliminarse ADN superfluo o pueden efectuarse otras modificaciones semejantes a las secuencias de las realizaciones. Con este propósito, puede emplearse mutagénesis in vitro, reparación con cebadores, restricción, alineamiento, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones. Pueden incluirse genes informantes o genes marcadores de selección en las construcciones de ADN. Por ejemplo, pueden hallarse ejemplos de genes informantes apropiados conocidos en la técnica en Jefferson ef al. (1991 ), en Plant Molecular Biology Manual, editado por Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), pp. 1 -33; DeWet ef al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737; Goff et al. (1990) EMBO J. 9:2517-2522; Kain et al. (1995) BioTechniques 79:650-655; y Chiu et al. (1996) Current Biology 6:325-330. Los genes marcadores de selección para seleccionar células o tejidos transformados pueden incluir genes que confieren resistencia a antibióticos o resistencia a herbicidas. Los ejemplos de genes marcadores de selección apropiados incluyen, sin limitaciones, genes que codifican resistencia a cloramfenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella ef al. (1983) Nature 303:209-213; Meijer eí al. (1991 ) Plant Mol. Biol. 76:807-820); higromicina (Waldron ef al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103-108; Zhijian ef al. (1995) Plant Science 708:219-227); estreptomicina (Jones ef al. (1987) Mol. Gen. Genet. 270:86-91 ); espectinomicina (Bretagne-Sagnard ef al. (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille ef al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 75:127-136); bromoxinil (Stalquer et al. (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481 ); fosfinotricina (DeBlock eí al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518). Otros genes que pueden ser útiles en la recuperación de los eventos transgénicos, pero que pueden no ser necesarios en el producto final, incluyen, sin limitaciones, ejemplos tales como GUS (ß-glucuronidasa; Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (proteína fluorescente verde; Chalfie ef al. (1994) Science 263:802), luciferasa (Riggs et al. (1987) Nucleic Acids Res. 75(19):8115 y Luehrsen et al. (1992) Methods Enzymol. 276:397-414), y los genes de maíz que codifican la producción de antocianina (Ludwig et al. (1990) Science 247:449). Las moléculas de ácidos nucleicos de las realizaciones son útiles en los métodos dirigidos a la expresión de una secuencia de nucleótidos en una planta.

Esto puede efectuarse transformando una célula vegetal de interés con una construcción de ADN que comprende un promotor identificado en la presente documentación, unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga, y regenerando una planta transformada en forma estable a partir de dicha célula vegetal. Los métodos de las realizaciones también se relacionan con la expresión de una secuencia de nucleótidos en una planta. Estos métodos comprenden transformar una célula vegetal con una construcción de ADN que comprende un promotor identificado en la presente documentación que inicia la transcripción en una célula vegetal de una forma específica por la raíz, unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga, y regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal. La construcción de ADN que comprende la secuencia promotora particular de las realizaciones, unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés, puede usarse para transformar cualquier planta. De este modo, pueden obtenerse plantas modificadas genéticamente, es decir, plantas transgénicas o transformadas, células vegetales, tejido vegetal, semillas, raíces y semejantes. Las especies de plantas apropiadas para las realizaciones incluyen, sin limitaciones, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, S. napus, B. rapa, B. júncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceites de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Sécale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perlado (Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorro (Setaria itálica), mijo ahusado (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glicine max), tabaco (Nicotiana tabacum), papa (Solanum tuberosum), maní (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), casava (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucífera), ananá (Ananas comosus), árboles de cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), avocado (Persea americana), higo (Ficus casica), guava (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardio (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, verduras, plantas ornamentales y coniferas. Las verduras incluyen tomate (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), judías lima (Phaseolus limensis), arvejas (Lathyrus spp.), y miembros de los géneros Cucumis, tales como pepino (C. sativus), melón (C. cantalupensis), y melón musk (C. meló). Las ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hidrangea (Macrophylla hidrangea), hibiscus (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), clavel (Dianthus caryophyllus), pastora roja (Euphorbia pulcherrima), y crisantemo. Las coniferas que pueden emplearse en la práctica de las realizaciones incluyen, por ejemplo, pinos, tales como el pino loblolly, (Pinus taeda), el pino del incienso (Pinus elliotii), el pino ponderosa (Pinus ponderosa), el pino lodgepole (Pinus contorta) y el pino de Monterrey (Pinus radiata); el abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii); la Tsuga del Oeste (Tsuga canadensis); el abeto Sitka (Picea glauca); la secuoya (Sequoia sempervirens); los abetos verdaderos, tales como el abeto de oro (Abies amabilis); y abeto balsam (Abies balsamea); y los cedros, tales como el cedro rojo del Oeste (Thuja plicata) y el cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). En realizaciones específicas, las plantas de las realizaciones son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, maní, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etcétera). Por ejemplo, esta invención es apropiada para cualquier miembro de la familia de plantas monocotiledóneas, incluyendo, sin limitaciones, maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, ananá, ñame, cebolla, banana, coco y dátiles. Como se lo usa en la presente documentación, un "vector" hace referencia a una molécula de ADN, tal como un plásmido, un cósmido o un fago bacteriano para introducir una construcción de nucleótidos, por ejemplo, una construcción de ADN, en una célula huésped. Los vectores de clonación típicamente contienen uno o una pequeña cantidad de sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción, en los que pueden insertarse secuencias de ADN extrañas de forma determinable, sin que se pierda la función biológica esencial del vector, así como un gen marcador apropiado para usar en la identificación y la selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores típicamente incluyen genes que proporcionan resistencia a tetraciclina, resistencia a higromicina o resistencia a ampicilina. Los métodos de las realizaciones comprenden la introducción de una construcción de nucleótidos en una planta. Por "introducción" se interpreta la presentación de la construcción de nucleótidos a la planta, de modo que la secuencia accede al interior de una célula de la planta. Los métodos de las realizaciones no dependen de un método particular para introducir una construcción de nucleótidos en una planta, sino solamente de que la construcción de nucleótidos acceda al interior de al menos una célula de la planta. En la técnica se conocen métodos para introducir construcciones de nucleótidos en plantas, incluyendo, sin limitaciones, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.

Por "transformación estable", se interpreta que se introduce la construcción de nucleótidos en una planta, de modo que se integra en el genoma de la planta y puede ser heredada por la progenie de ésta. Por "transformación transitoria", se interpreta que la construcción de nucleótidos introducida en una planta no se integra en el genoma de la planta. Las construcciones de nucleótidos de las realizaciones pueden introducirse en las plantas poniendo en contacto las plantas con un virus o con ácidos nucleicos virales. En general, estos métodos comprenden incorporar una construcción de nucleótidos de las realizaciones en una molécula de ADN o ARN viral. En la técnica se conocen métodos para introducir construcciones de nucleótidos en plantas y expresar una proteína codificada por ellas, que comprenden moléculas de ADN o ARN viral. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EEUU N° 5889191 , 5889190, 5866785, 5589367 y 5316931 , incorporadas en la presente documentación a modo de referencia. Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas, pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal que se desea transformar, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea. Los métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótidos en plantas e insertarlos subsiguientemente en el genoma de la planta incluyen microinyección microinyección (Crossway eí al. (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs ef al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de los EEUU N° 5981840 y 5563055), transferencia directa de genes (Paszkowski eí al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), y aceleración balística de partículas (véanse, por ejemplo, Sanford et al., Patentes de los EEUU N° 4945050, 5879918, 5886244, 5932782, Tomes et al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, editado por Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); y McCabe eí al. (1988) Biotechnology 6:923-926). También véanse Weissinger ef al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou ef al. (1988) Plant Physiol. 87:671 -674 (soja); McCabe ef al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991 ) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Patentes de los EEUU N° 5240855, 5322783 y 5324646; Tomes ef al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, editado por Gamborg (Springer-Verlag, Berlín) (maíz); Klein ef al. (1988) Plant Physiol. 91 :440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren eí al. (1984) Nature (Londres) 311 :763-764; Patente de los EEUU N° 5736369 (cereales); Bytebier ef al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, editado por Chapman eí al. (Longman, Nueva York), pp. 197-209 (polen); Kaeppler ef al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler ef al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por fibrillas); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407- 413 (arroz); Osjoda ef al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz vía Agrobacierium tumefaciens); todas los cuales se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. Las células que hayan sido transformadas podrán cultivarse para dar plantas de acuerdo con métodos convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick ef al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas pueden luego cultivarse y polinizarse con la misma cepa transformada o con distintas cepas, y puede identificarse el híbrido resultante que presenta una expresión de la característica fenotípica deseada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para asegurar que se mantenga en forma estable y se herede la expresión de la característica fenotípica deseada, y luego pueden cosecharse las semillas para asegurar que se haya logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. Por consiguiente, como se lo usa en la presente documentación, el término "semillas transformadas" hace referencia a las semillas que contienen la construcción de nucleótidos integrada en forma estable en el genoma de la planta. Existe una variedad de métodos para regenerar plantas a partir de tejido vegetal. El método de regeneración particular dependerá del tejido vegetal inicial y la especie de planta particular a regenerar. La regeneración, el desarrollo y el cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplastos de plantas individuales o a partir de varios explantes transformados son bien conocidos en la técnica (Weissbach y Weissbach, (1988) en: Methods for Plant Molecular Biology, (Editores), Academic Press, Inc., San Diego, CA). Este proceso de regeneración y desarrollo típicamente incluye los pasos de selección de las células transformadas, cultivo de aquellas células individualizadas a través de las etapas usuales del desarrollo embrionario, hasta la etapa de plántula con raíz. Los embriones y las semillas transgénicas se regeneran de forma similar. Luego se siembran los brotes con raíces resultantes en un medio apropiado para el cultivo de plantas, tal como tierra. Preferiblemente, las plantas regeneradas se autopolinizan para proporcionar plantas transgénícas homocigotas. Caso contrario, se cruza el polen obtenido de las plantas regeneradas con plantas de líneas de importancia agronómica desarrolladas a partir de semillas. Por otro lado, se usa el polen de plantas de estas líneas importantes para polinizar plantas regeneradas.

Una planta transgénica de las realizaciones que contiene un polipéptido deseado se cultiva usando métodos bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica. En las realizaciones se proporcionan composiciones para analizar compuestos que modulan la expresión en las plantas. Los vectores, las células y las plantas pueden usarse para analizar moléculas candidatas en busca de agonistas y antagonistas del promotor Cyclol . Por ejemplo, un gen informante puede unirse con un promotor Cyclol y puede expresarse como un transgen en una planta. Se agregan los compuestos que se desea expresar, y se mide la expresión genética para determinar el efecto sobre la actividad promotora. Las realizaciones de la invención se relacionan con composiciones y métodos para impactar enfermedades vegetales e insectos plaga, particularmente plagas de plantas. Más específicamente, los ácidos nucleicos aislados de las realizaciones, y los fragmentos y las variantes de éstos, comprenden secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos plaguicidas (por ejemplo, proteínas). Las proteínas plaguicidas tienen actividad biológica (por ejemplo, plaguicida) contra insectos plaga. Otras realizaciones incluyen composiciones que comprenden los ácidos nucleicos aislados, y fragmentos y variantes de éstos, que codifican polipéptidos plaguicidas, construcciones de ADN que comprenden secuencias de nucleótidos de realizaciones de la invención, proteínas plaguicidas aisladas, y composiciones plaguicidas. Además, en otras realizaciones se proporcionan plantas y microorganismos transformados con estos nuevos ácidos nucleicos, y métodos que comprenden el uso de estos ácidos nucleicos, composiciones plaguicidas, organismos transformados y productos de éstos, para impactar insectos plaga. Las secuencias de ácidos nucleicos y nucleótidos descriptas en la presente documentación pueden usarse para transformar cualquier organismo para producir las proteínas plaguicidas codificadas. Se proporcionan métodos que comprenden el uso de estos organismos transformados para impactar o controlar plagas de plantas. Las secuencias de ácidos nucleicos y nucleótidos también pueden usarse para transformar organelas, tales como cloroplastos (McBride eí al. (1995) Biotechnology 13:362-365; Kota ef al. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 96: 1840-1845). Además, en algunas realizaciones se proporcionan fragmentos y variantes de la secuencias codificantes de ocurrencia natural que también codifican polipéptidos con actividad biológica (por ejemplo, plaguicidas). Estas secuencias de nucleótidos pueden usarse directamente en métodos para impactar plagas. Por consiguiente, las realizaciones de la invención comprenden nuevos abordajes para impactar insectos plaga que no dependen del uso de los plaguicidas tradicionales de tipo químico sintético. Algunas realizaciones comprenden el descubrimiento de plaguicidas biodegradables de ocurrencia natural, y los genes que los codifican. Las realizaciones de la invención también incluyen secuencias de ácidos nucleicos que han sido optimizadas para que sean expresadas por las células de un organismo particular, por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos que han sido retro-traducidas (es decir, traducidas en forma inversa) usando codones preferidos por la planta, sobre la base de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene actividad plaguicida mejorada. En otras realizaciones se proporcionan mutaciones que confieren propiedades mejoradas o alteradas a los polipéptidos que las comprenden. Estas mutaciones pueden utilizarse con cualquier secuencia de fondo, siempre que la toxina proporcionada presenta una actividad plaguicida alterada o mejorada. En las realizaciones de la presente invención se proporcionan, entre otros, composiciones y métodos para modular el nivel total de polipéptidos y/o alterar sus relaciones en una a planta. Como se lo usa en la presente documentación, el término "modulación" designa el ¡ncremento o la disminución de un carácter, una cualidad, una sustancia o una respuesta particular. Las composiciones comprenden secuencias de nucleótidos y aminoácidos de plantas de diversas especies. Como se los usa en la presente documentación, los términos "patógeno vegetal" o "plaga vegetal" hacen referencia a cualquier organismo que puede provocar daños a una planta. Una planta puede ser dañada mediante la inhibición o la pérdida de velocidad de crecimiento, por daños en sus tejidos, por el debilitamiento de su sistema inmune, por una reducción en su resistencia a estrés abiótico, por su muerte prematura, y semejantes. Como se los usa en la presente documentación, los términos "resistencia a enfermedades" o "resistencia a patógenos" denotan que los organismos evitan los síntomas de la enfermedad que constituyen el resultado de las interacciones organismo-patógeno. Es decir se evita que los patógenos causen las enfermedades y los síntomas asociados, o como alternativa, se minimizan o reducen los síntomas causados por el patógeno. Como se los usa en la presente documentación, los términos "actividad plaguicida" y "actividad insecticida" son sinónimos que hacen referencia a una actividad de un organismo o una sustancia (tal como, por ejemplo, una proteína) que puede ser medida, e incluye, sin limitaciones, la mortalidad de la plaga, la pérdida de peso de la plaga, la repelencia de la plaga, y otros cambios comportamentales y físicos de una plaga, después de alimentarla y exponerla por un período de tiempo apropiado. De este modo, la actividad plaguicida impacta al menos un parámetro mensurable de la aptitud de la plaga. Por consiguiente, la "actividad plaguicida" y la "actividad insecticida" incluyen, sin limitaciones, el antagonismo del daño causado por insectos plaga en la planta. Por ejemplo, las "proteínas plaguicidas" son proteínas que presentan actividad plaguicida por sí solas o en combinación con otras proteínas. Las endotoxinas son proteínas plaguicidas. Otros ejemplos de proteínas plaguicidas incluyen, por ejemplo, la pentina-1 (véanse las Patentes de los EEUU N° 6057491 y 6339144). De forma similar, un "agente plaguicida" actuará suprimiendo, controlando y/o matando un patógeno invasor. Una "composición insecticida" denota que las composiciones de realizaciones tienen actividad contra insectos plaga de plantas, por lo que son capaces de suprimir, controlar y/o matar el insecto invasor. Una composición insecticida de las realizaciones reducirá los síntomas resultantes del ataque del insecto al menos entre aproximadamente 5% y aproximadamente 50%, al menos entre aproximadamente 10% y aproximadamente 60%, al menos entre aproximadamente 30% y aproximadamente 70%, al menos entre aproximadamente 40% y aproximadamente 80%, o al menos entre aproximadamente 50% y aproximadamente 90%, o más. Por consiguiente, los métodos de las realizaciones de la invención pueden utilizarse para proteger los organismos, particularmente las plantas, de los insectos invasores. Los ensayos que miden la actividad insecticida son comúnmente conocidos en la técnica, e incluyen los bioensayos de alimentación de insectos. Véanse, por ejemplo, Marrone ef al. (1985) J. Econ. Entomol. 78:290-293 y Czapla y Lang (1990) J Econ. Entomol. 83:2480-2485, incorporados en la presente documentación a modo de referencia. El estadio de desarrollo óptimo para ensayar la actividad plaguicida es la forma de larva o las formas inmaduras de estos insectos plaga mencionados previamente. Los insectos pueden desarrollarse en oscuridad total, entre aproximadamente 20°C y aproximadamente °C, y con entre aproximadamente 30% y aproximadamente 70% de humedad relativa. Los métodos de recolección de las larvas de insectos y realización de ensayos biológicos son bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Aquellos entrenados en la técnica conocen una variedad de procedimientos de bioensayo. Los procedimientos generales incluyen la adición del compuesto o el organismo experimental a la fuente de dieta en un recipiente cerrado. La actividad plaguicida puede medirse, sin limitaciones, a través de cambios en la mortalidad, la pérdida de peso, la atracción, la repelencia y otros cambios comportamentales y físicos después de la alimentación y la exposición por un período de tiempo apropiado. Los bioensayos descriptos en la presente documentación pueden usarse con cualquier insecto plaga que se alimente de la planta, en la etapa larval o adulta. Las composiciones de las realizaciones pueden usarse en una variedad de métodos, en los que pueden expresarse los productos proteicos en plantas de cultivo para que actúen como proteínas insecticidas. Las composiciones de las realizaciones pueden expresarse en una planta de cultivo, tal como maíz o soja, para que funcionen como un agente insecticida. También es posible alterar la expresión de las proteínas de las realizaciones, lo que resulta en el cambio o la modulación del nivel, el tejido o el cronograma de la expresión, con el fin de obtener la resistencia deseada al insecto. La secuencia codificante de la ciclotida puede usarse en combinación con un promotor introducido en una planta de cultivo. En una realización, puede utilizarse un promotor constitutivo con un alto nivel de expresión, lo que resulta en niveles de expresión elevados de la ciclotida. En otras realizaciones, la secuencia codificante puede estar unida operativamente con un promotor con preferencia tisular para dirigir la expresión a un tejido vegetal conocido como susceptible al patógeno. Del mismo modo, puede utilizarse la manipulación del momento de la expresión. Por ejemplo, realizando una elección juiciosa del promotor, puede mejorarse la expresión temprano en el crecimiento de la planta, de modo que pueda responder a un ataque de patógenos. Del mismo modo, pueden usarse promotores inducibles con patógenos, donde la expresión de la ciclotida se active en presencia del patógeno. Si se lo desea, puede usarse un péptido de tránsito para dirigir la localización celular del producto proteico. De este modo, puede usarse el péptido de tránsito nativo o un péptido de tránsito heterólogo. Sin embargo, se reconoce que los métodos de las realizaciones abarcan la expresión extracelular y la expresión intracelular. Las secuencias de las realizaciones, tal como se las describe con mayor detalle más adelante, comprenden secuencias codificantes, secuencias antisentido y fragmentos y variantes de éstas. Puede usarse la expresión de las secuencias de las realizaciones para modular la expresión de las proteínas de ciclotida correspondientes. Las composiciones y los métodos de las realizaciones pueden usarse para mejorar la resistencia a insectos plaga de plantas. El método comprende transformar en forma estable una planta con una secuencia de nucleótidos capaz de modular el sistema de defensa contra insectos de la planta, unida operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión de un gen en una célula vegetal. "Mejorar la resistencia" denota incrementar la tolerancia de la planta a los insectos. Es decir, la ciclotida puede reducir la velocidad o prevenir la infección y/o la dispersión del insecto. En consecuencia, puede usarse polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 30 nucleótidos contiguos derivados de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID N° 11 , y su complemento, en métodos para seleccionar un polinucleótido aislado que afecta la expresión de un polipéptido de ciclotida vegetal en una célula huésped. Por ejemplo, un polinucleótido aislado que comprende al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60 o al menos cualquier cantidad de nucleótidos, hasta la extensión completa de SEQ ID N° 11. Un método para seleccionar un polinucleótido aislado que afecta el nivel de expresión de un polipéptido en un virus o una célula huésped (ecuariota, tal como una planta o una levadura, procariota, tal como una bacteria) puede comprender los pasos de: construir un polinucleótido aislado de las realizaciones o un gen quimérico aislado introducir el polinucleótido aislado o el gen quimérico aislado en una célula huésped; medir el nivel de un polipéptido o la actividad enzimática en la célula huésped que contiene el polinucleótido aislado; y comparar el nivel de un polipéptido o la actividad enzimática en la célula huésped que contiene el polinucleótido aislado con el nivel de un polipéptido o la actividad enzimática en una célula huésped que no contiene el polinucleótido aislado. Pueden aislarse genes que codifican otras ciclotidas vegetales en forma directa, como ADNc o ADN genómico, usando la totalidad o una porción de los fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención como sondas de hibridización de ADN para analizar bibliotecas de cualquier planta deseada, empleando metodologías bien conocidas por aquellos entrenados en la técnica. Los oligonucleótidos sonda específicos basados en las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención pueden diseñarse y sintetizarse empleando métodos conocidos en la técnica (Sambrook ef al. (1989), supra). Más aún, pueden usarse las secuencias completas en forma directa para sintetizar sondas de ADN, empleando métodos conocidos por aquellos entrenados en la técnica, tales como la marca de ADN con cebadores al azar, el traslado de muescas o los procedimientos de marca terminal, o sondas de ARN, usando sistemas de transcripción in vitro disponibles. Además, pueden diseñarse cebadores específicos, y puede usárselos para amplificar una parte o la totalidad de las secuencias de la presente invención. Los productos de amplificación resultantes pueden marcarse directamente durante las reacciones de amplificación, o pueden marcarse después de las reacciones de amplificación, y puede usárselos como sondas para aislar fragmentos de ADNc o genómicos completos bajo condiciones de severidad apropiadas. Además, pueden emplearse dos segmentos cortos de los fragmentos de ácidos nucleicos de la invención en protocolos de PCR para amplificar fragmentos más largos de ácidos nucleicos que codifican genes homólogos de ADN o de ARN. La PCR también puede llevarse a cabo con una biblioteca de fragmentos clonados de ácidos nucleicos, donde la secuencia de un cebador deriva de los fragmentos de ácidos nucleicos de la invención y la secuencia del otro cebador aprovecha la presencia de las extensiones de ácido poliadenílico hacia el extremo 3' de los genes vegetales que codifican el precursor de ARNm. Como alternativa, la secuencia del segundo cebador puede basarse en secuencias derivadas del vector de clonación. Por ejemplo, aquellos entrenados en la técnica pueden emplear el protocolo RACE (Frohman et al, (1988) Proc Nati Acad Sci USA 85: 8998-9002) para generar ADNc utilizando PCR para amplificar copias de la región entre un solo punto en el transcripto y el extremo 3' o 5'. Los cebadores orientados en las direcciones 3' y 5' pueden diseñarse a partir de las secuencias de la invención. El uso de los sistemas 3' RACE o 5' RACE disponibles comercialmente (BRL) permite aislar fragmentos de ADNc 3' o 5' específicos (Ohara eí al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:5673-5677; Loh et al. (1989) Science 243:217-220). Los productos generados mediante los procedimientos 3' y 5' RACE pueden combinarse para generar ADNc completos (Frohman y Martin (1989) Techniques 1 :165). En consecuencia, en estos métodos puede usarse un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos uno de cada 60 (preferiblemente al menos uno de cada 40, más preferiblemente al menos uno de cada 30) nucleótidos contiguos depvados de la secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 11 y su complemento, para obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica una porción sustancial de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de las realizaciones. Las realizaciones se relacionan con un método para obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica una porción sustancial de un polipéptido de ciclotida, que comprende los pasos de: sintetizar un oligonucleótido cebador que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 10, al menos 20 o al menos 30, o más, nucleótidos contiguos, derivados de la secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 11 , y su complemento; y amplificar un fragmento de ácido nucleico usando el oligonucleótido cebador. El fragmento de ácido nucleico amplificado codificará preferiblemente una porción de un polipéptido de ciclotida vegetal. La disponibilidad de las presentes secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos deducidas de la invención facilita el estudio inmunológico de bibliotecas de expresión de ADNc. Pueden sintetizarse los péptidos sintéticos que representan porciones de las secuencias de aminoácidos de la invención. Estos péptidos pueden utilizarse para inmunizar animales con el fin de producir anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidad para los péptidos o las proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos. Estos anticuerpos pueden utilizarse entonces para rastrear bibliotecas de expresión de ADNc con el fin de aislar los clones de ADNc de longitud completa de interés (Lerner (1984) Adv. Immunol. 36:1 -34; Sambrook ef al. (1989) supra).

Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica de la proteína nativa, y por consiguiente, tienen actividad de ciclotida, por ejemplo, actividad insecticida, por lo que afectan las respuestas a patógenos. Como alternativa, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos que son útiles como sondas de hibridización generalmente no codifican fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica. Por consiguiente, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden tener una longitud que varía entre al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta la longitud completa de las secuencias de nucleótidos que codifica las proteínas de las realizaciones. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos de ciclotida que codifica una porción con actividad biológica de una proteína de ciclotida de las realizaciones codificará al menos 10, 15, 25, 30, 50, 100 aminoácidos contiguos, o hasta la cantidad total de aminoácidos presentes en una proteína completa de las realizaciones. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos de ciclotida que son útiles como sondas de hibridización para cebadores de PCR generalmente no necesitan codificar una porción con actividad biológica de una proteína de ciclotida. Por consiguiente, un fragmento de una secuencia de nucleótidos de ciclotida puede codificar una porción con actividad biológica de una proteína de ciclotida, o puede ser un fragmento que pueda usarse como una sonda de hibridización o un cebador de PCR, empleando los métodos descriptos en la presente documentación. Puede prepararse una porción con actividad biológica de una proteína de ciclotida aislando una porción de una de las secuencias de nucleótidos de ciclotidas de las realizaciones, expresando la porción de la proteína de ciclotida codificada (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la porción de la proteína de ciclotida codificada. Las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de ciclotida comprenden al menos 16, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250 ó 300 nucleótidos, o hasta la cantidad de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos de ciclotida completa descripta en la presente documentación. Las "variantes" designan secuencias sustancialmente similares. Para las secuencias de nucleótidos, las variantes conservativas incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos de ciclotidas de las realizaciones. Pueden identificarse variantes alélicas de ocurrencia natural como éstas mediante el uso de procedimientos conocidos de biología molecular, tales como por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridización detalladas en la presente documentación. Las variantes de las secuencias de nucleótidos también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas en forma sintética, tales como aquellas generadas, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida a sitios específicos, pero que aún codifican una proteína de las realizaciones. Generalmente, las variantes de una secuencia de nucleótidos de las realizaciones en particular tendrán al menos aproximadamente 50%, 60%, 65%, 70%, generalmente al menos aproximadamente 75%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos particular, donde la determinación se efectúa empleando los programas de alineamiento de secuencias descriptos en otra parte la presente documentación, con los parámetros por omisión.

Una "proteína variante" designa una proteína que deriva de una proteína nativa por deleción (también denominada corte) o adición de uno o más aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína nativa; la deleción o la adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios de la proteína nativa, o la sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Las variantes de las proteínas comprendidas por la presente invención presentan actividad biológica, es decir, aún retienen la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, la actividad de ciclotida descripta en la presente documentación. Dichas variantes pueden ser el resultado, por ejemplo, de polimorfismos genéticos o de la manipulación humana. Las variantes de una proteína de ciclotida nativa de las realizaciones tendrán al menos aproximadamente 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, generalmente al menos aproximadamente 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, incluyendo al menos aproximadamente 98%, 99% o más identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, determinada empleando los programas de alineamiento de secuencias descpptos en otra parte la presente documentación, con los parámetros por omisión. Una variante con actividad biológica de una proteína de las realizaciones puede diferir de dicha proteína en tan poco como 1-15 residuos de aminoácidos, tan poco como 1-10, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o aún 1 residuo de aminoácido. Los polipéptidos de las realizaciones pueden modificarse de varias formas, incluyendo sustituciones, deleciones, cortes e inserciones de aminoácidos. Pueden crearse nuevas proteínas que tengan las propiedades de interés combinando elementos y fragmentos de proteínas de las realizaciones, también con otras proteínas. Los métodos para efectuar estas manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de secuencias de aminoácidos de las proteínas de ciclotida realizando mutaciones en el ADN. Los métodos para efectuar mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel eí al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; la Patente de los EEUU N° 4873192; Walker y Gaastra, editores (1983) Techniques in Molecular Biology (Macmillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias citadas en dichas publicaciones. Pueden hallarse guías para la sustitución apropiada de aminoácidos que no afectan la actividad biológica de las proteínas de interés en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporado en la presente documentación a modo de referencia. Se prefieren las sustituciones conservativas, tales como aquellas donde se intercambia un aminoácido por otro que tiene propiedades similares. De este modo, las secuencias genéticas y las secuencias de nucleótidos de las realizaciones incluyen tanto las secuencias naturales como las formas mutantes. Del mismo modo, las proteínas de las realizaciones comprenden proteínas de ocurrencia natural, así como variaciones y formas modificadas de éstas. Dichas variantes aún poseen la actividad de ciclotida (por ejemplo, actividad insecticida) o la respuesta defensiva deseada. Obviamente, las mutaciones que se realicen en el ADN que codifica la variante no deberán ubicar la secuencia fuera del marco de lectura, y prefepblemente no crearán regiones complementarias que puedan producir estructuras secundarias de ARNm (véase la Publicación de Patente EP N° 0 075 444 B1 ). No se espera que las deleciones, las inserciones y las sustituciones en las secuencias de proteínas abarcadas en la presente documentación produzcan cambios radicales en las características de la protema Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, la deleción o la inserción antes de efectuarla, aquellos entrenados en la técnica apreciarán que podrá evaluarse el efecto empleando ensayos de análisis de rutina Puede evaluarse la actividad biológica de las vanantes de los polipéptidos de las realizaciones empleando cualquier método conocido en la técnica, tal como aquellos ya descpptos y mencionados en otras partes de esta solicitud Las vanantes de las secuencias de nucleotidos y las proteínas también abarcan secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento de recombinación y mutagenesis, tal como el barajado de ADN Con dicho procedimiento, pueden manipularse una o más secuencias codificantes diferentes para crear una nueva proteína que posee las propiedades deseadas De esta manera, se generan bibliotecas de po nucleotidos recombinantes a partir de una población de secuencias de polinucleotidos relacionadas, que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden ser recombinadas por homología in vitro o in vivo En la técnica se conocen estrategias para barajar ADN Véanse, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91 10747-10751 , Stemmer (1994) Nature 370 389-391 , Cramep ef al (1997) Nature Biotech 15 436-438, Moore et al (1997) J Mol Biol 272 336- 347, Zhang ef al (1997) Proc Nati Acad Sci USA 94 4504-4509, Cramep ef al (1998) Nature 391 288-291 , y las Patentes de los EEUU N° 5605793 y 5837458 La "degeneración de los codones" hace referencia a la divergencia en el código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de aminoácidos del po péptido codificado Por consiguiente, la presente invención se relaciona con cualquier fragmento de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la totalidad o una porción sustancial de las secuencias de aminoácidos detalladas en la presente documentación. Aquél entrenado en la técnica conocerá el "sesgo de codones" que presentan las células huésped específicas al usar codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Entonces, cuando se sintetiza un fragmento de ácido nucleico para mejorar a expresión en una célula huésped, es deseable diseñar el fragmento de ácido nucleico de modo que su frecuencia de uso de codones se aproxime a la frecuencia de uso de codones preferida por la célula huésped. Puede realizarse la determinación de los codones preferidos sobre la base de un análisis de genes derivados de la célula huésped de la que hay información de secuencia disponible. Por ejemplo, pueden usarse las tablas de frecuencias de uso de codones en la red mundial en Kazusa.or.jp/codon/ para determinar los codones preferidos para una variedad de organismos. Véanse también Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1 -11 ; Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, las Patentes de los EEUU N° 5380831 y 5436391 ; y la información hallada en la red mundial en agron.missouri.edu/mnl/77/10simmons.html; incorporada en la presente documentación a modo de referencia. Pueden ensamblarse "fragmentos de ácidos nucleicos sintéticos" a partir de bloques de construcción de oligonucleótidos sintetizados en forma química usando procedimientos conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Estos bloques de construcción se unen y se alinean para formar fragmentos de ácidos nucleicos mayores, que luego pueden ensamblarse con la ayuda de enzimas para construir el fragmento de ácido nucleico completo deseado. "Sintetizado por medios químicos", con relación a un fragmento de ácido nucleico, denota que los nucleótidos componentes fueron ensamblados in vitro. Puede efectuarse la síntesis manual de fragmentos de ácidos nucleicos usando procedimientos bien establecidos, o puede efectuarse una síntesis automatizada usando cualquier máquina disponible comercialmente. Por consiguiente, pueden modificarse los fragmentos de ácidos nucleicos de modo que reflejen el sesgo de codones de la célula huésped para obtener una expresión genética óptima. Aquellos entrenados en la técnica apreciarán que es más probable obtener una expresión genética exitosa si se sesga el uso de codones hacia aquellos codones favorecidos por el huésped. Un "gen" designa un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo las secuencias reguladoras que preceden (secuencias 5' no codificantes) y siguen (secuencias 3' no codificantes) a la secuencia codificante. Un "gen nativo" hace referencia a un gen tal como se lo encuentra en la naturaleza, con sus propias secuencias reguladoras. Un "gen quimérico" hace referencia a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que derivan de fuentes diferentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificante que derivan de la misma fuente, pero dispuestas de una manera distinta de la disposición en que se encuentran en la naturaleza. Un "gen endógeno" hace referencia a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. Un gen "extraño" hace referencia a un gen que habitualmente no se encuentra en el organismo huésped, pero que es introducido en el organismo huésped por transferencia de genes. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que fue introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación.

Los "genes sintéticos" pueden armarse a partir de bloques de construcción de oligonucleótidos que se sintetizan en forma química utilizando procedimientos conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Estos bloques de construcción se unen y se alinean para formar segmentos de genes que luego se ordenan con la ayuda de enzimas para construir el gen completo. El término "sintetizado por medios químicos", con relación una secuencia de ADN, significa que los componentes nucleotídicos se ordenaron in vitro. La síntesis química manual de ADN puede llevarse a cabo utilizando procedimientos bien establecidos, o puede efectuarse una síntesis química automática utilizando uno de los diversos equipos disponibles comercialmente. Por consiguiente, pueden modificarse los genes para una expresión génica óptima basada en la optimización de la secuencia de nucleótidos con el fin de reflejar la preferencia de codones de la célula huésped. Aquellos entrenados en la técnica apreciarán que es más probable obtener una expresión genética exitosa si se sesga el uso de codones hacia aquellos codones favorecidos por el huésped. La determinación de los codones preferidos puede basarse en un estudio de genes derivados de la célula huésped de los que haya información de secuencia disponible. Una "secuencia codificante" hace referencia a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos específica. Como se los usa en la presente documentación, los términos "codificante" o "codificado", en el contexto de un ácido nucleico específico, denotan que el ácido nucleico comprende la información necesaria para guiar la traducción de la secuencia de nucleótidos en una proteína específica. La información por la cual está codificada una proteína está especificada por el uso de codones. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de regiones traducidas del ácido nucleico, o puede carecer de estas secuencias no traducidas en cuestión (por ejemplo, como en el ADNc). Las "secuencias reguladoras" hacen referencia a los nucleótidos localizados río arriba (secuencias no codificantes 5'), dentro o río abajo (secuencias no codificantes 3') de una secuencia codificante, que ejercen influencia sobre la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN, o sobre la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, sin limitaciones, promotores, secuencias directrices de la traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación. Una "proteína" o un "polipéptido" es una cadena de aminoácidos dispuestos en un orden específico determinado por la secuencia codificante en un polinucleótido que codifica el polipéptido. Los "niveles alterados" o la "expresión alterada" hacen referencia a la producción de uno o más productos genéticos en organismos transgénicos, en cantidades o proporciones que difieren de aquellos en organismos normales o no transformados. En la presente documentación, una "mutante nula" designa una célula huésped que carece de la expresión de un polipéptido determinado o expresa un polipéptido que es inactivo o no tiene ninguna función enzimática esperada detectable. En la naturaleza, algunos polipéptidos se producen como precursores complejos que, además de contener marcas de direccionamiento, tales como los péptidos señal descriptos en otra parte de esta solicitud, también contienen otros fragmentos de péptidos que son eliminados (procesados) en algún punto de tiempo durante la maduración de las proteínas, lo que resulta en una forma madura del polipéptido que es diferente del producto de traducción primario (aparte de la remoción del péptido señal). Los siguientes términos son relevantes: "proteína madura", "preproproteína" o "prepropéptido", y hacen referencia a un polipéptido procesado después de la traducción, es decir, uno del que se han eliminado los pre y propéptidos presentes en el producto primario de la traducción. Una "proteína precursora" designa el producto primario de la traducción del ARNm, es decir, con los pre y propéptidos aún presentes. Los pre y propéptidos pueden incluir, sin limitaciones, señales de localización intracelular. La forma del producto de traducción solamente con el péptido señal eliminado, pero sin procesamientos adicionales, se denomina "propéptido" o "proproteína". Los fragmentos o los segmentos a eliminar pueden denominarse "propéptidos". Aquellos entrenados en la técnica podrán determinar, dependiendo de la especie en que se expresan las proteínas y la localización intracelular deseada, si pueden obtenerse mayores niveles de expresión usando una construcción genética que codifique solamente la forma madura de la proteína, la forma madura con un péptido señal o la proproteína (es decir, una forma que incluya los propéptidos) con un péptido señal. Pueden ser necesarias las secuencias de los pre y propéptidos para obtener una expresión funcional en plantas u hongos. Los propéptidos pueden contribuir al plegamiento apropiado del péptido. Un "péptido de tránsito a cloroplasto" es una secuencia de aminoácidos que se traduce en combinación con una proteína y dirige la proteína hacia el cloroplasto o hacia otros tipos de plástidos presentes en la célula donde se produce la proteína. Una "secuencia de tránsito a cloroplasto" designa una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito a cloroplasto. Un "péptido señal" es una secuencia de aminoácidos que se traduce en combinación con una proteína y dirige la proteína hacia el sistema secretor (véase Chrispeeis (1991 ) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21 -53). Si la proteína debe dirigirse a una vacuola, puede agregarse además una señal de direccionamiento vacuolar, o, si el blanco es el retículo endoplasmático, puede agregarse una señal de retención en el retículo endoplasmático. Si se desea dirigir la proteína hacia el núcleo, debe eliminarse cualquier péptido señal presente y debe incluirse una señal de localización nuclear en su lugar (véase Raikhel (1992) Plant Phys. 100:1627-1632). La "transformación" hace referencia a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico hacia el genoma de un organismo huésped, lo que da como resultado una herencia genéticamente estable. Los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácidos nucleicos transformados se denominan organismos "transgénicos". Los ejemplos de métodos de transformación vegetal incluyen la transformación mediada por Agrobacterium (De Blaere et al (1987) Meth Enzymol 143: 277) y la tecnología de transformación con "cañón de genes" o con aceleración de partículas (Klein et al (1987) Nature (Londres) 327: 70-73; Patente de los EEUU N° 4945050, cuyo contenido se incorpora en este documento a modo de referencia). Se describen otros métodos de transformación más adelante. Entonces, los polinucleótidos aislados de las realizaciones pueden incorporarse en construcciones recombinantes, típicamente construcciones de ADN, que pueden introducirse y replicarse en una célula huésped. Esta construcción puede ser un vector que incluye un sistema de replicación y secuencias que son capaces de transcribir y traducir una secuencia que codifica polipéptidos en una célula huésped dada. Se ha descripto una cantidad de vectores adecuados para la transfección estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas, por ejemplo, en Pouwels eí al., (1985; Supp. 1987) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Weissbach y Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology, (Academic Press, Nueva York); y Flevin ef al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, (Kluwer Academic Publishers). Típicamente, los vectores de expresión en plantas incluyen, por ejemplo, uno o más genes vegetales clonados bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras 5' y 3', y un marcador de selección dominante. Estos vectores de expresión en plantas pueden contener también una región reguladora promotora (por ejemplo, una región reguladora que controla la expresión de forma inducible o constitutiva, regulada por el ambiente o por el desarrollo, o de forma específica para células o para tejidos), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión a ribosomas, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación. Los procedimientos comunes de ADN recombinante y clonación molecular utilizados en la presente documentación son bien conocidos en la técnica y están descriptos con mayor detalle en Sambrook eí al. (1989) supra. En otra realización, esta invención se relaciona con virus y células huésped que comprenden los genes quiméricos de las realizaciones descriptas en la presente documentación, o un polinucleótido aislado de las realizaciones descriptas en la presente documentación. Los ejemplos de células huésped que pueden usarse para poner en práctica las realizaciones incluyen, sin limitaciones, levaduras, bacterias, células de hongos, insectos, anfibios, mamíferos y células vegetales. Como se lo usa en la presente documentación, una "célula huésped" hace referencia a una célula que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga de las realizaciones. Las células huésped pueden ser células procariotas, tales como E. coli, o células eucariotas, tales como levaduras, células de hongos, insectos, anfibios, mamíferos o células vegetales. Las células huésped vegetales incluyen células vegetales de monocotiledóneas o dicotiledóneas. Un ejemplo de célula huésped de monocotiledónea es una célula huésped de maíz. Un ejemplo de célula huésped de dicotiledónea es una célula huésped de soja. Puede obtenerse la sobreexpresión de las proteínas de la presente invención construyendo primero un gen quimérico, donde la región codificante está unida operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión de un gen en los tejidos deseados y en la etapa del desarrollo deseada. El gen quimérico puede comprender secuencias promotoras y secuencias directrices de la traducción derivadas de los mismos genes. También pueden proporcionarse secuencias 3' no codificantes que codifiquen señales de terminación de la transcripción. Este gen quimérico también puede comprender uno o más intrones para facilitar la expresión genética. Las secuencias de ciclotidas de las realizaciones se proporcionan en construcciones de ADN que se expresarán en la planta de interés. El cassette incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' unidas operativamente a una secuencia de ciclotida de las realizaciones. Además, el cassette podrá contener al menos un gen adicional que se co-transformará en del organismo. Como alternativa, podrán proporcionarse los genes adicionales en múltiples construcciones de ADN. Dicha construcción de ADN contiene una pluralidad de sitios de restricción para insertar la secuencia de ciclotida bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. Además, la construcción de ADN puede contener genes marcadores de selección. En realizaciones específicas, los métodos para incrementar la resistencia a patógenos en una planta comprenden transformar en forma estable una planta con una construcción de ADN, que comprende una secuencia de nucleótidos antipatogénica de las realizaciones unida operativamente a un promotor que dirige la expresión en una planta. Estos métodos pueden usarse en la agricultura, particularmente para limitar el impacto de los patógenos vegetales sobre las plantas de cultivo. Si bien la elección del promotor dependerá del momento y la localización de la expresión deseada para las secuencias de nucleótidos antipatogénicas, los ejemplos de promotores incluyen promotores constitutivos y promotores inducibles por patógenos. Puede utilizarse una cantidad de promotores en la práctica de la invención. Los promotores pueden seleccionarse sobre la base del resultado que se desea obtener. Es decir, pueden combinarse los ácidos nucleicos con promotores constitutivos, promotores con preferencia por tejidos, inducibles u otros para lograr la expresión en el organismo huésped. Los promotores constitutivos adecuados para utilizar en una célula huésped vegetal incluyen, por ejemplo, el promotor nuclear del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descriptos en WO 99/43838 y la Patente de los EEUU N° 6072050; el promotor nuclear CaMV 35S (Odell ef al. (1985) Nature 313: 810-812); de actina de arroz (McEIroy et al. (1990) Plant Cel 2: 163-171 ), de ubiquitina (Christensen ef al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 y Christensen eí al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last ef al. (1991 ) Theor. Appl. Genet. 81 : 581-588); MAS (Velten ef al. (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); el promotor ALS (Patente de los EEUU N° 5659026), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, aquellos descriptos en las Patentes de los EEUU N° 5608149, 5608144, 5604121 , 5569597, 5466785, 5399680, 5268463, 5608142 y 617761 1 , incorporadas en la presente documentación a modo de referencia. En general, será beneficioso expresar el gen a partir de un promotor inducible, por ejemplo, a partir de un promotor inducible por patógenos. Estos promotores incluyen aquellos de las proteínas relacionadas con la patogénesis (proteínas PR), que son inducidas después de una infección con un patógeno, por ejemplo, las proteínas PR, las proteínas SAR, la beta-1 ,3-glucanasa, la quitinasa, etcétera. Véanse, por ejemplo, Redolfi ef al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes ef al. (1992) Plant Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:1 11-116. Véase también WO 99/43819, publicada el 9 de Septiembre de 1999, incorporada en la presente documentación a modo de referencia. Son de interés los promotores que se expresan en forma local en el sitio de la infección del patógeno o cerca de aquél. Véanse, por ejemplo, Marineau ef al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton ef al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331 ; Somsisch et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; e Yang (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Véanse también, Chen ef al. (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :2507-2511 ; Warner eí al. (1993) Plant J. 3:191 -201 ; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1 :961-968; la Patente de los EEUU N° 5750386 (inducible por nematodes), y las referencias citadas en dichas publicaciones. Es de interés particular el promotor inducible del gen PRms de maíz, cuya expresión es inducida por el patógeno Fusarium moniliforme (véase, por ejemplo, Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41 :189-200). Adicionalmente, debido a que los patógenos entran en las plantas a través de lesiones o daños provocados por insectos, podría usarse un promotor inducible por lesiones en las construcciones de las realizaciones. Estos promotores inducibles por lesiones incluyen el promotor del gen del inhibidor de la proteinasa de papa (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wunl y wun2, Patente de los EEUU N° 5428148; winl y win2 (Stanford ef al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); la sistemina (McGurl ef al. (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier ef al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp ef al. (1993) FEBS Letters 323:73-76); el gen MPl (Corderok ef al. (1994) Plant J. 6(2):141-150); y semejantes, incorporados en la presente documentación a modo de referencia. Pueden utilizarse promotores regulados por compuestos químicos para modular la expresión de un gen en una planta a través de la aplicación de un regulador químico exógeno. Dependiendo del objetivo a alcanzar, el promotor puede ser un promotor inducible por sustancias químicas, cuando la aplicación de la sustancia química induce la expresión del gen, o un promotor reprimible por compuestos químicos cuando la aplicación del compuesto químico reprime la expresión del gen. Los promotores inducibles por compuestos químicos son bien conocidos en la técnica e incluyen, sin limitaciones, el promotor ln2-2 de maíz, que es activado por el herbicida seguro bencensulfonamida, el promotor GST de maíz, que es activado por compuestos electrofílicos hidrofóbicos, que son utilizados como herbicidas pre-emergentes, y el promotor PR-1 a de tabaco, que es activado por ácido salicílico. Otros promotores regulados por compuestos químicos de interés incluyen los promotores que responden a esteroides (véanse, por ejemplo, los promotores inducibles por glucocorticoides en Schena ef al. (1991 ) Proc. Nati. Acad Sci. USA 88: 10421-10425 y McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2): 247-257) y los promotores inducibles por tetraciclina y reprimibles por tetraciclina. Véanse, por ejemplo, Gatz eí al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, y las Patentes de los EEUU N° 5814618 y 5789156; incorporadas en la presente documentación a modo de referencia. Pueden utilizarse promotores con preferencia tisular para dirigir la expresión potenciada de ciclotidas a un tejido vegetal en particular. Los promotores con preferencia tisular incluyen aquellos que se describen en Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata ef al. (1997) Plant Cell Physiol. 792-803; Hansen eí al. (1997) Mol. Gen Genet. 337-343; Russell ef al. (1997) Transgenic Res. 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 1331-1341 ; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 525-535; Canevascini eí al. (1996) Plant Physiol. 513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 773-778; Lam(1994) Results Probl. Cell Differ. 181-196; Orozco ef al. (1993) Plant mol Bio. 1129-1138; Matsuoka ef al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90(20): 9586-9590; y Guevara-García ef al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Si es necesario, pueden modificarse dichos promotores para obtener una expresión débil. En la técnica se conocen promotores específicos para hojas. Véanse, por ejemplo, Yamamoto ef al. (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kwon eí al. (1994) Plant Physiol. 357-67; Yamamoto eí al. (1994) Plant Cell Physiol. 773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3: 509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; y Matsuoka et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590. Los promotores "con preferencia por la semilla" incluyen los promotores "específicos para semillas" (aquellos promotores que se activan durante el desarrollo de la semilla, tales como los promotores de las proteínas de almacenamiento de semillas), así como los promotores "de semillas en germinación" (aquellos promotores que se activan durante la germinación de la semilla). Véase Thompson ef al. (1989) BioEssays 10:108, incorporada en la presente documentación a modo de referencia. Dichos promotores con preferencia por la semilla incluyen, sin limitaciones, Cim1 (mensajero inducido por citoquinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa de maíz); milps (mio-inositol-1 -fosfato sintetasa); y celA (celulosa sintetasa) (véase WO 00/11 177, incorporada en la presente documentación a modo de referencia). El promotor de gamma-zeína es un promotor preferido específico para endosperma. Glob-1 es un promotor preferido específico para el embrión. Para las dicotiledóneas, los promotores específicos para semillas incluyen, sin limitaciones, los promotores de la /?-faseolina de poroto, la napina, la /?-conglicinina, la lectina de soja, la cruciferina y semejantes. Para monocotiledóneas, los promotores específicos para semillas incluyen, sin limitaciones, los promotores de la zeína de 15 kDa de maíz, la zeína de 22 kDa, la zeína de 27 kDa, la g-zeína, waxy, shrunken 1 , shrunken 2, de la globulina 1 , etcétera. Véase también WO 00/12733, que descpbe los promotores con preferencia para semilla de los genes endl y end2; incorporada en la presente documentación a modo de referencia. El método de transformación/transfección no es crítico para la presente invención. En la actualidad existen varios métodos de transformación o transfección disponibles. A medida que aparecen nuevos métodos para transformar cultivos u otras células huésped, puede usárselos en la presente invención. Por consiguiente, se ha desarrollado una amplia variedad de métodos para insertar una secuencia de ADN en el genoma de una célula huésped, con el fin de obtener la transcripción y/o la traducción de la secuencia y efectuar cambios fenotípicos en el organismo. Los fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención pueden usarse para crear plantas transgénicas donde las ciclotidas vegetales descriptas están presentes a niveles mayores o menores que los hallados en tipos celulares normales, o en etapas del desarrollo en que no se los halla normalmente. Esto tendrá el efecto de alterar el nivel de resistencia a enfermedades (por ejemplo, causadas por hongos) y patógenos en dichas células. Por consiguiente, puede emplearse cualquier método que proporcione una transformación/transfección efectiva. Pueden usarse células procariotas como huéspedes de expresión. Los procariotas están frecuentemente representados por varias cepas de E. coli. Sin embargo, también pueden usarse otras cepas de microbios. Las secuencias de control procariotas de uso común definidas en la presente documentación incluyen promotores para iniciar la transcripción, opcionalmente con un operador, junto don secuencias de unión a ribosomas, incluyendo promotores de uso común tales como los sistemas de promotores de la beta lactamasa (penicilinasa) y la lactosa (lac) (Chang et al. (1977) Nature 198:1056), el sistema de promotores del triptofano (trp) (Goeddel et al. (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) y el promotor PL derivado de lambda y el sitio de unión a ribosomas del gen N (Simatake y Rosenberg (1981 ) Nature 292:128). Los ejemplos de marcadores de selección para E. coli incluyen, por ejemplo, genes que especifican resistencia a ampicilina, tetraciclina o cloramfenicol. El vector se selecciona para permitir la introducción en la célula huésped apropiada. Los vectores bacterianos típicamente se originan en plásmidos o fagos. Se infectan células bacterianas apropiadas con partículas de fagos, o se las transfecta con ADN vector de fago desnudo. Si se usa un vector plasmídico, se transfectan las células bacterianas con el ADN del vector plasmídico. Existen sistemas de expresión para expresar una proteína de las realizaciones disponibles usando Bacillus sp. y Salmonella (Palva et al. (1983) Gene 22:229-235 y Mosbach eí al. (1983) Nature 302:543-545). Existe una variedad de sistemas de expresión en eucariotas, tales como levaduras, líneas de células de insectos, células vegetales y de mamíferos, conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Como se explica brevemente más adelante, puede expresarse un polinucleótido de las realizaciones en estos sistemas eucariotas. En algunas realizaciones se emplean células vegetales transformadas/transfectadas, como se describirá más adelante, como sistemas de expresión para producir las proteínas de la presente invención. Estas proteínas antimicrobianas pueden usarse para cualquier aplicación, incluyendo el recubrimiento de superficies, para atacar microbios, como se describirá con mayor detalle más adelante. La síntesis de secuencias de nucleótidos heterólogas en levaduras es bien conocida. Sherman, ef al. (1982) Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory) es un trabajo bien conocido que describe los distintos métodos disponibles para producir proteínas en levaduras. Dos levaduras ampliamente utilizadas para producir proteínas eucariotas son Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. En la técnica se conocen vectores, cepas y protocolos para obtener expresión en Saccharomyces y Pichia, y están disponibles en proveedores comerciales (por ejemplo, Invitrogen). Los vectores apropiados tienen secuencias para controlar la expresión, tales como promotores, incluyendo aquellos de 3-fosfogl?cerato quinasa o alcohol oxidasa, y un origen de replicación, secuencias de terminación y semejantes, según se lo desee. Una vez expresada, puede aislarse una proteína de las realizaciones de la levadura usando las células y aplicando técnicas convencionales de aislamiento de proteínas sobre los lisados. Puede efectuarse el monitoreo del proceso de purificación usando técnicas de Western blot, radioinmunoensayo u otras técnicas de inmunoensayo convencionales. Las secuencias de las realizaciones también pueden unirse a varios vectores de expresión para usar en la transfección de cultivos celulares, por ejemplo, originados en mamíferos, insectos o plantas. Los cultivos celulares ilustrativos útiles para producir péptidos son aquellos de células de mamífero. En la técnica se ha desarrollado una cantidad de líneas de células huésped apropiadas capaces de expresar proteínas intactas, incluyendo las líneas celulares HEK293, BHK21 y CHO. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias para controlar la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor (por ejemplo, el promotor CMV, un promotor HSV tk o pgk (fosfoglicerato quinasa)), un potenciador (Queen eí al (1986) Immunol Rev. 89 49) y sitios necesarios para procesar la información, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte del ARN, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de adición de poli A SV40 grande T Ag) y secuencias de terminación de la transcripción Hay otras células animales útiles para producir las proteínas de las realizaciones disponibles, por ejemplo, en la Colección Americana de Tipos de Cultivo Los vectores apropiados para expresar las proteínas de las realizaciones en células de insectos comúnmente derivan del baculovirus SF9 Las células de insecto apropiadas incluyen líneas celulares de larvas de mosquito, gusano de seda, oruga marchadora, polilla Drosophila, tales como una línea celular de (véase Schne?der (1987) J Embryol Exp Morphol 27 353-365) Al igual que con la levadura, cuando se emplean células huésped de animales o plantas superiores, típicamente se incorporan secuencias de poliadenilación o secuencias de terminación de la transcripción en el vector Un ejemplo de una secuencia termmadora es la secuencia de po adenilación del gen de hormona de crecimiento bovina También pueden incluirse secuencias para el corte apropiado del transcripto Un ejemplo de una secuencia de separación es el intron VP1 de SV40 (Sprague eí al (1983) J Viro! 45 773-781 ) Adicionalmente, en el vector pueden incorporarse secuencias genéticas para controlar la rephcación en la célula huésped, tales como aquellas halladas en vectores semejantes al virus de papilloma bovino Savepa-Campo (1985) "Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector," en DNA Cloning Vol II A Practical Approach, editado por D M Glover (IRL Press, Arhngton, Virginia), pp 213-238.

Las células huésped de animales y eucariotas inferiores (por ejemplo, levaduras) son competentes o se tornan competentes para la transfección por vanos medios Existen vanos métodos bien conocidos para introducir ADN en células animales Éstos incluyen precipitación con fosfato de calcio, fusión de las células receptoras con protoplastos bacterianos que contienen el ADN, tratamiento de las células receptoras con hposomas que contienen el ADN, DEAE dextpna, electroporación, biolística, y microinyección directa del ADN en las células Las células transfectadas se cultivan por medios bien conocidos en la técnica. Kucler (1997) Biochemical Methods in Cell Culture and Virology (Dowden, Hutchinson y Ross, Ine ) Pueden construirse vectores plasmidicos que comprendan el polinucleótido aislado (o el gen quimérico) de las realizaciones La elección del vector plasmídico dependerá del método usado para transformar las plantas huésped Aquél entrenado en la técnica conoce los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector con el fin de transformar, seleccionar y propagar satisfactoriamente células huésped que contienen cualquiera de los fragmentos de ácidos nucleicos aislados de la invención Aquél entrenado en la técnica también reconocerá que diferentes eventos de transformación independientes darán como resultado distintos niveles y patrones de expresión (Jones eí al (1985) EMBO J. 4 241 1-2418, De Almeida ef al (1989) Mol Gen Genetics 218:78-86), y que por lo tanto, será necesario rastrear múltiples eventos con el fin de obtener líneas que presenten el nivel y el patrón de expresión deseados Dicho rastreo puede llevarse a cabo mediante análisis Southern del ADN, análisis Northern de la expresión del ARNm, análisis Western de la expresión de proteínas o análisis fenotípico Para algunas aplicaciones, puede ser util dirigir los polipéptidos de las realizaciones a distintos compartimientos celulares, o para facilitar su secreción de la célula. Por consiguiente, se contempla que el gen quimérico descripto previamente sea suplementado adicionalmente dirigiendo la secuencia codificante que codifica los polipéptidos deseados con secuencias de direccionamiento intracelular apropiadas, tales como secuencias de tránsito (Keegstra (1989) Cell 56:247-253), secuencias señal o secuencias que codifican señales de localización para el retículo endoplasmático (ER) (Chrispeeis (1991 ) supra) o nucleares (Raikhel (1992) supra), con o sin la eliminación de las secuencias de direccionamiento que ya estén presentes. Si bien las referencias citadas proporcionan ejemplos de cada una de éstas, la lista no es exhaustiva y pueden descubrirse más señales de direccionamiento para usar en el futuro. A diferencia del promotor, que actúa a nivel de la transcripción, esta información de direccionamiento es parte del producto inicial de la traducción. La localización de la proteína en distintos compartimientos de la célula puede tornarla más eficaz, o puede hacer que interfiera menos con las funciones de la célula. Por ejemplo, puede producirse una proteína precedida por un péptido señal, que dirige el producto de traducción hacia el ER, incluyendo en la construcción quimérica secuencias que codifican un péptido señal (secuencias que también pueden denominarse la "secuencia señal"). La secuencia señal usada podría ser aquella asociada con el gen que codifica el polipéptido, o puede tomarse de otro gen. Existen varios péptidos señal descriptos en la literatura, y son ampliamente intercambiables (Raikhel N, Chrispeeis MJ (2000) Protein sorting and vesicle traffic. en B Buchanan, W Gruissem, R Jones, editores, Biochemistry and Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD, pp 160-201 , incorporado en la presente documentación a modo de referencia). La adición de un péptido señal resultará en la entrada del producto de traducción en el ER (en dicho proceso, el péptido señal mismo es eliminado del polipéptido), pero la localización ¡ntracelular final de la proteína depende de otros factores, que pueden manipularse para obtener la localizacíón más apropiada para el patógeno y el tipo celular. La vía por omisión, es decir, la vía tomada por el polipéptido si no se incluyen otras marcas, resulta en la secreción del polipéptido a través de la membrana celular (Raikhel y Chrispeeis, (2000) supra). Esto dejará el péptido entre la membrana celular y la pared celular, lo que comúnmente será una localización apropiada. Otros patógenos pueden combatirse más efectivamente localizando el péptido entro de la célula. Esto puede lograrse, por ejemplo, agregando una secuencia codificante de una señal de retención en el ER al gen. Se describen métodos y secuencias para este propósito en Raikhel y Chrispeeis (2000) supra; por ejemplo, la adición de secuencias que codifican los aminoácidos K, D, E y L en dicho orden, o variaciones de éstas descriptas en la literatura, al extremo de la porción que codifica la proteína, permitirá alcanzar este objetivo. Como alternativa, el uso de marcas de direccíonamiento vacuolar, tales como aquellas descriptas por Raikhel y Chrispeeis (2000) supra, además de un péptido señal, resultará en la localización del péptido en una estructura vacuolar. El uso de una secuencia codificante de un péptido señal para plástidos resultará en la localización del polipéptido en el plástido del tipo celular seleccionado. Aquél entrenado en la técnica también podría contemplar la localización del polipéptido en otros compartimentos celulares, mediante la adición de información de direccionamiento apropiada. Si bien las referencias citadas proporcionan ejemplos de cada una de éstas, la lista no es exhaustiva y pueden descubrirse más señales de direccionamiento para usar en el futuro. También puede ser deseable reducir o eliminar la expresión de los genes que codifican los polipéptidos deseados en plantas para algunas aplicaciones.

Para lograr esto, puede construirse un gen quimérico diseñado para la cosupresión del polipéptido deseado uniendo un gen o un fragmento de un gen que codifica dicho polipéptido con secuencias promotoras para plantas. Como alternativa, puede construirse un gen quimérico diseñado para expresar ARN antisentido para la totalidad o parte del fragmento de ácido nucleico deseado, uniendo el gen o el fragmento de gen, en orientación inversa, con secuencias promotoras vegetales. Pueden introducirse los genes quiméricos de cosupresión o antisentido en plantas por medio de transformación, donde se reduce o se elimina la expresión de los genes endógenos correspondientes. Las soluciones basadas en genética molecular para la generación de plantas con una expresión génica alterada presentan una ventaja decidida con respecto a los enfoques de cultivo de plantas más tradicionales. Los cambios en los fenotipos de las plantas pueden producirse inhibiendo específicamente la expresión de uno o más genes por inhibición antisentido o cosupresión (Patentes de los EEUU N° 5190931 , 5107065 y 5283323). Una construcción antisentido o de cosupresión actuará como regulador dominante negativo de la actividad génica. En tanto las mutaciones convencionales puedan proveer una regulación negativa de la actividad génica, es muy probable que estos efectos sean recesivos. La regulación negativa dominante disponible con un enfoque transgénico puede resultar ventajosa desde una perspectiva de cruzamiento. Además, la capacidad de restringir la expresión de un fenotipo específico a los tejidos reproductores de la planta mediante el uso de promotores específicos de tejidos puede conferir ventajas agronómicas con relación a las mutaciones convencionales que pueden tener efecto en todos los tejidos en los cuales el gen mutante se expresa ordinariamente.

Aquél entrenado en la técnica comprenderá que existen consideraciones especiales asociadas con el uso de tecnologías antisentido o de cosupresión con el fin de reducir la expresión de genes particulares. Por ejemplo, es posible que para lograr el nivel apropiado de expresión de genes en el sentido del marco de lectura o antisentido sea necesario utilizar diferentes genes quiméricos utilizando distintos elementos reguladores conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Una vez obtenidas las plantas transgénicas empleando uno de los métodos descriptos antepormente, será necesario efectuar una búsqueda entre los transgénicos individuales de aquellos que presenten el fenotipo deseado con mayor efectividad. Por consiguiente, aquél entrenado en la técnica podrá desarrollar métodos para efectuar búsquedas entre grandes cantidades de transformantes. La naturaleza de dichas búsquedas se seleccionará generalmente sobre una base práctica. Por ejemplo, es posible efectuar el rastreo de cambios en la expresión génica utilizando anticuerpos específicos para la proteína codificada por el gen que está siendo suprimida o empleando ensayos que midan específicamente la actividad de la enzima. El método preferido será aquél que permita procesar rápidamente una gran cantidad de muestras, dado que cabe esperar que una gran cantidad de los transformantes será negativa para el fenotipo deseado. Los presentes polipéptidos son útiles en métodos para impactar un patógeno vegetal que comprenden introducir en una planta o una célula de ésta al menos una construcción de nucleótidos, que comprende una secuencia de nucleótidos de las realizaciones unida operativamente a un promotor que dirige la expresión de una secuencia unida operativamente en células vegetales, donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: una secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 1 1 ; una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos detallada en SEQ ID N° 12 ó 13; una secuencia de nucleótidos caracterizada por al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 11 ; una secuencia de nucleótidos caracterizada por al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 11 ; una secuencia de nucleótidos caracterizada por al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 1 1 ; y una secuencia de nucleótidos que comprende el complemento de cualquiera de las anteriores. Estos polipéptidos (o porciones de éstos) pueden producirse en células huésped heterólogas, particularmente en las células de huéspedes microbianos, y pueden usarse para preparar anticuerpos contra estas proteínas a través de métodos bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Los anticuerpos son útiles para detectar los polipéptidos de la invención in situ en células o in vitro en extractos celulares. Pueden prepararse anticuerpos policlonales contra ciclotidas inmunizando un sujeto apropiado (por ejemplo, un conejo, una cabra, un ratón u otro mamífero) con un agente inmunógeno contra ciclotidas. Puede monitorearse la titulación de anticuerpo anti-ciclotida en el sujeto inmunizado con el correr del tiempo, empleando procedimientos convencionales, tal como con un ensayo inmunosorbente conectado a enzimas (ELISA), usando polipéptidos antimicrobianos inmovilizados. Una vez que transcurre un período de tiempo después de la inmunización, por ejemplo, cuando es máxima la titulación de agente de anticuerpo anti-ciclotida, pueden obtenerse células productoras de anticuerpos del sujeto, y puede usárselas para preparar anticuerpos monoclonales empleando procedimientos convencionales, tales como la técnica del hibridoma descripta originalmente por Kohier y Milstein (1975) Nature 256:495-497, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor ef al. (1983) Immunol. Today 4:72), la técnica de hibridoma EBV (Colé ef al. (1985) en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, editado por Reisfeld y Sell (Alan R. Liss, Inc., Nueva York, NY), pp. 77-96) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas es bien conocida (véanse en general Coligan ef al., editores (1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY); Galfre eí al. (1977) Nature 266:55052; Kenneth (1980) en Monoclonal Antibodies: A New Dimensión In Biological Analyses (Plenum Publishing Corp., Nueva York); y Lerner (1981 ) Yale J. Biol. Med. 54:387-402). Como alternativa a la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, puede identificarse y aislarse un anticuerpo monoclonal anti-ciclotida analizando una biblioteca de combinación de inmunoglobulina recombinante (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos) con una ciclotida, con el fin de aislar los miembros de la biblioteca de inmunoglobulinas que se unan al agente defensivo. Existen conjuntos de elementos para generar y analizar bibliotecas de presentación de fagos disponibles comercialmente (por ejemplo, el sistema de anticuerpos de fagos recombinantes Pharmacia, N° de catálogo 27-9400-01 ; y el conjunto de elementos de presentación de fagos Stratagene SurfZAP™, N° de catálogo 240612). Adicionalmente, pueden hallarse ejemplos de métodos y reactivos particularmente apropiados para usar en la generación y el análisis de una biblioteca de presentación, por ejemplo, en la Patente de los EEUU N° 5223409; las solicitudes PCT N° WO 92/18619; WO 91/17271 ; WO 92/20791 ; WO 92/15679; 93/01288; WO 92/01047; 92/09690; y 90/02809; Fuchs ef al. (1991 ) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybrídomas 3:81-85; Huse ef al. (1989) Science 246:1275-1281 ; Griffiths eí al. (1993) EMBO J. 12:725-734. Los anticuerpos pueden usarse para identificar homólogos de las ciclotidas de las realizaciones. También puede usarse la totalidad o una porción sustancial de los polinucleótidos de la invención como sondas para mapear los genes de los que forman parte en términos genéticos y físicos, y como marcadores para caracteres relacionados con estos genes. Esta información será útil en el cruzamiento de plantas, con el objeto de desarrollar líneas con los fenotipos deseados. Por ejemplo, pueden usarse los fragmentos de ácidos nucleicos mencionados como marcadores de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). Pueden analizarse transferencias Southern (Sambrook eí al. (1989) supra) de ADN genómico de planta digerido con enzimas de restricción con los fragmentos de ácidos nucleicos de la invención. Luego pueden someterse los patrones de bandas resultantes a análisis genéticos, usando programas de computadora tales como MapMaker (Lander ef al. (1987) Genomics 1 : 174-181 ), de modo de construir un mapa genético. Además, pueden usarse los fragmentos de ácidos nucleicos de la invención como sondas para transferencias Southern que contengan ADN genómico tratado con endonucleasas de restricción de un conjunto de individuos que representen los progenitores y la progenie de un cruzamiento genético definido. Se observa la segregación de los polimorfismos de ADN y se la usa para calcular la posición de la secuencia de ácido nucleico deseada en el mapa genético obtenido previamente usando esta población (Botstein ef al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331 ). Se describe la producción y el uso de sondas derivadas de genes vegetales en el mapeo genético en Bernatzky y Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Repórter 4:37-41. Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clones de ADNc específicos usando la metodología detallada previamente, o variaciones de ésta. Por ejemplo, pueden usarse poblaciones de cruzamientos F2, poblaciones de retrocruza, poblaciones cruzadas al azar, líneas casi isogénicas y otros conjuntos de individuos para el mapeo. Estas metodologías son bien conocidas por aquellos entrenados en la técnica. Las sondas de ácidos nucleicos derivadas de las secuencias de ácidos nucleicos de las realizaciones también pueden usarse para el mapeo físico (es decir, la localización de las secuencias en mapas físicos, véase Hoheisel et al. en: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press, Nueva York), 1996, pp. 319-346, y las referencias citadas en dicha publicación). En otra realización, pueden usarse sondas de ácidos nucleicos derivadas de las secuencias de ácidos nucleicos deseadas en mapeo de hibridización directa con fluorescencia in situ (FISH) (Trask (1991 ) Trends Genet. 7:149-154). Aunque los métodos actuales de mapeo FISH favorecen el uso de clones de mayor tamaño (entre varios y varios cientos de KB; véase Laan ef al. (1995) Genome Res. 5:13-20), los mejoramientos en la sensibilidad pueden permitir la realización de mapeo FISH con sondas más cortas. Puede ponerse en práctica una variedad de métodos de mapeo genético y físico basados en la amplificación de ácidos nucleicos usando las secuencias de ácidos nucleicos de las realizaciones. Los ejemplos incluyen la amplificación específica de alelos (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med. 11 :95-96), el polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield ef al. (1993) Genomics 16:325-332), la unión específica de alelos (Landegren ef al. (1988) Science 241 :1077-1080), las reacciones de unión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671 ), el mapeo híbrido con radiación (Walter ef al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) y el mapeo Happy (Dear y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Para estos métodos, se usa la secuencia de un fragmento de ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores que se usarán en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión de cebadores. El diseño de estos cebadores es bien conocido por aquellos entrenados en la técnica. En los métodos que emplean un mapeo genético basado en PCR, puede ser necesario identificar diferencias en las secuencias de ADN entre los progenitores del cruzamiento de mapeo, en la región que corresponde a la secuencia de ácido nucleico deseada. Sin embargo, esto no es generalmente necesario para los métodos de mapeo. Pueden identificarse fenotipos de pérdida de función para los clones de ADNc de las realizaciones empleando protocolos de alteración dirigida de genes o identificando mutantes específicas para estos genes presentes en una población de maíz que contiene mutaciones en todos los genes posibles (Ballinger y Benzer (1989) Proc. Nati. Acad. Sci USA 86:9402-9406; Koes ef al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:8149-8153; Bensen ef al. (1995) Plant Cell 7:75-84). Este último abordaje puede llevarse a cabo de dos maneras. Primero, pueden emplearse segmentos cortos de los fragmentos de ácidos nucleicos de la invención en protocolos de reacción en cadena de la polimerasa, con un cebador que posee una secuencia marcadora de la mutación en ADN preparado a partir de una población de plantas, donde se hayan introducido previamente transposones Mutator o algún otro elemento que provoque la mutación del ADN (véase Bensen, supra). La amplificación del fragmento de ADN específico con estos cebadores indica la inserción del elemento marcador de la mutación en o cerca del gen vegetal que codifica el polipéptido deseado. Como alternativa, puede usarse el fragmento de ácido nucleico deseado como una sonda de hibridización para productos de amplificación por PCR generados a partir de la población mutante, utilizando cebadores con secuencias marcadoras de la mutación en combinación con un cebador de un sitio genómico arbitrario, tal como aquél para un adaptador sintético anclado en el sito de acción de una enzima de restricción. Con cualquiera de los métodos, puede identificarse y obtenerse una planta que contiene una mutación en el gen endógeno que codifica el polipéptido deseado. Esta planta mutante puede utilizarse luego para determinar o confirmar la función natural de los polipéptidos de las realizaciones descriptos en la presente documentación. Los métodos de las realizaciones pueden usarse con otros métodos disponibles en la técnica para mejorar la resistencia a insectos en plantas. Por ejemplo, las realizaciones de la invención abarcan la utilización de cualquiera de una variedad de segundas secuencias de nucleótidos, de modo que, cuando se expresan en una planta, ayudan a incrementar la resistencia de a planta a insectos plaga. Se reconoce que estas segundas secuencias de nucleótidos pueden usarse en la orientación del marco de lectura o antísentido, dependiendo del resultado deseado. Los métodos de las realizaciones pueden usarse con otros métodos disponibles en la técnica para mejorar la resistencia a enfermedades y patógenos en plantas. De forma similar, las composiciones antimicrobianas descriptas en la presente documentación pueden usarse solas o en combinación con otras secuencias de nucleótidos, polipéptidos o agentes para proporcionar protección contra enfermedades y patógenos vegetales. Aunque puede utilizarse cualquiera de una variedad de segundas secuencias de nucleótidos, las realizaciones específicas de la invención comprenden aquellas segundas secuencias de nucleótidos que, cuando se expresan en una planta, contribuyen a incrementar la resistencia de una planta a patógenos. Las proteínas, los péptidos y las lisozimas que aparecen naturalmente en insectos (Jaynes ef al. (1987) Bioassays 6:263-270), plantas (Broekaert ef al. (1997) Critical Reviews in Plant Sciences 16:297-323), animales (Vunnam et al. (1997) J. Peptide Res. 49:59-66) y seres humanos (Mitra y Zang (1994) Plant Physiol. 106:977-981 ; Nakajima ef al. (1997) Plant Cell Reports 16:674-679) también son una fuente potencial de resistencia a patógenos en plantas (Ko, K. (2000) en la red mundial, en Scisoc.org/feature/BioTechnology/antimicrobial.html). los ejemplos de estas secuencias que confieren resistencia a las plantas incluyen aquellas que codifican la proteína activadora de rhoGTPasa de girasol (rhoGAP), lipoxigenasa (LOX), alcohol deshidrogenasa (ADH) y la proteína inducible por Sclerotinia 1 (SCIP-1 ), descripta en la Solicitud de Patente de los EEUU con N° de Orden 09/714767, incorporada en la presente documentación a modo de referencia. Estas secuencias de nucleótidos mejoran la resistencia a enfermedades de la planta mediante la modulación del desarrollo, las vías de desarrollo y el sistema de defensa contra patógenos de la planta. Se reconoce que estas segundas secuencias de nucleótidos pueden usarse en la orientación del marco de lectura o antisentido, dependiendo del resultado deseado. En otra realización, las ciclotidas comprenden polipéptidos aislados. Las ciclotidas de las realizaciones pueden usarse en la descontaminación de patógenos vegetales durante el procesamiento de granos para el consumo de animales o seres humanos; durante el procesamiento de alimentos, y durante el procesamiento de material vegetal que se almacenará en silos. En esta realización, se presentan las ciclotidas de las realizaciones a los granos, el material vegetal que se almacenará en silos o un cultivo alimenticio contaminado, o durante una etapa apropiada del procedimiento de procesamiento, en cantidades efectivas para obtener actividad antimicrobiana. Las composiciones pueden aplicarse sobre el ambiente de un patógeno vegetal, por ejemplo, por medio de rociado, atomización, espolvoreado, dispersión, recubrimiento o volcado, introducción en o sobre la tierra, introducción en el agua de irrigación, tratamiento de las semillas, o espolvoreado en el momento en el que haya comenzado a aparecer el patógeno vegetal, o antes de la aparición de las plagas como medida de protección. Se reconoce que puede usarse cualquier medio para poner los polipéptidos de ciclotidas en contacto con el patógeno vegetal en la práctica de las realizaciones. Adicionalmente, las composiciones pueden usarse en formulaciones usadas debido a sus actividades antimicrobianas. Se proporcionan métodos para controlar patógenos vegetales que comprenden aplicar una cantidad descontaminante de un polipéptido o una composición de las realizaciones sobre el ambiente del patógeno vegetal. Los polipéptidos de las realizaciones pueden formularse con un vehículo aceptable en una o más composiciones que sean, por ejemplo, una suspensión, una solución, una emulsión, un polvo de espolvoreado, un granulo dispersable, un polvo humedecible, un concentrado emulsificable, un aerosol, un granulo impregnado, un coadyuvante, una pasta de recubrimiento, y también encapsulaciones, por ejemplo, en sustancias poliméricas. Las composiciones descriptas previamente pueden obtenerse a través de la adición de un agente con actividad de agente tensioactivo, un vehículo inerte, un preservante, un humectante, un estimulante de la alimentación, una sustancia atractiva, un agente encapsulante, un aglutinante, un emulsionante, un colorante, un protector UV, un amortiguador, un agente de flujo o fertilizantes, fuentes de micronutrientes u otras preparaciones que influyen en el crecimiento de las plantas. Uno o más de los agroquímicos incluyen, sin limitaciones, herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas, acaricidas, reguladores del crecimiento vegetal, coadyuvantes de cosecha y fertilizantes que pueden estar combinados con vehículos, agentes tensioactivos o coadyuvantes comúnmente empleados en la técnica de las formulaciones, u otros componentes para facilitar la manipulación y la aplicación del producto sobre micotoxinas blanco particulares. Los vehículos y los coadyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos, y pueden corresponder a sustancias comúnmente empleadas en la tecnología de las formulaciones, por ejemplo, sustancias minerales, naturales o regeneradas, solventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes adhesivos, aglutinantes o fertilizantes. Los ingredientes activos de las realizaciones se aplican normalmente bajo la forma de composiciones, y puede aplicárselos sobre el área de cultivo, las plantas o las semillas a tratar, en forma simultánea o en sucesión con otros compuestos. En algunas realizaciones, los métodos para aplicar un ingrediente activo de las realizaciones o una composición agroquímica de las realizaciones (que contiene al menos una de las proteínas de las realizaciones) son aplicaciones foliares, recubrimientos para semillas y aplicaciones para la tierra. Los agentes activos en superficie adecuados incluyen, sin limitaciones, compuestos aniónicos tales como un carboxilato, por ejemplo, un metal; un carboxilato de un ácido graso de cadena larga; un N-acilsarcosinato; mono o diésteres de ácido fosfórico con alcoholes grasos etoxilados, o sales de dichos esteres; sulfatos de alcoholes grasos, tales como dodecil sulfato de sodio, octadecil sulfato de sodio o cetil sulfato de sodio; sulfatos de alcoholes grasos etoxilados; sulfatos de alquilfenol etoxilados; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; alquil aril sulfonatos, tales como alquil-bencen sulfonatos o alquilnaftalen sulfonatos inferiores, por ejemplo, sulfonato de butil-naftaleno; sales de naftalen- formaldehído sulfonadas condensadas; sales de fenol-formaldehído sulfonadas condensadas; sulfonatos más complejos, tales como sulfonatos de amida, por ejemplo, producto de la condensación sulfonada de ácido oleico y N-metiltaurino; o dialquil sulfosuccinatos, por ejemplo, sulfonato de sodio o dioctil succinato. Los agentes no iónicos incluyen los productos de condensación de esteres de ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas de ácidos grasos o alquil fenoles grasos o alquenilos sustituidos con óxido de etileno, esteres grasos de éteres de alcohol polihídrico por ejemplo, esteres de ácido graso de sorbitan, productos de condensación de tales esteres con óxidos de etileno, por ejemplo, esteres de ácido graso de polioxietilen sorbitan, copolímeros de bloques de óxido de etileno y óxido de propileno, glicoles acetilénicos, tales como 2,4,7,9-tetraetil-5decin-4,7-diol, o glicoles acetilénicos etoxilados. Los ejemplos de agentes catiónicos activos en superficie incluyen, por ejemplo, una amina mono, di o poli alifática, tal como un acetato, naftenato u oleato; o aminas que contienen oxígeno, tales como un óxido de amina de polioxietilen alquilamina; una amina unida a amida preparada por la condensación de un ácido carboxílico con una di-o poliamina; o una sal de amonio cuaternaria. Los ejemplos de materiales inertes incluyen, sin limitaciones, minerales inorgánicos, tales como kaolina, filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, o materiales botánicos, tales como corcho, mazorcas de maíz en polvo, cascara de maní, cascara de arroz y cascara de nuez de nogal. Las composiciones de las realizaciones pueden tomar una forma apropiada para una aplicación directa, o pueden ser un concentrado de una composición primaria que necesite ser diluido con una cantidad apropiada de agua u otro diluyente antes de la aplicación. La concentración descontaminante variará dependiendo de la naturaleza de la formulación en particular, específicamente si se trata de un concentrado o se usará en forma directa. En otra realización, las composiciones, así como los polipéptidos de las realizaciones, pueden tratarse antes de la formulación para prolongar la actividad cuando se los aplique en el ambiente del patógeno vegetal, siempre y cuando dicho tratamiento previo no sea perjudicial para la actividad. Este tratamiento puede efectuarse por medios químicos y/o físicos, siempre que el tratamiento no afecte las propiedades de la composición. Los ejemplos de reactivos químicos incluyen, sin limitaciones, agentes halogenantes, aldehidos, tales como formaldehído y glutaraldehído; anti-infectivos, tales como cloruro de zefirán; alcoholes tales como isopropanol y etanol; y fijadores histológicos, tales como el fijador de Bouin y el fijador de Helly (véase, por ejemplo, Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W.H. Freeman y Co.)). En una realización, las composiciones comprenden un microbio que tiene integrada en forma estable la secuencia de nucleótidos de un agente de ciclotida. Los microbios resultantes pueden procesarse y usarse como un rocío microbiano. Cualquier microorganismo apropiado puede usarse con este propósito. Véase, por ejemplo, Gaertner ef al. (1993) en Advanced Engineered Pesticides, Kim (editor). En otra realización, se introducen las secuencias de nucleótidos en microorganismos que se multiplican en plantas (epífitos) para administrar las ciclotidas a cultivos blanco potenciales. Las epífitas, por ejemplo, pueden ser bacterias gram-posítivas o gram-negativas. Además, se reconoce que pueden tratarse células completas, es decir, sin lisar, del microorganismo transformado, con reactivos que prolongan la actividad del polipéptido producido en el microorganismo, cuando se aplica el microorganismo en el ambiente de una planta blanco. Puede usarse una señal de secreción en combinación con el gen de interés, con el fin de secretar la enzima resultante hacia el exterior del microorganismo, de modo de presentarla en la planta blanco.

De este modo, puede introducirse un gen que codifica un agente de ciclotida de las realizaciones a través de un vector apropiado en un huésped microbiano, y puede aplicarse dicho huésped transformado sobre el ambiente, las plantas o los animales. Pueden seleccionarse microorganismos huésped conocidos entre aquellos que ocupan la "fitósfera" (filoplano, filósfera, rizósfera y/o rizoplana) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan ya que son capaces de competir exitosamente en un ambiente particular con los microorganismos tipo salvaje, proporcionan una expresión y un mantenimiento estable del gen que expresa el polipéptido destoxificante y una protección mejorada de las proteínas de las realizaciones de la degradación y la inactivación provocada por el ambiente. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Los ejemplos de procariotas, tanto Gram-negativos como Gram-positivos, incluyen Enterobacteriaceae, tales como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella, y Proteus; Bacillaceae; Rhizobiaceae, tales como Rhizobium; Spirillaceae, tales como photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulf ovibrio, Spiríllum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tales como Pseudomonas y Acetobacter; Azotobacteraceae; y Nitrobacteraceae. Entre los eucariotas se hallan los hongos, tales como Phycomycetes y Ascomycetes, que incluyen levaduras, tales como Saccharomyces y Schizosaccharomyces', y levaduras Basidiomycetes, tales como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces, y semejantes. Son de interés particular los microorganismos, tales como las bacterias, por ejemplo, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Metilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes; hongos, particularmente levaduras, por ejemplo, Saccharomyces, Pichia, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, Aureobasidium, y Gliocladium. Son de interés particular las especies de bacterias de la fitósfera, tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli, y Azotobacter vinlandii; y las especies de levadura de la fitósfera, tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pullulans. Las ciclotidas de las realizaciones pueden usarse para cualquier aplicación, incluyendo el recubrimiento de superficies con microbios blanco. De este modo, los microbios blanco incluyen patógenos humanos o microorganismos. Las superficies que pueden recubrirse con las ciclotidas de las realizaciones incluyen alfombras e instalaciones médicas estériles. Pueden usarse polipéptidos unidos a los polímeros de las realizaciones para recubrir superficies. Los métodos para incorporar composiciones con propiedades antimicrobianas en polímeros son conocidos en la técnica. Véase la Patente de los EEUU N° 5847047, incorporada en la presente documentación a modo de referencia. Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, y no a modo de limitación. EXPERIMENTAL Las realizaciones se definen adicionalmente en los siguientes Ejemplos, donde las partes y los porcentajes se basan en peso y los grados son Celsius, a menos que se indique lo contrario. Los procedimientos de biología molecular típicamente se realizaron como se describe en Ausubel o Sambrook, supra. Debe comprenderse que estos Ejemplos, si bien indican determinadas realizaciones de la invención, se ofrecen solamente a modo de ilustración. A partir de la descripción antepor y estos Ejemplos, aquél entrenado en la técnica pude evaluar las características esenciales de esta invención, y sin apartarse del espíritu y el alcance de ésta, puede realizar varios cambios y modificaciones a las realizaciones para adaptarlas a varios usos y condiciones. Por consiguiente, varias modificaciones de las realizaciones, además de aquellas presentadas y descriptas en la presente documentación, serán evidentes para aquél entrenado en la técnica, a partir de la descppción anterior. Estas modificaciones también están incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. La descppción de cada referencia detallada en la presente documentación se incorpora por completo en la presente documentación a modo de referencia.

Ejemplo 1 : Patrón de expresión del gen Cyclol Se obtuvo evidencia de que el gen Cyclol se expresa de forma preferencial en la raíz usando tecnología de secuenciación masiva de firmas paralelas Lynx (MPSS) (véase Brenner S, et al. (2000) Nature Biotechnology 18:630-634, Brenner S ef al. (2000) Proc Nati Acad Sci USA 97:1665-1670). Esta tecnología comprende la generación de 17 marcas de bases características a partir de muestras de ARNm que han sido transcriptas en forma inversa. Las marcas se secuencian en forma simultánea y se asignan a genes o EST. A la abundancia de estas marcas se le asigna un valor numérico que se normaliza en partes por millón (PPM), que luego permite comparar la expresión de la marca, o la abundancia de la marca, en distintos tejidos. Por consiguiente, puede usarse la plataforma MPSS para determinar el patrón de expresión de un gen particular y su nivel de expresión en distintos tejidos.

La búsqueda en la base de datos Lynx MPSS permitió identificar marcas de secuencia expresadas de forma preferencial en la raíz. Una de estas marcas correspondió al gen Cyclol . La distribución de la marca Cyclol en distintos tejidos representada en la base de datos se indica en la Figura 1. La combinación de las características cuantitativas, espaciales y temporales sugirió que el promotor del gen Cyclol era un candidato apropiado para dirigir la expresión transgénica con preferencia por la raíz en plantas, tales como maíz. Estos transgenes pueden incluir genes insecticidas, pero también pueden incluir otros genes de resistencia a estrés biótico y abiótico (sequía, sal, frío, etcétera), genes de caracteres de importancia agrícola y ARNsi y microARNA. Ejemplo 2: RACE 5' para mapear el sitio de inicio de la transcripción] para el ARNm de Cyclol . Se usó RACE 5' para mapear el sitio de inicio de la transcripción del ARNm de Cyclol , y se la llevó a cabo de acuerdo con el protocolo proporcionado con el sistema RACE 5' para amplificación rápida de extremos de ADNc (Invitrogen, Carisbad, CA), con ARN aislado de raíces de plantas de maíz endocriadas B73. Se diseñaron cebadores específicos para la UTR 3' del gen (GSP) (usando la secuencia EST) como se indica más adelante. Se usó GSP1 (SEQ ID N° 2), localizado en la cadena complementaria, entre +284 y +314 respecto del sitio de inicio de la traducción (ATG) de Cyclol , para la síntesis de la ppmera cadena. Después del tratamiento con ARNasa, el procesamiento de la reacción y la adición de colas de dC al ADNc, se realizó una amplificación de PCR con GSP2 (SEQ ID N° 3), también localizado en la cadena de ADN complementaria, entre +257 y +287 respecto del ATG, en combinación con el cebador ancla Abridged (incluido en el conjunto de elementos).

La PCR se realizó usando ADN polimerasa Pfx (Invitrogen). Las condiciones de PCR usadas fueron: 1 ciclo de 93°C por 2 minutos; seguido por 35 ciclos de la combinación de 93°C por 15 segundos, 60°C por 30 segundos y 68°C por 2 minutos; y completado por 1 ciclo de 68°C por 10 minutos. Se realizó un segundo procedimiento de PCR usando GSP3 (SEQ ID N° 4) con el cebador proporcionado en el conjunto de elementos AUAP, usando los productos de PCR del primer procedimiento como moldes. El segundo procedimiento de PCR se realizó con ADN polimerasa Platinum Taq (Invítrogen) y las siguientes condiciones de PCR: 1 ciclo de 94°C por 2 minutos; seguido por 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos y 72°C por 2 minutos; y completado por 1 ciclo de 72°C por 5 minutos. Los productos de RACE 5' se clonaron con TOPO en pCR4.0 (Invitrogen), y se secuenciaron usando los cebadores directos e inversos M13. La secuencia de RACE 5' identificó la localización del sitio de inicio de la transcripción para el ARNm de Cyclol -137 bp respecto del sitio de inicio de la traducción (ATG) de Cyclol . Ejemplo 3: Aislamiento del promotor del gen Cyclol La secuencia río arriba del sitio de inicio de la traducción del gen Cyclol se aisló usando el conjunto de elementos Universal Genome Walker (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). Se construyeron bibliotecas genómicas a partir de ADN genómico de maíz B73 de acuerdo con el protocolo del conjunto de elementos. Se diseñaron cebadores específicos para el gen (GSP) sobre la base del complemento de la secuencia del clon EST correspondiente a entre +138 y +171 bp (GSP7; SEQ ID N° 5), y entre +108 y +141 (GSP8; SEQ ID N° 6), respecto del sitio de inicio de la traducción de Cyclol . Las reacciones de PCR primarias usando los cebadores GSP7 y AP1 , y las reacciones secundarias usando GSP8 y AP2 (AP1 y AP2 están incluidos en el conjunto de elementos) se realizaron usando el conjunto de elementos de PCR de ADNc Advantage (BD BioSciences Clontech). La PCR Touchdown se realizó bajo las siguientes condiciones para las reacciones de PCR primarias y secundarias: 20 ciclos de 94°C por 15 segundos y 65°C por 4 minutos - donde la temperatura cada ciclo sucesivo se redujo en 0,5°C para las reacciones de alineamiento y extensión (por ejemplo, 65°C, 64,5°C, 64°C etcétera); seguidos por 15 ciclos de 94°C por 15 segundos y 55°C por 4 minutos (35 ciclos en total). Las reacciones de PCR secundarias usaron los productos de la PCR primaria como moldes. Los productos de PCR de caminado genómico (GW) de la reacción secundaria se clonaron con TOPO en pCR4.0 (Invitrogen) y se secuenciaron. Este conjunto de reacciones de GW resultó en 480 bp de secuencia río arriba del sitio de inicio de la traducción de Cyclol . Para obtener otra secuencia circundante 5', se realizó un segundo procedimiento de GW usando los cebadores GSP 9 (SEQ ID N° 7) y GSP10 (SEQ ID N° 8). Estos cebadores complementan la secuencia río arriba recién obtenida, y se localizan entre -364 y -334, y entre -397 y -364 bp respecto del ATG Cyclol , respectivamente. La PCR se realizó como se describió previamente, y los productos de PCR se clonaron con TOPO en pCR4.0 (Invitrogen) y se secuenciaron. La combinación de los dos procedimientos de GW resultó en un total de 1140 bp de secuencia río arriba del sitio de inicio de la traducción de Cyclol . La secuencia circundante 5' de Cyclol se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de maíz B73 usando el conjunto de elementos de ADNc Advantage (BD BioSciences Clontech) y los cebadores BamC1 (SEQ ID N° 9) y XhoC1 (SEQ ID N° 10). Se agregaron sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción BamHl y Xhol al extremo 5' de los cebadores para facilitar la subclonación subsiguiente. Las condiciones para la amplificación por PCR fueron: 1 ciclo de 94°C por 5 minutos; 40 ciclos de 94°C por 30 segundos, 50°C por 30 segundos y 72°C por 30 segundos; seguidos por 1 ciclo de 72°C por 7 minutos. La clonación con TOPO en pCR4.0 (Invitrogen) y la verificación de secuencia indicaron que se habían obtenido (-)1 140 bp respecto del ATG de Cyclol . Ejemplo 4: Análisis de la secuencia del promotor de Cyclol El análisis de la secuencia del promotor Cyclol indicó la presencia de algunos motivos. Se identificó la caja TATA, que se indica en la Figura 1. Se localiza en las posiciones 976 a 981 de SEQ ID N° 1. El motivo "ATATT", identificado previamente como presente en otros promotores con expresión específica en la raíz (Elmayan & Tepfer (1995) Transgenic Research 4, 388-396), se identificó en el promotor Cyclol en ocho localizaciones separadas. Estas localizaciones pueden observarse en la Figura 1.

El sitio de inicio de la transcripción (TSS) se mapeó por RACE 5' (véase el Ejemplo 2) y se indica en la posición 1004 en al Figura 1. Ejemplo 5: Actividad promotora de Cyclol Se realizaron ensayos de bombardeo de partículas transitorio para demostrar que la secuencia de polinucleótidos de 1140 bp de Cyclol actúa como promotor. Estos ensayos proporcionaron una evaluación rápida de la capacidad de la secuencia de ADN de dirigir la expresión transgénica. El fragmento de PCR de ADN genómico de 1140 bp (véase el Ejemplo 3) se clonó en un vector de expresión frente al gen de ß-glucuronidasa (GUS). El bombardeo biolístico de retoños de maíz de 3 días de edad con este cassette de expresión resultó en numerosos focos con coloración de GUS en el coleoptile (>20 focos/coleoptile). El nivel de coloración fue moderado, en comparación con un control que contenía el promotor constitutivo fuerte Ubi-1 para dirigir la expresión de GUS. Sin embargo, los resultados indicaron que el ADN de 1 140 bp de Cyclol puede funcionar como promotor. Materiales y métodos utilizados para el ensayo biolístico de expresión transitoria en raíz Se colocaron semillas B73 a lo largo del borde de una hoja de papel de germinación humedecida previamente en una solución de sacarosa al 7%. Una hoja de papel de germinación de tamaño idéntico que la primera se humedeció en sacarosa al 7% y se usó para cubrir las semillas. Luego se enrolló el emparedado de papel de germinación-granos-papel de germinación, y se lo colocó en un recipiente con solución de sacarosa al 7%, de modo que la solución ascendiera por el papel hasta los granos en la parte superior del rollo. Este proceso permitió el crecimiento de raíces derechas. Se dejó que los granos germinaran y se desarrollaran por 2-3 días en la oscuridad a 27-28°C. Antes del bombardeo, se eliminó la vaina externa que cubría el coleoptile, y luego se colocaron los retoños en una placa de petri estéril (60 mm) en una capa de papel de filtro Whatman #1 humedecida con 1 ml de H20. Se colocaron dos retoños por placa en orientaciones opuestas, y se los ancló al papel de filtro con una solución de agarosa al 0,5%. Se prepararon mezclas de ADN/partículas de oro para el bombardeo con el siguiente método: se pre-lavaron 60 mg de partículas de oro de entre 0,6 y 1 ,0 micrones con etanol, se lavó con H20 destilada estéril y se suspendió nuevamente en un total de 1 ml de H20 estéril. Se almacenaron alícuotas de 50 µl de la suspensión de partículas de oro en tubos Eppendorf con silicona a temperatura ambiente. Se precipitó el ADN en la superficie de las partículas de oro combinando, en el siguiente orden, 50 µl de partículas de oro pre-lavadas 0,6 µM, 5-10 µg de ADN de prueba, 50 µl de CaCI2 2,5 M y 25 µl de espermidina 0,1 M. La solución se agitó inmediatamente por 3 minutos, y se centrifugó brevemente para precipitar la mezcla de ADN/partículas de oro. La mezcla de ADN/partículas de oro se lavó una vez con 500 µl de etanol al 100% y se suspendió en un volumen final de 50 µl de etanol al 100%. La solución de ADN/oro se incubó a -20°C por al menos 60 minutos, antes de aplicar 6 µl de la mezcla de ADN/oro a cada macrovehículo Mylar™ . Los retoños preparados como se indicó previamente se bombardearon dos veces usando el cañón PDS-1000/He a 1100 psi bajo un vacío de 27-28 pulgadas de Hg. La distancia entre el macrovehículo y la pantalla de detención fue de entre 6 y 8 cm. Las placas se incubaron en recipientes sellados por 18-24 horas en la oscuridad a 27-28°C después del bombardeo. Después de 18-24 de incubación, en los retoños bombardeados se evaluó la expresión transitoria de GUS. Los retoños se sumergieron en 10-15 ml de un amortiguador de ensayo GUS que contenía NaH2P04?20 100 mM (pH 7,0), EDTA 10 mM, K4Fe(CN)6-3H20 0,5 mM, 0,1% de Tritón X-100 y 5-bromo-4-cloro- 3-indoil glucurónido 2 mM. Los tejidos se incubaron en la oscuridad por 24 horas a 37°C. El reemplazo de la solución de coloración de GUS por etanol al 100% detuvo el ensayo. Se visualizó la expresión/coloración de GUS bajo un microscopio. Ejemplo 6: Patrón de expresión de Cyclol Se crearon plantas transformadas en forma estable para permitir una caracterización más detallada de la actividad promotora, incluyendo la regulación espacial y cuantitativa del promotor. El promotor de 1 140 bp de Cyclol (SEQ ID N° 1 ) se unió operativamente al gen GUS (abreviado como Cyclol : GUS), lo que permitió detectar la actividad promotora realizando una coloración histoquímica de actividad de GUS en los tejidos vegetales. El patrón de coloración de GUS refleja la localización del promotor activo. El patrón espacial de expresión dirigida por el promotor Cyclol presentó una preferencia por la raíz (Tablas 1 y 2). Se detectó expresión de GUS predominantemente en las raíces de las plantas jóvenes que se habían desarrollado en un nutriente a base de agarosa, y en las raíces de las plantas cultivadas en invernadero cuando habían alcanzado la etapa de desarrollo V5-V6 (5-6 hojas en collar). Estos resultados apoyaron los resultados de MPSS obtenidos en el Ejemplo 1 , e indicaron que la región circundante 5' de 1140 bp fue suficiente para obtener una expresión con preferencia por la raíz. Tabla 1 : Resultados de MUG ara el romotor C clol Los valores proporcionados son valores medianos, como nmol de MU/mg de proteína total/hora MU= 4-metil umbeliferona MUG = 4-metil umbeliferil-B-D-glucurónido El análisis adicional de las plantas de invernadero demostró que la expresión se localizaba principalmente en las áreas maduras de la raíz nodal y el nudo, en las regiones de división y expansión rápida de los extremos de las raíces. Este patrón de expresión también se observó en los extremos de las raíces de las raíces laterales, aún en las raíces laterales que emergieron de áreas maduras coloradas intensamente con GUS. El análisis cuantitativo de la expresión de GUS apoyó los resultados espaciales anteriores, y demostró que los niveles de expresión fueron más altos en las regiones maduras de la raíz, y fueron menores en los extremos de la raíz. El análisis de los resultados sobre una base por planta indicó que unas pocas plantas presentaban un nivel bajo de expresión de GUS. Esto fue apoyado por el análisis histoquímico, que demostró que la expresión estaba principalmente confinada a las venas de las hojas. Se dejó que las plantas se desarrollaran hasta la etapa reproductiva R1 (en la que se observa la formación de sedas y la liberación de polen). En esta etapa, se intentó detectar la expresión de GUS dirigida por Cyclol en polen, espiguillas y sedas. No se observó expresión por coloración histoquímica en el polen de ninguna de las plantas. Se obtuvieron resultados similares cuando se calificaron las sedas. No se detectó expresión, con la excepción de unas pocas sedas de 2 plantas. En las espiguillas, el análisis reveló que aproximadamente la mitad de las plantas presentaban coloración de actividad de GUS. La intensidad de la coloración tendió a ser baja, y en comparación con el nivel de coloración en las raíces, la expresión en las espiguillas fue infepor al nivel hallado en las raíces También se realizó la coloración histoquímica de los granos una vez cosechadas las mazorcas maduras de las plantas. Los resultados mostraron que aproximadamente la mitad de las plantas evaluadas tenían granos que no presentaban expresión alguna. En aquellos que presentaban actividad de GUS, la coloración estuvo mayormente confinada a la capa de abscisión y a un área de la capa granular del escutelo cercana a la capa de abscisión. Coloración histoquímica de los tejidos vegetales para determinar la actividad de GUS La detección de la actividad de GUS se realizó colocando tejido de plantas transformadas en placas de 48 cavidades, 12 cavidades o 6 cavidades que contenían entre 0,5 y 5 ml de amortiguador de ensayo GUS (con la receta del amortiguador de ensayo descripto en el Ejemplo 5). Las placas se colocaron en una recámara al vacío por 10 minutos, luego se incubaron durante la noche a 37°C. Se eliminó la pigmentación del tejido con entre 1 y 3 incubaciones sucesivas de 12 horas en etanol al 100% a temperatura ambiente. Los tejidos se almacenaron en 70% de etanol a 4°C. Ejemplo 7: Transformación de maíz mediada por Agrobacterium y regeneración de plantas transgénicas Para la transformación mediada por Agrobacterium del maiz con una secuencia promotora de las realizaciones, se empleó el método de Zhao (véanse: Patente de los EEUU N° 5981840 (conocida de aquí en adelante como la patente '840) y Publicación de Patente PCT W098/32326, y los contenidos de ambas se incorporan en la presente documentación a modo de referencia). Se incubaron Agrobacterium en una placa principal con medio 800, se realizó el cultivo a 28°C en la oscuridad por 3 días, y luego se almacenó a 4°C por hasta un mes. Las placas de trabajo de Agrobacterium se cultivaron en placas con medio 810, y se incubaron en la oscuridad a 28°C por uno o dos días. Brevemente, se disectaron embriones a partir de espigas de maíz frescas y esterilizadas, y se los mantuvo en medio 561 Q hasta que se hubieron recolectado todos los embriones requeridos. Luego se pusieron en contacto los embriones con una suspensión de Agrobacterium preparada a partir de la placa de trabajo, donde las Agrobacterium contenían un plásmido que comprendía la secuencia promotora de las realizaciones. Los embriones se co-cultivaron con las Agrobacterium en placas 562P, con los embriones colocados en las placas con el lado del eje hacia abajo, como lo indica el protocolo de la patente '840. Después de una semana en medio 562P, los embriones se transfirieron a medio 5630. Los embriones se subcultivaron en medio 5630 fresco a intervalos de 2 semanas, y se continuó la incubación bajo las mismas condiciones. Los eventos de callos comenzaron a aparecer después de entre 6 y 8 semanas de selección. Una vez que los callos hubieron alcanzado el tamaño apropiado, se los cultivó en medio de regeneración (288W) y se los mantuvo en la oscuridad por 2-3 semanas para iniciar la regeneración de las plantas. Una vez completada la maduración de los embriones somáticos, se transfirieron los embriones somáticos bien desarrollados a un medio de germinación (272V) y se los colocó en un cuarto de cultivo iluminado. Aproximadamente 7-10 días después, se transfirieron las plántulas en desarrollo a un medio 272V libre de hormonas, en tubos, por 7-10 días, hasta que las plántulas estuvieron bien establecidas. Luego se transfirieron las plantas a insertos en bandejas planas (equivalentes a macetas de 2,5") que contenían tierra para maceta, y se las dejó crecer por 1 semana en una cámara de cultivo, luego se las dejó crecer otras 1 -2 semanas en el invernadero, para luego transferirlas a macetas clásicas 600 (de 1 ,6 galones) y cultivarlas hasta la madurez. Medios usados en la transformación mediada por Agrobacterium y la regeneración de plantas de maíz transgénicas: El medio 561Q comprende 4,0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000x SIGMA-1511 ), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 68,5 g/l de sacarosa, 36,0 g/l de glucosa, 1 ,5 mg/l de 2,4-D, y 0,69 g/l de L-prolina (llevado a volumen con di H20, después de ajustar el pH en 5,2 con KOH); 2,0 g/l de Gelrite™ (agregado después de llevar a volumen con di H20); y 8,5 mg/l de nitrato de plata (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio 800 comprende 50,0 ml/l de solución madre A y 850 ml de di H20, y se lleva a un volumen menor que 100 ml/l con di H20, después de lo cual se agregan 9,0 g de fitagar. Después de esterilizar y enfriar, se agregan 50,0 ml/l de solución madre B, junto con 5,0 g de glucosa y 2,0 ml una solución madre de 50 mg/ml de espectinomicina. La solución madre A comprende 60,0 g de K2HP04 dibásico y 20,0 g de fosfato de sodio monobásico, disuelto en 950 ml de agua, con el pH ajustado en 7,0 con KOH, y llevado hasta un volumen de 1 ,0 I con di H20. La solución madre B comprende 20,0 g de NH4CI, 6,0 g de MgS04-7H 0, 3,0 g de cloruro de potasio, 0,2 g CaCI2 y 0,05 g de FeS04-7H20, todo llevado a volumen con di H20, esterilizado y enfriado.

El medio 810 comprende 5,0 g de extracto de levadura (Difco), 10,0 g de peptona (Difco), 5,0 g de NaCI, disuelto en di H20, y se lleva a volumen después de ajustar el pH en 6,8. Luego se agregan 15,0 g de bacto-agar, la solución se esteriliza y se enfría, y se agrega 1 ,0 ml de una solución madre de 50 mg/ml de espectinomiicna. El medio 562P comprende 4,0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1 OOOx SIGMA-151 1 ), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 30,0 g/l de sacarosa, y 2,0 mg/l de 2,4-D (llevado a volumen con di H20 después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); 3,0 g/l de Gelrite™ (agregado después de llevar a volumen con di H20); y 0,85 mg/l de nitrato de plata y 1 ,0 ml de una solución madre de acetosiringona 100 mM (ambos agregados después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio 5630 comprende 4,0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000x SIGMA-151 1 ), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 30,0 g/l de sacarosa, 1 ,5 mg/l de 2,4-D, 0,69 g de L-prolina y 0,5 g de amortiguador MES (llevado a volumen con di H20 después de ajustar el pH en 5,8 con KOH). Luego se agregan 6,0 g/l de agar-agar Ultrapure™ (EM Science) y se esteriliza y enfría el medio. Luego se agregan 0,85 mg/l de nitrato de plata, 3,0 ml de una solución madre de 1 mg/ml de Bialaphos y 2,0 ml de una solución madre de 50 mg/ml de carbenicilina. 288 W comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 1 1 1 17-074), 5,0 ml/l de solución madre de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCl, 0,10 g/l de piridoxina HCl, y 0,40 g/l de glicina, llevado a volumen con D-l H20 pulida) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant, 75:473), 100 mg/l de mio- inositol, 0,5 mg/l de zeatina, y 60 g/l de sacarosa, luego llevado a volumen con D-l H20 pulida después de ajustar el pH en 5,6. Posteriormente se agregan 6,0 g/l de agar-agar Ultrapure™ (EM Science) y se esteriliza y enfría el medio. Luego se agrega 1 ,0 ml/l de ácido abscísico 0,1 mM; 1 ,0 mg/l de ácido indolacético y 3,0 mg/l de Bialaphos, junto con 2,0 ml de una solución madre de 50 mg/ml de carbenicilina. El medio libre de hormonas (272V) comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l de solución madre de vitaminas MS (0,100 g/l de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCl, 0,10 g/l de piridoxina HCl y 0,40 g/l de glicina, llevado a volumen con di H20 pulida), 0,1 g/l de mio-inositol y 40,0 g/l de sacarosa (llevado a volumen con di H20 pulida después de ajustar el pH en 5,6); y 6 g/l de bacto-agar (agregado después de llevar a volumen con di H20 pulida), esterilizado y enfriado a 60°C. Todas las publicaciones y las solicitudes de patentes mencionadas en esta memoria descriptiva indican el nivel de aquellos entrenados en la técnica a los que concierne esta invención Todas las publicaciones y las solicitudes de patentes se incorporan en la presente documentación a modo de referencia, en la misma extensión en que se indicó que se incorporó específica e individualmente cada publicación o solicitud de patente individual a modo de referencia. Aunque se ha descripto la invención precedente con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo con el fin de facilitar la compresión, será obvio que podrán practicarse determinados cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES: 1. Una molécula de ácido nucleico aislada CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , o un complemento de ésta; b) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias de promotores vegetales de los plásmidos depositados con el N° de Depósito de Patente NRRL B-30794, o un complemento de ésta; c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula vegetal; y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula vegetal.
2. Una construcción de ADN CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1 , unida operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés.
3. Un vector CARACTERIZADO PORQUE comprende la construcción de ADN de la reivindicación 2.
4. Una célula vegetal CARACTERIZADA PORQUE tiene incorporada en forma estable en su genoma la construcción de ADN de la reivindicación 2.
5. La célula vegetal de la reivindicación 4, CARACTERIZADA PORQUE dicha célula vegetal es de una monocotiledónea.
6. La célula vegetal de la reivindicación 5, CARACTERIZADA PORQUE dicha monocotiledónea es maíz.
7. La célula vegetal de la reivindicación 4, CARACTERIZADA PORQUE dicha célula vegetal es de una dicotiledónea.
8. Una planta CARACTERIZADA PORQUE tiene incorporada en forma estable en su genoma la construcción de ADN de la reivindicación 2.
9. La planta de la reivindicación 8, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una monocotiledónea.
10. La planta de la reivindicación 9, CARACTERIZADA PORQUE dicha monocotiledónea es maíz.
11. La planta de la reivindicación 8, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una dicotiledónea.
12. Una semilla transgénica CARACTERIZADA PORQUE pertenece a la planta de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 , donde la semilla comprende la construcción de ADN de la reivindicación 2.
13. La planta de la reivindicación 8, CARACTERIZADA PORQUE la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, la sal, el frío, la sequía, patógenos o insectos.
14. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos en una planta, CARACTERIZADO PORQUE comprende introducir una construcción de ADN en una planta, donde dicha construcción de ADN comprende un promotor y una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés unida operativamente al promotor, donde dicho promotor comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia detallada en SEQ ID N ; b) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias de promotores vegetales de los plásmidos designados con el N° de Depósito de Patente NRRL B-30794; c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en dicha planta; y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 o SEQ ID N° 2, donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en una célula vegetal.
15. El método de la reivindicación 14, CARACTERIZADO PORQUE dicha una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés se expresa selectivamente en la raíz.
16. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos en una célula vegetal, CARACTERIZADO PORQUE comprende introducir una construcción de ADN en una célula vegetal, donde la construcción comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, donde dicho promotor comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 ; b) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias de promotores vegetales de los plásmidos designados con el N° de Depósito de Patente NRRL B-30794; c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en dicha célula vegetal; y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en una célula vegetal. 17. Un método para expresar selectivamente una secuencia de nucleótidos en la raíz de una planta, CARACTERIZADO PORQUE comprende introducir una construcción de ADN en una célula vegetal, y regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal, donde dicha construcción de ADN comprende un promotor y una secuencia de nucleótidos heteróloga unida operativamente al promotor, donde dicho promotor comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 ; b) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias de promotores vegetales de los plásmidos depositados con el N° de Depósito de
Patente NRRL B-30794; c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula de la raíz de la planta; y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula de la raíz de la planta.
18. El método de la reivindicación 17, donde la expresión de dicha secuencia de nucleótidos heteróloga altera el fenotipo de dicha planta.
19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 17, CARACTERIZADO PORQUE la planta es una monocotiledónea.
20. El método de la reivindicación 16, CARACTERIZADO PORQUE la célula vegetal es de una monocotiledónea.
21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, CARACTERIZADO PORQUE la monocotiledónea es maíz.
22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 17, CARACTERIZADO PORQUE la planta es una dicotiledónea.
23. El método de la reivindicación 16, CARACTERIZADO PORQUE la célula vegetal es de una dicotiledónea.
24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14, 16 ó 17, CARACTERIZADO PORQUE la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, la sal, patógenos o insectos.
25. Una molécula de ácido nucleico aislada CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 11 ; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos detallada en SEQ ID N° 12 ó 13; (c) una secuencia de nucleótidos que comprende el complemento completo de (a) o (b).
26. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 25, CARACTERIZADA PORQUE la secuencia de nucleótidos está optimizada para expresar en una planta.
27. Una construcción de ADN CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 25, donde dicha secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un promotor que dirige la expresión en una célula huésped.
28. Un cassette de expresión CARACTERIZADO PORQUE comprende la construcción de ADN de la reivindicación 27.
29. Una célula huésped CARACTERIZADA PORQUE tiene incorporado en forma estable en su genoma al menos una construcción de ADN de la reivindicación 27.
30. La célula huésped de la reivindicación 29, CARACTERIZADA PORQUE dicha célula huésped es una célula vegetal.
31. Una planta CARACTERIZADA PORQUE tiene incorporada en forma estable en su genoma la construcción de ADN de la reivindicación 27.
32. La planta de acuerdo con la reivindicación 31 , CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una monocotiledónea.
33. La planta de acuerdo con la reivindicación 32, CARACTERIZADA PORQUE dicha monocotiledónea es maíz.
34. La planta de acuerdo con la reivindicación 31 , CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una dicotiledónea.
35. La planta de acuerdo con la reivindicación 34, CARACTERIZADA PORQUE dicha dicotiledónea es soja.
36. Semillas transformadas CARACTERIZADAS PORQUE pertenecen a la planta de cualquiera de las reivindicaciones 31-35, donde las semillas comprenden la construcción de ADN de la reivindicación 27.
37. Una ciclotida aislada CARACTERIZADA PORQUE comprende la secuencia de aminoácidos detallada en SEQ ID N° 12 ó 13.
38. La ciclotida aislada de la reivindicación 37, CARACTERIZADA PORQUE dicha ciclotida se caracteriza por una actividad insecticida contra al menos una plaga vegetal.
39. Un método para impactar una plaga vegetal, CARACTERIZADO PORQUE comprende introducir en una planta, o una célula de ésta, al menos una construcción de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos, unida operativamente a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante en células vegetales, donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 1 ; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos detallada en SEQ ID N° 12 ó 13; (c) una secuencia de nucleótidos que comprende el complemento completo de (a) o (b).
40. El método de la reivindicación 39, CARACTERIZADO PORQUE dicha planta produce un polipéptido que presenta actividad insecticida contra al menos una plaga vegetal. RESUMEN Composiciones y métodos para regular la expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta. Las composiciones incluyen una nueva secuencia de nucleótidos de un promotor con preferencia por la raíz para el gen que codifica Cyclol . Se proporciona un método para expresar una secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta usando las secuencias promotoras descriptas en la presente documentación. El método comprende incorporar en forma estable una secuencia de nucleótidos, unida operativamente al promotor con preferencia por las raíces de la presente invención, en el genoma de una célula vegetal, y regenerar una planta transformada en forma estable que expresa la secuencia de nucleótidos. La presente invención también se relaciona con ácidos nucleicos aislados que codifican ciclotidas vegetales. La invención se relaciona con la construcción de un gen quimérico que codifica la totalidad o una porción de la ciclotida vegetal, en la orientación del marco de lectura o antisentido, donde la expresión del gen quimérico resulta en la producción de niveles alterados de ciclotidas vegetales en una célula huésped transformada.