MX2007008712A

MX2007008712A - Un promotor inducible de desoxihipusina sintetasa de maiz.

Info

Publication number: MX2007008712A
Application number: MX2007008712A
Authority: MX
Inventors: Billy F Mccutchen; Albert L Lu; Scott Diehn; Lynne E Sims; Kim R Ward
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 2005-01-20
Filing date: 2006-01-11
Publication date: 2009-02-18
Also published as: US20060162015A1; CA2595203C; US7439348B2; WO2006083513A2; EP1841876A2; WO2006083513A3; AR052088A1; BRPI0606427A2; CA2595203A1

Abstract

Composiciones y métodos para regular la expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta. Las composiciones incluye una nueva secuencia de nucleótidos de un promotor inducible del gen que codifica una desoxihipusina sintetasa de maíz. Se proporciona un método para expresar una secuencias de nucleótidos heteróloga en una planta usando las secuencias promotoras descriptas en la presente documentación. El método comprende incorporar en forma estable en el genoma de una célula vegetal una secuencia de nucleótidos unida operativamente al promotor con preferencia por la raíz de la presente invención, y regenerar una planta transformada en forma estable que expresa la secuencia de nucleótidos.

Description

UN PROMOTOR INDUCIBLE DE DESOX1HIPUSINA SINTETASA DE MAÍZ REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica prioridad y el beneficio de la Solicitud Provisional de los EEUU N° 60/645.146, presentada el 20 de enero de 2005, que se incorpora por completo en la presente documentación a modo de referencia. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de la biología molecular de plantas, más particularmente con la regulación de la expresión genética en plantas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los avances recientes en la ingeniería genética de plantas han permitido diseñar plantas con características o caracteres mejorados, tales como resistencia a enfermedades, resistencia a insectos, resistencia a herbicidas, estabilidad o duración de almacenamiento mejorada del producto de consumo final obtenido de las plantas, y mejoramiento de la calidad nutricional de las porciones comestibles de la planta. Por consiguiente, en el genoma de la planta pueden incorporarse uno o más genes deseados de una fuente diferente de la planta, pero modificados para impartir características o cualidades diferentes o mejoradas. De este modo, pueden expresarse uno o más genes nuevos en la célula vegetal para que presente el fenotipo deseado, tal como un carácter o una característica nueva. Debe haber señales reguladoras apropiadas presentes, y deben estar en la localización apropiada respecto del gen, con el fin de obtener la expresión del gen recién insertado en la célula vegetal. Estas señales reguladoras pueden incluir, sin limitaciones, una región promotora, una secuencia directriz 5' no traducida y una secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación 3'.

Un promotor es una secuencia de ADN que dirige la maquinaria celular de una planta para producir ARN a partir de la secuencia codificante contigua río abajo (3') del promotor. La región promotora influye en la velocidad, la etapa del desarrollo y el tipo celular en el que se expresa el transcripto de ARN a partir del gen. El transcripto de ARN se procesa para producir ARN mensajero (ARNm), que sirve como molde para la traducción de la secuencia de ARN en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. La secuencia directriz 5' no traducida es una región del ARNm río arriba de la región codificante de la proteína, que puede participar en el inicio y la traducción del ARNm. La señal de terminación de la transcripción/poliadenilación 3' es una región no traducida río abajo de la región codificante de la proteína, que opera en las células vegetales para provocar la terminación de la transcripción del ARN y la adición de nucleótidos de poliadenilato en el extremo 3' del ARN. La expresión de las secuencias de ADN heterólogas en un huésped vegetal depende de la presencia de un promotor unido operativamente que opera en la planta huésped. El tipo de secuencia promotora seleccionada se basa en cuándo y dónde se desea la expresión del ADN heterólogo en el organismo. Cuando se desea la expresión en tejidos u órganos específicos, pueden usarse promotores con preferencias tisulares. Cuando se desea la expresión genética en respuesta a un estímulo, los promotores inducibles son el elemento regulador a elegir. En contraste, cuando se desea una expresión continua en todas las células de una planta, se utilizan promotores constitutivos. Un promotor ¡nducible es un promotor que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripción de una o más secuencias de ADN o genes en repuesta a un inductor. En ausencia de un inductor, las secuencias de ADN o los genes no se transcribirán o se transcribirán a un nivel menor que en un estado inducido. El inductor puede ser un agente químico, tal como un metabolito, un regulador del crecimiento, un compuesto herbicida o fenólico, o un estrés fisiológico impuesto directamente sobre la planta, tal como frío, sequía, calor, sal, toxinas. En el caso del combate de plagas vegetales, también es deseable tener un promotor que sea inducido por patógenos vegetales, incluyendo insectos plaga, nematodes o agentes causantes de enfermedades en plantas, tales como una bacteria, un virus o un hongo. El contacto con el patógeno inducirá la activación de la transcripción, de modo que se producirá una proteína que combatirá el patógeno en un momento en que sea efectiva para defender la planta. También puede usarse un promotor inducido por patógenos para detectar el contacto con un patógeno, por ejemplo, mediante la expresión de un marcador detectable, de modo que pueda evaluarse la necesidad de aplicación de pesticidas. Una célula vegetal que contiene un promotor inducible puede exponerse a un inductor aplicando el inductor a la célula o la planta por vía externa, tal como por medio de rocío, riego, calentamiento o exposición al patógeno operativo. Un promotor constitutivo es un promotor que dirige la expresión de un gen en varias partes de una planta y en forma continua durante el desarrollo de la planta. Los ejemplos de algunos promotores constitutivos que se usan ampliamente para inducir la expresión de genes heterólogos en plantas transgénicas incluyen el promotor del gen de nopalina sintetasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, (Patente de los EEUU N° 5034322), los promotores 35S y 19S del virus en mosaico de la coliflor (CaMv) (Patente de los EEUU N° 5352605), aquellos derivados de cualquiera de los distintos genes de actina, de los que se sabe que se expresan en la mayor parte de los tipos celulares (Patente de los EEUU N° 6002068), y el promotor de ubiquitina, (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 72:619-632; y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675- 689), que es un producto genético conocido por acumularse en muchos tipos celulares. Pueden incluirse otras secuencias reguladoras río arriba y/o río abajo de la secuencia promotora nuclear en las construcciones de expresión de los vectores de transformación, con el propósito de alterar los niveles de expresión de las secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta transgénica. Por consiguiente, la modificación genética de plantas mediante el uso de técnicas de ingeniería genética para producir plantas con caracteres útiles requiere de la disponibilidad de una variedad de promotores. Con el fin de maximizar la aplicación comercial de la tecnología de plantas transgénicas, puede ser útil dirigir la expresión del ADN introducido de una forma con especificidad por sitios. Por ejemplo, puede ser útil producir compuestos defensivos tóxicos en los tejidos que se ven sometidos al ataque de patógenos, pero no en los tejidos que han de ser cosechados e ingeridos por los consumidores. Al dirigir la síntesis o el almacenamiento de proteínas o compuestos deseables de una forma con especificidad por sitios, pueden manipularse las plantas como fabricas o sistemas de producción, de modo de obtener una variedad importante de compuestos con utilidad comercial. Los promotores con especificidad celular proporcionan la capacidad de dirigir la síntesis de los compuestos, en forma espacial y temporal, a tejidos u órganos muy especializados, tales como raíces, hojas, tejidos vasculares, embriones, semillas o flores. Como alternativa, puede ser deseable inhibir la expresión de una secuencia de ADN nativa en los tejidos de una planta para obtener un fenotipo deseado. Puede lograrse esta inhibición transformando la planta para que comprenda un promotor con preferencia tisular, unido operativamente a una secuencia de nucleótidos antisentido, de modo que la expresión de la secuencia antisentido produzca un transcripto de ARN que interfiera con la traducción del ARNm de la secuencia de ADN nativa. Son de interés particular los promotores inducidos por la alimentación de insectos plaga. Los insectos plaga son un factor importante en la pérdida de cultivos agrícolas en el mundo. Las pérdidas de cultivos relacionadas con insectos plaga, atribuidas la oruga de la raíz del maíz por sí sola, alcanzan mil millones de dólares al año. La oruga de la raíz del maíz occidental (WCRW) es un insecto plaga importante del maíz en muchas regiones del mundo. Si bien no constituyen una plaga tan importante como la oruga de la raíz del maíz occidental, las orugas de la raíz del maíz del sur y el norte también pueden provocar daños económicos significativos al maíz. El daño provocado por las orugas de la raíz del maíz puede resultar en una mayor cantidad de derribos, menor tolerancia a la sequía, y finalmente pueden provocar reducciones en el rendimiento de los cultivos. Otra de las plagas que provocan derribos es Ostrinia nubilalis, comúnmente conocida como taladro del maíz europeo (ECB). COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para regular la expresión genética en una planta. Las composiciones comprenden nuevas secuencias de nucleótidos de un promotor inducible. Más particularmente, se proporciona una región de inicio de la transcripción aislada de maíz. Otras realizaciones de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 1 , un fragmento de la secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 1 , y las secuencias promotoras vegetales depositada en la Colección Americana de Tipos de Cultivo (ATCC) el 3 de Noviembre de 2004, en un huésped bacteriano con el N° de Depósito de Patente PTA-6277. Además, las realizaciones de la invención comprenden secuencias de nucleótidos que tienen al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , y que dirigen la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos unida operativamente. También se incluyen fragmentos funcionales de la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 que dirigen la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos unida operativamente. Las realizaciones de la invención también incluyen construcciones de ADN que comprenden un promotor unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, donde dicho promotor es capaz de dirigir la expresión de dicha secuencia de nucleótidos en una célula vegetal y dicho promotor comprende las secuencias de nucleótidos descriptas en la presente documentación. Además, en las realizaciones de la invención se proporcionan vectores de expresión, y plantas o células vegetales que tienen incorporada en forma estable en sus genomas una construcción de ADN mencionada previamente. Adicionalmente, las composiciones incluyen semillas transgénicas de dichas plantas. Las realizaciones del método comprenden un medio para expresar selectivamente una secuencia de nucleótidos en una raíz de una planta, que comprende transformar una célula vegetal con una construcción de ADN, y regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal, donde la construcción de ADN comprende un promotor y una secuencia de nucleótidos heteróloga unida operativamente a dicho promotor, donde dicho promotor inicia la transcripción inducible de dicha secuencia de nucleótidos en una célula vegetal. De este modo, las secuencias promotoras son útiles para controlar la expresión de secuencias codificantes unidas operativamente de una forma inducible.

Río abajo y bajo la regulación del inicio de la transcripción del promotor habrá una secuencia de interés que proporcionará la modificación del fenotipo de la planta. Esta modificación incluye modular la producción de un producto endógeno, en lo referente a la cantidad, la distribución relativa o semejante, o la producción de un producto de expresión de exógeno para obtener una función o un producto nuevo en la planta. Por ejemplo, se incluye una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, a la sal, el frío, la sequía, patógenos o insectos. En otra realización, se proporciona un método para modular la expresión de un gen en una planta transformada en forma estable, que comprende los pasos de (a) transformar una célula vegetal con una construcción de ADN que comprende el promotor de las realizaciones, unido operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos; (b) cultivar la célula vegetal bajo condiciones que favorecen el crecimiento de una planta y (c) regenerar una planta transformada en forma estable a partir de la célula vegetal, donde la expresión de la secuencia de nucleótidos altera el fenotipo de la planta. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es el perfil de Lynx MPSS del gen DHS, que presenta expresión preferencial en la raíz. La Figura 2 es un resultado de Northern blot que ilustra la expresión de DHS en tejido de raíz de plantas de maíz en la etapa V5, con y sin infestación de oruga de la raíz del maíz occidental. No se detectó expresión en las hojas en cualquier caso. El resultado describe el transplante de la planta a tierra fresca. El daño en las raíces generado por este proceso no induce la expresión de DHS. Por consiguiente, esta figura demuestra el patrón de expresión e inductibilidad en la raíz predicho por los datos de Lynx MPSS. Se proporcionan detalles adicionales sobre esta transferencia en el Ejemplo 1 . En la Figura 3 se muestra la secuencia del promotor DHS y su UTR 5'. Se indican las posiciones de la caja TATA, el sitio de inicio de la transcripción (TSS) mapeado por RACE 5' y otros motivos de interés. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las realizaciones de la invención comprenden nuevas secuencias de nucleótidos para promotores vegetales, particularmente un promotor inducible de un gen de desoxihipusina sintetasa (DHS) de maíz, más particularmente, el promotor del gen DHS. En particular, las realizaciones proveen moléculas de ácidos nucleicos que comprenden la secuencia de nucleótidos detallada en SEQ ID N° 1 , y la secuencia promotora vegetal depositada en huéspedes bacterianos como el Depósito de Patente N° PTA-6277 el 3 de Noviembre de 2004, y fragmentos, variantes y complementos de ésta. Los plásmídos que contienen las secuencias de nucleótidos promotoras vegetales de las realizaciones se depositaron el 3 de Noviembre de 2004 en el Depósito de Patentes de la Colección Americana de Tipos de Cultivo (ATCC), en 10801 University Blvd., Manassas, VA 201 10-2209, y se le asignó el Depósito de Patente N° PTA-6277. Este depósito se mantendrá bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con Propósitos de Procedimientos de Patentes. Este depósito se realizó meramente con fines de conveniencia para aquellos entrenados en la técnica, y no se admite que sea necesario un depósito bajo 35 U.S.C. §1 12. El depósito estará disponible para el público, de forma irrevocable y sin estricciones o condiciones, una vez otorgada la patente. Sin embargo, deberá comprenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la presente invención como derogación de los derechos de patente garantizados por la acción del gobierno. Las secuencias promotoras de las realizaciones son útiles para expresar secuencias de nucleótidos unidas operativamente de manera inducible. Las secuencias también pueden usarse en la construcción de vectores de expresión para la transformación subsiguiente en plantas de interés, como sondas para aislar otros promotores de genes DHS, como marcadores moleculares, y semejantes. El promotor DHS de maíz de las realizaciones fue aislado a partir de ADN genómico de maíz. El método específico usado para obtener el promotor DHS de la presente invención se describe en el Ejemplo 3 de la sección experimental de esta solicitud. Las realizaciones comprenden composiciones de ácidos nucleicos aislados o sustancialmente purificados. Una molécula de ácidos nucleicos "aislada" o "purificada", o una porción de ésta con actividad biológica, está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo, cuando se la produce de acuerdo con técnicas recombinantes, o está sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas, cuando se la sintetiza por medios químicos. Un ácido nucleico "aislado" está sustancialmente libre de las secuencias (incluyendo secuencias que codifican proteínas) que lo rodean en su ambiente natural (es decir, las secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que rodean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que deriva el ácido nucleico.

El producto del gen DHS tiene una participación central en el desarrollo y la senescencia de la planta. DHS cataliza el primer paso en la síntesis post-traduccional de dos pasos de la hipusina, que está únicamente presente en el factor de inicio eucariota 5A (elF5A). DHS y elF5A están conservados en el reino eucariota, y ambos son esenciales para la proliferación y la supervivencia celular. La proteína DHS de maíz presenta 85% de identidad de secuencia con una secuencia parcial del gen de DHS de Oryza sativa. Este gen DHS de maíz se expresa en tejido de raíz de maíz que ha sido dañado por la alimentación de la oruga de la raíz del maíz, lo que puede demostrarse con comparaciones de perfiles de expresión genética entre distintos tejidos y tratamientos derivados de secuenciación masiva de firmas paralelas Lynx (MPSS), que se describe con mayor detalle en el Ejemplo 1 . La secuencia promotora DHS dirige la expresión de las secuencias de nucleótidos unidas operativamente de forma ¡nducible. Entonces, las secuencias promotoras DHS pueden usarse en la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos de interés unida operativamente. Las composiciones de las realizaciones incluyen moléculas de ácidos nucleicos que comprenden la secuencia de nucleótidos promotora detallada en SEQ ID N° 1 . El término "promotor" designa una región de ADN reguladora, que comprende comúnmente una caja TATA capaz de dirigir la ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en el sitio de inicio de la transcripción apropiado para una secuencia codificante particular. Además, un promotor puede comprender otras secuencias de reconocimiento localizadas generalmente río arriba o 5' de la caja TATA, conocidas como elementos promotores río arriba, que influyen en la velocidad de inicio de la transcripción. Se reconoce que, al haber identificado las secuencias de nucleótidos para las regiones promotoras descriptas en la presente documentación, el aislamiento y la identificación de otros elementos reguladores en la región 5' no traducida de las regiones promotoras particulares identificadas en la presente documentación está dentro del alcance de aquellos entrenados en la técnica. Por consiguiente; por ejemplo, las regiones promotoras descriptas en la presente documentación pueden comprender elementos reguladores río arriba adicionales, tales como aquellos responsables de la expresión tisular y temporal de la secuencia codificante, los potenciadores y semejantes. Véanse en particular la Patente Australiana N° AU-A-7775 /94 y las Patentes de los EEUU N° 5466785 y 5635618. Del mismo modo, los elementos promotores que permiten la expresión inducible pueden identificarse, aislarse y usarse con otros promotores nucleares para conferir una expresión inducible. En este aspecto de las realizaciones, un "promotor nuclear" designa un promotor sin elementos promotores. En el contexto de esta descripción, el término "elemento regulador" también hace referencia a una secuencia de ADN, comúnmente, pero no siempre, río arriba (5') de la secuencia codificante de un gen estructural, que incluye secuencias que controlan la expresión de la región codificante al proporcionar el reconocimiento por la ARN polimerasa y/u otros factores requeridos para que la transcripción comience en un sitio particular. Un ejemplo de un elemento regulador que permite el reconocimiento por la ARN polimerasa u otros factores de transcripción para asegurar el inicio en un sitio particular es un elemento promotor. Un elemento promotor comprende un elemento promotor nuclear, responsable del inicio de la transcripción, así como otros elementos reguladores (como se describe en otra parte de esta solicitud) que modifican la expresión genética. Debe comprenderse que las secuencias de nucleótidos localizadas en los intrones, o 3' de la secuencia de la región codificante, también pueden contribuir a la regulación de la expresión de una región codificante de interés. Los ejemplos de intrones apropiados incluyen, sin limitaciones, el intrón IVS6 de maíz o el intrón de actina de maíz. Un elemento regulador también puede incluir aquellos elementos localizados río abajo (3') del sitio de inicio de la transcripción, o dentro de regiones transcriptas, o ambos. En el contexto de la presente exposición, un elemento regulador post-transcripcional puede incluir los elementos que están activos después del inicio de la transcripción, por ejemplo, potenciadores de la traducción y la transcripción, represores de la traducción y la transcripción, y determinantes de la estabilidad del ARNm. Los elementos reguladores de las realizaciones, o los fragmentos de éstos, pueden estar asociados operativamente con elementos reguladores o promotores heterólogos, con el fin de modular la actividad del elemento regulador heterólogo. Esta modulación incluye el mejoramiento o la represión de la actividad de transcripción del elemento regulador heterólogo, la modulación de los eventos post-transcripcionales, o el mejoramiento o la represión de la actividad de transcripción del elemento regulador heterólogo, y la modulación de los eventos post-transcripcionales. Por ejemplo, uno o más elementos reguladores de las realizaciones, o fragmentos de éstos, puede asociarse operativamente con promotores constitutivos, inducibles o específicos para tejidos, o con fragmentos de éstos, para modular la actividad de estos promotores en las células vegetales de tejidos deseados. La secuencia promotora DHS de maíz, cuando se coloca en una construcción de ADN, de modo tal que el promotor está unido operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés, permite la expresión de la secuencia de nucleótidos en las células de una planta transformada en forma estable con esta construcción de ADN. El término "unida operativamente" denota que la transcripción o la traducción de la secuencia de nucleótidos heteróloga está bajo la influencia de la secuencia promotora. La "unión operativa" también designa la unión de dos secuencias de nucleotidos, de modo tal que la secuencia codificante de cada fragmento de ADN permanece en el marco de lectura apropiado. De este modo, las secuencias de nucleotidos para los promotores de las realizaciones se proporcionan en construcciones de ADN, en combinación con la secuencia de nucleotidos de interés, típicamente una secuencia de nucleotidos heteróloga, para obtener la expresión en la planta de interés. El término "secuencia de nucleotidos heteróloga" designa una secuencia que no está unida operativamente en forma natural con la secuencia promotora. Si bien esta secuencia de nucleotidos es heteróloga respecto de la secuencia promotora, puede ser homologa, o nativa; o heteróloga, o extraña, respecto de la planta huésped. Se reconoce que los promotores de las realizaciones pueden usarse con sus secuencias codificantes nativas para incrementar o disminuir la expresión, lo que resulta en un cambio en el fenotipo de la planta transformada. · Las modificaciones de las secuencias promotoras aisladas de las realizaciones pueden proporcionar un rango de expresión de la secuencia de nucleotidos heteróloga. Por consiguiente, puede modificárselas para que sean promotores débiles o promotores fuertes. En general, un "promotor débil" designa un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante en un nivel bajo. Un nivel de expresión "bajo" hace referencia a niveles de expresión de entre aproximadamente 1/10000 transcriptos, aproximadamente 1/100000 transcriptos y aproximadamente 1/500000 transcriptos. Por otro lado, un promotor fuerte dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel elevado, o entre aproximadamente 1/10 transcriptos, aproximadamente 1 /100 transcriptos y aproximadamente 1/1000 transcriptos.

Los fragmentos y las variantes de las secuencias promotoras descriptas también están comprendidos por las realizaciones. Un "fragmento" designa una porción de la secuencia promotora. Los fragmentos de una secuencia promotora pueden retener la actividad biológica, y por consiguiente, abarcan fragmentos capaces de dirigir la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos unida operativamente. Por consiguiente, por ejemplo, puede utilizarse menos que la secuencia promotora completa descripta en la presente documentación para dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés unida operativamente, tal como una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina heteróloga. Aquellos entrenados en la técnica saben cómo determinar si estos fragmentos disminuyen los niveles de expresión o alteran la naturaleza de la expresión, es decir, expresión constitutiva o inducible. Como alternativa, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos promotora que son útiles como sondas de hibridización, como se describe más adelante, puede no retener esta actividad de regulación. Por consiguiente, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar entre al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta la extensión completa de las secuencias de nucleótidos de las realizaciones. Por consiguiente, un fragmento de una secuencia de nucleótidos promotora DHS puede codificar una porción del promotor DHS con actividad biológica, o puede ser un fragmento que puede usarse como una sonda de hibridización o un cebador de PCR, de acuerdo con los métodos que se describen más adelante. Puede prepararse una porción con actividad biológica de un promotor DHS aislando una porción de la secuencia de nucleótidos del promotor DHS y evaluando la actividad de dicha porción del promotor DHS. Las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos promotora comprenden al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, o hasta la cantidad de nucleótidos presentes en la secuencia de nucleótidos promotora completa descripta en la presente documentación, por ejemplo 949 nucleótidos para SEQ ID N° 1 . Los nucleótidos de dichos fragmentos comúnmente comprenderán la caja de reconocimiento TATA de la secuencia promotora particular. Estos fragmentos pueden obtenerse usando enzimas de restricción paras cortar la secuencia de nucleótidos promotora de ocurrencia natural descripta en la presente documentación; sintetizando una secuencia de nucleótidos de la secuencia de ocurrencia natural de la secuencia de ADN promotora; o pueden obtenerse usando tecnología de PCR. Véase en particular, Mullís et al. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350, y Erlich, editor (1989) PCR Technology (Stockton Press, Nueva York). Las variantes de estos fragmentos promotores, tales como aquellas resultantes de mutagénesis dirigida a sitios específicos y un procedimiento tal como el "barajado de ADN" también están abarcadas por las composiciones de las realizaciones. Un "análogo" de los elementos reguladores de las realizaciones incluye cualquier sustitución, deleción o adición a la secuencia de un elemento regulador, siempre que dicho análogo mantenga al menos una propiedad de regulación asociada con la actividad del elemento regulador de las realizaciones. Estas propiedades incluyen el direccionamiento de la especificidad por órganos, la especificidad por tejidos o una combinación de éstas, o la actividad temporal, la actividad durante el desarrollo o una combinación de éstas. El término "variantes" designa secuencias que tienen una similitud sustancial con una secuencia promotora descripta en la presente documentación. Para las secuencias de nucleótidos, pueden identificarse variantes de ocurrencia natural como éstas mediante el uso de procedimientos conocidos de biología molecular, tales como por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridización detalladas más adelante. Las variantes de las secuencias de nucleótidos también incluyen las secuencias de nucleótidos derivadas en forma sintética, tales como aquellas generadas, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida a sitios específicos. En general, las variantes de una secuencia de nucleótidos particular de las realizaciones tendrán al menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, hasta 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con dicha secuencia de nucleótidos particular, determinada empleando los programas de alineamiento de secuencias descriptos en otra parte la presente documentación, usando los parámetros por omisión. Las variantes con actividad biológica también están abarcadas por las realizaciones. Las variantes con actividad biológica incluyen, por ejemplo, la secuencias promotoras nativas de las realizaciones que tienen una o más sustituciones, deleciones o inserciones de nucleótidos. La actividad promotora puede medirse usando procedimientos tales como análisis de Northern, mediciones de actividad informante tomadas de fusiones de transcripción, y semejantes. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York), conocido de aquí en adelante como "Sambrook", e incorporado en la presente documentación a modo de referencia. Como alternativa, pueden medirse los niveles de un gen informante, tal como la proteína fluorescente verde (GFP) o semejantes, producidos bajo el control de un fragmento promotor o una variante. Véase, por ejemplo, la Patente de los EEUU N° 6072050, incorporada en la presente documentación a modo de referencia.

Aquél entrenado en la técnica reconocerá que algunas regiones de los promotores podrán tolerar las variaciones mejor que otras. En particular, las regiones que contengan motivos promotores conocidos, importantes para la función, y que puedan conferir características específicas a la actividad del promotor, probablemente tolerarán menos las modificaciones, y deberán mantenerse cuando se busquen o diseñen variantes de los promotores. Los métodos para efectuar mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 754:367-382; Patente de los EEUU N° 4873192; Walker y Gaastra, editores (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias citadas en dichas publicaciones. Las variantes de las secuencias de nucleótidos promotoras también comprenden secuencias derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico, tal como el barajado de ADN. Con un procedimiento como este, pueden manipularse una o más secuencias promotoras diferentes para crear un nuevo promotor que posee las propiedades deseadas. De este modo, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de secuencias de polinucleótidos relacionadas que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial, las cuales pueden recombinarse en forma homologa en vitro o in vivo. En la técnica se conocen estrategias para barajar ADN. Véanse, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :10747-10751 ; Stemmer (1994) Nature 370:389-391 ; Crameri ef al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore ef al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336- 347; Zhang ef al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391 :288-291 ; y las Patentes de los EEUU N° 5605793 y 5837458.

Las secuencias de nucleótidos de las realizaciones pueden usarse para aislar secuencias correspondientes, tal como otras plantas, por ejemplo, otras monocotiledóneas. De este modo, pueden usarse métodos, tales como PCR, hibridización y semejantes, para identificar estas secuencias sobre la base de su homología de secuencia con la secuencia detallada en la presente documentación. Las secuencias aisladas sobre la base de su identidad de secuencia con la secuencia promotora DHS completa detallada en la presente documentación, o con fragmentos de éstas, están abarcadas por las realizaciones. Las regiones promotoras de las realizaciones pueden aislarse de cualquier planta, incluyendo, sin limitaciones, maíz (Zea mays), Brassica {Brassica napus, Brassica rapa ssp. ), alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Sécale cereale), sorgo {Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus annuus), trigo (Triticum aestivum), soja (Glicine max), tabaco (Nicotiana tabacum), papa (Solanum tuberosum), maní (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), casava (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nucífera), ananá (Ananas comosus), árboles de cítricos (Citrus spp.), cacao ( Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), avocado (Persea americana), higo (Ficus casica), guava (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), avena, cebada, cártamo, verduras, ornamentales y coniferas. En un abordaje basado en PCR, pueden diseñarse oligonucleótidos cebadores para usar en reacciones de PCR para amplificar las secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. En un abordaje basado en PCR, pueden diseñarse oligonucleótidos cebadores para usar en reacciones de PCR para amplificar las secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y efectuar clonaciones por PCR son generalmente conocidos en la técnica, y se describen en Sambrook, supra. Véanse también Innis et al., editores (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, editores (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, editores (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos de PCR conocidos incluyen, sin limitaciones, métodos para usar cebadores apareados, cebadores anidados, cebadores individuales específicos, cebadores degenerados, cebadores específicos para genes, cebadores específicos para vectores, cebadores con faltas de coincidencia parciales y semejantes En los procedimientos de hibridización, se utiliza la totalidad o parte de una secuencia de nucleótidos conocida como una sonda, la cual hibridiza selectivamente con otras secuencias de nucleótidos correspondientes presentes una población de fragmentos de ADN genómico o fragmentos de ADNc clonados (es decir, bibliotecas genómicas o bibliotecas de ADNc) de un organismo seleccionado. Las sondas de hibridización pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos, y pueden estar marcadas con un grupo detectable, tal como 32P, o con cualquier otro marcador de detección. De este modo, por ejemplo, pueden prepararse sondas de hibridización marcando oligonucleótidos sintéticos basados en la secuencia promotora DHS. Los métodos para preparar sondas para hibridizar y construir bibliotecas de ADNc y genómicas son generalmente conocidos en la técnica, y se describen en Sambrook, supra. Por ejemplo, puede usarse la secuencia promotora DHS completa descripta en la presente documentación, o una o más porciones de ésta, como una sonda capaz de hibridizar específicamente con las secuencias promotoras DHS correspondientes. Para obtener una hibridización específica bajo una variedad de condiciones, estas sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias promotoras DHS y tienen al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, y generalmente al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Estas sondas pueden usarse para amplificar las secuencias promotoras DHS correspondientes a partir de una planta seleccionada por PCR. Puede usarse este procedimiento para aislar secuencias codificantes adicionales a partir de un organismo deseado, o como un ensayo diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en una planta. Los procedimientos de hibridización incluyen el análisis de hibridización de bibliotecas de ADN plaqueadas (placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook, supra). La hibridización de dichas secuencias puede llevarse a cabo bajo condiciones severas. Las "condiciones severas" o "condiciones de hibridización severas" comprenden condiciones bajo las cuales una sonda hibridiza con su secuencia blanco, con un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces respecto del fondo). Las condiciones severas dependen de la secuencia y difieren bajo distintas circunstancias. Mediante el control de la severidad de la hibridización y/o las condiciones de lavado, pueden identificarse secuencias blanco que son 100% complementarias con la sonda (análisis de homólogos). Como alternativa, pueden ajustarse las condiciones de severidad para permitir un cierto grado de falta de coincidencia entre las secuencias, con el fin de detectar grados de similitud menores (análisis de heterólogos). En general, una sonda tiene menos que aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, comúnmente menos que 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones severas son aquellas donde la concentración de sal es menor que aproximadamente 1 ,5 M de iones Na, típicamente una concentración de entre aproximadamente 0,01 y 1 ,0 M de iones Na (o de otras sales) a un pH de entre 7,0 y 8,3, donde la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, de entre 10 y 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, de más de 50 nucleótidos). También pueden obtenerse condiciones severas agregando agentes desestabilizadores, tales como formamida. Los ejemplos de condiciones de severidad baja incluyen una hibridización con una solución amortiguadora con entre 30 y 35% de formamida, NaCI 1 M, 1 % de SDS (dodecil sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en SSC entre 1 X y 2X (SSC 20X = NaCI 3,0 M/citrato de t sodio 0,3 M) a 50-55°C. Los ejemplos de condiciones de severidad moderada incluyen una hibridización en una solución que contiene entre 40 y 45% de formamida, NaCI 1 ,0 M, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado en SSC entre 0,5X y 1 X a 55-60°C. Los ejemplos de condiciones de severidad alta incluyen una hibridización en 50% de formamida, NaCI 1 M, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado final en SSC 0,1 X a 60-65°C por al menos 30 minutos. La duración de la hibridización es generalmente menor que aproximadamente 24 horas, comúnmente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 12 horas. La especificidad es típicamente una función de los lavados post-hibridizacíón, donde los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de ADN-ADN , puede estimarse el punto de fusión térmico (Tm) empleando la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 738:267-284: Tm = 81 ,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (% de GC) - 0,61 (% de form.) - 500/I; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de form. es el porcentaje de formamida en la solución de hibridización, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. El Tm es la temperatura (a una fuerza iónica y un pH específico) a la que 50% de una secuencia blanco complementaria hibridiza con una sonda que coincide perfectamente. El Tm se reduce en aproximadamente 1°C por cada 1 % de falta de coincidencia; por consiguiente, pueden ajustarse el Tm, las condiciones de hibridización y/o lavado para efectuar una hibridización con secuencias con una identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con ? 90% de identidad, puede reducirse el Tm en 10°C. Generalmente se seleccionan condiciones severas con temperaturas aproximadamente 5°C menores que el Tm para la secuencia específica y su complemento, a una fuerza iónica y un pH específico. Sin embargo, pueden obtenerse condiciones muy severas utilizando una hibridización y/o un lavado a una temperatura 1 , 2, 3 ó 4°C menor que el Tm; las condiciones de severidad moderada utilizan una hibridización y/o un lavado a una temperatura 6, 7, 8, 9 ó 10°C menor que el punto de fusión térmico (Tm); las condiciones de severidad baja utilizan una hibridización y/o un lavado a una temperatura 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 20°C menor que el punto de fusión térmico (Tm). Usando la ecuación, las condiciones de hibridización y lavado deseadas, y el Tm deseado, aquellos entrenados en la técnica comprenderán que se describen en forma implícita variaciones en la severidad de las soluciones de hibridización y/o lavado. Si el grado de falta de coincidencia resulta en un Tm menor que 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), es preferible incrementar la concentración SSC para usar una temperatura mayor. Puede hallarse una guía extensa para la hibridización de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., editores (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Pubiishing y Wiley-lnterscience, Nueva York), conocido como "Ausubel" de aquí en adelante.

Véase también Sambrook, supra. Por consiguiente; las secuencias aisladas que tienen una actividad promotora inducible e hibridizan bajo condiciones severas con las secuencias promotoras DHS descriptas en la presente documentación, o con fragmentos de éstas, están abarcadas por las realizaciones. En general, las secuencias que tienen actividad promotora e hibridizan con las secuencias promotoras descriptas en la presente documentación serán al menos entre 40% y 50% homologas, entre aproximadamente 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% homologas, o más, con las secuencias descriptas. Es decir, la similitud de secuencia entre las secuencias puede variar, y las secuencias pueden compartir al menos entre aproximadamente 40% y 50%, entre aproximadamente 60% y 70%, y entre aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de similitud de secuencia. Se usan los siguientes términos para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia" y (e) "identidad sustancial". (a) Como se lo usa en la presente documentación, una "secuencia de referencia" es una secuencia definida, usada como la base para realizar una comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo, un segmento o la totalidad de la secuencia de un ADNc o un gen, o la secuencia completa del ADNc o el gen. (b) Como se lo usa en la presente documentación, una "ventana de comparación" incluye referencias a un segmento contiguo y específico de una secuencia de polinucleótidos, donde la secuencia de polinucleótidos puede compararse con una secuencia de referencia, y donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, faltas de coincidencia) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para alinear ambas secuencias en forma óptima. En general, la ventana de comparación tiene al menos 20 nucleótidos contiguos de largo, y opcionalmente puede tener 30, 40, 50, 100 o más. Aquellos entrenados en la técnica comprenden que, para evitar una similitud elevada con una secuencia de referencia debido a la inclusión de faltas de coincidencia en la secuencia de polinucleótidos, típicamente se introduce una penalidad de falta de coincidencia y se la sustrae de la cantidad de coincidencias.

Los métodos para alinear secuencias de nucleótidos y aminoácidos con fines de comparación son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, puede realizarse la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias cualquiera usando un algoritmo matemático. Los ejemplos preferidos no limitantes de estos algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 1 1 -1 7; el algoritmo de homología local de Smith et al. (1981 ) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda por similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y AltschuI (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 872264, modificado como se indica en Karlin y AltschuI ( 993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Pueden usarse implementaciones informáticas de estos algoritmos matemáticos para comparar secuencias con el fin de determinar la identidad de secuencia. Dichas implementaciones incluyen, sin limitaciones: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible en Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0); el programa ALIGN PLUS (Versión 3.0, copiright 1997): y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Conjunto de Software Wisconsin Genetics del Grupo de Genética Informática, Versión 10 (disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California 92121 , EEUU). La matriz de calificación usada en la Versión 10 del Conjunto de Software Wisconsin Genetics es BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915). Pueden prepararse alineamientos usando estos programas con los parámetros por omisión. El programa CLUSTAL está bien descripto por Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151 -153; Corpet eí al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 -90; Huang et al. (1992) CABIOS 8: 155-65; y Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331 . Los programas ALIGN y ALIGN PLUS se basan en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Puede usarse una tabla de ponderación de residuos PAM120, una longitud de penalidad de falta de coincidencia de 12, y una falta de coincidencia de 4 con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de AltschuI er al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y AltschuI (1990) supra. La búsqueda de nucleótidos BLAST puede realizarse con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o un polipéptido de la invención. Para obtener alineamientos con faltas de coincidencia para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en AltschuI er al. (1997) Nucleic Acids Res. :3389. Como alternativa, puede utilizarse PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda repetida que detecte ¡nterrelaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul et al. (1997) supra. Cuando se emplea BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, pueden usarse los parámetros por omisión de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase el sitio de Internet del Centro Nacional de Información de Biotecnología. También puede realizarse el alineamiento por inspección manual. También pueden efectuarse los alineamientos por inspección manual. A menos que se establezca lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente documentación hacen referencia a los valores obtenidos usando el programa GAP con los parámetros por omisión, o cualquier programa equivalente. Un "programa equivalente" abarca cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualquiera en cuestión, genera un alineamiento idéntico de coincidencias de nucleótidos o residuos de aminoácidos, y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico, cuando se lo compara con el alineamiento correspondiente generado con GAP. El programa GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) supra, para hallar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de faltas de coincidencia. GAP considera todos los alineamientos posibles y todas las posiciones de falta de coincidencia, y crea el alineamiento con la mayor cantidad de coincidencias de bases y la menor cantidad de faltas de coincidencia. Permite proveer una penalidad de creación de faltas de coincidencia y una penalidad de extensión de faltas de coincidencia en unidades de bases coincidentes. GAP debe crear una ganancia a partir de la cantidad de coincidencias, respecto de la penalidad de creación de faltas de coincidencia, para cada falta de coincidencia que inserta. Si se selecciona una penalidad de extensión de falta de coincidencia mayor que cero, GAP debe además crear una ganancia para cada falta de coincidencia insertada, que abarca la longitud de la falta de coincidencia multiplicada por la penalidad de extensión de falta de coincidencia. Los valores por omisión de creación de faltas de coincidencia y extensión de faltas de coincidencia en la Versión 10 del Conjunto de Software Wisconsin Genetics para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Para secuencias de nucleótidos, la penalidad por omisión de creación de falta de coincidencia es de 50, mientras que la penalidad por omisión de extensión de falta de coincidencia es de 3. Las penalidades de creación de falta de coincidencia y extensión de falta de coincidencia puede expresarse como un número entero seleccionado del grupo de enteros que consiste entre 0 y 200. Por consiguiente, por ejemplo, las penalidades de creación de falta de coincidencia y extensión de faltas de coincidencia pueden ser de 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o más. (c) Como se la usa en la presente documentación, la "identidad de secuencia" o la "identidad", en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son idénticos cuando se efectúa un alineamiento de correspondencia máxima para una ventana de comparación específica. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de residuos que no son idénticas comúnmente difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas, donde se sustituyen los residuos de aminoácidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad), y, por ende, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, puede incrementarse el porcentaje de identidad de secuencia para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren en dichas sustituciones conservativas presentan "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Típicamente, esto comprende evaluar una sustitución conservativa como una falta de coincidencia parcial, en vez de total, lo que incrementa el porcentaje de identidad de secuencia. Por consiguiente, por ejemplo, cuando a un aminoácido idéntico se le asigna un valor de 1 y a una sustitución no conservativa se le asigna un valor de cero, a una sustitución conservativa se le asigna un valor entre cero y 1 . El valor de las sustituciones conservativas se calcula, por ejemplo, como se detalla en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California). (d) Como se lo usa en la presente documentación, el "porcentaje de identidad de secuencia" designa el valor determinado por medio de la comparación de dos secuencias alineadas en forma óptima a lo largo de una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, faltas de coincidencia), en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones), para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Se calcula el porcentaje determinando la cantidad de posiciones en las cuales existe una base de ácido nucleico idéntica en ambas secuencias, de modo de obtener la cantidad de posiciones de coincidencia, dividiendo la cantidad de posiciones de coincidencia por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando la cantidad total de posiciones por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. (e) El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 70% de identidad de secuencia, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95%, en comparación con una secuencia de referencia, usando uno de los programas de alineamiento descriptos, con los parámetros convencionales. Aquellos entrenados en la técnica reconocerán que pueden ajustarse apropiadamente estos valores para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos, teniendo en cuenta la degeneración de los codones, la similitud de los aminoácidos, la localización en el marco de lectura y semejantes. La identidad sustancial de secuencias de aminoácidos para estos propósitos normalmente comprende una identidad de secuencia de al menos 60%, 70%, 80%, 90% y al menos 95%. Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es cuando las dos moléculas hibridizan una con otra bajo condiciones severas. Generalmente se seleccionan condiciones severas con temperaturas aproximadamente 5°C menores que el Tm para la secuencia específica, a una fuerza iónica y un pH específico. Sin embargo, las condiciones severas abarcan temperaturas en el rango de entre aproximadamente 1°C y aproximadamente 20°C menores que el Tm, dependiendo del grado de severidad, como se indica de otro modo en la presente documentación. Los ácidos nucleicos que hibridizan unos con otros bajo condiciones severas aún son sustancialmente idénticos sí los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando se crea una copia del ácido nucleico usando la degeneración de codones máxima permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es cuando el polipéptído codificado por el primer ácido nucleico presenta reactividad inmunológica cruzada con el polipéptído codificado por el segundo ácido nucleico.

La secuencia promotora DHS descripta en la presente documentación, así como las variantes y los fragmentos de ésta, es útil para la modificación genética de plantas, por ejemplo, para la producción de una planta transformada o transgénica, para expresar un fenotipo de interés. Como se los usa en la presente documentación, los términos "planta transformada" y "planta transgénica" hacen referencia a una planta que comprende un polinucleótido heterólogo en su genoma. En general, el polinucleótido heterólogo se integra en forma estable en el genoma de una planta transgénica o transformada, de modo que el polinucleótido pasa a las generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede estar integrado en el genoma solo o como parte de una construcción de ADN. Debe comprenderse que, como se lo usa en la presente documentación, el término "transgénico" incluye cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de planta o planta cuyo genotipo ha sido alterado por la presencia del ácido nucleico heterólogo, incluyendo aquellos transgénicos alterados inicialmente de este modo, así como aquellos creados mediante el cruzamiento sexual o la propagación asexual a partir del transgénico inicial. El término "transgénico", como se lo usa en la presente documentación, no comprende la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) por métodos convencionales de cruzamiento de plantas o sucesos de ocurrencia natural, tales como fertilización cruzada al azar, infección por virus no recombinantes, transformación con bacterias no recombinantes, transposición no recombinante o mutación espontánea. Un "evento" transgénico se produce transformando las células vegetales con una construcción de ADN heterologa, que incluye un cassette de expresión de ácido nucleico que comprende un transgen de interés, regenerando una población de plantas resultantes de la inserción del transgen en el genoma de la planta, y seleccionando una planta particular caracterizada por la inserción en una localización particular del genoma. En términos fenotípicos, un evento se caracteriza por la expresión del transgen. A nivel genético, un evento es parte de la composición genética de una planta. El término "evento" también hace referencia a la progenie producida por un cruzamiento sexual entre la transformante y otra variedad que incluye el ADN heterólogo. Como se lo usa en la presente documentación, el término "planta" incluye referencias a plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etcétera), semillas y células vegetales, y progenie de éstas. Dentro del alcance de las realizaciones, las partes de las plantas transgénicas comprenden, por ejemplo, células vegetales, protoplastos, tejidos, callos, embriones, así como flores, tallos, frutos, óvulos, hojas o raíces originadas en las plantas transgénicas o su progenie transformada previamente con una molécula de ADN de las realizaciones, por lo que consisten al menos en parte en células transgénicas. Como se lo usa en la presente documentación, el término "célula vegetal" incluye, sin limitaciones, semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callos, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitas, polen y microsporas. La clase de las plantas que pueden usarse en los métodos descriptos en la presente documentación es generalmente tan amplia como la clase de las plantas superiores que pueden transformarse empleando procedimientos convencionales, incluyendo especies de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Las secuencias promotoras y los métodos descriptos en la presente documentación son útiles para regular la expresión de cualquier secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta huésped. Por consiguiente, la secuencia de nucleótidos heteróloga unida operativamente a los promotores descriptos en la presente documentación puede ser un gen estructural que codifica una proteína de interés. Los genes de interés reflejan los mercados y los intereses comerciales de aquellos que participan en el desarrollo del cultivo. Los cultivos y los mercados de interés cambian, y a medida que las naciones en desarrollo se abren a los mercados mundiales, también emergen nuevos cultivos y tecnologías. Además, a medida que crece la comprensión de los caracteres y las características agronómicas, tales como el rendimiento y la heterosis, la elección de los genes para la transformación cambia de forma acorde. Las categorías de genes de interés para las realizaciones incluyen, por ejemplo, aquellos genes que participan en la información, tales como los dedos de cinc, aquellos que participan en la comunicación, tales como las quinasas, y aquellos que participan en el mantenimiento, tales como las proteínas de ataque calórico. Las categorías de transgenes más específicos, por ejemplo, incluyen genes que codifican proteínas que confieren resistencia estrés abiótico, como por ejemplo, sequías, temperatura, salinidad y toxinas, tales como plaguicidas y herbicidas, o estrés biótico, como por ejemplo, ataques de hongos, virus, bacterias, insectos y nematodes, y el desarrollo de enfermedades asociadas con estos organismos. Resultan de interés varios cambios en el fenotipo, incluyendo la modificación de la expresión de un gen en una planta, la alteración del mecanismo de defensa contra patógenos o insectos en una planta, el incremento de la tolerancia a herbicidas de la planta, la alteración del desarrollo de la planta como respuesta a estrés ambiental, y semejantes. Pueden obtenerse estos resultados promoviendo la expresión de productos heterólogos o incrementando la expresión de productos endógenos en plantas. Como alternativa, también pueden obtenerse estos resultados mediante la reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, particularmente enzimas, transportadores o cofactores, o afectando la asimilación de nutrientes en la planta. Estos cambios resultan en una alteración del fenotipo de la planta transformada. Se reconoce que cualquier gen de interés puede ser unido operativamente a las secuencias promotoras de las realizaciones, y expresarse en una planta. Puede usarse una construcción de ADN que comprende uno de estos genes de interés en técnicas de transformación, tales como aquellas que se describen más adelante, para crear resistencia a enfermedades o insectos en plantas con fenotipos susceptibles o para mejorar la resistencia a enfermedades o insectos en plantas con fenotipos resistentes. Por consiguiente, las realizaciones abarcan métodos que están dirigidos a la protección de las plantas contra patógenos fúngicos, bacterias, virus, nematodes, insectos y semejantes. La "resistencia a enfermedades" o la "resistencia insectos" denotan que las plantas no presentan los síntomas dañinos resultantes de las interacciones planta-patógeno. Los genes de resistencia a enfermedades y resistencia a insectos, tales como las lisozimas, las cecropinas, las maganinas o las tioninas para la protección contra bacterias, o las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR), tales como las glucanasas, y las quitinasas para la protección contra hongos, o las endotoxinas de Bacillus thuringiensis, los inhibidores de proteasas, las colagenasas, las lectinas y glicosidasas para el control de nematodes o insectos, son todos ejemplos de productos génicos útiles. Los patógenos de las realizaciones incluyen, sin limitaciones, virus o viroides, bacterias, insectos, nematodes, hongos, y semejantes. Los virus incluyen el virus en mosaico del tabaco o el pepino, el virus de las manchas en anillo, el virus de necrosis, el virus en mosaico del maíz enano, etcétera. Los nematodes incluyen nematodes parásitos, tales como los nematodes de los nudos de las raíces, los quistes y las lesiones, etcétera.

Los genes de resistencia a insectos pueden codificar resistencia a plagas que producen grandes mermas en el rendimiento, tales como la oruga de la raíz, la oruga cortadora, el taladro del maíz europeo y semejantes. Estos genes incluyen, por ejemplo, los genes de proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (Patentes de los EEUU N° 5366892, 5747450, 5736514, 5723756, 5593881 y Geiser et al. (1986) Gene 48:109); lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); y semejantes. Los genes que codifican caracteres de resistencia a enfermedades incluyen genes de destoxificación, tales como aquellos contra fumonisina (Patente de los EEUU N° 5792931 ); avirulencia (avr) y los genes de resistencia a enfermedades (R) (Jones ef al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); y semejantes. Pueden introducirse caracteres de resistencia a herbicidas en plantas con genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la acetolactato sintetasa (ALS), en particular los herbicidas tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de acetolactato sintetasa (ALS), que contiene mutaciones que permiten obtener dicha resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra), genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la glutamina sintetasa, tales como fosfinothcina o basta (por ejemplo, el gen bar), u otros genes como los mencionados conocidos en la técnica. La resistencia a glifosato es impartida por los genes de 5-enol piruvilshikimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS) mutante y aroA. Véase, por ejemplo, la Patente de los EEUU N° 4940835, de Shah ef al., donde se describe la secuencia de nucleótidos de una forma de EPSPS que puede conferir resistencia a glifosato. En la Patente de los EEUU N° 5627061 , de Barry et al., también se describen genes que codifican enzimas EPSPS. Véanse también las Patentes de los EEUU N° 6248876; 6040497; 5804425; 5633435; 5145783; 4971908; 5312910; 5188642; 4940835; 5866775; 62251 14; 6130366; 5310667; 4535060; 4769061 ; 5633448; 5510471 ; RE 36449; RE 37287 y 5491288; y las publicaciones internacionales WO 97/04103; WO 97/041 14; WO 00/66746; WO 01/66704; WO 00/66747 y WO 00/66748, que se incorporan en la presente documentación a modo de referencia con este propósito. También puede obtenerse resistencia a glifosato en aquellas plantas que expresan un gen que codifica una enzima glifosato óxido-reductasa, como se describe con mayor detalle en las Patentes de los EEUU N° 5776760 y 5463175, que se incorporan en la presente documentación a modo de referencia con este propósito. Además, puede impartirse resistencia a glifosato en plantas mediante la sobreexpresión de genes que codifican glifosato N-acetiltransferasa. Véanse, por ejemplo, las Solicitudes de Patentes de los EEUU con N° de Orden 10/004357 y 10/427692. También puede haber genes de esterilidad codificados en un cassette de expresión, los cuales proporcionan una alternativa a la remoción física de espigas. Los ejemplos de genes usados de estas formas incluyen genes con preferencia por los tejidos masculinos y genes con fenotipos de esterilidad masculina, tales como QM, descripto en la Patente de los EEUU N° 5583210. Otros genes incluyen quinasas y aquellos que codifican compuestos tóxicos para el desarrollo de los gametofitos masculinos o femeninos. Los caracteres comerciales también pueden estar codificados por uno o más genes que, por ejemplo, pueden incrementar el contenido de almidón para producir etanol, o proporcionan la expresión de proteínas. Otro uso importante de las plantas transformadas es en la producción de polímeros y bioplásticos, tal como se describe en la Patente de los EEUU N° 5602321 . Los genes, tales como la ß-cetotiolasa, la PHBasa (polihidroxibutirato sintetasa) y la acetoacetil-CoA reductasa (véase Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA). Pueden alterarse caracteres de importancia agrícola que afectan la calidad del grano, tales como los niveles y los tipos de aceite, saturados e insaturados, la calidad y la cantidad de aminoácidos esenciales, los niveles de celulosa, almidón y el contenido de proteínas, usando los métodos de las realizaciones. Las modificaciones incluyen el incremento del contenido de ácido oleico, aceites saturados e insaturados, niveles incrementados de lisina y azufre, proporción de aminoácidos esenciales, y también la modificación del almidón. Se describen modificaciones de proteínas de hordotionina en las Patentes de los EEUU N° 5990389, 5885801 , 5885802 y 5703049, incorporadas en la presente documentación a modo de referencia. Otro ejemplo es la proteína rica en lisina y azufre codificada por la albúmina 2S de soja descripta en la Patente de los EEUU N° 5850016, y el inhibidor de quimiotripsina de cebada, descripto en Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, cuyas descripciones se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales, así como aquellos de otras fuentes, incluyendo procariotas y otros eucariotas. Estos productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas y semejantes. Los ejemplos de otros genes que pueden aplicarse, y su fenotipo asociado, incluyen el gen y/o el ARN que codifica la proteína de recubrimiento viral, u otros genes virales o vegetales que confieren resistencia a virus; genes que confieren resistencia a hongos; genes que confieren resistencia a insectos; genes que promueven mejoras en el rendimiento; y genes que proporcionan resistencia al estrés, tal como la deshidratación como resultado del calor y la salinidad, los elementos metálicos o traza tóxicos, o semejantes.

En otras realizaciones de la presente invención, las secuencias promotoras DHS se unen operativamente a genes de interés que mejoran el crecimiento de la planta o incrementan los rendimientos de los cultivos bajo condiciones de densidad elevada de plantas. Por ejemplo, el promotor DHS puede unirse operativamente una secuencia de nucleótidos que expresa genes de importancia agrícola que resultan en sistemas de raíces primarias o laterales mejoradas. Estos genes incluyen, sin limitaciones, transportadores de nutrientes/agua e inductores del crecimiento. Los ejemplos de estos genes incluyen, sin limitaciones, la H+-ATPasa de membrana plasmática de maíz (MHA2) (Frías ef al. (1996) Célula vegetal 8: 1 533-44); AKT1 , un componente del aparato de asimilación de potasio en Arabidopsis (Spalding ef al. (1999) J. Gen. Physiol. 1 3:909-18); los genes RML, que activan el ciclo de división celular en las células apicales de la raíz (Cheng ef al. (1995) Plant Physiol. 108:881 ); los genes de glutamina sintetasa de maíz (Sukanya et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26: 1935-46) y hemoglobina (Duff ef al. (1997) J. Biol. Chem. 27: 16749-16752; Arredondo-Peter ef al. (1997) Plant Physiol. 115:1259-1266; Arredondo-Peter et al. (1997) Plant Physiol. 1 14:493-500, y las referencias citadas en dichas publicaciones). El promotor DHS también puede ser útil para expresar secuencias de nucleótidos antisentido de genes que afectan negativamente el desarrollo de la raíz bajo condiciones de densidad de siembra elevada. La "ARNi" hace referencia a una serie de técnicas relacionadas para reducir la expresión de genes (véase, por ejemplo, la Patente de los EEUU N° 6506559). Se cree que las técnicas más antiguas, conocidas con otros nombres, se basan en el mismo mecanismo, pero se les da otros nombres en la literatura. Éstos incluyen "inhibición antisentido", la producción de transcriptos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína blanco, y "co-supresión" o "supresión en el sentido del marco de lectura", que hacen referencia a la producción de transcriptos de ARN en el sentido del marco de lectura capaces de suprimir la expresión de genes extraños o endógenos idénticos o sustancialmente similares (Patente de los EEUU N° 5231020, incorporada en la presente documentación a modo de referencia). Estas técnicas se basan en el uso de construcciones que resultan en la acumulación de ARN de cadena doble, con una cadena complementaria con el gen blanco que se desea silenciar. La secuencia promotora DHS de las realizaciones, y sus fragmentos o variantes con actividad biológica relacionadas descriptas en la presente documentación, puede usarse para dirigir la expresión de construcciones que resultarán en interferencia de ARN, incluyendo microARN y siARN. La secuencia de nucleótidos heteróloga unida operativamente al promotor DHS, y sus fragmentos o variantes con actividad biológica relacionadas descriptas en la presente documentación, puede ser una secuencia antisentido de un gen blanco. La terminología "secuencia de nucleótidos de ADN antisentido" designa una secuencia que está en orientación inversa, en la orientación normal 5' a 3', respecto de dicha secuencia de nucleótidos. Cuando se la administra a una célula vegetal, la expresión de la secuencia de ADN antisentido evita la expresión normal de la secuencia de nucleótidos de ADN del gen blanco. La secuencia de nucleótidos antisentido codifica un transcripto de ARN que es complementario y capaz de hibridizar con el ARN mensajero endógeno (ARNm) producido por la transcripción de la secuencia de nucleótidos de ADN del gen blanco. En este caso, se inhibe la producción de la proteína nativa codificada por el gen blanco para obtener una respuesta fenotípica deseada. Pueden realizarse modificaciones de las secuencias antisentido siempre que las secuencias hibridicen e interfieran con la expresión del ARNm correspondiente. De este modo, pueden usarse construcciones antisentido que tienen 70%, 80%, 85% de identidad de secuencia con las secuencias antisentido correspondientes. Además, pueden usarse porciones de los nucleótidos antisentido para alterar la expresión del gen blanco. En general, pueden usarse secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos o más. Por consiguiente, las secuencias promotoras descriptas en la presente documentación pueden unirse operativamente a secuencias de ADN antisentido para reducir o inhibir la expresión de una proteína nativa en la planta. En una realización de la invención, las construcciones de ADN comprenderán una región de inicio de la transcripción que comprenderá una de las secuencias de nucleótidos promotoras descriptas en la presente documentación, o variantes o fragmentos de ésta, unida operativamente a una secuencia de nucleótidos heterologa cuya expresión se desee controlar con el promotor inducible de las realizaciones. Esta construcción de ADN contiene una pluralidad de sitios de restricción para insertar la secuencia de nucleótidos bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. Además, la construcción de ADN puede contener genes marcadores de selección. La construcción de ADN incluirá, en la dirección de transcripción 5' a 3', una región de inicio de la transcripción (es decir, un promotor inducible de las realizaciones), una región de inicio de la traducción, una secuencia de nucleótidos heterologa de interés, una región de terminación de la traducción, y opcionalmente, una región de terminación de la transcripción funcional en el organismo huésped. Las regiones reguladoras (es decir, los promotores, las regiones de regulación de la transcripción y las regiones de terminación de la traducción) y/o el polinucleótido de las realizaciones pueden ser nativos/análogos respecto de la célula huésped o unos de otros. Como alternativa, las regiones reguladoras y/o el polinucleótido de la invención pueden ser heterólogos respecto de la célula huésped o unos de otros. Como se lo usa en la presente documentación, "heteróloga", en referencia a una secuencia, es una secuencia que se origina a partir de una especie extraña, o, si es de la misma especie, está sustancialmente modificada en comparación con su forma nativa, en lo referente a su composición y/o su locus genómico, merced a la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la que deriva el polinucleótido, o, si es de una especie igual/análoga, uno o ambos están sustancialmente modificados respecto de su forma y/o su locus genómico original, o el promotor no es el promotor nativo del polinucleótido unido operativamente. La región de terminación incluida opcionalmente puede ser nativa respecto de la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa respecto del polinucleótido de interés unido operativamente, puede ser nativa respecto de la planta huésped, o puede derivar de otra fuente (es decir, puede ser extraña o heteróloga) respecto del promotor, el polinucleótido de interés, el huésped o cualquier combinación de éstos. Existen regiones de terminación convenientes disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de finalización de la octopina sintetasa y la nopalina sintetasa. Véanse también Guerineau eí al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 262:141 -144; Proudfoot (1991 ) Cell 64:671 -674; Sanfacon et al. (1991 ) Genes Dev. 5:141 -149; Mogen eí al. (1990) Plant Cell 2:1261 -1272; Munroe et al. (1990) Gene 91 :151 -158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi eí al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639. En realizaciones particulares, se usa el terminador del gen del inhibidor de proteasa de papa II (Pinll). Véanse, por ejemplo, Keil eí al. (1986) Nucí. Acids Res. 4:5641 -5650; y An eí al. (1989) Plant Cell 1 : 1 15-122, incorporados por completo en la presente documentación a modo de referencia. La construcción de ADN que comprende una secuencia promotora de las realizaciones, unida operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga, también contiene al menos una secuencia de nucleótidos adicional de un gen que se desea cotransformar en el organismo. Como alternativa, pueden proporcionarse secuencias adicionales en otra construcción de ADN. Cuando sea apropiado, podrá optimizarse la secuencia de nucleótidos heteróloga, cuya expresión estará bajo el control de la secuencia promotora inducible de las realizaciones y cualquier secuencia de nucleótidos adicional, para obtener una expresión incrementada en la planta transformada. Es decir, podrán sintetizarse estas secuencias de nucleótidos usando codones preferidos por la planta para obtener una expresión mejorada. En la técnica existen métodos disponibles para sintetizar secuencias de nucleótidos con preferencia por las plantas. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EEUU N° 5380831 y 5436391 , y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporados en la presente documentación a modo de referencia. En la técnica se conocen otras modificaciones de secuencia para potenciar la expresión genética en una célula huésped. Éstas incluyen la eliminación de las secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitios de separación de exones-intrones, repeticiones tipo transposón y otras secuencias bien caracterizadas de este tipo, que puedan ser perjudiciales para la expresión genética. Puede ajustarse el contenido de G-C de la secuencia de nucleótidos heteróloga de acuerdo con los niveles promedio para un huésped celular dado, calculados en referencia a genes conocidos expresados en la célula huésped.

Cuando sea posible, se modificará la secuencia para evitar estructuras secundarias de ARNm en hebilla. Además, las construcciones de ADN pueden contener secuencias directrices 5'. Dichas secuencias directrices pueden servir para potenciar la traducción. Las directrices de la traducción son conocidas en la técnica e incluyen las siguientes: directrices de picornavirus, por ejemplo, la directriz EMCV (región no codificante 5' de la encefalomiocarditis) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); directrices de potivirus, por ejemplo, la directriz TEV (Virus de la Roya del Tabaco) (Allison er al. (1986) Virology 154:9-20); la directriz MDMV (Virus en Mosaico del Maíz Enano) y la proteína que se une a las cadenas pesadas de la inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak er al. (1991 ) Nature 353:90-94); la directriz no traducida del ARNm de la proteína de recubrimiento del virus en mosaico de la alfalfa (AMV ARN 4) (Jobling er al. (1987) Nature 325:622-625); la directriz del virus en mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology de RNA, paginas 237-256); y la directriz del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991 ) Virology 81 :382-385). Véase también, Della-Cioppa er al. (1987) Plant Physiol. también pueden utilizarse otros métodos conocidos para mejorar la traducción y/o la estabilidad del ARNm, por ejemplo, intrones, tales como el intrón de la ubiquitina de maíz (Christensen y Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218; Christensen et al. (1992) Planta Molecular Biology 18:675-689) o el intrón Adhl de maíz (Kyozuka et al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 228:40-48; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357) y semejantes. Las construcciones de ADN de las realizaciones también incluyen otros potenciadores, ya sean potenciadores de la traducción o la transcripción, según se los necesite. Estas regiones potenciadoras son bien conocidas por aquellos entrenados en la técnica, y pueden incluir el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. El codón de inicio debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante para asegurar la traducción de la secuencia completa. Las señales de control de la traducción y los codones de inicio pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. Pueden introducirse regiones de inicio de la traducción de la fuente de la región de inicio de la transcripción, o del gen estructural. La secuencia también puede derivar del elemento regulador seleccionado para expresar el gen, y puede modificarse específicamente para incrementar la traducción del ARNm. Se reconoce que puede utilizarse el incremento de los niveles de transcripción en combinación con las regiones promotoras de las realizaciones. En la técnica se conocen potenciadores, y éstos incluyen la región potenciadora SV40, el elemento potenciador 35S y semejantes. En la preparación de la construcción de ADN, pueden manipularse los distintos fragmentos de ADN para obtener las secuencias de ADN en la orientación apropiada, y, cuando resulte apropiado, en el marco de lectura apropiado. Con este fin, pueden emplearse adaptadores o conectores para unir los fragmentos de ADN, o puede recurrirse a otras manipulaciones para proporcionar los sitios de restricción convenientes. Pueden agregarse o eliminarse sitios de restricción, puede eliminarse ADN superfluo o pueden efectuarse otras modificaciones semejantes a las secuencias de las realizaciones. Con este propósito, puede emplearse mutagénesis in vitro, reparación con cebadores, restricción, alineamiento, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones. Pueden incluirse genes informantes o genes marcadores de selección en las construcciones de ADN. Por ejemplo, pueden hallarse ejemplos de genes informantes apropiados conocidos en la técnica en Jefferson et al. (1991 ), en Plant Molecular Biology Manual, editado por Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), pp. 1-33; DeWet et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737; Goff eí al. (1990) EMBO J. 9:2517-2522; Kain et al. (1995) BioTechniques 19:650-655; y Chiu ef al. (1996) Current Biology 6:325-330. Los genes marcadores de selección para seleccionar células o tejidos transformados pueden incluir genes que confieren resistencia a antibióticos o resistencia a herbicidas. Los ejemplos de genes marcadores de selección apropiados incluyen, sin limitaciones, genes que codifican resistencia a cloramfenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella ef al. (1983) Nature 303:209-213; Meijer et al. (1991 ) Plant Mol.

Biol. 76:807-820); higromicina (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103-108; Zhijian ef al. (1995) Plant Science 708:219-227); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 270:86-91 ); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131 -137); bleomicina (Hille ef al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171 -176); sulfonamida (Guerineau ef al. (1990) Plant Mol. Biol. 75:127-136); bromoxinil (Stalquer et al. (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481 ); fosfinotricina (DeBlock ef al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518). Otros genes que pueden ser útiles en la recuperación de los eventos transgénicos, pero que pueden no ser necesarios en el producto final, incluyen, sin limitaciones, ejemplos tales como GUS (ß-glucuronidasa; Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (proteína fluorescente verde; Chalfie ef al. (1994) Science 263:802), luciferasa (Riggs ef al. (1987) Nucleic Acids Res. 75(19):81 15 y Luehrsen ef al. (1992) Methods Enzymol. 276:397-414), y los genes de maíz que codifican la producción de antocianina (Ludwig et al. (1990) Science 247:449).

Las moléculas de ácidos nucleicos de las realizaciones son útiles en los métodos dirigidos a la expresión de una secuencia de nucleótidos en una planta. Esto puede efectuarse transformando una célula vegetal de interés con una construcción de ADN que comprende un promotor identificado en la presente documentación, unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heterologa, y regenerando una planta transformada en forma estable a partir de dicha célula vegetal. Los métodos de las realizaciones también se relacionan con la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos en una planta. Estos métodos comprenden transformar una célula vegetal con una construcción de ADN que comprende un promotor identificado en la presente documentación, que inicia la transcripción en una célula vegetal de forma inducible, unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heterologa, regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal, y someter la planta al estímulo requerido para inducir la expresión. La construcción de ADN que comprende la secuencia promotora particular de las realizaciones, unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés, puede usarse para transformar cualquier planta. De este modo, pueden obtenerse plantas modificadas genéticamente, es decir, plantas transgénicas o transformadas, células vegetales, tejido vegetal, semillas, raíces y semejantes. Las especies de plantas apropiadas para las realizaciones incluyen, sin limitaciones, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceites de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz {Oryza sativa), centeno (Sécale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perlado {Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorro (Setaria itálica), mijo ahusado (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo {Tríticum aestivum), soja {Glicine max), tabaco (Nicotiana tabacum), papa (Solanum tuberosum), maní (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), casava (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucífera), ananá (Ananas comosus), árboles de cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), avocado (Persea americana), higo (Ficus casica), guava (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardío (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, verduras, plantas ornamentales y coniferas. Las verduras incluyen tomate (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), judías lima (Phaseolus limensis), arvejas (Lathyrus spp.), y miembros de los géneros Cucumis, tales como pepino (C. sativus), melón (C. cantalupensis), y melón musk (C. meló). Las ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hidrangea (Macrophylla hidrangea), hibiscus (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), clavel (Dianthus caryophyllus), pastora roja (Euphorbia pulcherrima), y crisantemo. Las coniferas que pueden emplearse en la práctica de las realizaciones incluyen, por ejemplo, pinos, tales como el pino loblolly, (Pinus taeda), el pino del incienso (Pinus elliotii), el pino ponderosa (Pinus ponderosa), el pino lodgepole (Pinus contorta) y el pino de Monterrey (Pinus radiata); el abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii); la Tsuga del Oeste (Tsuga canadensis); el abeto Sitka (Picea glauca); la secuoya (Sequoia sempervirens); los abetos verdaderos, tales como el abeto de oro (Abies amabilis); y abeto balsam (Abies balsamea); y los cedros, tales como el cedro rojo del Oeste {Thuja plicata) y el cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). Las plantas de las realizaciones pueden ser plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, maní, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etcétera). Por ejemplo, esta invención es apropiada para cualquier miembro de la familia de plantas monocotiledóneas, incluyendo, sin limitaciones, maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, ananá, ñame, cebolla, banana, coco y dátiles. Como se lo usa en la presente documentación, un "vector" hace referencia a una molécula de ADN, tal como un plásmido, un cósmido o un fago bacteriano para introducir una construcción de nucleótidos, por ejemplo, una construcción de ADN, en una célula huésped. Los vectores de clonación típicamente contienen uno o una pequeña cantidad de sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción, en los que pueden insertarse secuencias de ADN extrañas de forma determinable, sin que se pierda la función biológica esencial del vector, así como un gen marcador apropiado para usar en la identificación y la selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores típicamente incluyen genes que proporcionan resistencia a tetraciclina, resistencia a higromicina o resistencia a ampicilina. Los métodos de las realizaciones comprenden la introducción de una construcción de nucleótidos en una planta. Por "introducción" se interpreta la presentación de la construcción de nucleótidos a la planta, de modo que la secuencia accede al interior de una célula de la planta. Los métodos de las realizaciones no dependen de un método particular para introducir una construcción de nucleótidos en una planta, sino solamente de que la construcción de nucleótidos acceda al interior de al menos una célula de la planta. En la técnica se conocen métodos para introducir construcciones de nucleótidos en plantas, incluyendo, sin limitaciones, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus. Por "transformación estable", se interpreta que se introduce la construcción de nucleótidos en una planta, de modo que se integra en el genoma de la planta y puede ser heredada por la progenie de ésta. Por "transformación transitoria", se interpreta que la construcción de nucleótidos introducida en una planta no se integra en el genoma de la planta. Las construcciones de nucleótidos de las realizaciones pueden introducirse en las plantas poniendo en contacto las plantas con un virus o con ácidos nucleicos virales. En general, estos métodos comprenden incorporar una construcción de nucleótidos de las realizaciones en una molécula de ADN o ARN viral. En la técnica se conocen métodos para introducir construcciones de nucleótidos en plantas y expresar una proteína codificada por ellas, que comprenden moléculas de ADN o ARN viral. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EEUU N° 5889191 , 5889190, 5866785, 5589367 y 5316931 , incorporadas en la presente documentación a modo de referencia. Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas, pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal que se desea transformar, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea. Los métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótidos en plantas e insertarlos subsiguientemente en el genoma de la planta incluyen microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de los EEUU N° 5981840 y 5563055), transferencia directa de genes (Paszkowski et al. (1 984) EMBO J. 3:2717-2722), y aceleración balística de partículas (véanse, por ejemplo, Sanford et al., Patentes de los EEUU N° 4945050, 5879918, 5886244, 5932782, Tomes eí al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, editado por Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); y McCabe eí al. (1988) Biotechnology 6:923-926). También véanse Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 -477; Sanford er al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou eí al. (1988) Plant Physiol. 87:671 -674 (soja); McCabe eí al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991 ) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 1 75-182 (soja); Singh eí al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta eí al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein eí al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein eí al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Patentes de los EEUU N° 5240855, 5322783 y 5324646; Tomes eí al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, editado por Gamborg (Springer-Verlag, Berlín) (maíz); Klein eí al. (1988) Plant Physiol. 91 :440-444 (maíz); Fromm eí al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren eí al. (1984) Nature (Londres) 31 1 :763-764; Patente de los EEUU N° 5736369 (cereales); Bytebier eí al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. { 1985) en The Experimental Manipulation oí Ovule Tissues, editado por Chapman eí al. (Longman, Nueva York), pp. 197-209 (polen); Kaeppler eí al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler eí al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por fibrillas); D'Halluin eí al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (electroporación); Li eí al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-41 3 (arroz); Osjoda eí al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz vía Agrobacterium tumefaciens); todas los cuales se incorporan en la presente documentación a modo de referencia.

Las células que hayan sido transformadas podrán cultivarse para dar plantas de acuerdo con métodos convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Célula vegetal Reports 5:81 -84. Estas plantas pueden luego cultivarse y polinizarse con la misma cepa transformada o con distintas cepas, y puede identificarse el híbrido resultante que presenta una expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para asegurar que se mantenga en forma estable y se herede la expresión inducible de la característica fenotípica deseada, y luego pueden cosecharse las semillas para asegurar que se haya logrado la expresión inducible de la característica fenotípica deseada. Por consiguiente, como se lo usa en la presente documentación, el término "semillas transformadas" hace referencia a las semillas que contienen la construcción de nucleótidos integrada en forma estable en el genoma de la planta.

Existe una variedad de métodos para regenerar plantas a partir de tejido vegetal. El método de regeneración particular dependerá del tejido vegetal inicial y la especie de planta particular a regenerar. La regeneración, el desarrollo y el cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplastos de plantas individuales o a partir de varios explantes transformados son bien conocidos en la técnica (Weissbach y Weissbach, (1988) en: Methodos for Plant Molecular Biology, (Editores), Academíc Press, Inc., San Diego, CA). Este proceso de regeneración y desarrollo típicamente incluye los pasos de selección de las células transformadas, cultivo de aquellas células individualizadas a través de las etapas usuales del desarrollo embrionario, hasta la etapa de plántula con raíz. Los embriones y las semillas transgénicas se regeneran de forma similar. Luego se siembran los brotes con raíces resultantes en un medio apropiado para el cultivo de plantas, tal como tierra. Preferiblemente, las plantas regeneradas se autopolinizan para proporcionar plantas transgénicas homocigotas. Caso contrario, se cruza el polen obtenido de las plantas regeneradas con plantas de líneas de importancia agronómica desarrolladas a partir de semillas. Por otro lado, se usa el polen de plantas de estas líneas importantes para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de las realizaciones que contiene un polipéptido deseado se cultiva usando métodos bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica. En las realizaciones se proporcionan composiciones para analizar compuestos que modulan la expresión en las plantas. Los vectores, las células y las plantas pueden usarse para analizar moléculas candidatas en busca de agonistas y antagonistas del promotor DHS. Por ejemplo, un gen informante puede unirse con un promotor DHS y puede expresarse como un transgen en una planta. Se agregan los compuestos que se desea expresar, y se mide la expresión genética para determinar el efecto sobre la actividad promotora. Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, y no a modo de limitación. EXPERIMENTAL Las realizaciones se definen adicionalmente en los siguientes Ejemplos, donde las partes y los porcentajes se basan en peso y los grados son Celsius, a menos que se indique lo contrario. Los procedimientos de biología molecular típicamente se realizaron como se describe en Ausubel o Sambrook, supra. Debe comprenderse que estos Ejemplos, si bien indican realizaciones de la invención, se ofrecen solamente a modo de ilustración. A partir de la descripción anterior y estos Ejemplos, aquél entrenado en la técnica pude evaluar las características esenciales de las realizaciones, y sin apartarse del espíritu y el alcance de éstas, puede realizar varios cambios y modificaciones a las realizaciones para adaptarlas a varios usos y condiciones. Por consiguiente, varias modificaciones de las realizaciones, además de aquellas presentadas y descriptas en la presente documentación, serán evidentes para aquél entrenado en la técnica, a partir de la descripción anterior. Estas modificaciones también están incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. La descripción de cada referencia detallada en la presente documentación se incorpora por completo en la presente documentación a modo de referencia. Ejemplo 1 : Identificación y patrón de expresión del gen DHS Se obtuvo evidencia de que el gen de desoxihipusina sintetasa (DHS) se expresa de manera inducible usando tecnología de secuenciación masiva de firmas paralelas (MPSS) (vénase Brenner S, et al. (2000) Nature Biotechnology 18:630-634, Brenner S et al. (2000) Proc Nati Acad Sci USA 97: 1665-1670). Esta tecnología comprende la generación de 17 marcas de bases características a partir de muestras de ARNm que han sido transcriptas en forma inversa. Las marcas se secuencian en forma simultánea y se asignan a genes o EST. A la abundancia de estas muestras se le asigna un valor numérico, que se normaliza en partes por millón (PPM), lo que luego permite comparar la expresión de las marcas o la abundancia de las marcas en distintos tejidos. Por consiguiente, puede usarse la plataforma MPSS para determinar el patrón de expresión de un gen particular y su nivel de expresión en distintos tejidos. La búsqueda de firmas de secuencia reguladas positivamente en respuesta al daño provocado por la alimentación de la oruga de la raíz del maíz (CRW) en la base de datos Lynx MPSS resultó en la identificación de una marca característica correspondiente al gen DHS. Las búsquedas identificaron perfiles de marcas en raíces de plantas de maíz en la etapa V5 tratadas con CRW, y perfiles de marcas en raíces de plantas de maíz en la etapa V6 no dañadas por CRW. Una comparación de los perfiles demostró que la marca de DHS era regulada positivamente desde 0 ppm hasta 512 ppm a las 24 horas, en respuesta a la alimentación de CRW (Figura 1 ). Se realizó un análisis de Northern blot para demostrar adicionalmente la expresión inducible por CRW del gen DHS (Figura 2). El ARN derivado de las hojas y las raíces de plantas de maíz Bt7 de etapa V5 infestadas por CRW y no infestadas (hojas de 5 collares) se sometió a electroforesis, se transfirió y se hizo hibridizar con sondas correspondientes a la secuencia EST de DHS. Solamente se detectó una hibridización fuerte en las muestras de ARN derivadas de tejido radicular de plantas infestadas por CRW. Se detectaron niveles de expresión bajos (básales) en muestras de las raíces de plantas no infestadas, y no se detectó expresión en las muestras de hojas de plantas infestadas o no infestadas. Para determinar si la lesión del tejido radicular podía inducir el gen DHS, se lesionaron mecánicamente las raíces nodales de plantas en etapa V5 comprimiendo el extremo de la raíz con pinzas. La expresión del gen, determinada por MPSS, no fue regulada positivamente en respuesta a la lesión (Figura 3). Adicionalmente, el daño en las raíces causado por el cambio de macetas de las plantas no indujo la expresión de DHS (véase la Figura 2). Estos resultados sugieren que la alteración física del sistema radicular no provoca la respuesta del gen DHS. La expresión del gen DHS presenta preferencia por la raíz. Además de no expresarse en hojas, el gen no se expresa en otros tejidos vegetativos o reproductivos, incluyendo polen y granos. El único caso en que se observó expresión de DHS fuera de la raíz fue un caso en que se observó expresión baja en hojas, en una biblioteca de retoños de maíz que contenía tejido de mesocótile. El gen no parece ser inducido por la alimentación del insecto en las porciones aéreas de la planta, en particular la alimentación por larvas del taladro del maíz europeo en tejido de espiral por 24 horas. Combinados, estos datos indicaron que el promotor DHS podría ser un candidato apropiado para dirigir la expresión ¡nducible del transgen en plantas tales como maíz. La combinación de la preferencia por la raíz y la inducción por CRW haría que este promotor fuera particularmente útil en los casos en que se deseara una expresión inducida con preferencia por la raíz. Materiales y métodos utilizados Se cultivaron plantas de maíz de la línea B73 bajo condiciones de invernadero hasta la etapa V5, y se las infestó con 75 larvas de 2o estadio de WCRW. Se cosecharon hojas (hoja V5) y raíces nodales. También se tomaron muestras de plantas en etapa V5. Se extrajo ARN de los tejidos usando el conjunto de elementos RNA Easy Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA.) Las muestras de ARN se sometieron a electroforesis en un gel de formaldehído convencional, usando amortiguadores para gel desnauralizante Northern Max (Ambion, Austin, TX). Luego se lavó el gel una vez en SSC 20X por un total de 15 minutos, luego se realizó una transferencia a una membrana de nylon, durante la noche en SSC 20X [Turboblotter de S&S]. La membrana se retículo con rayos UV por 2 minutos. La pre-hibridización de la transferencia se realizó por un total de 3 horas a 50°C en 15 mi de solución DIG Easy Hyb (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN). Se prepararon sondas de ADN de cadena simple a partir de la EST de DHS por PCR, usando el conjunto de elementos de síntesis de sondas de PCR DIG (Roche). De acuerdo con las recomendaciones del protocolo del conjunto de elementos, se agregaron 2 µ? de la sonda desnaturalizada por cada mi de solución DIG Easy Hyb. Se dejó que la hibridizacíón se prolongara durante la noche a 50°C en 10 ml de solución. Al día siguiente, se lavó la membrana dos veces en amortiguador de severidad baja (SSC 2X que contenía 0,1 % de SDS) a temperatura ambiente por 5 minutos, y luego se lavó dos veces en amortiguador de severidad alta (SSC 0,1 X que contenía 0,1 % de SDS) a 55°C por 15 minutos. Se realizó la visualización de los transcriptos de DHS usando el sistema DIG OMNI para sondas de PCR y el conjunto de amortiguadores de lavado y bloqueo DIG de Roche. Brevemente, se equilibró la membrana en amortiguador de lavado (ácido maleico 0,1 M, NaCI 0,15 M, pH 7,5; 0,3% (v/v) de Tween 20) por 2 minutos a temperatura ambiente, luego se mezcló con la solución de bloqueo (dilución 1 :10 de una solución de bloqueo 10X en amortiguador de ácido maleico (ácido maleico 0,1 M, NaCI 0,15 M, pH 7,5)) por 30 minutos. La membrana se incubó en solución de anticuerpos (anti-DIG-fosfato alcalino diluido 1 :10000 en solución de bloqueo (solución de bloqueo 10X diluida 1 :10 en amortiguador de ácido maleico)) por 30 minutos, y se lavó 2 veces en amortiguador de lavado por un total de 30 minutos. Después de equilibrar en amortiguador de detección (Tris-HCI 0,1 M, NaCI 0,1 M, pH 9,5) por 3 minutos, se colocó la membrana en un recipiente plástico de revelado (Applied BioSystems), y se aplicó 1 mi de solución de trabajo CDP-Star (dilución 1 :100 de CDP-Star (25 mM, 12,38 mg/ml) en amortiguador de detección) por goteo a la membrana. Después de incubar por 5 minutos a temperatura ambiente, se expuso la membrana a una película de rayos X entre 20 y una noche. Ejemplo 2: Protocolo de RACE 5' e identificación del sitio de inicio de Ga transcripción Se realizó una RACE 5' de acuerdo con el protocolo proporcionado con el sistema RACE 5' de amplificación rápida de extremos de ADNc (Invitrogen, Carlsbad, CA), usando ARN aislado de raíces de plantas de maíz endocriadas B73. Se diseñaron cebadores específicos para la secuencia codificante del gen (GSP) (usando la secuencia EST) como se indica más adelante. Se usó el protocolo alternativo para moldes ricos en GC, usando transcriptasa inversa SuperScript II (proporcionada en el conjunto de elementos) para la síntesis de la primera cadena con GSP1 (SEQ ID N° 2), y se siguió el protocolo general del sistema para los pasos subsiguientes de tratamiento con ARNasa, procesamiento de la reacción y adición de una cola de dC al ADNc. Se usó HotStarTaq (Qiagen) para las reacciones de PCR con GSP2 (SEQ ID N° 3) y el cebador ancla Abridged (incluido en el conjunto de elementos), a lo que siguió una reacción anidada usando los cebadores GSP3 (SEQ ID N° 4) y AUAP (proporcionado en el conjunto de elementos). Los productos resultantes de la PCR se subclonaron en el vector TA (Invitrogen) y se secuenciaron los clones candidatos. Los análisis de secuencia indicaron que el sitio de inicio de la transcripción (TSS) se localiza 105 pares de bases río arriba del sitio de inicio de la traducción. Durante el transcurso del mapeo del transcripto de DHS por RACE 5', se usó ARN derivado de hojas y raíces. Se observó un producto de RACE que correspondía a DHS solamente en la muestra de ARN de raíz, al tiempo que, en un control con Ubiquitina 1 , se observaron productos de RACE en ARN de hoja y raíz. Dada la sensibilidad de la PCR, estos resultados apoyan fuertemente los resultados de MPSS, que indican que DHS es un gen con preferencia por la raíz. Ejemplo 3: Aislamiento del promotor del gen DHS y análisis de la secuencia Se obtuvo una secuencia de polinucleótídos promotora de aproximadamente 949 bp del gen DHS. Esto se logró realizando múltiples búsquedas reiterativas BLASTN en la base de datos de secuencias de análisis genómicos (GSS), comenzando con la secuencia de la EST identificada.

Cada búsqueda en la base de datos GSS empleó secuencias disponibles obtenidas en la búsqueda previa para "caminar" la secuencia genómica, hasta que no se identificaron secuencias superpuestas adicionales. Sobre la base de la secuencia final, se sintetizaron dos cebadores, PHN71932 (SEQ ID N° 5) y PHN71933 (SEQ ID N° 6) para amplificar por PCR el promotor de DHS a partir de ADN genómico de maíz B73. El diseño de los cebadores incluyó sitios de restricción para facilitar la clonación. Los fragmentos de PCR se clonaron en un vector de expresión, frente al gen de la ß-glucuronidasa (GUS), con y sin el intrón 1 de ??? , para evaluar si el fragmento dirigía la expresión. Se identificó la caja TATA del promotor DHS, y se la indica en la Figura 3.

Se localiza en las posiciones 807 a 812 de SEQ ID N° 1 . El sitio de inicio de la transcripción (TSS) se localizó por RACE 5' (véase el Ejemplo 2), y se localiza en la posición 852, también indicada en la Figura 3. El análisis adicional de la secuencia promotora indicó la presencia de algunos motivos interesantes. El motivo ATATT, identificado previamente como presente en otros promotores con expresión específica en la raíz (Elmayan & Tepfer (1995) Transgenic Research 4, 388-396), se identificó en el promotor DHS en seis localizaciones separadas. (Figura 3). Se halló un motivo ACGTSSSC localizado entre las posiciones 744 y 751 , donde S=C o G. Este motivo es una caja Em1 , que ha sido identificada en una cantidad de otros promotores vegetales, y los estudios han demostrado que es un elemento que responde al ABA, especialmente en genes Em de trigo y genes Rab21 de arroz (Marcotte eí al. (1989) Plant Cell 1 :969-976). Se halló un motivo ACGT entre las posiciones 684 y 687 de SEQ ID N° 1. Se ha demostrado que este motivo participa en la activación de la expresión inducida por la etiolación del gen erd1 (que responde a la deshidratación en forma temprana) en Arabidopsis (Simpson ef al. (2003) Plant J. 33: 259-270). Se halló un motivo WAACCA localizado entre las posiciones 583 y 588 de SEQ ID N° 1 , donde W representa A o T. Este motivo es un sitio de unión MYB1 AT que se descubrió en el promotor del gen de respuesta a la hidratación rd22, y en los promotores de muchos otros genes en Arabidopsis (Abe ef al. (2002) Plant Cell 1 5:63-78). En el promotor de DHS de maíz también hay una secuencia con similitud significativa al elemento transponible de repetición invertida en miniatura ( ITE). Los MITE son elementos transponibles cortos con un tamaño que varía entre 125 y 500 bp, que han sido descubiertos en las regiones no codificantes de genes de maíz, incluyendo promotores (Wessler ef al. (1995) Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 814-821 ). Si bien aún se continúa el estudio de la biología de los MITE, una tendencia de pensamiento actual considera que los MITE tienen una participación importante al proporcionar secuencias reguladoras, tales como una caja TATA o un sitio de inicio de la transcripción, o semejantes. Se descubrió que la secuencia MITE del promotor DHS de maíz estaba localizada entre las posiciones 370 y 452. Se la indica en la Figura 3. Ejemplo 4: Ensayos transitorios en plantas que presentan actividad promotora de DHS Se realizaron ensayos de bombardeo de partículas transitorio para demostrar que la secuencia de polinucleótidos de 949 bp de DHS actúa como promotor. Estos ensayos proporcionaron una evaluación rápida de la capacidad de la secuencia de ADN de dirigir la expresión transgénica. El fragmento de PCR genómico de 949 bp se clonó en un vector de expresión frente al gen de ß-glucuronidasa (GUS) (véase el Ejemplo 3). El bombardeo biolistico de retoños de maíz de 3 días de edad con este cassette de expresión resultó en numerosos focos con coloración de GUS en el coleoptile (>30 focos/coleoptile). El nivel de coloración fue comparable, pero ligeramente menor que el control, el cual consistió en un promotor constitutivo fuerte, Ubi-1 , que dirigía la expresión de GUS. El bombardeo del tejido radicular y foliar proporcionó resultados modestos. La expresión de GUS fue mínima respecto del control. Aún así, los resultados combinados demostraron que el promotor de DHS de 949 bp es capaz de dirigir la expresión. Materiales y métodos utilizados para el ensayo biolistico de expresión transitoria en raíz Se colocaron semillas B73 a lo largo del borde de una hoja de papel de germinación humedecida previamente en una solución de sacarosa al 7%. Una hoja de papel de germinación de tamaño idéntico que la primera se humedeció en sacarosa al 7% y se usó para cubrir las semillas. Luego se enrolló el emparedado de papel de germinación-grano-papel de germinación, y se lo colocó en un recipiente con solución de sacarosa al 7%, de modo que la solución ascendiera por el papel hasta los granos en la parte superior del rollo. Este proceso permitió el crecimiento recto de la raíz. Se dejó que los granos germinaran y se desarrollaran por 2-3 días en la oscuridad a 27-28°C. Antes del bombardeo, se eliminó la vaina externa que cubría el coleoptile, y luego se colocaron los retoños en una placa de petri estéril (60 mm) en una capa de papel de filtro Whatman #1 humedecida con 1 mi de H2O.Se colocaron dos retoños por placa en orientaciones opuestas, y se los ancló al papel de filtro con una solución de agarosa al 0,5%. Se prepararon mezclas de ADN/partículas de oro para el bombardeo en el siguiente método. Se pre-lavaron 60 mg de partículas de oro de entre 0,6 y 1 ,0 micrones con etanol, se lavó con H2O destilada estéril y se suspendió nuevamente en un total de 1 mi de H20 estéril. Se almacenaron alícuotas de 50 µ? de la suspensión de partículas de oro en tubos Eppendorf con silicona a temperatura ambiente. Se precipitó el ADN en la superficie de las partículas de oro combinando, en el siguiente orden, 50 µ? de partículas de oro pre-lavadas 0,6 µ?, 5-10 µg de ADN de prueba, 50 µ? de CaCI2 2,5 M y 25 µ? de espermidina 0,1 M. La solución se agitó inmediatamente por 3 minutos, y se centrifugó brevemente para precipitar la mezcla de ADN/partículas de oro. La mezcla de ADN/partículas de oro se lavó una vez con 500 µ? de etanol al 100% y se suspendió en un volumen final de 50 µ? de etanol al 100%. La solución de ADN/oro se incubó a -20°C por al menos 60 minutos, antes de aplicar 6 µ? de la mezcla de ADN/oro a cada macrovehículo Mylar™ . Se bombardearon retoños preparados como se indicó previamente, y secciones de los extremos de las raíces y las hojas con partículas de ADN/oro, usando el cañón PDS-1000/He a 1 100 psi bajo un vacío de 27-28 pulgadas de Hg. La distancia entre el macrovehículo y la pantalla de detención fue de entre 6 y 8 cm. Las placas se incubaron en recipientes sellados por 24 horas en la oscuridad a 27-28°C después del bombardeo. Después de 18-24 de incubación, en los retoños, las secciones de los extremos de las raíces y las hojas se evaluó la expresión transitoria de GUS. Los retoños, las raíces y las hojas separadas se sumergieron en 10-15 mi de un amortiguador de ensayo GUS que contenía NaH2P04 H20 100 mM (pH 7,0), EDTA 10 mM, K4Fe(CN)6-3H20 0,5 mM, 0, 1 % de Tritón X-100 y 5-bromo-4-cloro-3-indoil glucurónido 2 mM. Los tejidos se incubaron en la oscuridad por 24 horas a 37°C. El reemplazo de la solución de coloración de GUS por etanol al 100% detuvo el ensayo. Se visualizó la expresión/coloración de GUS bajo un microscopio.

Ejemplo 5: Expresión de DHS en plantas transgénicas estables Se crearon plantas transformadas en forma estable, usando protocolos de transformación con Agrobacterium de acuerdo con el Ejemplo 7, para permitir una caracterización más detallada de la actividad promotora, incluyendo la inducción del promotor por lesión mecánica y herbivoría por insectos. Las plantas regeneradas se desarrollaron en agar nutritivo una vez transformadas en forma estable con cassettes de expresión que contenían el promotor DHS de 949 bp (SEQ ID N° 1 ), unido operativamente al gen GUS solo (abreviado DHS: GUS); o el promotor DHS de 949 bp unido operativamente al intrón Adh1 y el gen GUS (abreviado DHS (intrón 1 de Adh1) :GUS). Se incluyó el intrón Adh1 con el propósito de incrementar la expresión, ya que se ha demostrado que, en células de cereal, la expresión de genes extraños es mejorada por la presencia de un intrón en las construcciones genéticas (véase Callis et al. (1987) Genes and Development 1 : 1 183-1200; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357). Para obtener información temprana sobre el comportamiento del promotor DHS, se sometieron las plantas a un experimento de lesión. Se estableció una línea de expresión basal antes de la lesión con el fin de medir la inducción de la expresión de GUS. El análisis histoquímico del tejido foliar y radicular demostró que la mayor parte de las plantas eran negativas para actividad de GUS. Solamente aproximadamente ¼ de las plantas presentaron algo de expresión en raíces y/u hojas. La presencia del intrón de Adh1 resultó en la expresión de GUS en aproximadamente la mitad de los eventos. Las plantas se lesionaron comprimiendo los primeros 0,75 cm del extremo de la raíz con fórceps aserrados y removiendo las primeras 1 -2 pulgadas abaxiales de la hoja. Después de 24 horas, se cosechó una sección de la raíz y la hoja lesionada. La coloración histoquímica de los tejidos reveló que esencialmente no hubo cambios en la cantidad de plantas que expresaban GUS. Se obtuvieron resultados similares con plantas transformadas con el gen DHS(intrón 1 de Adh1): GUS. Las plantas se llevaron a un invernadero, donde se las lesionó nuevamente en la etapa del desarrollo V5-V6 (5-6 hojas en collar), comprimiendo aproximadamente 1 pulgada de los extremos de las raíces nodales con pinzas aserradas, y removiendo las 1 -2 pulgadas abaxiales de la hoja. Los resultados fueron similares a aquellos obtenidos cuando se cultivaron las plantas en agar nutritivo. Para determinar si la inducción modesta del promotor con lesión mecánica podía ser llevada a la siguiente generación, se cultivaron plantas T1 hasta la etapa V5-V6, y se las lesionó como se describió previamente. Se recolectaron muestras 24 horas después. Antes del experimento, se estableció una línea de expresión basal, con la cual se midió la inducción antes de la lesión. La prueba previa demostró que ninguna de las plantas DHS: GUS expresaban GUS, y que 2 plantas DHS(intrón Adh 1): GUS presentaban niveles bajos de coloración de GUS en las hojas, pero nada de coloración en las raíces. Las raíces de la mayor parte de las plantas DHS: GUS y DHS(intrón 1 de Adh 1): GUS lesionadas fueron negativas para la expresión de GUS. Solamente aproximadamente 1 /3 de las raíces presentaron algún nivel de coloración de GUS, la mayor parte de la cual tuvo baja intensidad. La coloración observada se localizó en el tejido lesionado mismo. No estuvo adyacente a la lesión, ni se localizó en una posición distal respecto de la lesión. No se detectó la inducción de la expresión de GUS en las hojas de ninguna de las plantas, estuvieran transformadas con los cassettes de expresión DHS: GUS o DHS(intrón 1 de Adh 1 ): GUS. Esto incluye el extremo de la hoja lesionada creado el día anterior, y las porciones de la hoja adyacentes a la lesión. Combinados, estos datos concuerdan con los resultados descriptos en el Ejemplo 1 , y proporcionan evidencias de que el promotor DHS de 949 bp responde modestamente a las lesiones. Los resultados en el Ejemplo 1 también indicaron que el gen DHS era regulado positivamente de forma más robusta en respuesta a la infestación de CRW, en comparación con las lesiones. Para determinar si el promotor DHS de 949 bp imitaba esta respuesta, se cultivaron independientemente plantas TO y T1 hasta la etapa V5-V6, y se las infestó con larvas de CRW de 2o estadio por 48 horas. Estos experimentos no se realizaron en las plantas cultivadas en agar nutritivo, debido a la masa radicular limitada en esta etapa. Se determinó la expresión basal antes del tratamiento, y los resultados fueron similares a los descriptos previamente. Se demostró que la alimentación de CRW regulaba positivamente el promotor de DHS de 949 bp en raíces. Específicamente, en las plantas T1 , casi todas las plantas DHS: GUS y DHS(íntrón 1 de Adh 1): GUS evaluadas estaban reguladas positivamente (Tabla 1 ). Solamente 1 planta no respondió. La expresión, sobre la base de los análisis histoquímicos, pareció localizarse en las áreas donde se había alimentado o se estaba alimentando la CRW al momento de tomar las muestras. Como las larvas se alimentaron principalmente con extremos de raíces, una buena parte de la coloración de GUS se localizó en esta área. El análisis cuantitativo de las plantas TO apoyó estas observaciones (Tabla 2). Se midieron niveles de expresión de GUS más altos en los extremos de las raíces, en comparación con la región madura de las mismas raíces. Esto también demuestra que la alimentación de CRW induce mayores niveles de expresión que las lesiones.

Tabla 1 : Patrón de ex resión del romotor DHS en lantas T1 Tabla 2: Resultados del ensa o de MUG ara el romotor DHS Los valores proporcionados son valores medianos, como nmol de MU/mg de proteína total/hora MU= 4-metil umbeliferona MUG = 4-metil umbeliferil-B-D-glucurónido Coloración histoquímica de tejidos vegetales en busca de actividad de GUS La detección de la actividad de GUS se realizó colocando tejido de plantas transformadas en placas de 48 cavidades, 12 cavidades o 6 cavidades que contenían entre 0,5 y 5 mi de amortiguador de ensayo GUS (con la receta del amortiguador de ensayo descripto en el Ejemplo 5). Las placas se colocaron en una recámara al vacío por 10 minutos, y luego se incubaron durante la noche a 37°C. Se eliminó la pigmentación del tejido con entre 1 y 3 incubaciones sucesivas de 12 horas en etanol al 100% a temperatura ambiente. Los tejidos se almacenaron en 70% de etanol a 4°C. Ejemplo 6: Transformación de maíz mediada por Agrobacterium y regeneración de plantas transgénicas Para la transformación mediada por Agrobacterium del maíz con una secuencia promotora de las realizaciones, se empleó el método de Zhao (véanse: Patente de los EEUU N° 5981840 (conocida de aquí en adelante como la patente '840) y Publicación de Patente PCT W098/32326, cuyos contenidos se incorporan en la presente documentación a modo de referencia). Se incubaron Agrobacterium en una placa principal con medio 800, se realizó el cultivo a 28°C en la oscuridad por 3 días, y luego se almacenó a 4°C por hasta un mes. Las placas de trabajo de Agrobacterium se cultivaron en placas con medio 810, y se incubaron en la oscuridad a 28°C por uno o dos días. Brevemente, se disectaron embriones a partir de espigas de maíz frescas y esterilizadas, y se los mantuvo en medio 56 Q hasta que se hubieron recolectado todos los embriones requeridos. Luego se pusieron en contacto los embriones con una suspensión de Agrobacterium preparada a partir de la placa de trabajo, donde las Agrobacterium contenían un plásmido que comprendía la secuencia promotora de las realizaciones. Los embriones se co-cultivaron con las Agrobacterium en placas 562P, con los embriones colocados en las placas con el lado del eje hacia abajo, como lo indica el protocolo de la patente '840.

Después de una semana en medio 562P, los embriones se transfirieron a medio 5630. Los embriones se subcultivaron en medio 5630 fresco a intervalos de 2 semanas, y se continuó la incubación bajo las mismas condiciones. Los eventos de callos comenzaron a aparecer después de entre 6 y 8 semanas de selección. Una vez que los callos hubieron alcanzado el tamaño apropiado, se los cultivó en medio de regeneración (288W) y se los mantuvo en la oscuridad por 2-3 semanas para iniciar la regeneración de las plantas. Una vez completada la maduración de los embriones somáticos, se transfirieron los embriones somáticos bien desarrollados a un medio de germinación (272V) y se los colocó en un cuarto de cultivo iluminado. Aproximadamente 7-10 días después, se transfirieron las plántulas en desarrollo a un medio 272V libre de hormonas, en tubos, por 7-10 días, hasta que las plántulas estuvieron bien establecidas. Luego se transfirieron las plantas a insertos en bandejas planas (equivalentes a macetas de 2,5") que contenían tierra para maceta, y se las dejó crecer por 1 semana en una cámara de cultivo, luego se las dejó crecer otras 1 -2 semanas en el invernadero, para luego transferirlas a macetas clásicas 600 (de 1 ,6 galones) y cúltivarlas hasta la madurez. Medios usados en la transformación mediada por Agrobacterium y la regeneración de plantas de maíz transgénicas: El medio 561 Q comprende 4,0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000x SIGMA-151 1 ), 0,5 mg/l de tiamína HCI, 68,5 g/l de sacarosa, 36,0 g/l de glucosa, 1 ,5 mg/l de 2,4-D, y 0,69 g/l de L-prolina (llevado a volumen con di H2O, después de ajustar el pH en 5,2 con KOH); 2,0 g/l de Gelrite™ (agregado después de llevar a volumen con di H2O); y 8,5 mg/l de nitrato de plata (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio 800 comprende 50,0 ml/l de solución madre A y 850 mi de di H20, y se lleva a un volumen menor que 100 ml/l con di H20, después de lo cual se agregan 9,0 g de fitagar. Después de esterilizar y enfriar, se agregan 50,0 ml/l de solución madre B, junto con 5,0 g de glucosa y 2,0 mi una solución madre de 50 mg/ml de espectinomicina. La solución madre A comprende 60,0 g de ?2??04 dibásico y 20,0 g de fosfato de sodio monobásico, disuelto en 950 mi de agua, con el pH ajustado en 7,0 con KOH, y llevado hasta un volumen de 1 ,0 I con di H20. La solución madre B comprende 20,0 g de NH4CI, 6,0 g de MgS04-7H20, 3,0 g de cloruro de potasio, 0,2 g CaCI2 y 0,05 g de FeSO4-7H2O, todo llevado a volumen con di H20, esterilizado y enfriado. El medio 810 comprende 5,0 g de extracto de levadura (Difco), 10,0 g de peptona (Difco), 5,0 g de NaCI, disuelto en di H20, y se lleva a volumen después de ajustar el pH en 6,8. Luego se agregan 15,0 g de bacto-agar, la solución se esteriliza y se enfría, y se agrega 1 ,0 mi de una solución madre de 50 mg/ml de espectinomicina. El medio 562P comprende 4,0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000x SIGMA-15 ), 0,5 mg/l de tiamina HCI, 30,0 g/l de sacarosa, y 2,0 mg/l de 2,4-D (llevado a volumen con di H20 después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); 3,0 g/l de Gelrite™ (agregado después de llevar a volumen con di H2O); y 0,85 mg/l de nitrato de plata y 1 ,0 mi de una solución madre de acetosiringona 100 mM (ambos agregados después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio 5630 comprende 4,0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000x SIGMA-151 1 ), 0,5 mg/l de tiamina HCI, 30,0 g/l de sacarosa, 1 ,5 mg/l de 2,4-D, 0,69 g de L-prolina y 0,5 g de amortiguador MES (llevado a volumen con di H20 después de ajustar el pH en 5,8 con KOH). Luego se agregan 6,0 g/l de agar-agar Ultrapure™ (EM Science) y se esteriliza y enfría el medio. Luego se agregan 0,85 mg/l de nitrato de plata, 3,0 mi de una solución madre de 1 mg/ml de Bialaphos y 2,0 mi de una solución madre de 50 mg/ml de carbenicilina. 288 W comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 1 1 1 17-074), 5,0 ml/l de solución madre de vitaminas MS (0, 100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCI, 0, 10 g/l de piridoxina HCI, y 0,40 g/l de glicina, llevado a volumen con D-l H20 pulida) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Planta, 75:473), 100 mg/l de mio-inositol, 0,5 mg/l de zeatina, y 60 g/l de sacarosa, luego llevado a volumen con D-l H20 pulida después de ajustar el pH en 5,6. Posteriormente se agregan 6,0 g/l de agar-agar Ultrapure™ (EM Science) y se esteriliza y enfría el medio. Luego se agrega 1 ,0 ml/l de ácido abscísico 0,1 mM; 1 ,0 mg/l de ácido indolacético y 3,0 mg/l de Bialaphos, junto con 2,0 mi de una solución madre de 50 mg/ml de carbenicilina. El medio libre de hormonas (272V) comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 1 1 1 17-074), 5,0 ml/l de solución madre de vitaminas MS (0, 100 g/l de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCI, 0, 10 g/l de piridoxina HCI y 0,40 g/l de glicina, llevado a volumen con di H2O pulida), 0,1 g/l de mio-inositol y 40,0 g/l de sacarosa (llevado a volumen con di H2O pulida después de ajustar el pH en 5,6); y 6 g/l de bacto-agar (agregado después de llevar a volumen con di H2O pulida), esterilizado y enfriado a 60°C. Todas las publicaciones y las solicitudes de patentes mencionadas en esta memoria descriptiva indican el nivel de aquellos entrenados en la técnica a los que concierne esta invención Todas las publicaciones y las solicitudes de patentes se incorporan en la presente documentación a modo de referencia, en la misma extensión en que se indicó que se incorporó específica e individualmente cada publicación o solicitud de patente individual a modo de referencia. Aunque se ha descripto la invención precedente con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo con el fin de facilitar la compresión, será obvio que podrán practicarse determinados cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES: 1 . Una molécula de ácido nucleico aislada CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , o un complemento de ésta; b) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias promotoras vegetales de los plásmidos depositados con el N° de Depósito de Patente PTA-6277, o un complemento de ésta; c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula vegetal; y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula vegetal.
2. Una construcción de ADN CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1 , unida operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés.
3. Un vector CARACTERIZADO PORQUE comprende la construcción de ADN de la reivindicación 2.
4. Una célula vegetal CARACTERIZADA PORQUE tiene incorporada en forma estable en su genoma la construcción de ADN de la reivindicación 2.
5. La célula vegetal de la reivindicación 4, CARACTERIZADA PORQUE dicha célula vegetal es de una monocotiledónea.
6. La célula vegetal de la reivindicación 5, CARACTERIZADA PORQUE dicha monocotiledónea es maíz.
7. La célula vegetal de la reivindicación 4, CARACTERIZADA PORQUE dicha célula vegetal es de una dicotiledónea.
8. Una planta CARACTERIZADA PORQUE tiene incorporada en forma estable en su genoma la construcción de ADN de la reivindicación 2.
9. La planta de la reivindicación 8, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una monocotiledónea.
10. La planta de la reivindicación 9, CARACTERIZADA PORQUE dicha monocotiledónea es maíz..
1 1 . La planta de la reivindicación 8, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una dicotiledónea.
12. Una semilla transgénica CARACTERIZADA PORQUE pertenece a la planta de la reivindicación 8, donde la semilla comprende la construcción.
13. La planta de la reivindicación 8, CARACTERIZADA PORQUE la secuencia de nucleótidos heterologa de interés codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, la sal, el frío, la sequía, patógenos o insectos.
14. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos en una planta, CARACTERIZADO PORQUE comprende introducir una construcción de ADN en una planta, donde dicha construcción de ADN comprende un promotor y una secuencia de nucleótidos heterologa de interés unida operativamente al promotor, donde dicho promotor comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 ; b) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias promotoras vegetales de los plásmidos designados con el N° de Depósito de Patente PTA-6277; c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en dicha planta; y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 o SEQ ID N° 2, donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en una célula vegetal.
15. El método de la reivindicación 14, CARACTERIZADO PORQUE dicha planta es una dicotiledónea.
16. El método de la reivindicación 14, CARACTERIZADO PORQUE dicha planta es una monocotiledónea.
17. El método de la reivindicación 16, CARACTERIZADO PORQUE dicha monocotiledónea es maíz.
18. El método de la reivindicación 14, CARACTERIZADO PORQUE la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, la sal, el frío, la sequía, patógenos o insectos.
19. El método de la reivindicación 14, CARACTERIZADO PORQUE dicha secuencia de nucleótidos heteróloga de interés se expresa selectivamente en la raíz.
20. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos en una célula vegetal, CARACTERIZADO PORQUE comprende introducir una construcción de ADN en una célula vegetal, donde la construcción comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, donde dicho promotor comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 ; b) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias promotoras vegetales de los plásmidos designados con el N° de Depósito de Patente PTA-6277; c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en dicha célula vegetal; y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en una célula vegetal.
21 . El método de la reivindicación 20, CARACTERIZADO PORQUE dicha célula vegetal es de una monocotiledónea.
22. El método de la reivindicación 21 , CARACTERIZADO PORQUE dicha monocotiledónea es maíz.
23. El método de la reivindicación 20, CARACTERIZADO PORQUE dicha célula vegetal es de una dicotiledónea.
24. El método de la reivindicación 20, CARACTERIZADO PORQUE la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, la sal, patógenos o insectos.
25. Un método para expresar selectivamente una secuencia de nucleótidos en la raíz de una planta, CARACTERIZADO PORQUE comprende introducir una construcción de ADN en una célula vegetal y regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal, donde dicha construcción de ADN comprende un promotor y una secuencia de nucleótidos heteróloga unida operativamente al promotor, donde dicho promotor comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 ; b) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias promotoras vegetales de los plásmidos depositados con el N° de Depósito de Patente PTA-6277; c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula de la raíz de la planta; y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia detallada en SEQ ID N° 1 , donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula de la raíz de una planta.
26. El método de la reivindicación 25, CARACTERIZADO PORQUE la expresión de dicha secuencia de nucleotidos heterologa altera el fenotipo de dicha planta.
27. El método de la reivindicación 25, CARACTERIZADO PORQUE la planta es una monocotiledónea.
28. El método de la reivindicación 27, CARACTERIZADO PORQUE la monocotiledónea es maíz.
29. El método de la reivindicación 25, CARACTERIZADO PORQUE la planta es una dicotiledónea.
30. El método de la reivindicación 25, CARACTERIZADO PORQUE la secuencia de nucleotidos heterologa codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, la sal, el frío, la sequía, patógenos o insectos.